TWI646968B - Use of Taiwan Hypericum Extract - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種台灣金絲桃萃取物的製備方法，其包含以下步驟：(1)齊備一台灣金絲桃植物組織，並將其乾燥、粉碎成為待萃物；(2)將該待萃物浸泡於有機溶劑中；(3)超音波震盪浸泡於有機溶劑之待萃物，獲得粗萃物；以及(4)將該粗萃物過濾獲得台灣金絲桃萃取物。本發明亦關於一種由前述製備方法而得的台灣金絲桃萃取物。本發明亦關於一種將所述台灣金絲桃萃取物用於製備抗糖化及皮膚抗皺的組成物的用途。本發明亦關於一種化妝保養品其包含所述台灣金絲桃萃取物以及化妝保養品與皮膚科領域中可被接受之佐劑。

Description

台灣金絲桃萃取物之用途
本發明係涉及一種植物萃取方法，特別是指台灣金絲桃萃取物的製備方法。本發明另涉及一種由前述製備方法而得的台灣金絲桃萃取物。本發明另涉及一種將所述台灣金絲桃萃取物用於製備抗糖化及皮膚抗皺的組成物的用途。本發明另涉及一種化妝保養品，其包含所述台灣金絲桃萃取物以及化妝保養品與皮膚科領域中可被接受之佐劑。
現代人重視外表且注重皮膚保養。惟氣候異常，大環境改變加上臭氧層破壞，使得人們對於防曬及抗皮膚老化相關產品的需求量大增，因而化妝保養品的市場逐年擴大。另外，現代人已避免使用人工化學合成，而是選用天然成分之化妝保養品，因此，由植物萃取的天然美容產品的應用已普遍受到重視，尤其是將植物萃取物應用於化妝品中已成為全球趨勢。
糖化反應(glycation)是造成老化和導致疾病的一大主因，糖化反應的本質就是梅納反應(Maillard reaction)，這是糖的醛(酮)基與含胺基物質(例如蛋白質、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸或上述之衍生物)的胺基之間的一種非酵素性糖化反應。當過量攝取糖質食物，使體內多餘的糖分增加，並與蛋白質結合形成最終糖化蛋白(advanced glycation end products,AGEs)，而AGEs會使皮膚及體內細胞老化。而近年研究發現，有許多天然成分，例如薑黃素(curcumin)、迷迭香(rosemary)及黃酮類化合物如芸香苷(rutin)等，能有效降低AGEs之形成，保護生物體免於受到糖化反應之傷害。
已有許多研究指出，基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotinases,MMPs)是和皮膚老化相關的酵素，當皮膚細胞的MMPs分泌不正常時會造成結 締組織的損害進而造成皺紋產生。在正常、健康或休止的組織中，MMPs幾乎不表現，或是維持在微量的狀態；而當細胞或組織處於需要被修復(repair)或重組(remodeling)的狀態時，例如遭逢組織受傷、發炎反應、皮膚日曬、或各類疾病等，各類型的基質金屬蛋白酶就會被大量的分泌出來。
綜上所述，皮膚內因性老化難以避免，但外因性老化可以預防甚至是治療的。有鑑於此，提出一種能具有抗糖化(anti-glycation)活性並可以抑制皮膚基質金屬蛋白質的植物性物質，以期能延緩甚至避免皮膚組織受到破壞，減少皮膚的皺紋等老化現象。
金絲桃屬植物是著名的藥草，在國際上已經被開發成各種保健食品及植物藥品，用於緩解憂鬱症的保健食品。其中，台灣金絲桃是金絲桃科金絲桃屬的灌木植物，學名為Hypericum formosanum Maxim，屬於台灣特有種，而目前並未有發現將台灣金絲桃此天然植物應用於抗糖化及抗光老化等應用。
因此，本發明之目的在於提供一種台灣金絲桃萃取物的製備方法，製備而得的台灣金絲桃萃取物能藉由抗糖化及抗光老化以達成預防及延緩皮膚老化的效果。
為了達到上述之發明目的，本發明遂提供一種台灣金絲桃萃取物的製備方法，其包含以下步驟：(1)齊備一台灣金絲桃植物組織，並將其乾燥、粉碎成為待萃物；(2)將該待萃物浸泡於有機溶劑中，其中該待萃物與有機溶劑的體積比介於1：5至1：15；(3)超音波震盪浸泡於有機溶劑之待萃物，獲得粗萃物；以及，(4)將該粗萃物過濾獲得台灣金絲桃萃取物。
較佳的，所述步驟(1)中，該台灣金絲桃植物組織為台灣金絲桃根莖葉。
較佳的，所述步驟(2)中，該有機溶劑為酒精、甲醇、乙酸乙酯。
更佳的，所述酒精的濃度係介於50%至80%。更佳的，所述酒精濃度為65%。
較佳的，所述步驟(3)中，該超音波震盪之條件為溫度介於55℃至80℃；頻率介於25Hz至40Hz；萃取時間介於30分鐘至60分鐘。
較佳的，所述之製備方法，在所述步驟(4)中過濾步驟之後更包含一濃縮步驟；該濃縮步驟為減壓濃縮或冷凍乾燥，以去除其所含之有機溶劑。更佳的，所述濃縮步驟係以真空減壓濃縮機去除有機溶劑並濃縮乾燥。
本發明另提供一種台灣金絲桃萃取物，其係前述之製備方法所製備而得，所述台灣金絲桃萃取物具有抗糖化及抗光老化進而達到預防或減緩皮膚老化之效果。
較佳的，該台灣金絲桃萃取物更包含黃酮類活性化合物。
更佳的，所述黃酮類活性化合物包含，但不限於金絲桃苷(hyperoside)、落新婦苷(astilbin)、槲皮苷(quercitrin)及槲皮素(quercetin)。
本發明另提供一種化妝保養品，其包含所述台灣金絲桃萃取物以及化妝保養品與皮膚科領域中可被接受之佐劑。
依據本發明，所述化妝保養品可被製造的化妝品形式包含，但不限於水性溶液、水-醇溶液、油性溶液、水包油乳劑(oil-in-water emulsion)、油包水乳劑(water in oil emulsion)、複合型乳劑、面膜(mask)、水性凝膠、油性凝膠、氣霧(aerosol)、乳霜(cream)、油膏(ointment)、乳(milk)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、軟膏(paste)、慕斯(mousse)、泡沫(foam)或分散液(dispersion)等。
本發明的優點在於本發明的台灣金絲桃萃取物之製備方法可獲得含有高含量黃酮類活性化合物的台灣金絲桃萃取物，其具有抗糖化反應、抗光老化等效果，可達到預防或延緩皮膚老化的功效。
圖1為台灣金絲桃萃取物之HPLC分析結果。
圖2A為酒精濃度對於台灣金絲桃萃取物之總黃酮含量之折線圖。
圖2B為超音波震盪萃取時間對於台灣金絲桃萃取物之總黃酮含量之折線圖。
圖2C為超音波震盪萃取溫度對於台灣金絲桃萃取物之總黃酮含量之折線圖。
圖3A至圖3C為台灣金絲桃萃取物萃取最適化之反應曲面圖；圖3A為不同酒精濃度萃取的反應曲面圖；圖3B為不同萃取時間的反應曲面圖；圖3C為不同萃取溫度的反應曲面圖。
圖4為台灣金絲桃萃取物抗糖化反應檢測之結果。
圖5為台灣金絲桃萃取物抑制MMP-1基因表現(以AGE處理24小時後)之柱狀圖；★標記為與負控制組相比具有統計顯著差異(p<0.05)；＊標記為與正控制組相比具有統計顯著差異(p<0.05)。
圖6為台灣金絲桃萃取物抑制MMP-1基因表現(照射UVB24小時後)之柱狀圖；★標記為與負控制組相比具有統計顯著差異(p<0.05)；＊標記為與正控制組相比具有統計顯著差異(p<0.05)。
圖7為台灣金絲桃萃取物抑制MMP-3基因表現(照射UVB24小時後)之柱狀圖；★標記為與負控制組相比具有統計顯著差異(p<0.05)；＊標記為與正控制組相比具有統計顯著差異(p<0.05)。
以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。
製備例1 台灣金絲桃萃取物之製備
將台灣金絲桃植物之根莖葉在於5℃至35℃之溫度條件下進行乾燥，而後於5℃至40℃之溫度條件下進行粉碎處理，得到台灣金絲桃乾燥粉末。將所得到的台灣金絲桃乾燥粉末與酒精以體積比1：10進行混合，並以55℃至80℃、頻率介於25Hz至40Hz之條件下超音波震盪浸泡於酒精之待萃物持續萃取30分鐘至60分鐘，得到粗萃物；而後進行過濾取其濾液，並以真空減壓濃縮機去除酒精並濃縮乾燥，得到台灣金絲桃萃取物。
製備例2 人類皮膚角質細胞(HaCaT)之準備
將人類皮膚角質細胞培養於含有10%去活化之小牛血清(fetal bovine serum,FBS)及1%青黴素/鏈黴素雙抗生素溶液(penicillin-streptomycin)之改良杜氏伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)中，利用相位差顯微鏡觀察細胞，待細胞生長約90%即進行繼代培養，繼代培養時先以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered-saline,PBS)潤洗2次，接著加入1mL至2mL的tyrpsin-EDTA於37℃、5%CO2培養箱中培養5分鐘使細胞懸浮，而後離心1250rpm、5分鐘，於移除上清液後加入新的培養液再將細胞均勻打散，最後回種於新的三角培養瓶中。每個三角培養瓶注入約12mL的細胞培養液，細胞培養液約1至2天更換一次。
製備例3 初代人類真皮纖維母細胞(primary normal human dermal fibroblasts,NHDFs)之準備
取2平方公分至4平方公分健康人類皮膚檢體浸泡於2.5mg/mL含有dispase II的DMEM中，在37℃條件下浸泡2小時使上皮組織與真皮組織分 離。將真皮組織轉置於0.1%膠原酵素溶液(collagenase I)中，於4℃溫度條件下浸泡作用24小時，再將已作用完全之膠原酵素溶液收集至已備有DMEM的離心管中，以1000rpm離心5分鐘除去上清液並收集沉澱的纖維母細胞。而後加入含有20%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的DMEM均勻打散纖維母細胞，平均種於10公分細胞培養皿中，放置於37℃、5% CO2培養箱中培養。
實施例1 台灣金絲桃萃取物活性成分分析
取製備例1製備方法而得的台灣金絲桃萃取物進行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。HPLC的分析條件為管柱：T3(100mm×3mm)；移動向A：水，移動向B：甲醇(含1%甲酸)，梯度設置為0分鐘至5分鐘為85% A，5分鐘至10分鐘為30% A，10分鐘至15分鐘為0% A，15分鐘至20分鐘為85% A，流速為0.4mL/min，檢測波長200nm至400nm。
請參閱圖1所示，液相層析儀的分析結果顯示台灣金絲桃萃取物具有豐富的黃酮類化合物，經與標準品檢測結果比對，台灣金絲桃萃取物主要的黃酮類活性成分包括金絲桃苷(hyperoside)、落新婦苷(astilbin)、槲皮苷(quercitrin)及槲皮素(quercetin)，其各成分占台灣金絲桃萃取物(由製備例1製備而得)之含量如表1所示。
實施例2 台灣金絲桃萃取物之總黃酮含量(total flavonoids content,TFC)測定
由實施例1已知台灣金絲桃萃取物具有多種黃酮類活性成分；本實施例利用總黃酮含量測定法測試於製備例1中的酒精濃度、超音波萃取溫度及萃取時間對於台灣金絲桃萃取物之TFC的影響。TFC測定方法為取1mL台灣金絲桃萃取物加入0.3mL 5% NaNO2及4mL去離子水中，混合均勻並於室溫下靜置反應5分鐘，而後加入0.3mL 10% AlCl3‧6H2O在於室溫下靜置反應6分鐘，最後加入2mL 1M NaOH及10mL去離子水，以吸光值570nm測定，並以兒茶素(catechin)作為對照組，以兒茶素的標準曲線計算待測物之TFC，測試結果如圖2A至圖2C所示。
圖2A為以酒精濃度20%至100%進行測試之結果，由結果得知當酒精濃度介於65%至80%時，台灣金絲桃萃取物之TFC可達100mg/g以上。圖2B為超音波震盪萃取時間為10分鐘至70分鐘之測試結果，由結果可知，當超音波震盪萃取時間介於45分鐘至55分鐘時，台灣金絲桃萃取物之TFC可達100mg/g以上。圖2C為音波震盪萃取溫度為20℃至80℃之測試結果，結果顯示，當萃取溫度介於58℃至78℃時，台灣金絲桃萃取物之TFC可達100mg/g以上。
實施例3 台灣金絲桃萃取物之超音波震盪步驟最適化試驗
為萃取出最高含量黃酮類活性成分的台灣金絲桃萃取物，本實施例採用Box-Behnken design(BBD)反應曲面法(response surface methodology,RSM)之設計，以總黃酮萃取含量作為反應指標進行三因子三階實驗方案，透過數學計算及統計學分析得到於製備方法之超音波震盪步驟時最適化的萃取方法，藉此降低實驗成本及次數，並且有效萃取出最高含量黃酮活性成分的台灣金絲桃萃取物。因此，以Design Expert Version 8.0軟體設計萃取變數包含乙醇 濃度為X1、萃取時間為X2及萃取溫度為X3，實驗因子編碼及階層設計如表2所示。
其中，過程變數係依據式(1)進行編碼，x=(Xi-X0)/△X 式(1)
於式(1)中，x為編碼值(coded value)，Xi為變數的實際值，X0為變數在中心點(center point)的值，而△X為值的增量變化。而後將實驗數據代入式(2)二階多項式中，
於式(2)中，Y為總黃酮含量預測反應值，β0、βi、βii及βij分別為截距、線性、二次項及交互項之回歸係數，而Xi及Xj則是獨立變數。使用單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)進行比較分析而後以Tukey’s post-hoc test檢驗(p<0.05)。利用反應方程式繪出模式三度空間曲面與等高線圖，觀察並分析出最適合的操作條件。本實驗反應曲線實驗結果回歸方程式為：Y=103.91A+5.44B+1.82C+3.75AB-0.1AC-2.5BC-24.63A2-13.06B2-6.04C2 式(3)
由圖3A至圖3C的台灣金絲桃萃取物萃取最適化之反應曲面圖顯示，本實施例以乙醇萃取台灣金絲桃萃取物並以超音波震盪步驟加強萃取效果時，當酒精濃度為65%、萃取溫度為65℃以及萃取時間為47分鐘的條件下，可以得到最多的總黃酮含量107mg/g。
實施例4 抗糖化反應(anti-glycosylation)檢測
當白蛋白與葡萄糖共同存在時會緩慢進行糖化反應進而產生AGEs，當AGEs含量越高則會使螢光強度增加。以含有500mM葡萄糖、20mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)及0.02%疊氮化鈉(sodium azide)的0.1M pH7.4 PBS，分別加入濃度為0μg/mL(控制組)、100μg/mL、200μg/mL及400μg/mL由製備例1製備而得的台灣金絲桃萃取物後，於37℃且避光條件下震盪培養以進行糖化反應，實驗期間為5個星期，每隔1星期取樣一次，分別分為第0、1、2、3、4、5週，以波長370nm進行激發並以波長440nm測定螢光強度反應AGEs含量，結果如圖4所示。
如圖4所示，與控制組相比，含有台灣金絲桃萃取物的組別可明顯降低螢光強度，即減少AGEs含量，而且螢光強度(AGEs含量)會隨著台灣金絲桃萃取物的濃度增加而降低，此實驗結果表示台灣金絲桃萃取物具有抗糖化反應的效果。
取製備例2的HaCaT種於細胞培養盤中，加入100μg/mL的高級糖化終產物(advanced glycation endproduct-modified bovine albumin,AGE-BSA)處理24小時，使細胞進行糖化反應，而後以不含血清的細胞培養液潤洗細胞2次除去AGE-BSA，再分別加入0μg/mL[作為正控制(positive control)組]及200μg/mL由製備例1製備而得的台灣金絲桃萃取物(溶於DMSO中，DMSO最終濃度為0.5%)處理細胞24小時，其中一組HaCaT細胞不以AGE-BSA處理亦不加台灣金絲桃萃取物作為負控制(negative control)組。以上實驗結束後，分別收集細 胞，萃取細胞RNA並以即時反轉錄聚合酶連鎖反應(Real-time,RT-PCR)檢測基質金屬蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1,MMP-1)之基因表現量，測定結果如圖5所示。在本實施例中的測定方法是屬於本發明所屬技術領域的通常知識，並且非本發明的技術特徵所在，故於此不加以贅述。
人類皮膚角質細胞經過AGE-BSA糖化反應24小時後的MMP-1基因表現量如圖5所示。可觀察到正控制組在經過AGE-BSA處理24小時後，其MMP-1基因表現量是負控制組之MMP-1基因表現量的5.2倍，此結果顯示AGE-BSA會刺激MMP-1基因的大量表現；而經過200μg/mL台灣金絲桃萃取物處理人類角質細胞後，相較於正控制組，其MMP-1基因表現量則顯著下降92%，此結果證明台灣金絲桃萃取物具有顯著抑制MMP-1基因表現的效果。
實施例5 抗光老化(anti-photoagi ng)檢測
取製備例3的NHDFs以細胞密度為2×105cells/plate種於6公分細胞培養皿中培養24小時，而後分別加入濃度為0μg/mL(控制組)及200μg/mL由製備例1製備而得的台灣金絲桃萃取物處理6小時。處理結束後，以PBS進行潤洗細胞，並將6公分細胞培養皿之上蓋暫時移除，以5mJ/cm2紫外線輻射B(ultraviolet B,UVB)照射處理24小時[其中一組控制組不以UVB照射處理作為負控制(negative control)組，另一組控制組以UVB照射處理作為正控制(positive control)組]。UVB照射處理結束後，立即將細胞培養皿內之PBS替換為含有各自原先濃度之台灣金絲桃萃取物的新鮮細胞培養液繼續培養細胞24小時。以上實驗結束後，分別收集細胞，萃取細胞RNA並以RT-PCR檢測MMP-1以及基質金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3,MMP-3)之基因表現量，測定結果如圖6及圖7所示。而在本實施例中的測定方法是屬於本發明所屬技術領域的通常知識，並且非本發明的技術特徵所在，故於此不加以贅述。
MMP-1基因表現量結果如圖6所示，於正控制組中可觀察到，NHDFs在經過24小時UVB照射後，其MMP-1基因表現量為負控制組之表現量的6.5倍，可見UVB之照射會刺激MMP-1基因表現量顯著大量表現；而經過200μg/mL台灣金絲桃萃取物處理的NHDFs，其MMP-1基因表現量則顯著下降為正控制組60%，並接近回復於負控制組之MMP-1基因表現量。MMP-3基因表現量結果如圖7所示，經UVB照射後的NHDFs之MMP-3基因表現量顯著增加為負控制組的5倍；與正控制組相比，同樣經過UVB照射後以200μg/mL台灣金絲桃萃取物處理的NHDFs的MMP-3基因表現量則是顯著下降為正控制組的65%。
因MMP-1及MMP-3之過度分泌皆會使皮膚膠原老化及產生皺紋，因此，由此實驗結果可證明台灣金絲桃萃取物可通過抑制MMP-1及MMP-3之表現，進而達到抑制皮膚膠原老化、皮膚抗皺及抗光老化的效果。
根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。

Claims (10)

  1. 一種台灣金絲桃萃取物之用途，其係用於預防或減緩皮膚老化，其中該台灣金絲桃萃取物的製備方法，包含以下步驟：(1)齊備一台灣金絲桃植物組織，並將其乾燥、粉碎成為待萃物；(2)將該待萃物浸泡於有機溶劑中，其中該待萃物與有機溶劑的體積比介於1：5至1：15；(3)超音波震盪浸泡於有機溶劑之待萃物，獲得粗萃物；以及，(4)將該粗萃物過濾獲得台灣金絲桃萃取物。
  2. 一種台灣金絲桃萃取物之用途，其係用於製備抗糖化或抗光老化之醫藥組合物，其中該台灣金絲桃萃取物的製備方法，包含以下步驟：(1)齊備一台灣金絲桃植物組織，並將其乾燥、粉碎成為待萃物；(2)將該待萃物浸泡於有機溶劑中，其中該待萃物與有機溶劑的體積比介於1：5至1：15；(3)超音波震盪浸泡於有機溶劑之待萃物，獲得粗萃物；以及，(4)將該粗萃物過濾獲得台灣金絲桃萃取物。
  3. 如請求項1或2所述之用途，其中該步驟(1)中，該台灣金絲桃植物組織為台灣金絲桃根莖葉。
  4. 如請求項1或2所述之用途，其中該步驟(2)中，該有機溶劑為酒精、甲醇、乙酸乙酯。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該酒精的濃度介於50%至80%。
  6. 如請求項1或2所述之用途，其中該步驟(3)中，該超音波震盪之條件為溫度介於55℃至80℃；頻率介於25赫茲至40赫茲；萃取時間介於30分鐘至60分鐘。
  7. 如請求項1或2所述之用途，其中該步驟(4)中過濾步驟之後更包含一濃縮步驟；該濃縮步驟為減壓濃縮或冷凍乾燥。
  8. 如請求項1或2所述之用途，其中該台灣金絲桃萃取物包含黃酮類活性化合物。
  9. 如請求項8所述之用途，其中該黃酮類活性化合物包含金絲桃苷、落新婦苷、槲皮苷及槲皮素。
  10. 如請求項9所述之用途，其中以該金絲桃萃取物1克作為基準，該金絲桃苷占1毫克至3毫克，該落新婦苷占2毫克至6毫克，該槲皮苷占7毫克至10毫克，以及該槲皮素占1毫克至3毫克。
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完美植萃潤膚水，https://www.iope.com/tw/zh/skincare_makeup/skin_care/collection/detail.iope2016110817153579skin_... *
張聖顯等，金絲桃屬植物抗氧化能力比較分析，花蓮區農業改良場研究彙報(Bull.Hualien DARES)31:31-32(2013) *
張聖顯等，金絲桃屬植物抗氧化能力比較分析，花蓮區農業改良場研究彙報(Bull.Hualien DARES)31:31-32(2013)。

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