TWI638990B - 血流量的評估或間接測量方法 - Google Patents

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Abstract

本發明的課題係提供不是外科摘取皮膚而對皮膚帶來刺激等的方法，而是可簡便且確實地測定或評價血流狀態的使用生物化學指標的新穎的測定或評價方法。一種皮膚血流量的間接測定或評價方法，其係以皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑及/或白細胞介素-1 α的表現量作為指標。

Description

血流量的評估或間接測量方法
本發明係關於肌膚血流量的水平評價或間接測定方法。
作為肌膚老化現象的原因之一，可列舉血液循環不良所導致的膚色紅潤度的降低。該肌膚紅潤度的降低現象在明顯時作為“肌膚暗沉”出現，是藉由化妝難以彌補的現象。其次，可以說藉由改善肌膚的血流，可期待提高透明性及明亮度且促進皮膚組織的代謝活性、活化細胞，作為其結果，可應對以暗沉的原因為主的肌膚各種老化現象的原因。
肌膚組織因血流量增加而代謝被促進從而除去廢物。例如，開發了藉由照射根據化學發光的包含近紅外線的光來改善肌膚血流的技術(專利文獻1：WO2005/077458號公報)。在專利文獻1中使用雷射都卜勒血流儀來測定肌膚血流量的變化。
這樣，為了評價肌膚的健康狀態，需要測定皮膚的血流量。與前述的雷射都卜勒式血流儀同樣，使用雷射光的 多通道式血流儀(專利文獻2：日本專利第3783491號公報)、加壓式血流儀(專利文獻3：日本特開平11-285476號公報)也被用於肌膚的血流測定。然而，在測定時需要直接用血流量計測定受試者，為了測定遠方受試者的肌膚血流量，除非將測定裝置設置在受試者的住處附近或者受試者直接借調到測定裝置的設置場所，否則就不可能測定。
[先前技術文獻] (專利文獻)
[專利文獻1] WO2005/077458號公報
[專利文獻2] 日本專利第3783491號公報
[專利文獻3] 日本特開平11-285476號公報
如上所述，為了能夠間接地評價遠方受試者的血流狀態，期望使用從受試者採集的角質層來間接地測定或評價血流量。
本發明的課題係提供不是外科摘取皮膚而對皮膚帶來刺激等的方法，而是可簡便且確實地測定或評價血流狀態的使用生物化學指標的新穎的測定或評價方法。
本發明為以下的構成。
(1)一種皮膚血流量的間接測定或評價方法，其係以皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑及/或白細胞介素-1 α的表現量作為指標。
(2)如(1)所述的方法，其中，用於測定或評價方法的皮膚角質層係藉由膠帶剝離法進行採集。
(3)一種方法，其係從基於預先測定的血流量與皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑及/或白細胞介素-1 α的表現量的相關性所製作的相關式來間接測定皮膚的血流量。
(4)一種皮膚血流量的間接測定法，其係由下列步驟構成：採集角質層的採集步驟；測定前述採集步驟中所採集的角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-1 α的表現量的測定步驟；以及將前述測定步驟中所測定的白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-1 α的表現量藉由下述回歸式換算成皮膚血流量的步驟，前述回歸式為從預先測定的集團角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-1 α的表現量分佈求出的得到血流量相關的回歸式。
(5)一種皮膚血流量的評價方法，其係與基於預先測定的血流量與皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑及/或白細胞介素-1 α的表現量的相關性所製作的散點圖進行對比來評價。
(6)一種皮膚血流的評價方法，其係由下列步驟構成：採集角質層的採集步驟；測定前述採集步驟中所採集的角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-1 α的表現量的測定步驟；以及將前述測定步驟中所測定的白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-1 α的表現量與預先測定的 集團角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-1 α的表現量分佈進行比較的比較步驟。
根據本發明的方法，皮膚血流的測定或評價可藉由測定角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量來間接地測定或評價。
此外，由於本發明的方法係藉由膠帶剝離法等簡便的操作方法來採集評價試樣，所以受試者的負擔少，無論是誰均可簡單地進行評價。
由於特別是使用從遠方受試者採集的樣品，例如，藉由膠帶剝離法的角質層可簡便間接地評價肌膚血流量或者血流的狀態，所以不需要受試者直接來試驗場所。這樣的話，成為血流量測定對象的適用範圍廣，可簡便地診斷或評價皮膚的狀態。
進而，不需要用血流量計直接測定受試者，即使為遠方的受試者只要可得到角質層就可簡便地測定或評價皮膚血流量。
進而，根據本發明的方法可客觀地評價肌膚狀態、化妝品等的效果。
第1圖為將皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1RA)和與皮膚血流量成比例的相對輸出量(relative output amount)(V)的測定結果製成散點圖並求出了回歸直 線的圖。
第2圖為將皮膚角質層中的白細胞介素-1 α(IL-1 α)和與皮膚血流量成比例的相對輸出量(V)的測定結果製成散點圖並求出了回歸直線的圖。
本發明為關於皮膚血流量的間接測定或評價方法的發明，其特徵係以皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑及/或白細胞介素-1 α的表現量作為指標。
以下，關於本發明進行詳細說明。
本發明的血流量的測定或評價方法的特徵係，以皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑(以下，叫做IL-1RA)或白細胞介素-1 α(以下，叫做IL-1 α)的表現量作為指標。
本發明中的血流量是指用雷射都卜勒血流量計測定的皮膚微血管內的血流量。發現用雷射都卜勒血流量計測定的血流量與皮膚角質層中的IL-1RA或IL-1 α的表現量相關。因此，藉由測定IL-1RA或IL-1 α的皮膚角質層中的表現量，可間接地對皮膚血流量或皮膚血流狀態進行評價。
IL-1RA是單核細胞、巨噬細胞等產生的抗炎症性的細胞介素，在炎症時增加並使皮膚正常化。IL-1RA拮抗性地阻礙白細胞介素-1的功能。在細胞水平IL-1RA增加時，作為分解並片段化膠原蛋白的酶的基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1)減少。
IL-1 α是單核細胞、巨噬細胞等產生的促炎症性的細胞介素，活化淋巴細胞、巨噬細胞並引起炎症。 IL-1RA拮抗性地阻礙白細胞介素-1的功能。已知IL-1 α增加時，作為分解並片段化膠原蛋白的酶的基質金屬蛋白酶-1增加。
角質層是位於皮膚最上層的組織，具有保護皮膚不受來自體外的異物、刺激的功能。
本發明中的測定或評價對象部位只要是可取得角質層的部分，則還可包含任意部位，作為主要的部位，可列舉臉部、頸部、上臂部。可根據以往的方法得到來自上述部位皮膚的角質層。然而，如前所述，由於外科摘取皮膚等的方法會給使用者帶來負擔，所以較佳係膠帶剝離法、刮擦等可簡便地得到角質層的方法。特佳係膠帶剝離法。
這樣準備的各試樣中的IL-1RA或IL-1 α的表現量可用以往已知的方法進行測定。例如，可使用基於與針對IL-1RA或IL-1 α的抗體的反應之酶免疫測定法(enzyme immunoassay)、放射免疫測定法、西方墨點法(Western blotting)等的方法。這樣的測定手段已有市售，作為代表性的IL-1RA的酶免疫測定試劑盒，可例示R&D Systems製的Human IL-1RA/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit、Life Technologies公司製的IL-1RA Human ELISA Kit。
另外，作為代表性的IL-1 α的酶免疫測定試劑盒，可例示R&D Systems製的Human IL-1 α/IL-1F1 Quantikine ELISA Kit、Thermo Scientific公司製的Human IL-1 alpha ELISA Kit。
從各試樣中將IL-1RA、IL-1 α藉由其自身已知的生物 化學方法，例如凍融法、超音波破碎法、均質法等作為可溶性組分進行萃取。萃取後迅速地進行測定。
由於皮膚血流量多的人的角質層中的IL-1RA表現量高於皮膚血流量少的人的角質層中的IL-1RA表現量，所以可將角質層中的IL-1RA表現量的多寡作為指標，簡便地測定或評價皮膚血流量的多寡。
另外，由於皮膚血流量多的人的角質層中的IL-1 α表現量低於皮膚血流量少的人的角質層中的IL-1 α表現量，所以可將角質層中的IL-1 α表現量的多寡作為指標，簡便地評價皮膚血流量的多寡。
本發明所使用的角質層可藉由膠帶剝離法這樣的用角質層膠帶僅採集角質層的表層部分的簡單方法進行採集。因此不會給受試者帶來負擔，可測定受試者的皮膚血流量或評價皮膚的血流狀態。
本發明的皮膚血流量的測定方法由以下步驟構成：採集角質層的採集步驟；測定前述採集步驟中所採集的角質層中的IL-1RA、IL-1 α的表現量的測定步驟；以及將前述測定步驟中所測定的IL-1RA、IL-1 α的表現量藉由下述回歸式換算成皮膚血流量的步驟，前述回歸式即為從預先測定的集團角質層中的IL-1RA、IL-1 α的表現量分佈求出的得到血流量相關的回歸式。
本發明的皮膚血流量的評價方法由以下步驟構成：採集角質層的採集步驟；測定前述採集步驟中所採集的角質層中的IL-1RA、IL-1 α的表現量的測定步驟； 以及將前述測定步驟中所測定的IL-1RA、IL-1 α的表現量與預先測定的集團角質層中的IL-1RA、IL-1 α的表現量分佈進行比較的比較步驟。受試者的IL-1RA表現量與預先測定的集團角質層中的IL-1RA表現量分佈相比，當表現量多時，判定為皮膚的血流量大，當表現量少時，判定為皮膚的血流量小。受試者的IL-1 α表現量與預先測定的集團角質層中的IL-1 α表現量分佈相比，當表現量多時，判定為皮膚的血流量小，當表現量少時，判定為皮膚的血流量大。
以下，對具體的實施例進行說明，但本發明不限定於下述實施例。
(實施例)
試驗例1
受試集團的皮膚血流量的測定結果與IL-1RA表現量測定結果的分佈相關。
<受試者>
將75名健康女性臉頰的角質層藉由膠帶剝離法進行採集。
<角質層樣品萃取方法、蛋白質定量>
在受試者的臉頰貼上角質層測試片(ASAHIBIOMED公司製)來採集角質層。從角質層測試片使用珠磨法(在容器中加入受試物、直徑約2mm的玻璃珠和萃取液進行振盪萃取的方法)使用500μl的T-PER萃取緩衝液(Tissue Protein ExtRAction Reagent Thermo Scientific製(product# 78510)來進行角質層蛋白質的萃取。各樣品的蛋白質量藉由Pierce BCA protein Assay Kit(Thermo Scientific #23225)進行測定。測定時，在10μl之前述角質層蛋白質萃取液中加入200μl之Pierce BCA protein Assay Kit的反應試劑液，在60℃孵育30分鐘後，測定562nm處的吸光度。同時，用BSA(牛血清白蛋白)製作標準曲線，從吸光度的值計算蛋白質量。
<角質層中的IL-1RA的表現量測定>
同樣地將從膠帶萃取的角質層蛋白質萃取液中的IL-1RA表現量使用R&D systems的ELISA試劑盒[Human IL-1RA/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit]進行測定。首先，在costar製的96孔板(#3590)中將成為初次抗體的固相化抗體以試劑盒指定的濃度在20℃過夜進行固相化。接著，用1% BSA在37℃下放置1小時來封閉(blocking)培養板，並用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，將各100μl之成為標準曲線的標準品及樣品進行加樣，在25℃孵育2小時。用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，將2次抗體以試劑盒指定濃度在25℃下孵育2小時。進而，用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，將Streptavidin-HRP以試劑盒指定濃度在25℃下孵育30分鐘。最後，用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，按照100μl/well加入作為顯色基質的TMB solution(Promega,G7431))，經過試劑盒指定的時間後，加入100μl之終止液(0.5M硫酸)，測定450nm處的吸光度來計算IL-1RA的表現量。
<皮膚血流量的測定>
使用雷射都卜勒血流量計(Lisca Ab製PIMII Laser Doppler Perfusion Imager)測定與受試者臉頰的血流量成比例的相對輸出量(V)。
<結果>
X軸作為IL-1RA表現量、Y軸作為與血流量成比例的相對輸出量(V)將測定結果製成散點圖，以該散佈數據為基礎求出直線回歸式。散點圖及回歸直線、相關係數、相關式如第1圖所示。
X軸作為IL-1RA值、Y軸作為與血流量成比例的相對輸出量(V)時，回歸式表示Y=0.005110+0.4434、R2=0.0703、相關係數0.27的直線回歸。
可從第1圖所示的回歸直線或回歸式將測定的IL-1RA換算成與血流量成比例的相對輸出量(V)。此外，從散點圖判明與標準的皮膚血流量成比例的相對輸出量(V)的分佈。只要基於該散點圖及回歸式，藉由測定皮膚角質層中的IL-1RA的表現量，皮膚的血流量即可知，而且從分佈可評價受試者的血流量是否正常。
試驗例2.
與受試集團的皮膚血流量成比例的相對輸出量(V)的測定結果和IL-1 α的表現量測定結果的分佈相關
<受試者>
將73名健康女性臉頰的角質層藉由膠帶剝離法進行採集。
<角質層樣品萃取方法、蛋白質定量>
與IL-1RA的測定同樣地進行測定。
<角質層中的IL-1 α的測定>
與試驗例1同樣地將從膠帶萃取的角質層蛋白質萃取液中的IL-1 α表現量使用R&D systems的ELISA試劑盒[Human IL-1 α/IL-1F1 Quantikine ELISA Kit]進行測定。首先，在costar製的96孔板(#3590)中將成為初次抗體的固相化抗體以試劑盒指定的濃度在20℃過夜進行固相化。接著，用1%BSA在37℃下放置1小時來封閉培養板，並用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，將各100μl之成為標準曲線的標準品及樣品進行加樣，在25℃孵育2小時。用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，將2次抗體以試劑盒指定濃度在25℃下孵育2小時。進而，用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，將Streptavidin-HRP以試劑盒指定濃度在25℃下孵育30分鐘。最後，用0.01% Tween-PBS洗淨培養板後，按照100μl/well加入作為顯色基質的TMB solution(Promega,G7431)，經過試劑盒指定的時間後，加入100μl之終止液(0.5M硫酸)，測定450nm處的吸光度並計算表現量。
<皮膚血流量的測定>
與試驗例1同樣，使用雷射都卜勒血流量計(Lisca Ab製PIMII Laser Doppler Perfusion Imager)測定與受試者臉頰的血流量成比例的相對輸出量(V)。
<結果>
X軸作為IL-1 α表現量、Y軸作為血流量將測定結果 製成散點圖，以該散佈數據為基礎求出直線回歸式。散點圖及回歸直線、相關係數、相關式如第2圖所示。
X軸作為IL-1 α值、Y軸作為與血流量成比例的相對輸出量(V)時，回歸式表示Y=-0.1873X+0.5681、R2=0.0912、相關係數0.30的負的直線回歸。
可從第2圖所示的回歸直線或回歸式將測定的IL-1 α換算成血流量。此外，從散點圖判明了標準的皮膚血流量的分佈。只要基於該散點圖及回歸式，藉由測定皮膚角質層中的IL-1 α的表現量，皮膚的血流量即可知，而且從分佈可評價受試者的血流量是否正常。

Claims (5)

  1. 一種皮膚血流量的間接測定或評價方法，其係以藉由膠帶剝離法採集到之皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量作為指標。
  2. 一種皮膚血流量的間接測定方法，其係從基於血流量與皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量的相關性預先所製作的相關式，藉由測定以膠帶剝離法採集到之皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量來間接測定皮膚的血流量。
  3. 一種皮膚血流量的間接測定法，其係由下列步驟構成：藉由膠帶剝離法採集角質層的採集步驟；測定前述採集步驟中所採集的角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量的測定步驟；以及將前述測定步驟中所測定的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量藉由回歸式換算成皮膚血流量的步驟，前述回歸式為從集團角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量與血流量之分佈預先求出的回歸式。
  4. 一種皮膚血流量的評價方法，其係將基於血流量與皮膚角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量的相關性預先所製作的散點圖與對藉由膠帶剝離法採集到之皮膚角質層所測定的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量進行對比來做評價。
  5. 一種皮膚血流的評價方法，其係由下列步驟構成：藉由膠帶剝離法採集角質層的採集步驟；測定前述採集步驟中所採集的角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量的測定步驟；以及將前述測定步驟中所測定的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量、與預先測定的集團角質層中的白細胞介素-1受體拮抗劑或白細胞介素-1 α的表現量和血流量之分佈進行比較的比較步驟。
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