TWI634209B - 癌相關纖維母細胞用於維持癌幹細胞之幹性 - Google Patents

Abstract

一種體外共同培養系統，包含癌相關纖維母細胞(cancer associated fibroblasts，簡稱CAFs)以及癌細胞，用於生產或維持癌幹細胞及判定能使癌細胞幹性降低之藥劑的用途。本發明亦揭露一旁泌素機制，係經由癌相關纖維母細胞促進生產及/或維持癌幹細胞，並利用該機制預測患者之預後，且可用於分辨癌症患者對於特定治療的可能反應。

Description

癌相關纖維母細胞用於維持癌幹細胞之幹性

本發明係關於一種體外維持癌幹細胞之幹性的方法，特別係關於一種體外共同培養系統，以維持癌幹細胞之幹性的方法。

肺癌是全球最普遍的致命性惡性腫瘤，Siegel et al.,CA Cancer J Clin 62,10-29(2012)。由於在肺癌之驅動基因(driver gene)的成功辨識以及專一性標靶治療，許多肺癌患者有良好的起始反應(initial responses)。然而，大多數的患者在一年內還是會對於藥物產生抗藥性並復發，Kobayashi,et al.N Engl J Med 352,786-792(2005)；and Sequist,et al.,J Clin Oncol 25,587-595(2007)。傳統抗癌策略大部份為作用於非專一型的癌細胞，然而固態腫瘤代表一種有組織的、異質性的細胞群體。Egeblad,et al.,Dev Cell 18,884-901(2010)。形成腫瘤微環境(或稱利基(niche))之複雜的細胞-細胞交互作用，係包含了稱為癌幹細胞/癌起始細胞(cancer stem/initiating cells，簡稱CSCs)的一個小細胞群體。這些癌症幹細胞被認為是大多數惡性腫瘤進程的原因，並且癌幹細胞與癌利基在癌症復發、轉移及抗藥性上扮演重要的角色，Eramo,et al.,Oncogene 29,4625-4635(2010)；Joyce,et al.,Nat Rev Cancer 9,239-252(2009)；Reya,et al.,Nature 414,105-111(2001)；and McCarthy,Nat Rev Cancer 12,152-153(2012)。因此，找出標靶於腫瘤微環境或是癌症幹細胞的藥物被認為是新一代的抗癌策略，Mitra,et al.,Cancer Sci.103,400-407(2012)；Vaiopoulos,et al.,Stem Cells 30,363-371(2012)； Malanchi,et al.,Nature 481,85-89(2012)；Zhang,et al.,Cell 148,259-272(2012)。

癌幹細胞理論係基於腫瘤中存在於一種致癌性類幹細胞(tumorigenic stem-like cells)亞群體的存在，該細胞具有多潛能性與非對稱分裂能力，使得這些細胞可自我更新、分化為特定細胞種類並發展為癌症，Reya et al.,2001；and Wang,et al.,Trends Cell Biol 15,494-501(2005)。癌幹細胞幹性之表型即為腫瘤生成背後的趨動力(Eramo et al.,2010)，且癌幹細胞也被認為與化學治療或放射治療之抵抗性及癌症轉移具有極大的關聯性(Malanchi ,et al.Nature 481,85-89(2012)；Pardal,et al.,Nat Rev Cancer 3,895-902(2003)以及Clevers,et al.,Nat Med 17,313-319(2011))。越來越多的證據顯示癌幹細胞不僅存在於血液腫瘤如白血病中，也存在於許多的固態腫瘤中，包括肺癌。Zhang , et al.Cell 148,259-272(2012)；Kim,et al.Cell 121,823-835(2005)；以及Eramo,et al.Cell Death Differ 15,504-514(2008)。雖然肺癌幹細胞可經由專一性標誌從側群細胞(side populations，簡稱SPs)中分離出來，或其他專一性標誌例如CD 133與乙醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase，簡稱ALDH)(Ho,et al.,Cancer Res 67,4827-4833(2007)；Vermeulen,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 105,13427-13432(2008)；and Sullivan,et al.Cancer Res 70,9937-9948(2010))，然而體外難以維持癌幹細胞的幹性特徵，因而不利於對癌幹細胞深入研究(Ho et al.,2007；and Bertolini et al.,2009)。大多數的幹細胞(例如胚胎幹細胞，包括多能幹細胞甚至是肺幹細胞)為維持一個靜止狀態(quiescent state)，其依賴與該微環境直接接觸或是餵養細胞(feeder cells)的存在，Fuchs et al.,2004；Sneddon et al.,2007；Ling,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 103,9530-9535(2006)；Takahashi,et al.,Cell 126,663-676(2006)；Thomson et al.,1998；and Williams,et al.Nature 336,684-687(1988)。有趣的是，最近的研究發現也指出腫瘤微環境 可以透過發炎性或是轉化生長因子β(transforming growth factor-beta，簡稱TGF-β)訊號，可能促進腫瘤形成性，Chaffer,et al.Cell 154,61-74(2013)；Schwitalla et al.,2013；and Ghajar,et al.Nat Cell Biol 15,807-817(2013)。在人類肺癌中，腫瘤微環境含有大量的癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblasts，簡稱CAFs)。Kalluri et al.,2006。癌相關纖維母細胞與正常纖維母細胞有不同的形態與功能，且在癌生成期間他們被活化並與癌細胞交互作用(cross-talk)，Kojima,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 107,20009-20014(2010)；and Bremnes,et al.J Thorac Oncol 6,209-217(2011)。此種交互作用有助於產生幫助腫瘤成長以及轉移的利基，Orimo,et al.Cell 121,335-348(2005)；Albini,et al.Nat.Rev.Cancer 7,139-147(2007)；Kalluri,et al.J.Clin.Invest.119,1420-1428(2009)；Thiery,et al.Cancer Res.72,1416-1427(2012)；Giannoni,et al.Cancer Res.70,6945-6956(2010)。

在本發明之揭露中，從臨床癌症患者而來的癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast，簡稱CAF)顯示出對於維持並強化癌幹細胞(cancer stem cells，簡稱CSCs)之群體，對於=形成球體之初代肺癌幹細胞是很重要。這個癌幹細胞/癌相關纖維母細胞共同培養系統對於之後在腫瘤微環境維持癌幹性(cancer stemness)、癌細胞分化訊號之研究、以及甚至是抗癌幹細胞藥物的研發，是非常有助益的。最重要的是，本發明揭露癌幹細胞的生長，係由癌相關纖維母細胞之一種旁泌素(paracrine)機制經由IGF-II/IGF1R/Nanog途徑所調節。尤其利用一特定抗體或抑制劑抑制IGF1R訊號，可抑制癌症幹性與腫瘤生長。最後，這個結果在80位非小細胞肺癌(NSCLC)第I期患者中得到支持，並確定了在肺癌進程上IGF-II/IGF1R/Nanog旁泌素訊號在病理生理學的意義。總而言之，這些發現顯示腫瘤微環境中癌相關纖維母細胞在維持癌症幹性上扮演一個重要的角色。

因此，本發明提供一種體外生產或維持癌幹細胞的方法、體外共同培養系統、以及用於判定候選藥物是否能夠降低癌細胞之幹性、評估癌症患者存活率之方法、以及用於實行前述方法之套組。

本發明之一目的係提供一種體外共同培養系統，包含癌相關纖維母細胞(cancer associated fibroblasts，簡稱CAFs)以及一癌細胞群體，其中該癌相關纖維母細胞為CD90⁺，且在該共同培養系統中該癌相關纖維母細胞維持癌細胞之幹性(stemness)。例如，該體外共同培養系統可包含癌幹細胞，其為Oct3/4⁺與Nanog⁺。在一些實施例中，該些癌相關纖維母細胞取自一癌症患者，例如一肺癌患者、一乳癌患者、一腎癌患者、一前列腺癌患者、一卵巢癌患者、一皮膚癌患者、一子宮頸癌患者、一結腸直腸癌患者、一肝癌患者、一黑色素瘤患者、一口腔癌患者、或是一胰臟癌患者。在一實施例中，該癌症患者為一非小細胞肺癌患者。

該癌細胞群體可選擇地或額外地包含肺癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、子宮頸癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝癌細胞、黑色素瘤細胞、口腔癌細胞、或是胰臟癌細胞。在一實施例中，該癌細胞為非小細胞肺癌細胞。

本發明之另一目的係提供一種體外生產或維持癌幹細胞之方法，該方法包含：(i)提供一癌細胞群體；(ii)提供CD90⁺癌相關纖維母細胞；以及(iii)共同培養該幹細胞之群體與該癌相關纖維母細胞，以於該共同培養中生產或維持癌幹細胞，其可為Oct3/4⁺與Nanog⁺細胞。

該癌細胞群體可來自一已建立的癌細胞株。該癌細胞群體可選擇地為取自一癌症患者之初代癌細胞。該癌細胞群體可包括但不限於肺癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、子宮頸癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝癌細胞、黑色素瘤細胞、口腔癌細胞、 或是胰臟癌細胞。在一實施例中，該癌細胞群體包含非小細胞肺癌細胞。

該癌相關纖維母細胞可取自一癌症患者，包含但不限於一肺癌患者、一乳癌患者、一腎癌患者、一前列腺癌患者、一卵巢癌患者、一皮膚癌患者、一子宮頸癌患者、一結腸直腸癌患者、一肝癌患者、一黑色素瘤患者、一口腔癌患者、或是一胰臟癌患者。在一實施例中，該癌相關纖維母細胞取自一非小細胞肺癌患者。該癌相關纖維母細胞可選擇地來自一已建立之癌相關纖維母細胞株。

進一步地，本發明提供一種判定一抗癌藥物之方法，包含：(i)將癌細胞與癌相關纖維母細胞在一候選藥物之存在下共同培養，其中該癌相關纖維母細胞為CD90⁺；(ii)評估該共同培養中癌細胞之幹性程度，以及(iii)若與未有該候選藥物之共同培養相較，該候選藥物存在之共同培養中癌幹細胞之幹性程度減少，則判定該候選藥物為一抗癌藥物。

該癌細胞可來自一已建立之癌細胞株。該癌細胞可選擇地取自一癌症患者之初代癌細胞。在一些實施例中，該癌細胞為肺癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、子宮頸癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝癌細胞、黑色素瘤細胞、口腔癌細胞、或是胰臟癌細胞。在一實施例中，該癌細胞為非小細胞肺癌細胞。

該癌相關纖維母細胞可取自一癌症患者，例如，一肺癌患者、一乳癌患者、一腎癌患者、一前列腺癌患者、一卵巢癌患者、一皮膚癌患者、一子宮頸癌患者、一結腸直腸癌患者、一肝癌患者、一黑色素瘤患者、一口腔癌患者、或是一胰臟癌患者。在一實施例中，該癌症患者為一非小細胞肺癌患者。該癌相關纖維母細胞可選擇地為一已建立之癌相關纖維母細胞株。

本發明之任一方法中，癌細胞之幹性程度係以共同培養中癌 幹細胞之數量表示，其中該癌幹細胞為Oct3/4⁺與Nanog⁺。癌細胞之幹性程度可選擇地或額外地以共同培養中癌細胞之抗藥性表示。在另一實施例中，癌細胞之幹性的程度，以癌相關纖維母細胞中一或多個的IGF-II、HGF、LIF、及SDF1之表現程度、癌細胞中一或多個的IGF1R、IGF2R、LIFR、CXCR4、及Nanog之表現程度，或其二者之組合表示。在另一實施例中，癌細胞之幹性程度，以共同培養之癌細胞群落中癌幹細胞數與總細胞數之比例表示。

此外，本發明提供一種評估一癌症患者存活率的方法，該方法包含：(i)提供一癌症患者之腫瘤組織；(ii)量測該腫瘤組織之癌相關纖維母細胞中IGF-II之表達程度；(iii)量測該腫瘤組織之癌細胞中IGF1R、Nanog或其二者之組合的表達程度；以及(iv)基於癌相關纖維母細胞中IGF-II之表達程度以及癌細胞中IGF1R、Nanog或其二者之組合的表達程度，評估該癌症患者之存活率。若IGF-II之表達程度及IGF1R、Nanog或其二者之組合的表達程度高於預定值時，表示該患者之存活率不佳。若IGF-II之表達程度及IGF1R、Nanog或其二者之組合的表達程度低於預定值時，表示該患者之存活率良好。

在一些實施例中，IGF-II之表達程度及IGF1R、Nanog或其二者之組合的表達程度以免疫組織化學法(Immunohistochemistry)量測。該存活率可為整體存活率或無復發存活率。

該癌症患者可患有肺癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝癌、黑色素瘤、口腔癌、或是胰臟癌。在一實施例中，該患者患有非小細胞肺癌。

本發明亦提供一種評估癌細胞幹性的套組，包含：(i)一第一試劑，係用於偵測IGF-II、HGF、LIF、SDF1、DLL1、Jagged1、IBP5、 thrombospondin1、PLAU、或Decorin，以及(ii)一第二試劑，係用於偵測IGF1R、IGF2R、LIFR、CXCR4、HGFR、Notch3、或Nanog。該第一試劑、該第二試劑或二者可為抗體。在一些實施例中，該第一試劑為一種對IGF-II具有專一性之抗體。該第二試劑可選擇地或額外地為一種對IGF1R或Nanog具有專一性之抗體。

在一實施例中，該第二試劑為一種對IGF1R具有專一性的抗體。該套組可進一步包含一偵測Nanog之第三試劑，例如，一種抗Nanog抗體。

進一步地，本發明亦提供一種治療肺癌的方法，包含將一有效劑量之抗肺癌藥物施予一需要的個體，其中該個體為一肺癌患者，係具有癌相關纖維母細胞的IGF-II高表達程度以及癌幹細胞的IGF1R或Nanog高表達程度。該抗肺癌藥物為一種干擾IGF-II/IGF1R訊號途徑之藥物。在一些實施例中，該藥物是一種專一性結合IGF-II或IGF1R之抗體。

本發明亦揭露一種用於評估癌細胞幹性之以影像為基礎的高通量分析(high content assay)，該分析包含：(i)提供一包含癌細胞與癌相關纖維母細胞之樣本；(ii)把一第一試劑染色該樣本，以偵測Nanog，其中該第一試劑係直接或間接地與一第一標誌結合；(iii)把一第二試劑染色該樣本，以偵測CD90，其中該第二試劑係直接或間接地與一第二標誌結合，該第二標誌與該第一標誌不相同；(iv)將利用該第一試劑與該第二試劑染色的樣本擷取影像；以及(v)基於該第一標誌與該第二標誌所釋放之訊號，評估該樣本中癌細胞之幹性。該第一標誌、該第二標誌、或其二者可為螢光染劑。該高通量分析可進一步包含將該樣本利用一第三試劑染色，以偵測核酸，該第三試劑可為DAPI。在一些實施例中，該第一試劑、該第二試劑、或其二者為抗體。

在一些實施例中，步驟(ii)把該樣本與該第一試劑反應，該第一試劑係為對Nanog具有專一性之抗體，以及把與該樣本鍵結之抗體結合至一具有TRITC標誌之二級抗體。在一些實施例中，該第二試劑可為一具有FITC標誌之抗CD90抗體。

在一些實施例中，步驟(v)判定癌細胞群落並評估一或多個癌細胞群落之幹性，係以每一癌細胞群落中Nanog-陽性細胞數與總細胞數之比例表示。

本發明提及之任何以影像為基礎的高通量分析中，該樣本為癌細胞與癌相關纖維母細胞之共同培養。該共同培養可進一步包含一候選化合物，且該分析可進一步包含決定該候選化合物是否為一抗癌藥物，其中在該候選藥物的存在下相對於未有該候選藥物的存在下，癌細胞之幹性呈現一降低的程度，表示該候選藥物為一抗癌藥物。

該樣本中的癌細胞可為肺癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、子宮頸癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝癌細胞、黑色素瘤細胞、口腔癌細胞、或是胰臟癌細胞。在一實施例中，該癌細胞為非小細胞肺癌細胞。

本發明一或多個實施例之詳細內容，將於之後說明。經由本發明之圖式、含有數個實施例之實施方式、以及所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將為明白易見。

第一圖包含癌相關纖維母細胞或正常纖維母細胞作為餵養細胞對於促進腫瘤生成於促進肺癌細胞幹性標誌之示意圖。(a)：顯示A549與EKVX肺癌細胞株與癌相關纖維母細胞或正常纖維母細胞共同培養之群落 形成能力的照片和圖表。比例尺為100μm。(b)：顯示有或無與正常纖維母細胞或癌相關纖維母細胞共同培養之A549與EKVX細胞中幹細胞標誌Oct3/4及Nanog之RT Q-PCR分析的圖表。(c)：顯示有或無與癌相關纖維母細胞共同培養之A549與EKVX細胞內Nanog經免疫螢光染色之照片。比例尺為100μm。(d)：顯示A549與EKVX細胞之PKH26滯留分析(retention assay)的照片。比例尺為100μm。(e)：顯示與癌相關纖維母細胞共同培養之肺癌細胞株(CL141、CL83、CL25與CL152)初代培養照片。比例尺為200μm。(f)：顯示有或無癌相關纖維幹細胞共同培養之CL141、CL83、CL25與CL152細胞內幹細胞標誌Nanog之RT Q-PCR分析的圖表(N=3)。(g)：顯示衍生自與癌相關纖維母細胞培養2~10天之成球體肺癌組織中之肺癌幹細胞(CLS1)之照片及圖表(上圖)。CLS1細胞中Oct3/4、Sox2與Nanog表達之RT Q-PCR分析(下圖)(N=3)。(h)：顯示CLS1細胞與癌相關纖維母細胞之免疫螢光特徵的照片。比例尺為100μm。(I)顯示癌相關纖維母細胞之表面標誌的圖表。

第二圖包含顯示肺癌幹細胞(CLS1)在與癌相關纖維母細胞餵養細胞共同培養下，維持癌症幹性與具有高度腫瘤形成性之圖表，在未與癌相關纖維母細胞共同培養時，肺癌幹細胞分化成較少的腫瘤形成癌細胞。(a)：顯示在移除癌相關纖維母細胞後，已分化癌細胞會喪失其癌症幹性之示意圖。(b)：顯示QT-PCR分析之示意圖，係確認幹性標誌Nanog與Oct3/4在離開癌相關纖維母細胞存在下繼續培養的CLS1細胞內隨著培養代數增加而顯著降低(從P1至P14)。(c)：顯示有(CLS1/CAF)或無(CLS1)與癌相關纖維母細胞培養5天之CLS1細胞中Oct3/4之免疫螢光照片。箭頭顯示在移除癌相關纖維母細胞後，喪失Oct3/4染色之腺型CLS1細胞。比例尺為50μm。(d)：顯示CLS1/CAF 自發性肺轉移腫塊(nodules)(N=15隻小鼠)的照片，以及CLS1異種移植腫瘤(上方)，腫瘤以H&E染色(下方)。比例尺為100μm。(e)：顯示衍生自與癌相關纖維母細胞共同培養之CLS1球體，經注射方式之異種移植腫瘤(皮下注射並自發性肺轉移腫瘤)內Oct3/4與Nanog表達之IHC分析的照片。比例尺為50μm。

第三圖包括顯示分化的肺癌細胞可經由與癌相關纖維母細胞共同培養而去分化並再獲得類似幹性之圖表。(a)：顯示RT Q-PCR分析之圖表，係為評估有或無與癌相關纖維母細胞培養之CLS1 p.12及CLS1 p.27細胞的幹性標誌Nanog與Oct3/4(N=3)。(b)：顯示小鼠從CLS1/CAF共同培養之異種移植腫瘤的生成率照片及圖表(N=6隻小鼠)。比例尺為200μm。(c)：顯示小鼠異種移植腫瘤之生成率的圖表。(d)顯示RT Q-PCR分析之圖表，係為評估有或無與癌相關纖維母細胞培養之ALDH-CLS1細胞內幹性標誌Nanog與Oct3/4的表達(N=3)。(e)：圖表顯示有或無與癌相關纖維母細胞培養之ALDH-CLS1細胞的ALDH活性。

第四圖包括顯示癌幹細胞與癌相關纖維母細胞交互作用(crosstalk)中的旁泌素機制與相對應受體途徑之圖表。(a)：顯示有或無與癌相關纖維母細胞培養之癌幹細胞(CLS1)，其差異性表達基因之階層式分群(hierarchical clustering)圖表。(b)：顯示旁泌素調節途徑之RT Q-PCR驗證的圖表。(c)：顯示以共培養細胞中收集之條件培養基培養的CLS1細胞內其幹細胞標誌Nanog經由RT Q-PCR分析的圖表。(d)：顯示細胞激素抗體陣列之圖表，該細胞激素抗體陣列是用於檢驗癌相關纖維母細胞或是有/無與癌相關纖維母細胞於無血清RPMI培養基中共同培養24小時之CLS1細胞分泌的生長因子。(e)：顯示細胞激素表達程度之半量化結果的圖表，以一熱區圖(heat map)表示。(f)：顯 示RT Q-PCR分析CLS1細胞中幹細胞標誌Nanog之圖表(N=3)。(g)顯示CLS1細胞中幹細胞標誌Nanog之RT Q-PCR分析的圖表(N=3)。(h)免疫螢光之照片，顯示IGF1R與IGF-II在CLS1細胞與癌相關纖維母細胞內的差異性定位(differentially localize)。在肺癌幹細胞內IGF1R染色(紅色，上圖)。CD90陽性的癌相關纖維母細胞(綠色)顯示IGF-II染色(紅色，下圖)。細胞核以DAPI染色(藍色；N=3)。比例尺為50μm。(i)：顯示RT Q-PCR分析癌相關纖維母細胞內IGF-II之圖表，該癌相關纖維母細胞係取自患者，並分為有或無與癌細胞之組別培養(A549細胞的N=6，而EKVX細胞的N=9)。(j)：顯示分為有或無與癌相關纖維母細胞培養之癌細胞(A549或EKVX)內IGF1R，以RT Q-PCR分析的圖表，其中癌相關纖維母細胞取自患者(N=4位患者)。(k)：顯示癌幹細胞與癌相關纖維母細胞之間串擾的示意圖。

第五圖包括顯示IGF-II/IGF1R/Nanog途徑參與微環境旁泌素訊號，可維持肺癌幹細胞之幹性的圖表。(a)：顯示四種不同的肺癌細胞株(CLS1、A549、H1975及H460)經過IGF-II(100ng/ml)處理後之幹細胞標誌Nanog的RT Q-PCR分析的圖表(N=3)。(b)：顯示在MCDB201培養基與EGF(20ng/ml)及bFGF(20ng/ml)培養21天後，以IGF-II(10與100ng/ml)處理的CLS1細胞球體形成能力(下圖)及形態(上圖)之照片及圖表。比例尺為100μm。(c)：顯示經IGF-II(10ng/ml)處理的CLS1細胞、與經IGF-II(100ng/ml)處理的初代細胞株(CL141與CL152細胞)內，於指定的時間點(0、10、30分鐘、以及1、2、6與24小時)，其IGF1R、AKT與Nanog表達之西方墨點分析的照片。(d)：顯示以IGF-II(10ng/ml)處理24小時之凌亂siRNA(scrambled siRNA；shLuc)細胞，其以Nanog為標靶之shRNA Nanog(shN1與shN2)蛋白質程度的照片，係以免疫墨點法檢驗。β-Actin用於作為內部控制組。(e)：顯示以IGF-II(10 ng/ml)處理的CLS1細胞之球體形成能力(球體數量，N=6；球體平均面積，N=10)與形態之照片與圖表，並於搭配EGF(20ng/ml)與bFGF(20ng/ml)之MCDB201培養基培養14天後Nanog專一性剔除之分析。比例尺為50μm。(f)：顯示以Nanog為標靶之shRNA細胞(shN1與shN2)或凌亂siRNA(shLuc)細胞內的Nanog蛋白質程度之照片，係經由免疫墨點法檢驗。β-Actin用於作為內部控制組。比例尺為200μm。(g)：顯示CLS1/CAF細胞形成的異種移植腫瘤之發生率的圖表，其中該CLS1/CAF細胞分為有或無以shRNA介導的Nanog剔除。腫瘤經由注射1,000 CLS1/CAF細胞而生成(N=8隻小鼠)。(h)：顯示由CLS1/CAF細胞形成的腫瘤體積之圖表，其中該CLS1/CAF細胞分為有或無Nanog剔除(N=8隻小鼠)。

第六圖包括顯示IGF-II/IGF1R訊號途徑作為抑制肺癌幹性與腫瘤形成性之標靶的圖表。(a)：顯示每一群落之Nanog陽性幹細胞之照片與圖表，係利用以影像為基礎的高通量分析(N=3)。比例尺為50μm。(b)：顯示CLS1細胞之球體形成形態與能力的照片與圖表(球體數量，N=6；球體平均面積，N=10)。比例尺為200μm。(c)：顯示ALDH活性之圖表，係利用流式細胞儀檢驗不同的肺癌細胞株(CLS1、A549、H1975與EKVX)而得，該些肺癌細胞株經IGF-II(100ng/ml)或IGF-II合併IGF1Rα Ab處理(N=3)。(e)：顯示CLS1細胞之IGF1R-p/IGF1R、AKT-p/AKT與Nanog之西方墨點法分析的照片，該些CLS1細胞係經由IGF-II(100ng/ml)或IGF-II合併IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理6小時(CLS1細胞)或24小時(CL141與CL152細胞)。(f)：顯示從CLS1/CAF細胞形成的異種移植發病率之照片與圖表。

第七圖包括顯示第I期非小細胞肺癌患者之癌相關纖維母細胞內IGF-II與IGF1R之臨床顯著性，以及癌細胞內Nanog之臨床顯著性的圖表。 (a)：顯示腫瘤組織中癌相關纖維母細胞中高與低IGF-II表達程度以及腫瘤細胞中高與低IGF1R/Nanog表達之患者比例的樹狀圖。(b)：顯示初代腫瘤樣本之連續切片的癌相關纖維母細胞內IGF-II與癌細胞內IGF1R/Nanog之IHC染色的照片。(c-d)：顯示患者為高或低IGF-II、GF1R與Nanog表達之圖(截止值=風險分數之中位數)。(e)：顯示經由合併癌相關纖維母細胞內IGF-II與癌細胞內IGF1R/Nanog表達程度結果的圖。

第八圖為癌相關纖維母細胞與肺癌幹細胞之間串擾的示意圖。

第九圖包括顯示癌相關纖維母細胞共同培養系統可作為維持肺癌幹性之平台的圖。(a)肺癌幹細胞(CLS1)與癌相關纖維母細胞共同培養10天，在不同的時間點形成類似腫瘤球體的形態(上方)。CLS1細胞內的幹細胞標誌Nanog與Oct3/4以RT Q-PCR分析，該CLS1細胞係為與癌相關纖維母細胞共同培養不同代數之細胞(下方)，結果係與癌相關纖維母細胞與已分化的CLS1細胞相較(N=3)。(b)由CLS1/CAF共同培養不同代數、不同細胞數注射入SCID小鼠，其小鼠異種移植腫瘤的發病率。

第十圖包括顯示已分化的CLS1細胞可經由再次與癌相關纖維母細胞共同培養而去分化的圖表。

第十一圖之圖表包括顯示癌幹細胞內關鍵訊號途徑的全基因組基因表達圖譜。

第十二圖包含顯示癌相關纖維母細胞與CLS1細胞潛在的旁泌素交互作用，經由即時RT Q-PCR驗證之圖表。

第十三圖包括顯示癌相關纖維母細胞經由與肺癌細胞共同培養，所引起的基因互相交互作用之圖表。

第十四圖包括顯示經由高通量分析判定癌幹細胞之步驟的圖表。(a)細胞核以DAPI染色，對利用以影像為基礎的高通量分析用於判定癌幹細胞群落很有幫助。(b)以影像為基礎之高通量分析顯示CLS1細胞之Nanog(+)群落形成能力在經過IGF-II(10 and 100ng/ml)處理後增加。

第十五圖包括顯示IGF-II在不同的肺癌細胞中誘導幹性的圖表。(a)以IGF-II(100ng/ml)處理的CLS1/CAFs細胞，其搭配ALDEFLUOR法之流式細胞儀分析。螢光強度係依據ALDH活性，以無DEAB測量(上圖)與有DEAB測量(下圖)。(b)以流式細胞儀檢驗四種不同的肺癌幹細胞株(CLS1/CAFs、A549、H1975、與EKVX)的ALDH活性，該些肺癌細胞株係經IGF-II(100ng/ml)處理。

第十六圖包括顯示以IGF1R中和抗體或是抑制不同肺癌幹細胞株之幹性以阻擾IGF1R訊號之圖表。(a)A549與EKVX細胞與癌相關纖維母細胞共同培養，並分為有或無IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理；測量每群落中Nanog陽性幹細胞之數量(N=3)。(b)每群落中Nanog陽性幹細胞係利用以影像為基礎的高通量分析測量。(N=3)(c)肺癌細胞株(包括A549與EKVX)之球體形成形態與能力。

第十七圖包括顯示於體外經由IGF1R酶抑制劑阻擾IGF1R訊號以抑制肺癌幹細胞之幹性的圖表。

癌幹細胞(Cancer stem cells，CSCs)為癌症治療的一個有前景的目標，但目前如何在體內維持癌幹細胞之可塑性仍然未知。更何況要於體外維持癌幹細胞之可塑性。本發明之揭露係基於建立維持主要培養Oct3/4(+)/Nanog(+)肺癌幹細胞，並以CD90(+)癌相關纖維母細胞餵養，以於腫瘤微環境維持癌幹細胞特性使之不會走向分化。進一步地，應用轉錄基 因體學以找出利基(niche)，並透過旁泌素機制(paracrine-network)經由去分化(dedifferentiation)及重新獲得(reacquisition)類幹細胞性質以支持並增加癌幹細胞之能力。特別是，癌相關纖維母細胞可透過於表達IGF-II，促進癌細胞內IGF1R訊號的活化。該IGF-II/IGF1R訊號誘導Nanog表達並促進肺癌細胞之幹性。此外，這個旁泌素訊號在早期(例如第I期)癌症患者(例如肺癌患者，如非小細胞肺癌細胞患者)中預測了整體存活率與非復發存活率。更有甚著，阻擾IGF-II/IGF1R訊號會抑制Nanog表達並降低癌幹細胞的特徵。本發明實施例之數據顯示癌相關纖維母細胞組成癌症幹性之支持性利基，並以阻斷此旁泌素訊號為目標可使癌症(例如非小細胞肺癌)有新的治療方式。

因此，本發明提供一種產生及/或維持癌細胞之幹性的體外共同培養系統，及該系統可用於開發降低癌細胞之幹性之候選藥物，而幫助臨床上有效治療癌症。本發明之範圍亦包含癌相關纖維母細胞/癌幹細胞之生物標誌，用於評估癌症患者之存活率以及用於判定癌症患者對以癌幹細胞為標靶之治療的反應，以及用於判定癌幹細胞之套組。進一步地，本發明提供一種用於判定一癌症樣本中癌幹細胞之高通量分析。

I.體外共同培養包含癌相關纖維母細胞與癌細胞可用以維持癌細胞之幹性

本發明為一種體外共同培養系統，包括癌相關纖維母細胞與癌細胞，其中癌相關纖維母細胞可促進癌細胞之幹性的維持。利用此體外共同培養系統為產生及/或維持癌幹細胞之方法，可應用於篩選降低癌細胞幹性之候選藥物。這裡所使用的「幹性(stemness)」一詞，係指一細胞能夠自我更新及具有分化生成不同表型癌細胞之特性。

癌幹細胞(Cancer stem cells，簡稱CSCs)為顯現類似幹性之癌細胞。癌幹細胞通常表現至少一種癌症的特徵，且能夠有能力產生至少一 種表型不同的癌細胞類型。此外，癌幹細胞能夠以對稱或不對稱方式複製。癌幹細胞可來源自癌細胞重獲得幹細胞之特性，或幹細胞獲得與癌細胞相關表型。此癌幹細胞可以為非基質(non-stromal)細胞型式存在於腫瘤中。

癌相關纖維母細胞為一群分離自腫瘤基質之纖維母細胞。癌相關纖維母細胞可為較大的、紡錘狀的間質細胞，其與平滑肌及纖維母細胞具有一些共同特徵。Kharaishvili et al.,Cancer Cell International 2014,14：41。他們通常具有過度增生能力的特徵，並具有分泌促進腫瘤生長之生長因子、胞外基質組成物、以及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteineases)的能力。

體外共同培養系統中，癌相關纖維母細胞可為取自一癌症患者(一個具有實體腫瘤之人類患者)之初代細胞，該癌症患者包括但不限於一肺癌患者、一乳癌患者、一腎癌患者、一前列腺癌患者、一卵巢癌患者、一皮膚癌患者、一子宮頸癌患者、一結腸直腸癌患者、一肝癌患者、一黑色素瘤患者、一口腔癌患者、或一胰臟癌患者。在一些實施例中，該癌相關纖維母細胞取自一肺癌患者，例如一非小細胞肺癌患者或小細胞肺癌患者。用於本發明共同培養系統中的癌相關纖維母細胞，可取自不同期的癌症患者，例如早期或晚期。在一些實施例中，癌相關纖維母細胞取自第I期肺癌患者，例如第I期非小細胞肺癌患者。癌相關纖維母細胞可取自腫瘤組織或腫瘤周圍之組織，以後述實施例1之方法取得，同樣可參考Navab et al.,2011；and Tesei et al.,2009，相關的揭露以參考的方式併入本說明書中。可選擇地，本說明書所使用的癌相關纖維母細胞可為已建立之細胞株。

該些癌相關纖維母細胞可與一癌細胞群體以適合的條件共同培養，使其增殖或維持癌幹細胞特性。在共培養的情況下，癌細胞群體會含有癌幹細胞，並維持該癌細胞之幹性。維持癌細胞之幹性(stemness)包括維持癌細胞群體中癌幹細胞之幹細胞特性(stem cell properties)，且同樣包 括已分化幹細胞之去分化與重新獲得類似幹細胞的特性。癌細胞群體可為取自一癌症患者(例如具有一實體腫瘤之人類患者)之初代癌細胞，該癌症患者與本發明說明書中所揭露的相同，例如一肺癌患者。這樣的一個癌症患者可以是未經治療的，該治療包括化學治療或放射治療。可選擇地，該癌細胞群體可為已建立之癌細胞株。於一較佳之實施例中，該癌相關纖維母細胞與癌細胞為同一種癌症類型。例如，癌相關纖維母細胞與癌細胞皆衍生自肺癌，如非小細胞肺癌或小細胞肺癌。

在一實施例中，一培養盤可預先植入癌相關纖維母細胞餵養細胞(例如1×10⁵至1×10⁶個細胞/盤)。一癌細胞群體，例如具有密度為2,500至7,500存活的細胞/毫升，置入培養盤中並與癌相關纖維母細胞餵養細胞共同培養。癌相關纖維母細胞與癌細胞之比例可落於100：1至5：1之範圍(例如50：1、20：1、或是10：1)。與癌相關纖維母細胞共同培養中之癌細胞的幹性的分析，係以後述本領域中已知的方法評估生成的細胞群落中癌細胞的能力。見後述實施例。癌細胞之幹性亦以癌幹細胞標誌評估，例如IGF1R、Oct3/4、以及Nango，如本發明說明書所述。癌細胞之幹性可選擇地經由本發明以影像為基礎的高通量分析評估。

本發明體外共同培養系統提供一判定以癌幹細胞為標靶之抗癌候選藥物的篩選平台。癌幹細胞已知為一腫瘤中所有癌細胞之一小群體(例如0.1%至10%)的細胞。這種癌細胞被人為在癌症進展中非常重要，其被認為是在癌症生成時的起始細胞，且具有分化為與前代不同表型之癌症細胞能力。癌幹細胞通常具有緩慢的生長及複製速率的特性，因而並被認為是癌症中最難以消滅的細胞。先前的研究也顯示在去除所有其他的癌細胞之後，此殘留的癌幹細胞具有複製產生新的腫瘤的能力。因此，能夠以癌幹細胞為標靶的候選藥物應是癌症治療中特別重要。

為評估一候選藥物是否能夠降低癌細胞之幹性，例如一候選 化合物可添加入本發明之體外共同培養系統。在以適合的條件培養一段適合的時間後，該共同培養系統中癌細胞之幹性的程度可與一共同培養之控制組比較，該共同培養之控制組未添加該候選化合物。若在該候選化合物存在下與未有該候選化合物存在下相較，癌細胞之幹性的程度降低，則表示該候選化合物可能是一個以癌幹細胞為標靶的抗癌藥物。

在一些實施例中，癌細胞之幹性程度，可利用該共同培養中Oct3/4⁺與Nanog⁺細胞數評估，該Oct3/4⁺與Nanog⁺細胞即代表癌幹細胞。在其他實施例中，癌細胞之幹性程度，可利用該共同培養中的癌細胞之抗藥性程度評估。高抗藥性代表癌細胞之幹性高。在又一些實施例中，癌細胞之幹性的程度可經由測量本發明所述一或多個旁泌素機制(見第四圖)之因子(components)而得，該旁泌素機制之因子包括在癌相關纖維母細胞中表達的IGF-II、HGF、LIF、及SDF1、在癌細胞中表達的一或多個IGF1R,IGF2R、LIFR、CXCR4、及Nanog、或其二者之組合。這些細胞表面標誌中一或多個之表達程度可利用一例行方法測量，例如，FACS分析或是免疫組織化學染色法(immunohistochemistry staining)。

一候選化合物在本發明篩選方法(利用該體外共同培養系統)被判定出來，這樣的一個候選化合物可進一步經由例行技術去確認其抗癌活性，特別是其抗癌幹細胞之活性。

II.調節癌細胞幹性的旁泌素機制

本發明另一方面，揭露纖維母細胞透過旁泌素機制促進癌幹細胞去分化及類幹細胞特性。特別是在這個旁泌素機制中發現IGF-II/IGF1R訊號途徑，在觸發癌幹細胞內Nanog的表達上扮演重要的角色。此旁泌素機制在初期癌症患者中，可作為預測整體存活率與未復發存活率的可靠生物 標誌，該初期癌症患者例如第I期非小細胞肺癌患者。因此，這個此旁泌素機制中一或多個因子可應用於本發明癌症預後之預測方法。

本說明書所揭露的旁泌素機制之因子任一個或任一組合，可用於評估一早期的癌症患者(這裡的「癌症患者」如本說明書所提及的癌症患者，例如一肺癌患者，舉例來說，一非小細胞肺癌患者或一小細胞肺癌患者；「早期的癌症患者」例如第I期非小細胞肺癌患者)之存活率(例如整體存活率或未復發存活率)的預後標誌。該旁泌素機制之示例性的因子如第四圖所示。包括但不限於表達於癌相關纖維母細胞內之IGF-II、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，簡稱HGF)、LIF、及基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1，簡稱SDF1)、以及表達於癌幹細胞內之相對應的受體，例如IGF1R、IGF2R、HGF受體(HGFR)、LIFR、及C-X-C第4型趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 4，簡稱CXCR4)。其它生物標誌例如癌幹細胞內的Nanog與IGF結合蛋白(IGF-binding proteins，簡稱IGFBPs)，亦可用於預測預後之標誌。在一實施例中，本發明預測預後之生物標誌包括在癌相關纖維母細胞內表現的IGF-II以及在癌幹細胞內表現的IGF1R或Nanog。請參考下面實施例1。

為實行此方法，含有癌細胞與癌相關纖維母細胞的組織樣本，可經由例行方式自一癌症患者(具有一實體腫瘤者，如本說明書所述者)取得。本說明書所述一或多個生物標誌的表達程度，係經由例如IHC分析所量測，如上所述。得到一或多個生物標誌之程度後，可作標準化及選擇性地依前述流程以產生該樣本的表達圖表。與一預定值相較，一或多個生物標誌較高(例如，IGF-II及IGF1R或Nanog)，表示該患者之存活率不佳。另一方面，與該預定值相較，一或多個生物標誌較低，表示該患者之存活率良好。在一些實施例中，該預定值可為一早期癌症患者(例如，第I期非小細胞肺癌患者)之群體中，一生物標誌的平均表達程度。基於本說明書所述預測 預後之方法評估的患者存活率，可決定一適當的治療方式。

這些任一個預測預後的生物標誌也可以用於判定癌症患者對癌症治療之反應，例如以IGF-II/IGF1R訊號途徑為標靶的癌症治療(例如對IGF-II或IGF1R有專一性的抗體)。因此，本說明書提供以一干擾IGF-II/IGF1R訊號途徑之藥劑，去治療一癌症患者方法，該癌症患者顯示出具有較高的一或多個本說明書所述生物標誌。在一些實施例中，該癌症患者可具有一實體腫瘤，例如肺癌(如非小細胞肺癌或是小細胞肺癌)、乳癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝癌、黑色素癌、口腔癌、或是胰臟癌。該患者可於癌相關纖維母細胞有一高的IGF-II表達程度，及/或於癌幹細胞有一高的IGF1R及/或Nanog表達程度，前述表達程度係以例如IHC分析而得。可干擾IGF-II/IGF1R訊號途徑之藥劑可包括但不限於抗IGF-II抗體，或是抗IGF1R抗體。

本發明亦提供用於辨別癌幹細胞及一樣本中癌細胞幹性之套組。這個套組包括一第一試劑，用於偵測該旁泌素機制之第一生物標誌(例如由癌相關纖維母細胞表達的IGF-II)，以及一第二試劑，用於偵測該旁泌素機制之第二生物標誌(例如由癌幹細胞表達的IGF1R或Nanog)，並選擇性地包括一第三試劑，用於偵測該旁泌素機制之第三生物標誌(若該第二試劑對Nanog具有專一性，則該第三試劑例如IGF1R；若該第二試劑對IGF1R具有專一性，則該第三試劑例如Nanog)。

在一些實施例中，該第一試劑、第二試劑、及/或第三試劑為抗體，且對該生物標誌具有專一性。一抗體(在複數形式中可替換使用)為一種免疫球蛋白，能夠經由至少一抗原決定位專一地結合至一目標物，該抗原決定位位於免疫分子之不同的區域，該目標物例如一醣類、多核苷酸、脂質、多肽等等。本說明書所使用的「抗體」一詞不只包含完整(例如全長的)多株抗體(polyclonal antibodies)或單株抗體(monoclonal antibodies)， 也包含其抗原連接片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)、其變異、融合蛋白質包含一抗體部份(antibody portion)、擬人化抗體(humanized antibodies)、嵌合抗體(chimeric antibodies)、雙抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體、多重專一性抗體(例如雙專一性抗體)以及任何其他經修飾的免疫分子，係包含所需專一性之一抗原決定位，該經修飾的免疫分子包含抗體的糖基化變體、抗體之胺基酸序列變體、以及共價修飾之抗體。一抗體包含任何類別的抗體，類別例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其次類)，以及不需任何特定類別的抗體。依據其重鏈之一定區域的抗體胺基酸序列，將免疫球蛋白分至不同的類別中。免疫球蛋白有五個主要的類別：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且其中數個可分成次類(同類別)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2。依據免疫球蛋白之不同重鏈之一定區域係分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單株的結構與三維形狀為習知。

本說明書用於該方法之抗體可以是小鼠、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合抗體或擬人抗體)。本說明書所述之任何抗體可以是單株抗體或多株抗體。一「單株抗體」指的是一個同質抗體群體，一「多株抗體」指的是一異質抗體群體。該二個名詞並未限制抗體來源或是抗體製作的方式。

在一些實施例中，該套組可包含用於本說明書所述方法之指示。所包含的指示可包含使用量測相對應生物標誌之第一試劑、第二試劑、或第三試劑，該生物標誌係在一感興趣的細胞群體(癌相關纖維母細胞或癌幹細胞)中表達。該套組可進一步包含對於該分析中選擇一個別適合之試劑的說明。

本發明之套組係包裝於適合的包裝。適合的包裝包括但不限於樣品瓶(vials)、大瓶(bottles)、罐(jars)、有彈性的包裝(例如密封聚酯薄膜或塑膠袋)、或其類似物。

III.用於判定癌幹細胞之高通量分析(High-Content Assay，簡稱HCA)

本說明書亦說明一種以影像為基礎的高通量分析，係為分析一樣本中癌細胞之幹性程度，該樣本中含有癌細胞以及癌相關纖維母細胞。高通量分析方法之示意圖如第十四a圖所示。

這個分析可包含使用一偵測癌相關纖維母細胞之標誌(例如CD90)的第一試劑，以及一偵測癌幹細胞之標誌(例如Nanog)的第二試劑。在一些實施例中，該第一試劑、該第二試劑或其二者為抗體。例如，該第一試劑可為一抗CD90抗體，且該第二試劑可為一抗Nanog抗體。

為實行高通量分析，將癌幹細胞培養於含有癌相關纖維母細胞作為餵養細胞而存在的培養盤內。癌幹細胞與癌相關纖維母細胞之比例自1：100到1：5(例如1：50、1：20、或1：10)。癌幹細胞與癌相關纖維母細胞可於適當條件下共同培養一段適當的時間(例如，70小時)以形成癌細胞群落，此為癌幹細胞的一個特徵。癌幹細胞面積大於10,000μm²可視為一細胞群落。

含有癌幹細胞與癌相關纖維母細胞之樣本，可與本說明書所述第一試劑與第二試劑反應。在一些實施例中，該第一試劑、該第二試劑、或其二者直接與標誌結合，例如，螢光染劑，其中該第一試劑與該第二試劑與不同的標誌結合。在其他的一些實施例中，第一試劑或第二試劑之一或二者未直接標誌。在這種情況下，可使用一個對於第一試劑或第二試劑具有專一性之二級試劑(已標誌)，以使第一試劑或第二試劑間接與一標誌結合。

在一實施例中，將含有癌幹細胞/癌相關纖維母細胞之樣本以抗Nanog抗體與抗CD90抗體染色，該抗CD90抗體有與FITC結合。在足夠的清洗並去除未鍵結的的抗體後，該樣本進一步與一二級抗體反應，該二 級抗體係對該抗Nanog抗體具有專一性。該二級抗體可利用TRITC標誌。

該含有癌幹細胞/癌相關纖維母細胞之樣本進一步以一辨識核酸之試劑(DAPI)染色。

可擷取經染色樣本的影像，例如，利用一裝有4x物鏡之高通量分析平台。見下述實施例2。該影像可利用本發明領域已知方法分析，例如，MetaXpress®軟體(Molecular Devices公司)。癌細胞細胞核(CD90-)可利用多波長細胞評估的模組判定。癌細胞群體可利用本說明書所述方法判定(參考實施例2)。Nanog⁺細胞(例如TRITC染色細胞)之數量代表癌幹細胞之數量，且該總細胞數也可決定。每一癌細胞群體之幹性可計算Nanog陽性細胞(TRITC染色)與總細胞之比例而得。群體的密度也可定義為總細胞數除以群落面積。

癌相關纖維母細胞餵養細胞之總數可利用計算CD90⁺(例如FITC陽性)細胞而得。每孔內每群體之細胞數以及所有群體的幹細胞總數，分別利用將細胞以每一群體平均、以及所有群體之總幹細胞數來計算。每群體的幹細胞與全部群體的幹細胞數，可分別經由將幹細胞以每一群體平均、以及每孔內所有的總幹細胞來計算。

該高通量分析可用於作為一種判定候選藥物是否能夠降低癌細胞之幹性的高通過量篩選平台。舉例來說，一候選化合物可加入該癌幹細胞/癌相關纖維母細胞之共同培養中，該共同培養係可利用適當之條件培養一段適當的時間。癌症幹性可用本說明書所述方法測量。若與未有候選藥物的存在下比較，該候選藥物能降低癌細胞之幹性，這樣的一個候選化合物可判定為降低癌細胞幹性的一個有潛力的抗癌藥物。

這個篩選平台可應用於判定治療任何癌症之候選藥物，該癌症特別指的是實體腫瘤，取決於用於高通量分析方法中癌幹細胞/癌相關纖 維母細胞之類型。例如，該癌幹細胞與癌相關纖維母細胞可衍生自一患者患有，例如，肺癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝癌、黑色素瘤、口腔癌、或是胰臟癌。

在未有進一步說明的情況下，本發明領域中具有通常知識者能夠基於上述說明，以最大程度地實現本發明。以下為特定實施例，因此僅為例示，不能以任何方式限制本發明之其餘部分。本說明書引述的所有已公開文獻，皆以參考用途或作為本說明書參考標的之方式併入本說明書。

實施例1：癌相關纖維母細胞經由旁泌素訊號調節肺癌幹性

本發明與一種維持主要培養Oct3/4(+)/Nanog(+)肺癌幹細胞，並以CD90(+)癌相關纖維母細胞餵養，以維持癌幹細胞處於腫瘤微環境中。這裡將一轉錄體學研究應用於此，並辨識出一旁泌素機制作為支持並增加癌幹細胞數量之利基(niche)，該利基係經由去分化及重新獲得(reacquisition)類幹細胞的性質而支持並增加癌幹細胞數量。特別是，本發明發現在表達IGF-II之癌相關纖維母細胞的存在下，癌細胞內IGF1R訊號活化可誘導Nanog表達與幹性的提升。此外，這個旁泌素的訊號在第I期非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，預測了整體存活率與未復發存活率。進一步地，阻擾IGF-II/IGF1R訊號會抑制Nanog的表達與減弱癌幹細胞的特徵。本研究的數據顯示癌相關纖維母細胞構成癌症幹性(cancer stemness)之支持利基，且以這個旁泌素訊號為標靶，對於非小細胞肺癌來說可能會有一個新的治療策略。Chen et al.,Nature Communication,5：3472(2014)，其內容以參考方式併入本說明書中。

材料與方法 (i)肺癌細胞株、病患以及腫瘤樣本

人類非小細胞肺癌細胞株NCI-A549、NCI-H460、H1975以及NCI-EKVX，取自國家癌症研究所(國家衛生研究院，Bethesda,MD,USA)或美國菌種保存中心(簡稱ATCC，Manassas,VA,USA)。人類肺癌細胞株CL25、CL83、CL141與CL152，係自具有腺癌之肺癌患者的初代培養所建立。細胞培養於添加10%胎牛血清RPMI 1640培養基，並於37℃加濕環境、維持20% O₂與5% CO₂中培養。

肺腫瘤組織樣本自患者(N=80)處取得，並以組織學確認為經完整手術切除之非小細胞肺癌。參與的患者係分類於第I期，且其並未以新輔助化學治療(neoadjuvant chemotherapy)或是放射治療。所有的樣本以福馬林固定、切片、以H&E染色並以顯微鏡檢測。術後的病理分期係依據肺癌的國際分期系統。Zuo,et al.J Cell Biochem 113：2567-2575(2012)。

(ii)肺癌幹細胞(CSCs)、癌相關纖維母細胞(CAFs)及正常纖維母細胞之初代培養

人類肺癌幹細胞與癌相關纖維母細胞取自從肺癌患者新鮮手術切除的肺腫瘤組織。一些患者的人口統計學資料如下方表二所示。腫瘤與同一患者的正常組織在手術切除後30分鐘內收集，以分離出初代肺癌幹細胞、癌相關纖維母細胞以及正常纖維母細胞，利用一調整過的條件培養。Navab,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 108：7160-7165(2011)；and Tesei,et al.Cell Prolif 42：298-308(2009)。

從非小細胞肺癌患者之切除組織中的癌相關區域分離出肺癌幹細胞，並與餵養細胞培養與維持著，該餵養細胞即間質纖維母細胞(stromal fibroblasts)。樣本依據核可的人類受試者研究之IRB協議採購並實 行。非癌相關間質經由病理學家採樣，係在病理切除後30分鐘內，距離腫瘤性病變(在無菌條件下)至少5cm處採樣，在手術切除及隨後的組織分析時以肉眼確定。該組織以先前研究所述參數操作並有些許修改。Dontu,et al.Genes Dev 17：1253-1270(2003)。簡短地說，將該組織絞碎並在脫氧核糖核酸1(deoxyribonuclease 1；1mg/ml；Bioshop)以及蛋白酶(1mg/ml；Sigma)的存在下在S-MEM培養基(GIBCO)中以4℃培養6~12小時。在消化之後，細胞團塊經過40-μm的細胞過濾器過篩，以得到單一細胞的懸浮物。收集到的細胞以不同的細胞密度(5×10⁵)在24孔培養盤培養，培養基為修改培養條件之添加10%胎牛血清的RPMI1640中，並培養於37℃含有20% O₂與5% CO₂之加濕空氣中。在30天的培養之後，可在間質細胞周圍辨識出類似球形的群落。將該些類似球形的細胞，以前述經修改的方式續行培養。Dontu,et al.,2003。7~10天後，以溫和地離心(58g,800rpm)收集該些球體，並以酶分解(10分鐘0.05%胰蛋白酶、0.53mM EDTA‧4Na；Invitrogen)，再利用火拋光的巴斯德吸管機械性地破壞。收集通過40-μm篩網的細胞，並以顯微分析單一細胞的狀態。該些細胞，密度為5,000個存活的細胞/ml，置入有預先植入間質細胞做為餵養者的培養盤內(5×10⁵細胞/孔)。對於單一細胞/孔的繁殖實驗(clone experiments)來說，該些細胞利用一細胞分選器(FACS Ariel)培養於96孔盤中，且孔內已預先植入餵養細胞(2,000個細胞/孔)。肺癌幹細胞之續培養如先前研究所述並有些許修改的方式實行。Dontu et al.,2003。簡短地說，經由溫和地離心(58g、800rpm)收集球體、酶消化(10分鐘的0.25%胰蛋白酶、1mM EDTA；Invitrogen)，以及機械性破壞。從通過100-μm過濾器分離得肺癌幹細胞，篩過的細胞以顯微鏡分析。該些單一細胞以5,000個存活細胞/ml的密度培養於10-cm的培養盤中，該培養盤有預先植入癌相關纖維母細胞餵養細胞(5×10⁵個細胞/孔)。

(iii)利用Cyntellect LEAP ^TM 系統將群落純化

利用胰蛋白酶在含有EDTA的溶液中將癌細胞分離為單一細胞，單一細胞的懸浮液(500個存活細胞/孔)加入C-lect^TM 6孔培養盤內，該培養盤內有預先植入間質細胞(5×10⁴個細胞/孔)。在細胞群落形成之後，個別的細胞利用LEAP^TM系統(Cyntellect)純化。依照LEAP^TM系統群落純化使用說明書之指示。將培養盤載入LEAP^TM儀器並利用群落純化參數進行純化。群落純化區域之影像處理及選擇限制(gating)以正方形進行。LEAP^TM系統會顯示所選細胞之影像以供預覽。利用綠光雷射針對個別細胞剔除(cell ablation)。在LEAP處理後，培養的細胞以胰蛋白酶從孔中移除，並利用標準細胞培養條件培養。

(iv)即時反轉錄(RT)Q-PCR

與幹性相關基因之表達程度，以及CAF、CLS1/CAF及CLS1之數據的驗證，係利用ABI Prism 7900定序器(Applied Biosystems)經由RT Q-PCR實行。利用Primer Express 3.0(Applied Biosystems)所設計的引子如下表所示：

TATA盒結合蛋白(TATA-box binding protein，簡稱TBP)與β-actin用於作為內部控制組。表達程度係經以TBP標準化，定義為-△CT=-[CT_target-CT_TBP]。相對表達程度比例以相對於控制組之倍數(2^-△△CT)計算。以三重複試驗實行。

(v)免疫螢光分析

細胞在室溫以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸鹽緩衝溶液(PBS)固定。依據標準免疫螢光試驗參數實行。Ginestier,et al.Cell Stem Cell 1：555-567(2007)。在3%(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)之磷酸鹽緩衝溶液中做阻擾及雜交。針對Nanog(ReproCELL；1：300)及Oct3/4(H134；Santa Cruz；1：100)之單株抗體(mAbs)，以及與FITC結合的CD90(5E10；BD Pharmingen；1：100)、細胞角蛋白-7(cytokeratin-7；Dako；1：50)、細胞角蛋白-20(cytokeratin-20；Dako；1：25)、keratin-5/6(Thermo；1：10)、以及甲狀腺轉錄因子(thyroid transcription factor，簡稱TTF1；Dako)抗體皆有使用。利用Axiovert 200顯微鏡(Carl Zeiss，Göttingen,Germany)、共焦雷射掃描顯微鏡(Clsi，Nikon,Japan)搭配MetaXpress®(Molecular Devices)或是流式細胞儀(FACSAria，Becton Dickinson)檢驗已染色的細胞。

(vi)PKH26滯留分析

肺癌幹細胞(10⁶個細胞/100μl)以2μM PKH26紅(Sigma)標誌，並於室溫培養5分鐘，Bertolini,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 106：16281-16286(2009)。有標誌的細胞利用培養液清洗三次。有標誌的細胞在有/無癌相關纖維母細胞共同培養1週。利用螢光顯微鏡監測帶有紅色螢光之有染色細胞。

(vii)超低球形成(Ultra-low sphere-forming)分析

如文獻所述做超低球形成分析(Dontu,et al.,2003)，並以下述方式修改。培養於添加20ng/ml EGF(Sigma)及20ng/ml bFGF(Invitrogen)之MCDB201無血清培養液(Invitrogen)肺癌幹細胞之單一細胞懸浮液，植入超低附著24孔培養盤內(Corning；Coming,NY,USA；200個存活細胞/孔)。每週二次於培養液內添加新鮮生長因子。三週後，利用Axiovert 200顯微鏡觀察所形成的球體。

(viii)SP分析

如文獻所述方式進行赫斯特染色(Hoechst staining)(Goodell et al.,J Exp Med 183：1797-1806；1996)，並以下述方式修改。細胞以1×10⁶個細胞/ml之密度懸浮於預溫的磷酸鹽緩衝溶液(Invitrogen)中，有/無蛇根鹼(reserpine；50μg/ml；Sigma)之存在下添加赫斯特33342染劑(Invitrogen)至最終濃度為5μg/ml。細胞在37℃培養120分鐘，其間施以間歇性搖晃，培養結束後以磷酸鹽緩衝溶液沖洗、於4℃離心並於磷酸鹽緩衝溶液中再懸浮。添加碘化丙啶(propidium iodide；2μg/ml；Invitrogen)以篩選存活細胞。將該懸 浮液以40-μM細胞過濾器過濾，以在細胞分選前得到單一細胞懸浮液。利用FACSAria儀器(Becton Dickinson)分析並分選細胞。赫斯特33342染劑以375nm激發並經由雙波長偵測器(藍色，450/20；紅色，670LP)偵測其螢光並分析。

(ix)ALDEFLUOR分析

基於原廠參數以及先前文獻，利用ALDEFLUOR分析套組(StemCell Technologies)量測細胞之ALDH活性(Ginestier,et al.,2007)。在不同的處理後，細胞懸浮於含有ALDH受質(substrate)BODIPY-胺基乙醛(BODIPY-aminoacetaldehyde)之ALDEFLUOR分析緩衝液(BAAA，1mM/1×10⁶個細胞，於37℃培養30分鐘)。在負控制組的部分，細胞樣本以二乙胺基苯甲醚(diethylaminobenzaldehyde，簡稱DEAB)處理，係為一種ALDH專一性抑制劑。未存活的細胞以碘化丙啶(propidium iodide)染色辨識出，並利用FACSAria儀器(Becton Dickinson)分析。

(x)抗藥性分析

利用MTT[3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide](Sigma)分析以評估細胞增殖性。簡言來說，將肺癌幹細胞/癌相關纖維母細胞、以及肺癌細胞，以5×10³個細胞/孔的密度加入96孔培養盤。培養24小時後以血清飢餓(serum-starved)培養隔夜。然後細胞以不同濃度(0~50μM)的藥物，包括歐洲紫杉醇(docetaxel)、順氯氨鉑(cisplatin)、伊妥普賽(etoposide)、以及長春瑞濱(vinorelbine)培養48小時。48小時後，添加0.5mg/ml MTT的培養液加入培養盤的每一孔內。再培養1.5小時後，將培養液移除，加入DMSO至培養盤中。可溶解甲臢(formazan)的顏色強度，以 ELISA培養盤讀取器(Vector3；Perkin-Elmer,USA)以570nm測量。

(xi)在SCID小鼠異種移植之腫瘤形成

利用六週大的SCID公小鼠皮下注射低劑量(100μl之HBSS含有10⁶、10⁵、10⁴、10³或10²存活的細胞，以基質膠(Matrigel)混合)的肺癌幹細胞或癌幹細胞。監測小鼠八週，並檢測到腫瘤形成與轉移。腫瘤切片以蘇木素和伊紅(hematoxylin and eosin，簡稱H&E)染色並利用針對Nanog的抗體(ReproCELL)、針對Oct3/4的抗體(Santa Cruz；H-134)以及針對vimentin的抗體(NCL-L-VIM-V9)，以IHC分析。該染色的視覺可見，係利用一Ultra Vision偵測系統搭配一HPR聚合物(Dako)及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑(Dako)，接著以蘇木素對比染色。

(xii)基因表達特性以及途徑分析

癌相關纖維母細胞、肺癌幹細胞/癌相關纖維母細胞、以及肺癌幹細胞之基因表達特性圖(gene expression profiling map)，係利用Affymetrix GeneChip系統(Affymetrix,Inc.,Santa Clara,CA,USA)及遵循原廠參數而得。癌相關纖維母細胞、肺癌幹細胞/癌相關纖維母細胞、以及肺癌幹細胞之基因表達特性(Gene expression profiling)係利用Affymetrix GeneChip系統(Affymetrix,Inc.,Santa Clara,CA,USA)及遵循原廠參數而得。

陣列數據係經由國立臺灣大學基因醫學微陣列核心設備(National Taiwan University Microarray Core Facility for Genomic Medicine)處理。簡單來說，從癌相關纖維母細胞、肺癌幹細胞以及癌細胞中分離出總RNA，用於產生有T7-(dT)₂₄引子的cDNA(Superscript Choice System,Gibco BRL Life Technologies)。以BioArray高產量RNA轉錄標誌套組(Enzo Diagnostic,Inc.)合成生物素標誌的核糖核酸，雜交至人類染色體U133 Plus 2.0晶片(Affymetrix)上。基因表達數據機制以及基因列表的富集分析(enrichment analysis)，係利用GeneGo公司的MetaCore(genego.com/metacore.php)實行。

(xiii)人類趨化因子與細胞激素抗體陣列

使用人類細胞激素抗體陣列(C Series 4000,Ray Biotech,Inc.)，並依據原廠指示操作。Acosta,et al.,Cell 133：1006-1018(2008)。簡單來說，收集癌相關纖維母細胞、CLS1細胞/癌相關纖維母細胞共同培養、以及CLS1細胞培養盤內的無血清培養液，並在4℃有溫和搖晃下培養於隔離的膜24小時。生長之後，以Fujifilm LAS 3000系統(Fujifilm,Tokyo,Japan)擷取化學發光訊號，所擷取的影像以ImageJ軟體處理。化學發光訊號之強度以內部正控制組標準化。

(xiv)西方墨點法分析

詳細的方法描述於Zoller,Nat Rev Cancer 11：254-267(2011)。p-IGF1R(Y1316，6113S；1：1000)、p-AKT(D9E；1：1000)、AKT(927L；1：1000)以及Nanog(D73G4；1：1000)之一級抗體購自Cell Signaling Technology公司，而IGF1R(C-20；1：1000)之一級抗體購自Santa Cruz。單株鼠抗β-actin(Chemicon，Millipore；1：5000)用於作為負載控制。該膜以TBST沖洗三次，接著與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，簡稱HRP)結合的二級抗體(1：5,000)培養於含有2%脫脂牛奶之TBST。結合的抗體利用Enhanced Chemiluminescence System(Santa Cruz,CA)偵測。以Fujifilm LAS 3000系統 (Fujifilm,Tokyo,Japan)擷取化學發光訊號。所有的實驗皆以至少三重複試驗實行。

(xv)以免疫化學分析自肺癌患者之腫瘤樣本

詳細的方法於Wielenga,et al.Am J Pathol 154：515-523(1999)敘述，並以下述方式修改。非小細胞肺癌患者之腫瘤樣本的IHC染色，係利用修改的UltraVision quanto HRP-DAB偵測系統(Thermo,UK)實行。用於IGF-II、IGF1R、Nanog、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，簡稱PCNA)蛋白質表達之IHC分析的切片，首先於抗原修復AR-10溶液(Biogenex)或抗原修復Citra溶液(Biogenex)中，以121℃高壓滅菌10分鐘。然後樣本以3% H₂O₂-甲醇處理並隨後與Ultra V Block(Lab Vision Corporation)培養10分鐘並與多株抗-IGF-II抗體(MBS551011，MyBioSource；1：100)、多株抗-IGF1R β抗體(#3027，Cell signaling；1：20)、兔單株抗-Nanog(D73G4，Cell signaling；1：300)以及鼠單株抗-PCNA(PC-10，Thermo Scientific；1：400)於室溫培養2小時。利用超靈敏非生物素聚合物HRP偵測系統(BioGenex)偵測免疫染色，依據原廠指示實行。

(xvi)統計分析

Kaplan-Meier檢定用於估計整體存活率或是未復發存活曲線，且該對數等級檢定(log-rank test)用於測試存活曲線之差異。區分高/低風險組別之截止值(Cut-off value)，係為風險分數之中位數。年齡、性別、細胞種類、腫瘤尺寸、腫瘤期數、作為增殖標誌之增殖細胞核抗原(PCNA)、IGF-II表達(高或低)、IGF1R表達(高或低)、以及Nanog表達(高或低)皆用於評估獨立預後因子進行多變量Cox比例風險回歸分析。除非有其他說明，量 化的體外與體內之數據以平均值±標準差(S.D.)表示。學生t檢定用於兩組的比較。單因子(One-way)或二因子(two-way)變異數分析(analysis of variance，簡稱ANOVA)方法搭配Tukey’s事後分析相關性，用於多組別比較。所有的檢定皆為雙側(two-tailed)檢定，並定義p值小於0.05視為具有顯著差異。

結果 (i)從原發性腫瘤而來的癌相關纖維母細胞，支持癌幹細胞的生長

為研究自非小細胞肺癌患者(參考下方表二)而來的癌相關纖維母細胞是否能夠提供癌症幹性之利基(niche)，從腫瘤組織而來的癌相關纖維母細胞作為餵養細胞培養，以測試A549及EKVX肺癌細胞株與初代肺癌細胞(CL25、CL83、CL141、及CL152；第一圖)之幹細胞特徵。

ASC：腺鱗狀癌(Adenosquamous carcinoma)；ADC：腺癌(Adenocarcinoma)；SCC：鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma)；SCLC：小細胞肺癌(Small cell lung cancer)。

第一圖包含癌相關纖維母細胞或正常纖維母細胞作為餵養細胞對於促進腫瘤生成於促進肺癌細胞幹性標誌之示意圖。(a)：顯示A549與EKVX肺癌細胞株與癌相關纖維母細胞或正常纖維母細胞共同培養之群落形成能力的照片和圖表，癌相關纖維母細胞或正常纖維母細胞係來自不同的肺癌患者(N=4~5位患者，PT707、201、376、881與337)。比例尺為100μm。(b)：顯示有或無與正常纖維母細胞或癌相關纖維母細胞共同培養之A549與EKVX細胞中幹細胞標誌Oct3/4及Nanog之RT Q-PCR分析的圖表(N=3~4位患者，PT707、201、376與881)。(c)：顯示有或無與癌相關纖維母細胞共同培養之A549與EKVX細胞內Nanog經免疫螢光染色之照片。細胞核以DAPI染色。比例尺為100μm。(d)：顯示A549與EKVX細胞之PKH26滯留分析(retention assay)的照片。細胞以PKH26紅螢光染劑預染，且細胞分為有或無與癌相關纖維母細胞共同培養之組別。比例尺為100μm。(e)：顯示與癌相關纖維母細胞共同培養之肺癌細胞株(CL141、CL83、CL25與CL152)初代培養照片，癌細胞株形成類似球體的群落。比例尺為200μm。(f)：顯示有或無癌相關纖維幹細胞共同培養之CL141、CL83、CL25與CL152細胞內幹細胞標誌Nanog之RT Q-PCR分析的圖表(N=3)。(g)：顯示衍生自與癌相關纖維母細胞培養2~10天之成球體肺癌組織中之肺癌幹細胞(CLS1)之照片及 圖表(上圖)。CLS1細胞中Oct3/4、Sox2與Nanog表達之RT Q-PCR分析。從與癌相關纖維母細胞培養之CLS1球體(CLS1/CAF共同培養)或是未與癌相關纖維母細胞培養第4代之後的CLS1細胞(CLS1 p4)萃取RNA。胚胎幹細胞株H9用於作為控制組，癌相關纖維母細胞或正常纖維母細胞用於作為餵養細胞控制組(下圖)(N=3)。(h)：顯示CLS1細胞與癌相關纖維母細胞之免疫螢光特徵的照片；CLS1細胞表達Oct3/4與Nanog，而癌相關纖維母細胞表達CD90。細胞核以DAPI染色。比例尺為100μm。數據以平均值±標準差的形式表示，並使用二因子變異數分析(two-way ANOVA)方法搭配Tukey’s事後相關性分析(a)或是學生t檢定(b-g)比較其是否具有顯著差異；*P<0.05。數據為至少三重複獨立生物實驗之表示，每一實驗皆進行三重複或更多次重複。(I)顯示癌相關纖維母細胞之表面標誌的圖表。

結果顯示癌相關纖維母細胞較正常纖維母細胞有優越的促進球體形成的能力(第一a圖)。此外，經由雷射致能分析與處理(Laser-Enabled Analysis and Processing，簡稱EAP)雷射捕捉這些球體，該雷射致能分析與處理能夠有效率地從CLS1細胞/癌相關纖維母細胞共同培養中，純化出肺癌幹細胞群落。與癌相關纖維母細胞共同培養中，純化的球體顯示幹性基因Oct3/4與Nanog的高表達程度，但在與正常纖維母細胞共同培養中未有此現象(第一b圖)。與癌相關纖維母細胞共同培養的癌細胞亦於免疫染色中顯示幹性標誌Nanog較高(第一c圖)。PKH26滯留細胞只有在癌細胞與癌相關纖維母細胞共同培養中發現(第一d圖)。此外，第一e與第一f圖顯示由癌相關纖維母細胞促進的形成球體的能力以及癌細胞中Nanog之表達，不只有在癌細胞株中出現，也在衍生自肺腺癌患者之初代肺癌細胞中出現(CL25、CL83、CL141及CL152)。

(ii)利用癌相關纖維母細胞作為餵養細胞建立肺癌幹細胞株

習知用於體外癌細胞分離的技術具有限制，因為無法促進及維持癌幹細胞。為克服這些限制，自一肺腫瘤組織分離出的癌相關纖維母細胞用於作為餵養細胞，以於體外支持癌幹細胞。這些初代肺癌細胞在與癌相關纖維母細胞共同培養時形成球體，一種形成球體的肺癌幹細胞株CLS1於是建立。如第一g圖所示，單一CLS1細胞在與癌相關纖維母細胞繼續培養之10天內形成球體，顯示Nanog、Sox2及Oct3/4之高表達程度(第一g圖、第一h圖)，並顯示為非整倍體(aneuploidy)。相反地，癌相關纖維母細胞顯示以CD90判定的正常核型(karyotype)(第一h圖)，以及肌纖維母細胞標誌α-SMA與HLA-a、b與c之表達。CLS1細胞以有限的稀釋及與癌相關纖維母細胞餵養細胞繼續培養以供進一步的研究。纖維母細胞表面標誌之流式細胞儀分析決定癌相關纖維母細胞餵養細胞之表型。這些癌相關纖維母細胞與人類纖維母細胞專一性CD90、HLA-A、HLA-B、HLA-C(第I類)、及肌纖維母細胞α-SMA染色，第一I圖。

請同時參考第九圖及後述，第九圖顯示癌相關纖維母細胞共同培養系統可作為維持肺癌幹性之平台的圖。(a)肺癌幹細胞(CLS1)與癌相關纖維母細胞共同培養10天，在不同的時間點形成類似腫瘤球體的形態(上方)。CLS1細胞內的幹細胞標誌Nanog與Oct3/4以RT Q-PCR分析，該CLS1細胞係為與癌相關纖維母細胞共同培養不同代數之細胞(CLS1/CAF p.3、CLS1/CAF p.6、以及CLS1/CAF p.16)(下方)，結果係與癌相關纖維母細胞與已分化的CLS1細胞相較(N=3)。(b)由CLS1/CAF共同培養不同代數(CLS1/CAF p.3、CLS1/CAF p.12、與CLS1/CAF p.16)(N=4-6 mice)、不同細胞數(5×10⁶、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、以及1×10²個細胞)注射入SCID小鼠，其小鼠異種移植腫瘤的發病率。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以三次獨立實驗表示。

利用癌相關纖維母細胞餵養細胞，繼續培養CLS1細胞並維 持其形成球體能力與Nanog及Oct3/4的高表達程度(第九a圖)，顯示了癌細胞之幹性。為進一步評估體內CLS1細胞之幹性，癌細胞進行序列稀釋並注射入於Visvader,et al.,Nat Rev Cancer 8,755-768(2008)所述的免疫缺陷小鼠。這些結果顯示少數約100 CLS1細胞與癌相關纖維母細胞共同培養，能夠在NOD-SCID小鼠生成異體移植腫瘤，且這樣的腫瘤起始能力能夠在癌相關纖維母細胞餵養細胞的共同培養下維持幾個代數之後(第九B圖)。

(iii)癌相關纖維母細胞從共同培養中移除會降低幹性

第二圖包含顯示肺癌幹細胞(CLS1)在與癌相關纖維母細胞餵養細胞共同培養下，維持癌症幹性與具有高度腫瘤形成性之圖表，在未與癌相關纖維母細胞共同培養時，肺癌幹細胞分化成較少的腫瘤形成癌細胞。(a)：顯示在移除癌相關纖維母細胞後，已分化癌細胞會喪失其癌症幹性之示意圖。(b)：顯示QT-PCR分析之示意圖，係確認幹性標誌Nanog與Oct3/4在離開癌相關纖維母細胞存在下繼續培養的CLS1細胞內隨著培養代數增加而顯著降低(從P1至P14)。數據以平均值±標準差表示(N=3)，CLS1/CAFs中的CLS1細胞的不同代數，以單因子變異數分析(One-way ANOVA)方法搭配Tukey’s事後相關性分析。數據係三次獨立生物實驗表示。(c)：顯示有(CLS1/CAF)或無(CLS1)與癌相關纖維母細胞培養5天之CLS1細胞中Oct3/4之免疫螢光照片。箭頭顯示在移除癌相關纖維母細胞後，喪失Oct3/4染色之腺型CLS1細胞。以DAPI將細胞核染色。在CLS1細胞群中，PKH26陽性之染色細胞的滯留分析。細胞以PKH26紅螢光染劑預染，然後細胞以有或無癌相關纖維母細胞共同培養1週。箭頭標誌的CLS1細胞保留了PKH26螢光。比例尺為50μm。(d)：顯示CLS1/CAF自發性肺轉移腫塊(nodules)(N=15隻小鼠)的照片，以及CLS1異種移植腫瘤(上方)，腫瘤以H&E染色(下方)。比例尺為100μm。(e)：顯示衍生自與癌相關纖維母細胞共同培 養之CLS1球體，經注射方式之異種移植腫瘤(皮下注射並自發性肺轉移腫瘤)內Oct3/4與Nanog表達之IHC分析的照片。比例尺為50μm。

癌相關纖維母細胞與CLS1細胞共同培養(CLS1/CAF)會維持CLS1細胞的幹性表型；然而，當癌相關纖維母細胞在繼代培養期間移除，例如癌症幹性會喪失，接著Oct3/4及Nanog的下調(第二a、b圖)，同時Oct3/4陽性細胞及PKH26-滯留細胞也減少(第二c圖)。最重要的是，數據顯示CLS1/CAF之腫瘤起始(tumor-initiating)頻率為1/910，且這些細胞顯示高轉移活性(12/15)，然而在未有癌相關纖維母細胞共同培養下，CLS1細胞在12代之後腫瘤起始能力與轉移能力降低(1/4,137)(參考下方表三及表四)。

表四：CLS1/CAFs、CLS1及A549細胞之轉移發生率

該異體移植腫瘤的細胞內，於皮下與轉移處顯示Oct3/4及Nanog的強烈染色(第二e圖)。此外，這些皮下與轉移肺癌腫瘤能夠被再次培養，且從轉移部位而來的初代培養肺癌細胞顯示一癌化、球形表型，與原始CLS1細胞類似。重複培養的癌細胞顯示與CLS1細胞親代相同的腫瘤生成能力並於鼠體內以低細胞數(100個細胞)形成異體移植腫瘤。參考下方表五。

初代肺癌幹細胞(CL141及CL152)與癌相關纖維母細胞共同培養，與CLS1相比下具有較高球體形成能力、以及形成較大球體尺寸，以及相較於未與癌相關纖維母細胞續行培養3代之癌細胞，其異體移植之腫瘤起始頻率要高(第二d圖)。在共同培養中移除癌相關纖維母細胞後，ALDH活性亦降低。這些結果顯示癌相關纖維母細胞之行為如同初代癌幹細胞之癌症幹性的關鍵調節者。

請參考第十圖及後述，第十圖顯示已分化的CLS1細胞可經由再次與癌相關纖維母細胞共同培養而去分化的圖表。與癌相關纖維母細胞共同培養(CLS1/CAF)之腫瘤細胞(C1、C2、C3、與C4)之不同群落的幹細胞標誌Nanog與Oct3/4的RT Q-PCR分析，係與腫瘤細胞的不同群落比較(N=3)。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以至少三次之獨立生物實驗表示。

細胞SP之評估是評估癌症幹性能力與抗藥性的另外一個方 法。與其他與癌相關纖維母細胞共同培養的肺癌細胞株(包括CL1-5、A549、H522、H23、Hop62、H322M及EKVX)相較，與癌相關纖維母細胞共同培養的CLS1細胞顯示有較高的SP細胞百分比。CL1-5(腺癌)、A549(腺癌)、H522(腺癌)、H23(腺癌)、Hop62(腺癌)、H322M(支氣管肺泡癌)、以及EKVX(腺癌)細胞株之SP%分別為ND、5.1、0.2、ND、ND、ND、以及9.6。CLS1細胞之SP在癌相關纖維母細胞移除後顯著降低(第十d圖)，並且對於化學治療藥物(伊妥普賽(etoposide)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、長春瑞賓雙酒石酸鹽(vinorelbine ditartrate)、以及順氯氨鉑(cisplatin))的抗藥性也下降(表六)。

(iv)癌相關纖維母細胞之移除導致CLS1肺癌幹細胞之分化

與癌相關纖維母細胞共同培養的CLS1細胞(CLS1/CAF)維持其癌症幹性表型。然而，CLS1細胞在移除餵養細胞之後呈現貼壁依賴性並降低Nanog及Oct3/4之表現。一些CLS1細胞甚至呈現腺狀分化且同時喪失Oct3/4(第二c圖箭頭處)，並且在不同的CLS1單一細胞之群落(C1、2、3及4群落)中，腺癌與鱗狀細胞癌標誌(鱗狀細胞癌標誌有TTF1、CK7、CK20、p63及keratin 5/6)有不同的表達圖譜。免疫組織化學(IHC)試驗在CLS1形成的異體移植組織中，亦顯示分化的癌細胞具有不同染色圖譜(TTF1、CK7、CK20、p63、keratin 5/6、及mucin-1)。這些結果顯示具有幹性之CLS1細胞可分化為不同種類的肺癌細胞，該些不同種類的肺癌細胞能夠表達不同的 腺癌及鱗狀細胞癌標誌。重要的是，這個圖譜可經由再次與癌相關纖維母細胞共同培養而反轉，使分化的標誌向下調節以及Nanog與Oct3/4之顯著上調(第十圖)。

(v)癌相關纖維母細胞促進肺癌細胞之類幹細胞特性

請參考第三圖，該圖顯示分化的肺癌細胞可經由與癌相關纖維母細胞共同培養而去分化並再獲得類似幹性之圖表。(a)：顯示RT Q-PCR分析之圖表，係為評估有或無與癌相關纖維母細胞培養之CLS1 p.12及CLS1 p.27細胞的幹性標誌Nanog與Oct3/4(N=3)。(b)：顯示小鼠從CLS1/CAF共同培養之異種移植腫瘤的生成率照片及圖表(N=6隻小鼠)，該CLS1/CAF共同培養係分化自12代及27代之後的CLS1細胞(p6及p12；N=6隻小鼠)、A549與CLS1 p.12/CAFs、CLS1 p.27/CAFs、以及A549/CAFs(N=6隻小鼠)，以不同的細胞數(1×10⁴、1×10³及1×10²個細胞)皮下注射入SCID小鼠體內。比例尺為200μm。(c)：顯示小鼠異種移植腫瘤之生成率的圖表，該腫瘤衍生自篩選過的3代後ALDH-CLS1細胞(p3；N=6隻小鼠)與ALDH-CLS1/CAFs(N=6隻小鼠)，以不同的細胞數(1×10⁴、1×10³及1×10²個細胞)進行SCID小鼠之皮下注射。(d)顯示RT Q-PCR分析之圖表，係為評估有或無與癌相關纖維母細胞培養之ALDH-CLS1細胞內幹性標誌Nanog與Oct3/4的表達(N=3)。(e)：圖表顯示有或無與癌相關纖維母細胞培養之ALDH-CLS1細胞的ALDH活性。ALDH活性經由ALDEFLUOR染劑於有(上方)或無(下方)DEAB(一種ALDH抑制劑)存在下，於37℃培養30分鐘進行評估，並以流式細胞儀分析。數據以平均值±標準差表示，差異以學生t檢定評估，*P<0.05。數據係至少三次獨立生物實驗之表示。

如先前實施例所述，肺癌幹細胞在癌相關纖維母細胞移除後 會導致分化與幹性特徵之喪失，已分化的癌細胞(CLS1 p12、CLS1 p27與A549細胞)可經由再次與癌相關纖維母細胞共同培養而被去分化，以重新得到類似幹細胞之性質，同時提升幹性之標誌(Nanog與Oct3/4；第三a圖)，亦能夠在100個細胞如此低細胞數的皮下(intradermal administration)而形成異體移植(第三b圖)。這些數據進一步支持已分化的肺癌細胞可被誘導而「去分化」。

接著，將ALDH活性為陰性(ALDH-)的CLS1細胞分類為已分化(非癌幹細胞)群體(population)；然後將這些ALDH陰性細胞與癌相關纖維母細胞共同培養，以評估癌相關纖維母細胞是否有經由增加癌幹性而促進癌生成的能力。結果顯示ALDH陰性群體在異體移植模型上的癌生成能力非常低(第三c圖)。有趣的是，這些ALDH陰性CLS1細胞在與癌相關纖維母細胞再次共同培養之後，重新獲得了非常高的癌生成能力；尤其是其癌症幹性特性也再次被活化，且其癌細胞特性標誌之表達也增加(Nanog及Oct3/4分別增加53.8倍及145.3倍；ALDH活性增加8.83倍；腫瘤起始頻率從1/7,917增加至1/91；第三c~e圖)。

這些結果顯示Oct3/4(+)及Nanog(+)之癌幹細胞群體可經由癌相關纖維母細胞餵養細胞而維持，但會在癌相關纖維母細胞移除後降低，且此群體可在與癌相關纖維母細胞再次共同培養之後，而再次獲得幹性(第二a圖)。這個癌幹細胞/癌相關纖維母細胞共同培養系統因而代表了一個研究微環境如何影響癌幹細胞的良好模型，特別是癌生成癌幹細胞如何分化為較少的癌生成癌細胞，係經由腫瘤微環境所影響，Magee,et al.,Cancer Cell 21,283-296(2012)。

(vi)轉錄基因體學(transcriptomics)特性顯露出癌幹細胞內之幹性途徑

請同時參考第十一圖及後述，第十一圖顯示癌幹細胞內關鍵訊號途徑的全基因組基因表達圖譜。CLS1/CAF共同培養10天及離開癌相關纖維母細胞存在之連續繼代(serial passages)(p3與p14)的CLS1細胞，其與TGFβ相關途徑之分子(TGFBR1與SMAD2)、與Wnt相關途徑之分子(TCF21)、與EGFR相關途徑的分子(EGR1)、以及與LIF相關途徑的分子(LIF與LIFR)的即時RT Q-PCR分析。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以三次之獨立生物實驗表示。

本實施例係為了找尋肺癌幹細胞中對癌症幹性具專一性之訊號途徑，分析Oct3/4(+)/Nanog(+)CLS1癌幹細胞(CLS1/CAF)以及與離開餵養細胞共同培養之CLS1即為已分化之癌細胞其不同的代數(CLS1 p3、p6及p12)之基因表達特性進行比較。根據轉錄基因體學結果分析其所調控之訊息傳遞路徑。發現在CLS1/CAF共同培養中與調控幹性相關的途徑包括類胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor 1 receptor，簡稱IGF1R)、上皮細胞中胚轉化(epithelial-mesenchymal transition，簡稱EMT)、磷脂肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，簡稱PI3K)、TGF-β、WNT、及刺蝟訊號途徑相關，以及該些途徑調節數個幹性轉錄因子(Oct3/4、Nanog與Sox2)，會在共同培養下具有高度表現，反之在離開癌相關纖維母細胞的繼代培養及分化之癌細胞中急劇地降低。該些途徑中的一些是在CLS1/CAF共同培養中辨識出來，例如EMT、TGF-β以及刺蝟訊號途徑(Hedgehog signaling)，係已於先前研究中報導為參與維持癌細胞特性之途徑，Chang,et al.Nat Cell Biol 13,317-323(2011)；Mani,et al.Cell 133,704-715(2008)；以及Zhao,et al.Nature 458,776-779(2009)。例如，EMT經由表徵遺傳機制(epigenetic mechanism)調節，係習知抑制上皮標誌之表達以及將上皮細胞轉換為具有幹性之惡性、具侵襲能力的腫瘤細胞，Chang et al.,2011。這些結果顯示有一個複雜的調節機制存在，以維持肺癌幹細胞。一些關鍵調節子已辨識出， 包括轉化生長因子受體1(transforming growth factor receptor 1，簡稱TGFBR1)、轉錄因子21(transcription factor 21，簡稱TCF21)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，簡稱LIF)、白血病抑制因子受體(leukemia inhibitory factor receptor，簡稱LIFR)、早期生長反應蛋白1(early growth response 1，簡稱EGR1)以及SMAD2，皆經由Q-PCR驗證，顯示在無癌相關纖維母細胞的繼代培養下有下降的趨勢(第十一圖)。Metacore途徑分析顯示在CLS1/CAF共同培養中，參與EMT、PI3K、IGF1R、TGF-beta、WNT、以及Hedgehog訊號途徑之基因上調。有趣的是，這些幹性途徑可經由細胞外訊號觸發，表示旁泌素調節及自體分泌調節可能對體內維持癌幹細胞群體具有貢獻。

(vii)癌相關纖維母細胞經由旁泌素機制調節癌幹性

請參考第四圖，該圖顯示癌幹細胞與癌相關纖維母細胞交互作用(crosstalk)中的旁泌素機制與相對應受體途徑之圖表。(a)：顯示有或無與癌相關纖維母細胞培養之癌幹細胞(CLS1)，其差異性表達基因之階層式分群(hierarchical clustering)圖表。(b)：顯示旁泌素調節途徑之RT Q-PCR驗證的圖表。CLS1細胞係衍生自CLS1球體，分解為單一細胞並於沒有癌相關纖維母細胞的繼代培養下，培養不同代數(p3、p6以及p14)。癌相關纖維母細胞作為餵養細胞控制組(N=3)。(c)：顯示以共培養細胞中收集之條件培養基培養的CLS1細胞內其幹細胞標誌Nanog經由RT Q-PCR分析的圖表。該條件培養基是從癌相關纖維母細胞與CLS1細胞共同培養而來(N=3)。(d)：顯示細胞激素抗體陣列之圖表，該細胞激素抗體陣列是用於檢驗癌相關纖維母細胞或是有/無與癌相關纖維母細胞於無血清RPMI培養基中共同培養24小時之CLS1細胞分泌的生長因子。掃描並量化該陣列，量化所得到的值並以正控制組標準化。(e)：顯示細胞激素表達程度之半量化結果的圖表，以一熱區圖(heat map)表示。(f)：顯示RT Q-PCR分析CLS1細胞中幹細胞標誌 Nanog之圖表，該CLS1細胞經下列細胞激素處理：IGF-II(10ng/ml)；IGFBP1(10ng/ml)；IGFBP2(10ng/ml)；IGFBP3(10ng/ml)；IGFBP4(100ng/ml)；bFGF(10ng/ml)；HGF(10ng/ml)；PARC(10ng/ml)；sCD14(500ng/ml)以及GM-CSF(1ng/ml)(N=3)。(g)顯示CLS1細胞中幹細胞標誌Nanog之RT Q-PCR分析的圖表，該CLS1細胞經IGF-II(10ng/ml)與HGF(10ng/ml)及sCD14(500ng/ml)之組合處理(N=3)。(h)免疫螢光之照片，顯示IGF1R與IGF-II在CLS1細胞與癌相關纖維母細胞內的差異性定位(differentially localize)。在肺癌幹細胞內IGF1R染色(紅色，上圖)。CD90陽性的癌相關纖維母細胞(綠色)顯示IGF-II染色(紅色，下圖)。細胞核以DAPI染色(藍色；N=3)。比例尺為50μm。(i)：顯示RT Q-PCR分析癌相關纖維母細胞內IGF-II之圖表，該癌相關纖維母細胞係取自患者，並分為有或無與癌細胞之組別培養(A549細胞的N=6，而EKVX細胞的N=9)。(j)：顯示分為有或無與癌相關纖維母細胞培養之癌細胞(A549或EKVX)內IGF1R，以RT Q-PCR分析的圖表，其中癌相關纖維母細胞取自患者(N=4位患者)。(k)：顯示癌幹細胞與癌相關纖維母細胞之間串擾的示意圖，該串擾可能對癌症幹性有助益。數據以平均值±標準差的方式表示，且分析其差異時使用學生t檢定(b-c,i-j)或是單因子變異數分析搭配Tukey’s事後相關性分析(f-g)；*P<0.05。數據以至少三次獨立生物實驗表示，每一實驗中進行三次或更多次的重複試驗。

為更了解癌相關纖維母細胞如何維持肺癌之幹性，研究癌相關纖維母細胞與CLS1細胞之間與其內之轉錄調節機制與細胞激素機制。有趣的是，癌相關纖維母細胞高度表達數個生長因子，包括類胰島素生長因子(IGF-II)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，簡稱HGF)、LIF以及基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，簡稱SDF1)。相反地，這些生長因子的受體包括IGF1R、類胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor receptor 2，簡稱IGF2R)、肝細胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor，簡稱HGFR)、LIFR以及C-X-C趨化因子受體第四型(C-X-C chemokine receptor type 4，簡稱CXCR4)，以及相關的訊號調節子，例如類胰島素生長因子結合蛋白質(insulin-like growth factor binding proteins，簡稱IGFBPs)，在CLS1細胞內是高度表達的(第四a、b圖)。這個發現顯示癌相關纖維母細胞與CLS1存在細胞之間交互作用(crosstalk)，包含旁泌素調節機制。最重要的是，發現從CLS1/CAF共同培養系統的條件培養基，能夠使CLS1細胞中的Nanog表現量顯著上昇(第四c圖)。顯示旁泌素調節機制的確是存在此共培養系統當中並扮演著重要的角色。為進一步研究旁泌素調節的機制，本發明利用人類趨化因子及細胞激素抗體陣列(Ray Biotech,Inc.Norcross GA)，包括274個專一性抗體，結果顯示CLS1/CAF共同培養液內有多個細胞激素會有高度表現的現象(第四d、e圖)。

進一步釐清究竟在這些辨識出的候選細胞激素中在調控癌細胞幹性有何關聯性，結果發現IGF-II、可溶性CD14、以及HGF單獨地在CLS1細胞內引起Nanog表達(第四f圖)，其中IGF-II有最好的效果。有趣的是，在CLS1細胞內，HGF以及可溶的CD14協同性地提升IGF-II誘導Nanog表現的作用達20倍(第四g圖)。重要的是，發現IGF的行為並不像自體分泌因子，是像其在肝細胞癌中作用模式，Shan,et al.Hepatology 56,1004-1014(2012)。癌相關纖維母細胞之IGF-II主要透過旁泌素調節作用於肺癌幹細胞(CLS1)內顯著表現的受體IGF1R，以及其他的IGF反應因子(IGF2R、IGFBP1及IGFBP2；第四b圖與第十二圖)。以免疫螢光染色進一步確認IGF1R的確在肺癌幹細胞內大量表現，而IGF-II主要於癌相關纖維母細胞內表現(第四h圖)。此外，HGFR與CXCR4的mRNA皆於CLS1細胞內表現，而HGF與SDF1在癌相關纖維母細胞中是較高度表現的(第四a、b圖)。

第十二圖係顯示癌相關纖維母細胞與CLS1細胞潛在的旁泌素交互作用，經由即時RT Q-PCR驗證之圖表。參與癌相關纖維母細胞與癌 幹細胞(CLS1)旁泌素串擾之候選基因，包括IGF2R、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP5、SPARC、decorin、以及thromobospondin-1，以QPCR驗證。將衍生自CLS1球體的CLS1細胞(在代數p3、p6及12之後)分解為單一細胞並在未有癌相關纖維母細胞的存在下繼代培養。將癌相關纖維母細胞作為餵養細胞控制組。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以三次之獨立生物實驗表示。

另外，經由與肺癌細胞共同培養，癌相關纖維幹細胞內所誘導的基因交互作用於調節癌症幹性之利基(niche)也很重要。事實上，發現數個關鍵性的旁泌素因子，包括IGF-II、HGF、與SDF-1，是從癌相關纖維母細胞釋放出，並於維持癌症幹性的維持上可能扮演重要的角色(第四b圖)。此外，這些因子可經由與癌細胞(CLS1、A549、以及EKVX細胞；第四i圖及第十三圖)共同培養而調節。因此，數據顯示癌幹性利基可參與癌細胞與癌相關纖維母細胞之雙向溝通。

第十三圖顯示癌相關纖維母細胞經由與肺癌細胞共同培養，所引起的基因互相交互作用之圖表。不同患者(N=5位患者)的癌相關纖維母細胞中HGF與SDF1之RT-PCR分析，其中該癌相關纖維母細胞分為有或無與A549、EKVX與CLS1細胞培養。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以至少三次的獨立生物實驗表示。

(viii)癌相關纖維母細胞經由IGF-II/IGF1R/Nanog訊號支持幹性

為進一步評估IGF-II是否在所有腫瘤衍生的癌相關纖維母細胞中皆能夠產生，將不同肺癌患者的癌相關纖維母細胞分離出，與不同的肺癌細胞共同培養。從不同的癌相關纖維母細胞樣本中經雷射捕捉的餵 養細胞顯示有較高的IGF-II表達(A549細胞為N=6；EKVX細胞為N=9)(第四i圖)。相似地，與癌相關纖維母細胞共同培養之癌細胞的群落(N=4)顯示較高的IGF1R表達程度(第四j圖)。從患者中分離出來的12個樣本癌相關纖維母細胞之患者表徵顯示於表二。因此這裡提出一個可能的假說關於癌相關纖維母細胞與癌幹細胞之間旁泌素交互作用之訊號串擾(crosstalk)模型，未有既定理論所束縛，並對維持癌幹性有所貢獻(第四k圖)。

請參考第五圖，該圖顯示IGF-II/IGF1R/Nanog途徑參與微環境旁泌素訊號，可維持肺癌幹細胞之幹性的圖表。(a)：顯示四種不同的肺癌細胞株(CLS1、A549、H1975及H460)經過IGF-II(100ng/ml)處理後之幹細胞標誌Nanog的RT Q-PCR分析的圖表(N=3)。(b)：顯示在MCDB201培養基與EGF(20ng/ml)及bFGF(20ng/ml)培養21天後，以IGF-II(10與100ng/ml)處理的CLS1細胞球體形成能力(下圖)及形態(上圖)之照片及圖表。比例尺為100μm。(c)：顯示經IGF-II(10ng/ml)處理的CLS1細胞、與經IGF-II(100ng/ml)處理的初代細胞株(CL141與CL152細胞)內，於指定的時間點(0、10、30分鐘、以及1、2、6與24小時)，其IGF1R、AKT與Nanog表達之西方墨點分析的照片。(d)：顯示以IGF-II(10ng/ml)處理24小時之凌亂siRNA(scrambled siRNA；shLuc)細胞，其以Nanog為標靶之shRNA Nanog(shN1與shN2)蛋白質程度的照片，係以免疫墨點法檢驗。β-Actin用於作為內部控制組。(e)：顯示以IGF-II(10ng/ml)處理的CLS1細胞之球體形成能力(球體數量，N=6；球體平均面積，N=10)與形態之照片與圖表，並於搭配EGF(20ng/ml)與bFGF(20ng/ml)之MCDB201培養基培養14天後Nanog專一性剔除之分析。比例尺為50μm。(f)：顯示以Nanog為標靶之shRNA細胞(shN1與shN2)或凌亂siRNA(shLuc)細胞內的Nanog蛋白質程度之照片，係經由免疫墨點法檢驗。β-Actin用於作為內部控制組。比例尺為200μm。(g)：顯示CLS1/CAF細胞形成的異種移植腫瘤之發生率的圖表，其中該CLS1/CAF細胞分為有或無以 shRNA介導的Nanog剔除。腫瘤經由注射1,000 CLS1/CAF細胞而生成(N=8隻小鼠)。(h)：顯示由CLS1/CAF細胞形成的腫瘤體積之圖表，其中該CLS1/CAF細胞分為有或無Nanog剔除(N=8隻小鼠)。數據以平均值±標準差表示，顯著差異之測試由學生t檢定(a)或是單因子變異數分析搭配Tukey’s事後相關性分析(b-h)；*P<0.05。數據以至少三次獨立實驗表示，每一實驗進行三次或更多次的重複試驗。

為進一步確認此假說即探討IGF-II訊號在肺癌幹細胞內癌症幹性上之角色，檢驗CLS1與其他肺癌細胞株內數個癌症幹性。發現給予IGF-II會增加細胞中Nanog的表達(第五a圖)，且會增加其癌幹細胞球體的數量與尺寸(第五b圖)，促進一群落中Nanog陽性細胞(即肺癌幹細胞)的數量，此分析係經由影像為基礎的高通量分析(HCA；第十四a、b圖。亦請參考實施例2)所得，並於不同的肺癌細胞(CLS1/CAFs、A549、H1975及EKVX)中增加ALDEFLUOR陽性比例(即前人研究所指出之肺癌幹細胞；第十五a、b圖)。進一步西方墨點分析顯示IGF-II在初代肺癌細胞(CLS1、CL141及CL152，第五c圖)內以時間依賴方式誘導IGF1R與Akt磷酸化與下游的Nanog表達。此外，PI3K抑制劑LY294002在與癌相關纖維母細胞共同培養之初代肺癌細胞(CLS1、CL141及CL152)內，顯著地降低每群落中Nanog陽性細胞的數量。另外，LY294002(濃度為1、5、及10μM/ml)抑制IGF-II誘導的Akt磷酸化及Nanog表達，並降低CLS1細胞(10³細胞)在NOD/SCID小鼠內的腫瘤形成性(tumorigenicity)。總之，這些結果顯示PI3K可能是IGF-II/IGF1R/Nanog訊號途徑的中介因子，且阻擾PI3K訊號將因此降低IGF-II所調節的癌幹性。

第十四圖顯示經由高通量分析判定癌幹細胞之步驟的圖表。(a)CD90作為癌相關纖維母細胞之標誌；Nanog為幹性細胞之標誌；細胞核以DAPI染色，對利用以影像為基礎的高通量分析用於判定癌幹細胞群落很有幫助。群落數、面積、每一群落的細胞數、以及Nanog陽性細胞。(b) 以影像為基礎之高通量分析顯示CLS1細胞之Nanog(+)群落形成能力在經過IGF-II(10 and 100ng/ml)處理後增加。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以三次之獨立生物實驗表示。

第十五圖顯示IGF-II在不同的肺癌細胞中誘導幹性的圖表。(a)以IGF-II(100ng/ml)處理的CLS1/CAFs細胞，其搭配ALDEFLUOR法之流式細胞儀分析。螢光強度係依據ALDH活性，以無DEAB測量(上圖)與有DEAB測量(下圖)。(b)以流式細胞儀檢驗四種不同的肺癌幹細胞株(CLS1/CAFs、A549、H1975、與EKVX)的ALDH活性，該些肺癌細胞株係經IGF-II(100ng/ml)處理。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以三次之獨立生物實驗表示。

第十六圖顯示以IGF1R中和抗體或是抑制不同肺癌幹細胞株之幹性以阻擾IGF1R訊號之圖表。(a)A549與EKVX細胞與癌相關纖維母細胞共同培養，並分為有或無IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理；測量每群落中Nanog陽性幹細胞之數量(N=3)。(b)每群落中Nanog陽性幹細胞係利用以影像為基礎的高通量分析測量。不同的初代肺癌細胞株(CLS1、CL141與CL152)與癌相關纖維母細胞共同培養，並分為有或無以IGF1R酶抑制劑(AEW541在1,5 10μM/ml濃度下)處理的組別。(N=3)(c)該些肺癌細胞株(包括A549與EKVX)之球體形成形態與能力(球體數量，N=6；球體平均面積，N=10)，顯著地經由以IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理而降低。數據以平均值±標準差的方式表示，並以學生t檢定測試其顯著性；*P<0.05。每一數據皆以至少三次之獨立生物實驗表示。

此外，IGF-II所調節的癌症幹性可經由Nanog之專一性剔除而減弱。如第五d圖所示，抗Nanog之shRNA抑制了IGF-II所誘導的p-IGF1R及Nanog表達，並降低體外培養中的球體形成能力(第五e、f圖)與NOD/SCID 小鼠內的腫瘤形成性(第五g、h圖)，表示Nanog在IGF-II誘導肺癌幹性中的重要性。

(ix)阻擾IGF1R訊號將抑制肺癌幹性

請同時參考第六圖與後述，第六圖顯示IGF-II/IGF1R訊號途徑作為抑制肺癌幹性與腫瘤形成性之標靶的圖表。(a)：顯示每一群落之Nanog陽性幹細胞之照片與圖表，係利用以影像為基礎的高通量分析。CLS1細胞與癌相關纖維母細胞共同培養，該癌相關纖維母細胞分為有或無以IGF1R中和抗體(IGF1Rα Ab；1μg/ml)及IGF訊號抑制劑(AEW541與PPP 1μM/ml)處理(N=3)。比例尺為50μm。(b)：顯示CLS1細胞之球體形成形態與能力的照片與圖表(球體數量，N=6；球體平均面積，N=10)，其球體形成之形態與能力在經由IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理之組別有顯著降低。比例尺為200μm。(c)：顯示ALDH活性之圖表，係利用流式細胞儀檢驗不同的肺癌細胞株(CLS1、A549、H1975與EKVX)而得，該些肺癌細胞株經IGF-II(100ng/ml)或IGF-II合併IGF1Rα Ab處理(N=3)。(e)：顯示CLS1細胞之IGF1R-p/IGF1R、AKT-p/AKT與Nanog之西方墨點法分析的照片，該些CLS1細胞係經由IGF-II(100ng/ml)或IGF-II合併IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理6小時(CLS1細胞)或24小時(CL141與CL152細胞)。(f)：顯示從CLS1/CAF細胞形成的異種移植發病率之照片與圖表，發病率隨著以1μg/ml IGF1Rα Ab處理而降低。腫瘤經由注射1,000個CLS1/CAF細胞而生成(N=5隻小鼠)。CLS1/CAF細胞的腫瘤形成能力會被IGF1Rα Ab(1μg/ml)處理抑制(N=5隻小鼠)(控制組之發病率為100%(5/5)以及IGF1Rα Ab處理組別之發病率為40%(2/5))。數據以平均值±標準差表示，顯著差異之測試由單因子變異數分析搭配Tukey’s事後相關性分析(a)或是學生t檢定(b-d)；*P<0.05。數據以至少三次獨立實驗表示，每一實驗進行三次或更多次的重複試驗。

此實施例係為了進一步評估IGF-II訊號在抗癌治療上針對肺癌幹細胞是否是可被藥物調控(druggable)，因此本發明使用藥物專一抑制IGF1R訊息傳遞。利用影像為基礎的高通量分析，無論是IGF1R專一性抗體或是IGF1R抑制劑(picropodophyllin、PPP以及AEW541)存在的狀況下，肺癌細胞株(A549、EKVX)以及初代肺癌細胞(CLS1、CL141及CL152)的每個細胞群落中Nanog陽性細胞顯著被抑制(第六a圖)。利用IGF1R阻擾抗體(IGF1Rα Ab)，進一步確認CLS1細胞之癌幹細胞球體形成能力在阻擾IGF1R訊號之後降低(第六b圖)；在A549與EKVX細胞中也有相似的作用。肺癌細胞株(CLS1、A549、H1975與EKVX)在IGF-II處理下增加的ALDEFLUOR陽性比例會在添加IGF1Rα Ab阻擾之後被抑制(第六c圖)。此外，CLS1、CL141與CL152細胞中IGF-II所上調之Nanog表現量之，也在IGF1R訊號阻擾後被抑制(第六d圖)，IGF-II誘導的IGF1R磷酸化、Akt磷酸化、以及下游Nanog訊號也在IGF1R訊號阻擾後被抑制(第六e圖)。最重要的是，IGF1Rα Ab與抑制劑(AEW541)顯著降低CLS1細胞(10³細胞)注射入NOD/SCID小鼠的腫瘤生成能力(第六f圖與第十七圖)，對於肺癌幹細胞IGF-II訊號顯示為一個有潛力抗癌標靶。

第十七圖顯示於體外經由IGF1R酶抑制劑阻擾IGF1R訊號以抑制肺癌幹細胞之幹性的圖表。由CLS1/CAF細胞之異種移植腫瘤之腫瘤生成能力，可經由以AEW541處理而降低。腫瘤係經由注射1,000個CLS1/CAF細胞而生成。CLS1/CAF細胞所形成的腫瘤重量，會經由AEW541(5μM/ml)處理而降低(每組別N=5隻小鼠)。

(x)IGF-II-IGF1R/Nanog的共同存在與預後不良相關

本發明說明書已提及癌相關纖維母細胞作為分泌IGF-II之 「餵養細胞」，並作用於肺癌細胞之IGF1R，驅動幹性途徑與維持癌症幹性特徵。為檢驗IGF-II/IGF1R/Nanog旁泌素調節在腫瘤生成早期的臨床相關性與重要性，從80位尚未接受預先的化學治療或放射治療之第I期非小細胞肺癌患者取得腫瘤樣本，每一樣本作連續切片並經由IHC以抗IGF-II、IGF1R與Nanog抗體染色。這些患者的臨床特徵整理於下表七至九。將癌相關纖維母細胞中的IGF-II程度以及腫瘤細胞中的IGF1R/Nanog程度分數化，並對分為高(分數≧風險分數之中位數)或低(分數<風險分數之中位數)IGF-II、IGF1R與Nanog蛋白質表達的類別。

連續性變量：t檢定

分類性變量：費雪精確檢定(Fisher’s exact test)

MD：中度分化；WD：高度分化

增殖標誌r：增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，簡稱PCNA)

請同時參考第七圖與後述，第七圖顯示第I期非小細胞肺癌患者之癌相關纖維母細胞內IGF-II與IGF1R之臨床顯著性，以及癌細胞內Nanog之臨床顯著性的圖表。(a)：顯示腫瘤組織中癌相關纖維母細胞中高與低IGF-II表達程度以及腫瘤細胞中高與低IGF1R/Nanog表達之患者比例的樹狀圖。(b)：顯示初代腫瘤樣本之連續切片的癌相關纖維母細胞內IGF-II與癌 細胞內IGF1R/Nanog之IHC染色的照片，該樣本係取自80位經切除手術之第I期非小細胞肺癌的臨床患者。影像取自癌相關纖維母細胞內IGF-II及癌細胞內IGF1R/Nanog之低(分數<風險分數之中位數)與高(分數≧風險分數之中位數)表達的不同患者(原始放大倍率為100x)。(c-d)：顯示患者為高或低IGF-II、GF1R與Nanog表達之圖(截止值=風險分數之中位數)。結果顯示高或低表達組別於整體存活率(c)未復發存活率(d)在Kaplan-Meier評估中具有顯著差異。P值由雙邊指數系列檢定(two-sided log-rank tests)獲得。(e)：顯示經由合併癌相關纖維母細胞內IGF-II與癌細胞內IGF1R/Nanog表達程度結果的圖，患者分為三組：高IGF-II/高IGF1R/高Nanog組、低IGF-II/低IGF1R/低Nanog組及其他。Kaplan-Meier評估結果顯示於整體存活率未復發存活率具有顯著差異。P值由雙邊指數系列檢定(two-sided log-rank tests)獲得。

以樹狀圖表示IGF-II、IGF1R與Nanog表達之條件機率，如第七a圖所示。這些結果顯示高IGF-II及高IGF1R表達程度的患者中，有72%的患者也顯示有高Nanog表達程度，而低IGF-II及低IGF1R表達程度的患者中，有80.6%的患者顯示有較低Nanog表達程度。接著，每一樣本的連續切片以抗IGF-II抗體染色CAFs，抗IGF1R與Nanog染色腫瘤細胞，顯示於第七b圖。這些結果顯示在癌相關纖維母細胞內IGF-II高表達程度或是在腫瘤細胞內IGF1R或Nanog高表達程度之患者，相較於低表達程度的患者來說，有顯著較不佳的整體存活率(P<0.0001，Kaplan-Meier分析；第七c圖)與未復發存活率(P<0.0001，Kaplan-Meier分析；第七d圖)。

利用多變量Cox比例風險回歸分析評估9個與患者存活率相關的獨立預後因子變數(表九)。

表九：以多變量Cox比例風險回歸分析，利用年齡、性別、細胞型、腫瘤尺

結果顯示獨立預後因子包括IGF-II表達(風險比值(HR)=19.15，95%信賴區間=6.32至58.00；P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析)、IGF1R表達(風險比值(HR)=15.80，95%信賴區間=5.85至65.96；P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析)以及Nanog表達(風險比值(HR)=4.84，95%信賴區間=2.17至10.80；P=0.0001，Cox比例風險迴歸分析)。與轉移相關的獨立預後因子為IGF-II表達(風險比值(HR)=7.37，95%信賴區間=2.43至22.35：P=0.0004，Cox比例風險迴歸分析)、IGF1R表達(風險比值(HR)=13.29，95%信賴區間=3.09至57.23；P=0.0005，比例風險迴歸分析)以及Nanog表達(風險比值(HR)=7.59，95%信賴區間=2.67至21.62；P=0.0001，Cox比例風險迴歸分析)，表十。

患者預後之配體(ligand)與受體合併效果的分析顯示，與癌相關纖維母細胞內IGF-II低程度表達以及腫瘤細胞內IGF1R與Nanog低程度表達的患者相較，癌相關纖維母細胞內IGF-II高程度表達以及腫瘤細胞內IGF1R與Nanog高程度表達的患者有最差的整體存活率(IGF-II+IGF1R+Nanog，P<0.0001，Kaplan-Meier分析；第七e圖；風險比值(HR)=8.37，95%信賴區間=33.84至18.26；P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析； 表一)與未復發存活率(IGF-II+IGF1R+Nanog，P<0.0001，Kaplan-Meier分析；第七E圖；風險比值(HR)=5.02，95%信賴區間=2.41至10.47；P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析；補充表七)。這些結果進一步顯示IGF-II、IGF1R及Nanog旁泌素訊號可提供早期非小細胞肺癌患者預測轉移(P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析)以及整體存活率(P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析)之一新穎預後參數(表九及表十)。

討論

阻擾癌幹細胞研究的一個關鍵因素是缺乏一個有利的培養系統，以支持癌幹細胞生長同時維持其幹性。此外，利用纖維母細胞作為餵養細胞之傳統胚胎幹細胞培養系統至今尚未成功地轉作為癌幹細胞研究的工作模型。本發明首創建立一個從肺癌患者而來之肺癌幹細胞之初代培養系統，可用於研究癌幹細胞之特性以及用於篩選癌幹細胞的癌症標靶藥物。重要的是，肺癌幹細胞可利用癌相關纖維母細胞作為餵養細胞進行繼代培養，具有維持癌症幹性之特徵。

本發明顯示癌纖維母細胞(非為正常纖維母細胞)支持癌幹細胞生長。這些從肺腫瘤與癌細胞株初代培養中分離出來的癌幹細胞，維持了表達幹性標誌與在小鼠異種移植之低細胞數(<100個細胞)生成腫瘤的能力，且癌相關纖維母細胞於維持癌幹細胞這種幹性特徵是必要。離開癌相關纖維母細胞餵養細胞之支持下，肺癌幹細胞分化為癌細胞。有趣的是，癌相關纖維母細胞作為利基(niche)之添加可促進腫瘤細胞經由EMT/MET、WNT、Notch、及Hedgehog訊號之旁泌素活化而反轉分化為癌幹細胞狀態。Giannoni,et al.Cancer Res 70,6945-6956；2010。更重要的是，發現癌相關纖維母細胞會以一種旁泌素的方式經由生長因子的過度表達來調節癌幹細胞 之生長，該些生長因子例如IGF-II、HGF與SDF1以及經由誘導癌幹細胞內相對應受體表達，包括IGF1R、IGF2R、HGFR與CXCR4。此外，癌相關纖維母細胞分泌IGF-II刺激癌幹細胞上IGF1R，並因此活化IGF-II/IGF1R/Nanog訊號途徑，該途徑係維持體外與體內肺癌之幹性。總結來說，本發明實施例中的數據支持癌幹細胞模型並顯示自主分泌調節(autocrine regulation)的存在(Richards et al.,Nat Biotechnol 20,933-936；2002)；然而，癌相關纖維母細胞與癌幹細胞之間的旁泌素交互作用，對維持癌幹細胞之癌症幹性利基是具關鍵性(第八圖)。

第八圖為癌相關纖維母細胞與肺癌幹細胞之間串擾的示意圖。A與B：癌相關纖維母細胞分泌IGF-II，其可經由IGF1R訊號與Akt磷酸化而活化肺癌幹細胞內的IGF1R/Nanog。在觸發旁泌素IGF-II/IGF1R途徑下，其他癌相關纖維母細胞與癌幹細胞之間的自主分泌(LIF與LIFR；TGF-β與TGFBR1；WNT與捲曲受體(Frizzled receptor))與旁泌素(HGF與HGFR/c-MET；SDF-1與CXCR4)訊號可能共同對維持肺癌幹細胞之幹性有助益。

重要的是，利用癌相關纖維母細胞餵養細胞，癌幹細胞可在保留其癌症幹性特徵下繼代培養。於實施例中比較來自不同患者的癌相關纖維母細胞與正常纖維母細胞，發現癌相關纖維母細胞會刺激癌幹細胞之球體形成能力並在肺癌細胞株中使其表達幹性標誌，而正常纖維母細胞不會，表示癌相關纖維母細胞在體外培養中會支持癌幹細胞生長。先前研究中，分離癌幹細胞的方法包括從腫瘤內利用特定標誌或是經由在超低附著培養盤上形成微球體(mammospheres)而分選出來，請參考例如Fuchs,et al.,Cell 116,769-778(2004)；以及Sneddon,et al.,Cell Stem Cell 1,607-611(2007)。然而，這些方法並未讓癌幹細胞於體外能夠維持或是於體外繼代培養。本發明建立利用癌相關纖維母細胞作為餵養細胞，癌幹細胞可以繼代 培養並保留其癌症幹性，且這個概念類似於小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblasts，簡稱MEFs)維持人類胚胎幹(human embryonic stem，簡稱hES)細胞之幹性。Thomson,et al.,Science 282,1145-1147(1998)；and Richards et al.,2002。基於這個概念，在這裡提出一個利用從癌症患者取得之癌相關纖維母細胞作為餵養細胞，培養肺癌幹細胞之新模型，以克服目前難以在體外培養中維持癌症幹性的問題。這個方法支持長期肺癌幹細胞生長以及繼代培養且同時維持癌症幹性表型，並證明這個平台對於藥物篩選以及發展以癌幹細胞或幹性利基為標靶之新穎治療策略是有用。

先前研究中有揭露腫瘤微環境中的細胞種類，包括浸潤免疫細胞(例如腫瘤相關巨噬細胞)，且癌相關纖維母細胞是驅動癌症特徵的關鍵，癌症特徵包括腫瘤生成、血管新生、以及轉移。Doedens,et al.Cancer Res 70,7465-7475(2010)；and Xu,et al.,Cell Biol Int 35,509-517(2011)。然而，腫瘤微環境如何支持癌症幹性仍然是不大了解。Xu et al.,2011；以及Hanahan,et al.,Cancer Cell 21,309-322(2012)。胚胎幹細胞研究顯示餵養細胞是必要的，以經由活化重要訊號(WNT、Notch、Hedgehog與EMT訊號)之特定因子(例如TGF-β1、LIF與bFGF)的分泌而支持幹細胞生長與抑制分化。Mannello,et al.,Stem Cells 25,1603-1609(2007)。目前的數據顯示癌相關纖維母細胞(HGF、IGF-II、SDF-1、bFGF、WNT與抑瘤素M(oncostatin M))以旁泌素方式經由肺癌幹細胞內副受體(counterpart receptor)/訊號因子(EMT、TGF-β、WNT、Notch與Hedgehog)與幹性因子(Oct3/4、Sox2與anog)調節類癌幹細胞之特徵。此外，目前的數據確認了IGF-II/IGF1R/Nanog途徑在調節肺癌幹細胞生長的重要性，主要是在腫瘤微環境內以旁泌素方式調節，以及支持肺癌幹性的方式調節。經由肺癌幹細胞與癌相關纖維母細胞之間的交互作用，肺癌幹細胞可刺激癌相關纖維母細胞產生IGF-II，其在癌幹細胞內觸發IGF1R訊號是很重要。

進一步地研究癌幹細胞與癌相關纖維母細胞之間雙向旁泌素聯繫，與其促進癌症幹性之角色，結果顯示癌相關纖維母細胞分泌IGF-II、HGF與SDF-1。這些因子在維持癌症幹性中可能扮演重要的角色，並且在與癌幹細胞或癌細胞之共同培養中顯著上升。目前的數據顯示細胞激素(cytokines)，包含bFGF、HGF、IGFBP2、GM-CSF與PARC，在癌幹細胞條件培養基中含量豐富，可能經由癌相關纖維母細胞在IGF-II表達之誘導後釋放。先前研究中更多的證據顯示從癌細胞釋放bFGF與TGF-β可能參與纖維母細胞活化。Kalluri,et al.,Nat Rev Cancer 6,392-401(2006)；以及Franco,et al.,Cancer Res 71,1272-1281(2011)。本發明之結果顯示癌症幹性利基可能使用相似其調節人類胚胎幹細胞之旁泌素迴路。Bendall,et al.,Nature 448,1015-1021(2007)。

此外，目前的數據揭露癌細胞與癌纖維母細胞之雙向聯繫。癌相關纖維母細胞在IGF-II分泌之調節可由bFGF或其他細胞激素經由肺癌細胞或癌幹細胞上調，而IGF-II/IGF1R促進癌細胞內的Nanog表達。正向的回饋迴路便顯現，使得癌幹細胞內IGF1R表達增加，並維持癌幹細胞的幹性。Shan et al.,2012。這個證據支持癌-基質(stroma)交互作用之角色與腫瘤微環境在調節癌症幹性之重要性。目前的數據進一步顯示IGF-II/IGF1R/Akt/Nanog訊號之阻擾可降低癌幹細胞之癌症幹性，表示針對肺癌幹細胞利用一種IGF1R抑制劑於標靶治療之臨床應用的潛力。

近年來，許多的新治療策略設計於針對並消除癌幹細胞；然而，腫瘤微環境已被認為在決定癌幹細胞之惡性特徵上為主導地位。Vermeulen,et al.,Lancet Oncol 13,e83-89(2012)。特別重要的是，評估非致瘤癌細胞之去分化成為癌幹細胞是否能在特定利基中發生。先前研究認為正常體細胞的細胞可塑性與去分化可經由微環境因子或人為轉導正確的因子而控制。Bjornson,et al.,Science 283,534-537(1999)；以及Takahashi,et al., Cell 131,861-872(2007)。最近，腫瘤微環境基質細胞已顯示能誘導腸道上皮細胞之去分化，在腸道腫瘤生成期間得到腫瘤起始能力。Schwitalla,et al.,Cell 152,25-38(2013)。本發明中顯示分化的癌細胞(CLS1 p12、CLS1 p27與A549細胞)與非癌幹細胞群體(ALDH-CLS1細胞)可能經由與癌相關纖維母細胞共同培養而去分化，以再獲得類似癌幹細胞的性質與幹性標誌(Nanog與Oct3/4)之再表達。這個發現證實去分化的癌細胞之去分化可能基於腫瘤微環境(即癌相關纖維母細胞)的影響而發生。

此外，本發明檢測了IGF-II/IGF1R旁泌素與幹性標誌Nanog是否能作為第I期非小細胞肺癌患者之新穎預後標誌。目前，大多數的預後因子研究皆在癌細胞而不是癌相關纖維母細胞；只有一種11-基因預後癌相關纖維母細胞特徵被報導，係與非小細胞肺癌患者存活率相關。Navab et al.,2011。然而，癌相關纖維母細胞與癌幹細胞之間的旁泌素調節之臨床意義尚未被研究透徹。這是第一次，IHC染色用於清楚區分癌相關纖維母細胞中的IGF-II程度與癌細胞中的IGF1R/Nanog程度作為早期肺癌患者的重要預後標誌。事實上，癌相關纖維母細胞中的個別IGF-II程度或是與癌細胞中的IGF1R與Nanog程度合併，皆與整體存活率與未復發存活率強烈相關。因此得到的結論是在腫瘤進展中IGF-II/IGF1R/Nanog旁泌素訊號可作為早期肺癌的預後標誌。

綜上所述，本發明在腫瘤微環境與癌幹細胞之間的串擾(crosstalk)提供了一個新的觀點。CLS1/CAF共同培養模型代表一個新的抗癌藥物篩選平台，以衍生針對癌幹細胞與腫瘤相關基質細胞為標靶之化合物。此外，癌相關纖維母細胞以旁泌素方式經由IGF-II/IGF1R/Nanog途徑調節癌幹細胞之發現，提供抗癌治療新的潛力標靶。

實施例2：以影像為基礎的高通量分析

肺癌幹細胞或癌細胞(200個細胞/孔)加入有預植入癌相關纖維母細胞(2000個細胞/孔)之96孔培養盤內，並允許貼盤培養隔夜。在不同的處理之後，細胞依照Nanog(ReproCELL)(1：300)一級抗體(作為癌幹細胞標誌)與小鼠抗人類CD90 FITC-結合(5E10，BD Pharmingen)的抗體(作為癌相關纖維母細胞之標誌)之免疫螢光參數於4℃培養隔夜。接著，一級抗體與TRITC-結合的二級抗體(山羊抗兔IgG(H+L)結合，Invitrogen)於室溫培養2小時。細胞核以赫斯特33342染劑(Invitrogen)反染。為決定二級抗體的背景螢光程度，每一個包括控制組孔的培養盤，只含有二級抗體(以赫斯特33342染劑染色)。利用自動螢光顯微鏡擷取染色細胞的影像。

影像擷取與分析之執行如下。有染色的細胞利用設有4x物鏡之高通量分析平台擷取。每孔12個視野，每個波長的影像皆擷取並結合(montaged)以供進一步的影像分析。利用MetaXpress®軟體(Molecular Devices)分析影像。首先，以多重波長細胞分選器判定癌細胞核(未有FITC染色的細胞，CD90-)。將影像中癌細胞核的部分利用形態過濾器(Morphology Filters)擴大(dilated)並平滑化，以創造一個細胞簇遮罩。將大於10000μm²的細胞簇定義為癌細胞群落。最後，決定TRITC染色的細胞數與總細胞數。每一群落之幹性以Nanog陽性(TRITC染色)細胞與總細胞之比例計算。群落密度定義為總細胞數除以群落面積。

示例性的以影像為基礎的高通量分析之示意圖顯示於第十四a圖。

其他實施例

本說明書所揭露之所有特徵可以任何方式結合。本說明書中 所揭露之每一特徵可以替代為相同、相等或是近似用途之另一個特徵。因此，除非明確聲明，所揭露的每一特徵僅為相等或近似特徵的廣泛系列中的一個例子。

由上所述，本發明領域中具有通常知識者可輕易地確定本發明之必要技術特徵，且在不超過本發明之精神與範疇下，可多方改變與修飾本發明以供不同的用法與條件。因此，其他的實施方式亦包含於申請專利範圍內。

<110> 國立臺灣大學

<120> 癌相關纖維母細胞用於維持癌幹細胞之幹性/Cancer-Associated Fibroblasts in Maintaining Stemness of Cancer Stem Cells

<130> N0563.70000WO00

<140> 103133345

<141> 2014-09-25

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成寡核苷酸

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Claims (25)

1. 一種於體外生產或維持肺癌幹細胞之方法，該方法包含：提供一肺癌細胞群體；提供CD90⁺癌相關纖維母細胞；以及於含有胎牛血清的培養基中共同培養該肺癌細胞群體與該癌相關纖維母細胞，以於該共同培養中生產或維持肺癌幹細胞的幹性，其中該共同培養係為不添加膠原蛋白且非3D培養狀況，且該肺癌幹細胞為Oct3/4⁺與Nanog⁺。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該肺癌細胞群體係來自一已建立之肺癌細胞株。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該肺癌細胞群體係取自一肺癌患者之初代癌細胞。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之方法，其中該肺癌細胞群體包含非小細胞肺癌細胞。
5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之方法，其中該癌相關纖維母細胞取自一癌症患者。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該癌症患者為一肺癌患者、一乳癌患者、一腎癌患者、一前列腺癌患者、一卵巢癌患者、一皮膚癌患者、一子宮頸癌患者、一結腸直腸癌患者、一肝癌患者、一黑色素瘤患者、一口腔癌患者、或一胰臟癌患者。
7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該癌相關纖維母細胞係取自一非小細胞肺癌患者。
8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該癌相關纖維母細胞係來自一已建立的癌相關纖維母細胞株。
9. 一種判定一抗肺癌藥物之方法，包含：將肺癌細胞與癌相關纖維母細胞在一候選藥物的存在下，共同培養於含有胎牛血清的培養基，其中該癌相關纖維母細胞為CD90⁺；評估該共同培養中肺癌細胞之幹性(stemness)的程度，係以CD90^-細胞群落中Nanog⁺細胞數與總細胞數之比例作為肺癌細胞之幹性，其中該共同培養不添加膠原蛋白且非3D培養；以及若與未有該候選藥物存在之共同培養相較，該肺癌細胞之幹性的程度降低，則該候選藥物判定為一抗肺癌藥物。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該肺癌細胞係來自一已建立之癌細胞株。
11. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該肺癌細胞取自一肺癌患者之初代癌細胞。
12. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之方法，其中該肺癌細胞為非小細胞肺癌細胞。
13. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之方法，其中該癌相關纖維母細胞係取自一癌症患者。
14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該癌症患者為一肺癌患者、一乳癌患者、一腎癌患者、一前列腺癌患者、一卵巢癌患者、一皮膚癌患者、一子宮頸癌患者、一結腸直腸癌患者、一肝癌患者、一黑色素瘤患者、一口腔癌患者、或一胰臟癌患者。
15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該癌症患者為一非小細胞肺癌 患者。
16. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之方法，其中該癌相關纖維母細胞係來自一已建立之癌相關纖維母細胞株。
17. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該評估該共同培養中肺癌細胞之幹性係利用以影像為基礎的高通量分析(high content assay)方法，該以影像為基礎的高通量分析方法包含：(i)提供一包含肺癌細胞與癌相關纖維母細胞之樣本；(ii)把一第一試劑染色該樣本，以偵測Nanog，其中該第一試劑係直接或間接地與一第一標誌結合；(iii)把一第二試劑染色該樣本，以偵測CD90，其中該第二試劑係直接或間接地與一第二標誌結合，該第二標誌與第一標誌不相同；(iv)把利用該第一試劑與該第二試劑染色的樣本擷取影像；以及(v)以第二標誌陰性之細胞定義出肺癌細胞群落，並以每一肺癌細胞群落中第一標誌陽性細胞數與總細胞數之比例作為肺癌細胞之幹性。
18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該第一標誌、該第二標誌、或二者為螢光染劑。
19. 如申請專利範圍第17項所述之方法，進一步包含將該樣本利用一第三試劑染色，以偵測核酸。
20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該第三染劑為DAPI。
21. 如申請專利範圍第17項至第20項任一項所述之方法，其中該第一試劑、該第二試劑、或二者為抗體。
22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該步驟(ii)把該樣本與該第一試劑反應，該第一試劑係為對Nanog具有專一性之抗體，以及把與該樣 本鍵結之抗體結合至一具有TRITC標誌之二級抗體。
23. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該第二試劑為一具有FITC標誌之抗CD90抗體。
24. 如申請專利範圍第17項至第20項中任一項所述之方法，其中該樣本為一肺癌細胞與癌相關纖維母細胞之共同培養。
25. 如申請專利範圍第17項至第20項中任一項所述之方法，其中該肺癌細胞為非小細胞肺癌細胞。