TWI626942B - Use of a pharmaceutical composition for the preparation of a medicament for the treatment of memory deficiency, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, psoriasis, heart disease and cancer - Google Patents

Abstract

本發明包含以人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸及大棗cAMP為主要成份，製成迅速增加體內環腺苷單磷酸(cAMP)含量及利用度之口服藥物或保健食品。

Description

藥物組合物用於製備治療記憶力不足、阿茲海默症、帕金森氏症、牛皮癬、心臟病及癌症的藥物之用途

本發明係關於一種藥物組合物，尤指一種口服藥物及保健食品。

榮獲1971年諾貝爾生理醫學獎的科學家Earl Wilbur Sutherland Jr.，發現了細胞內cAMP的作用機制；而榮獲1992年諾貝爾生理醫學獎的科學家Edmond H.Fischer及Edwin G.Krebs，更進一步發現了細胞內cAMP→PKA(即cAMPdependent protein kinase)的作用機制；榮獲2000年諾貝爾生理醫學獎的科學家Eric Kandel，再更進一步發現了細胞內cAMP→PKA→CREB的作用機制。足見細胞內cAMP的相關作用，與人類的生理及醫學，有絕對而且非常重大的關聯；例如，當Eric Kandel探究出短期記憶和長期記憶形成的作用機制，是依賴細胞內cAMP→PKA→CREB信號轉導通路(第二信使轉導通路)並榮獲諾貝爾獎之後，科學家們認為，這些成果是發明記憶加強藥的關鍵。雖然，科學家們不斷努力，企圖研發可以迅速活化腦細胞內cAMP→PKA→CREB信號轉導通路的藥物，使人類得以加強記憶力，以提高學習能力，以及預防和治療健忘、老人癡呆、阿茲海默、帕金森等腦神經退行性疾病，更可以預防和治療其他體內cAMP含量及利用度低下相關疾病，例如憂鬱症；但是，1971年Earl Wilbur Sutherland Jr.獲得諾貝爾生理醫學獎至今，已經超過了30年，仍未見任何適於人類長期服用、 毒副作用低、有效率高的相關藥物問市。

現有技術中，已問市的SSRI、SNRI、NDRI等類的抗憂鬱藥物，藉由抑制憂鬱症病患機體中濃度已較正常人低下的5-HT、NE、DA等第一信使神經遞質的再攝取，待第一信使神經遞質的濃度及與受體之結合趨向較正常之後，才能從而使病患細胞內cAMP第二信使轉導遞質的生成趨向較正常；但是，副作用高，有效率低，卻使抗憂鬱藥物令人望而生畏。故而，從未聽聞有健康的人為了增加記憶力而長期服用抗憂鬱藥物。

美國國家健康研究院(NIH)的心理健康研究院(NIMH)耗資3千5百萬美元，以6年的時間，對於超過2800名憂鬱症病患，進行5種具代表性之SSRI類抗憂鬱藥物(Celexa、Zoloft、Wellbutrin、Effexor、Buspar)的臨床有效率(remission rat)研究(STAR*D study)，結果研究報告指出，每一種藥物的有效率僅約30%，而且平均約須6至7週才能緩解憂鬱症狀。更何況，已問市的抗憂鬱藥物都有不同程度的副作用，例如：增加自殺率、頭痛、頭暈、暈眩、失眠、嗜睡、耳鳴、口乾、厭食、食慾增加、體重上升、血壓上升、腸胃不適、反胃、噁心、嘔吐、消化不良、腹瀉、便秘、下肢痛、皮膚出疹、顫抖、痙攣、多汗、水腫、性慾降低、性無能等。近年來百憂解等抗憂鬱藥物已成為社會嚴重關注的問題，美國食品暨藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)更於2004年要求藥廠將市場上主要的32種抗憂鬱藥物重新標示其副作用和警告的部分，並對醫護人員強調這些藥物可能增加孩童及青少年自殺的機率。

多年以來，國際醫藥界的科學家們不斷努力研發副作用低、更安全、更有效，可以直接作用在第一信使神經遞質的受體之後，更迅速的提高細胞內cAMP第二信使轉導遞質的生成及利用度的藥物，以預防和治療細胞內cAMP低下的相關病症。雖然，四型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 4,PDE4)的抑制劑羅列普拉(Rolipram)，即屬於受體後作用機制調節類藥物，且試驗表明它具有明顯的抗憂鬱作用，原因是細 胞內生成的cAMP會被四型磷酸二酯酶降解，而抑制了四型磷酸二酯酶就提高了cAMP的利用度；但是，由於服用羅列普拉會出現強烈嘔吐等副作用，故而並未能被廣泛應用。

吾人為了解決前述技術之不足，與張作光先生合作潛研成功一種採用人蔘、甘草及大棗3種天然植物為原料製成的藥物組合物，不僅可以使細胞內cAMP含量升高，還可抑制磷酸二酯酶以減少cAMP的降解而增加cAMP的利用度，並可提高腦內DA和NE等神經遞質的濃度，而且長期服用安全性高，適於治療必須長期服藥的憂鬱症，當然也適於預防及治療細胞內cAMP低下，以及腦內DA和NE等神經遞質不足的相關病症。然而，天然植物因為生長期的不同、產地的不同、採收季節的不同，保存方式的不同，以及氣候變遷溫度、雨水、陽光等等因素，所以每一批天然植物原料中，可以提高cAMP的生成及利用度之有效成份的含量，均不可能相同；故而，有效成份愈明確，則愈能藉由控制及配比有效成份的含量，使每一次生產之藥物組合物的有效性及安全性更趨一致化，以提升藥物組合物的質量可控性(CMC)；再者，倘能更明確化有效成份中人蔘皂甙的種類，即可以擴大原料取得的範圍，使原料不致匱乏，因為除了人蔘的根、莖、葉之外，例如三七、西洋蔘等植物的根、莖、葉亦含有多種人蔘皂甙可以利用。於是，吾人與張作光先生為了進一步提升該藥物組合物的質量可控性(CMC)，以及擴大原料取得的基源，遂在原研發成果的基礎之上，繼續努力研究更明確化之主要功效成份及作用機制，而研發成功主要功效成份更明確之人蔘皂甙Rg1、Rb1、甘草酸(甘草次酸)及大棗cAMP的藥物組合物，且係多靶標受體後作用機制調節類藥物，而選擇採用人蔘皂甙Rg1、Rb1為主要功效成份，更可以強化BDNF的表達。

但是，除了人蔘皂甙Rg1、Rb1之外，倘若能夠再進一步利用人蔘、三七、西洋蔘等植物的根、莖、葉含有之其他種類的人蔘皂甙，協助人蔘皂甙Rg1、Rb1，達成前述藥物組合物的有效性，則可以更進一步 增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本。此外，前述藥物組合物中含有甘草酸類成份，而自古以來中醫早已確定，有嘔吐問題的人倘服用甘草，恐會誘發其嘔吐之問題。

職是之故，吾人繼續努力在原研發成果基礎上，悉心研究與探索，以更進一步改良習知技術及其中之缺失，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案之「可迅速增加體內cAMP含量及利用度之藥物組合物」，以下為本案之簡要說明。

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一組包含以人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸及大棗cAMP為主要成份，製成迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，特別是能更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本，並以穩定的品質提供可迅速強化細胞內cAMP/PKA/CREB信號轉導通路，以及強化BDNF表現量的口服藥物或保健食品的新技術方案。

本發明藥物組合物的解決方案是經吾人潛心研究探索並採用實施例進行充分實驗後證明之結果，由於先前技術實驗證明人蔘皂甙Rg1與Rb1可以增加體內BDNF的表達，故而可用以作為研製相關藥物的主要功效成份；但是目前技術尚未能人工合成人蔘皂甙Rg1與Rb1，故而必須從人蔘、三七、西洋蔘等天然植物的根、莖、葉中取得。由於人蔘皂甙的種類多達30種以上，為了能更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本，故而發明人潛心研究探索後，可以採用人蔘皂甙Re協同人蔘皂甙Rg1、Rb1，並與甘草酸(甘草次酸)及大棗cAMP配伍作為主要功效成份製 成藥物組合物，在進行充分實驗後證明，本發明可以在正常大鼠服用8小時後，既提高海馬組織中cAMP濃度，且增強PKA活性，並提高CREB磷酸化水準；尚可以抑制大鼠腦海馬組織中PDE的活性；且慢性重復應激實驗，服用的小鼠腦海馬組織中cAMP濃度、PKA活性、CREB磷酸化的表達，以及BDNF的表達，均明顯高於未服用之模型組的小鼠；而慢性重復應激實驗，服用的大鼠海馬組織中cAMP、PKA，以及血清BDNF和下丘腦5-HT、NE、DA等單胺遞質的表達，亦明顯高於未服用之模型組的大鼠；由此可以證實，本發明之藥物組合物可以迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度。足見本發明具有良好的有效性，而且比先前技術更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本，並且可以有效地進行質量可控制性。此外，由於本發明長期服用安全性高，且適於治療必須長期服藥的憂鬱症，以及預防及治療體內及細胞中cAMP低下、BDNF表現量低下、腦內DA和NE等神經遞質不足等的相關病症(例如：記憶力不足、老人癡呆、阿茲海默、帕金森等腦神經退行性疾病，以及牛皮癬、癌症等體內及細胞中cAMP低下之疾病等等)，適用人群廣泛；但是，因為藥物組合物中含有甘草酸類成份，而自古以來中醫早已確定，有嘔吐問題的人倘服用甘草，恐會誘發其嘔吐；然而，自古以來中醫也早已確定，長期服用安全性高的生薑是止吐聖品；故而，本發明之藥物組合物，還可以加入生薑粉或其萃取物，以改善先前技術之不足。

本發明係揭露一種迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，它是由包括含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸及大棗cAMP等主要功效成份的原料所製成。

本發明說明書和申請專利範圍中所述之迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，是實現本發明目的的核心內容，在本發明公開後，本領域的技術人員對上述藥物進行常規的加減化裁，均屬於本領域技術和研究人員的一般性技術活動，故其都在本發明的保護範圍之內。

本發明得藉參閱如附圖示及詳細說明而獲較佳瞭解。

第1圖為製備本發明實施例一藥物的方法流程示意圖。

第2圖為製備本發明方案二藥物的方法流程示意圖。

第3圖為製備本發明方案三藥物的方法流程示意圖。

第4圖為製備本發明方案四藥物的方法流程示意圖。

第5圖為給藥8h後，大鼠海馬組織中Cyclic AMP的含量變化。

第6圖為測定cAMP-Dependent PKA活性試驗中典型的凝膠電泳照片。

第7圖為給藥8h後，大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性差異。

第8圖為給藥8h後，大鼠海馬組織中p-CREB的含量變化。

第9圖為實施例一對於重復應激小鼠海馬cAMP濃度的影響。

第10圖為實施例一對於慢性應激小鼠海馬PKA活性的影響。

第11圖為實施例一對於慢性應激小鼠海馬CREB磷酸化的影 響。

第12圖為實施例一對於慢性應激小鼠海馬BDNF的影響。

以下將結合附圖和實施例進一步說明本發明。本發明主要是採用本領域技術人員習知的方法結合本發明的特徵製備本發明所述的藥物。以下實施例僅僅是為了說明，並非限定本發明。

為了完成本發明的目的，本發明特別提出下列技術方案。

本發明係揭露迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，它是由包括含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸及大棗cAMP等主要功效成份的原料所製成。

方案一：

以含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸或甘草次酸及大棗cAMP的原料，加工製成本發明迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物。

方案二：

以含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)合計2~26重量份、甘草酸或甘草次酸3~48重量份及大棗cAMP 0.002~0.5重量份的原料，加工製成本發明的藥物組合物。

方案三：

以含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)合計4~13重量份、 甘草酸或甘草次酸5~16重量份及大棗cAMP 0.01~0.1重量份的原料，加工製成本發明的藥物組合物。

方案四：

本發明之藥物組合物包括可以加入生薑水萃取物。

方案五：

本發明之藥物組合物包括可以含有藥學上可接受的載體或添加劑，可以製成錠劑、膠囊劑、散劑等任何藥劑學上所公知的口服藥物劑型。

方案六：

本發明所述的藥物組合物可用來製成迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物、保健食品和營養劑。

為了完成本發明的目的，特提出以下藥物的製作方法。

方法一：

分別自人參、甘草及大棗中，萃取含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸及大棗cAMP的萃取物為原料，或直接採用已製備成的含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸或甘草次酸及大棗cAMP的原料，加工製成本發明迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物。

方法二：

將含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)合計2~26重量份、甘草酸或甘草次酸3~48重量份及大棗cAMP 0.002~0.5重量份的原 料，加工製成本發明的藥物組合物。

方法三：

將含有人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)合計4~13重量份、甘草酸或甘草次酸5~16重量份及大棗cAMP 0.01~0.1重量份的原料，加工製成本發明的藥物組合物。

方法四：

本發明之藥物組合物包括可以加入生薑水萃取物。

方法五：

本發明所述的藥物組合物包括可以含有藥學上可接受的載體或添加劑，可以製成錠劑、膠囊劑、散劑等任何藥劑學上所公知的口服藥物劑型。

方法六：

將本發明所述的原料依食品管理標準或依保健食品生產製造標準的方法，加工製成本發明迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度的保健食品或營養劑。

具體實施例

以下將結合附圖和具體實施案例進一步說明本發明。

實施例一

請參閱第1圖，為製備本發明實施例一藥物的方法流程示意圖。在第1圖中，將40kg的人參破碎後用70%乙醇溶液加溫萃取，經上柱層析分離純化、乾燥，得含270g人參皂甙Rg1+ Rb1+Re(Rg1約48.4g、Rb1約176.9g、Re約44.7g)之人參萃取物1.42kg；並將15kg的甘草破碎後常溫浸泡12小時，以水提醇沈法萃取、濃縮乾燥，得含甘草酸307g的甘草萃取物3.1kg；且將10kg的大棗破碎後加水常溫浸泡，再以水提醇沈法萃取獲得大棗萃取液，再用大孔樹脂OU-2、ME-2兩柱先後連續上柱吸附分離、乾燥，得含大棗cAMP 0.752g的大棗萃取物40g作為原料供製備本發明藥物；之後，將上述方法得到的人參萃取物144g、甘草萃取物300g及大棗萃取物3.6g粉碎混合均勻後，得447.6g(含27.4g人參皂甙Rg1+Rb1+Re，以及29,7g甘草酸，以及0.067g大棗cAMP)本發明方案一的藥物組合物。

實施例二

請參閱第2圖，為製備本發明實施例二藥物的方法流程示意圖。在第2圖中，將實施例一得到的人參萃取物120g及甘草萃取物200g及大棗萃取物0.5g粉碎混合均勻後，得320.5g(含22.8g人參皂甙Rg1+Rb1+Re、19.8g甘草酸及0.009g大棗cAMP)本發明方案二的藥物組合物。

實施例三

請參閱第3圖，為製備本發明實施例三藥物的方法流程示意圖。在第3圖中，將已製備成的3.6g純度為90%的人參皂甙Rg1、3.2g純度為90%的人參皂甙Re、15.6g純度為90%的人參皂甙Rb1及26g純度為96%的甘草次酸及實施例一得到的大棗萃取物10g粉碎混合均勻後，得58.4g(含22.4g人參皂甙Rg1+Rb1、26g 甘草次酸及0.188g大棗cAMP)本發明方案三的藥物組合物。

實施例四

請參閱第4圖，為製備本發明實施例四藥物的方法流程示意圖。在第4圖中，將實施例一得到的本發明方案一的藥物組合物100g，與市售的生薑萃取物35g混合均勻後，得135g本發明方案四的藥物組合物。

實驗例一：正常大鼠給藥實施例一8小時，對cAMP/PKA/CREB信號轉導通路影響之動物實驗。

正常大鼠灌胃給藥實施例一8h後分取海馬組織，用酶聯免疫法(ELISA)測定海馬組織中的環磷酸腺苷(Cyclic AMP)、磷酸化Cyclic AMP反應元件結合蛋白(p-CREB)的含量變化，生物發光法(Bioluminescent)測定磷酸蛋白激酶A(cAMP-Dependent PKA)的活性變化，螢光法測定磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)的活性變化，揭示實施例一給藥8h後短時間內提高Cyclic AMP濃度，從而增強cAMP-Dependent PKA活性，提高CREB磷酸化水準，且可抑制腦海馬組織中PDE活性之分子藥理學機制。試驗資料採用Oringin Pro 7.5軟體統計分析作圖。

1. 試驗材料

1.1 試驗動物

健康雄性SD大鼠，體重180-200g，70只，購於北京維通利華動物試驗中心。

1.2 試劑

陽性對照藥物，抗憂鬱劑鹽酸帕羅西汀(批號：08030078，中美天津史克制藥有限公司)；Parameter Cyclic AMP Assay Kit，KGE002(美國R&D Systems,Inc.)；DuoSet IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB(S133)ELISA Kit，DYC2510-2(美國R&D Systems,Inc.)；PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent Protein Kinase Kit，V5340(美國Promega Corporation.)；PDE-Glo Phosphodiesterase Assay Kit，V1361(美國Promega Corporation.)；Pierce BCA Protein Assay Kit，23227，(美國Thermo)；環磷酸腺苷、腺苷等對照品購自中國藥品生物製品檢定所；NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、MgCl2、Tris Base、Tris-HCl等試劑均為細胞培養級生化試劑，購自美國Sigma公司；E-64、APROTININ、LEUPEPTIN、Pepstatin A、PMSF、NaF、EDTA、EGTA、DTT、NaVO4、Sodium pyrophosphate、瓊脂糖、甘油等試劑均為高純級，購自加拿大BioBasic公司；乙腈、甲醇(色譜純，德國MERCK公司)；超純水(MilliQ純水)；實施例一。

1.3 試驗儀器

FlexStation 3多功能微孔板分析儀(美國Molecular Devices Corporation.)；Waters600E高效液相色譜儀(四元泵、線上脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器，美國Waters公司)；冷凍離心機(美國BECKMAN公司)；電子超聲勻漿器(美國 UNTRASOUND TECHNOLOGY公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(SYN GENE公司)；ULTRA LOW超低溫冰箱(日本SANYO公司)；mLine單道移液器、8道移液器(芬蘭Biohit公司)。

2. 給藥

大鼠適應性飼養三天後，隨機分為3個組，分別標記為：A生理鹽水組、B帕羅西汀組、C實施例一組。鹽酸帕羅西汀片碾碎，用超純水配成一定濃度的混懸液，大鼠灌胃給藥劑量為5mg/kg；實施例一取其內容物用水配成一定濃度的溶液，大鼠灌胃給藥劑量為50mg/kg；生理鹽水組給予等體積的0.9%生理鹽水；給藥之前所有大鼠稱重並用苦味酸標記，所有藥物均在37℃下預熱30min後給藥。

3. 取材

A、B、C三組試驗動物給藥8h後，乙醚麻醉，股動脈放血處死，冰上斷頭取腦，分取海馬組織，精細切割成三份，分別置於預先編號標記的1.5mL彩蓋螺口凍存管中，準確稱重後迅速投入液氮中速凍15min，再置於-80℃冰箱中保存備用。

4. 樣本檢測

4.1 大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量測定：

將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1：20(g：mL)的比例加入試劑盒提供的細胞裂解液(將5倍濃縮液稀釋後使用)，電子超聲勻漿器勻漿30s，4℃下10000rpm冷凍 離心5min，取上清液置於預先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，置於冰盒內，待測。應用美國R&D Systems公司Parameter Cyclic AMP Assay ELISA試劑盒進行樣本檢測。將樣品恢復至室溫，按試劑盒說明書採用競爭性ELISA法測定樣品中Cyclic AMP含量。用多孔板分析儀在450nm下測定OD值，根據標準曲線計算出樣本中Cyclic AMP含量。

4.2 大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性測定：

將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1：10(g：mL)的比例加入PKA extraction buffer(按照試劑盒中配方配製)，電子超聲勻漿器勻漿30s，4℃下10000rpm離心5min，取上清液置於預先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，置於冰盒內，待測。應用美國Promega公司PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent Protein Kinase試劑盒進行檢測分析。在預先編號的200μL PCR八聯管中按照試劑盒說明書加入預混的試劑，分別取9μL各樣本對號加入各管中，渦旋混勻，離心，室溫反應30min，然後置於PCR儀中98℃ 5min對酶進行滅活。試驗中按照說明書要求分別設置正對照與負對照管，隨行試驗。製備0.8%的瓊脂糖凝膠，將酶反應後的樣本各取10μL加入凝膠的梳孔中，100V，130mA電泳30min，電泳液為50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液。電泳後將瓊脂糖凝膠取出，凝膠成像儀照相，然後置於紫外分析儀上，將已磷酸化反應的PepTag A1 Peptide斑點切下，分別置於預先編號標記的1.5mL彩蓋螺口凍存管中。加熱使瓊脂糖凝膠融化，用超純水定容到250μL，迅速取出125μL加入預先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，再加入75μL試劑盒提供的溶膠液和50μL冰醋酸，渦旋混勻，取200μL加入96孔酶標板中，以負對照管正極方向瓊脂糖為空白對照，在多孔板分析儀上進行螢光分析。設定Excitation Wavelength 568nm，Emission Wavelength 592nm。以樣本螢光強度表示PKA活性。

4.3 大鼠海馬組織中p-CREB含量測定：

應用美國R&D Systems公司DuoSet IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB(S133)ELISA試劑盒進行樣本檢測。將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1：20(g：mL)的比例加入組織勻漿液(按照試劑盒中IC DELUENT 6#配方配製)，電子超聲勻漿器勻漿30s，4℃下10000rpm離心5min，取上清液置於預先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，置於冰盒內，待測。測定時將樣品恢復至室溫，按試劑盒說明書採用sandwich ELISA法測定樣品中p-CREB含量。用多孔板分析儀在450nm下測定OD值，根據標準曲線計算出樣本中p-CREB含量。

4.4 大鼠海馬組織中總蛋白測定：

為了更準確標定樣本中每毫克蛋白所含的p-CREB蛋白的量，需要對樣本的總蛋白含量進行測定。取p-CREB測定 試驗中的組織勻漿離心後的上清液，用PBS稀釋25倍後，作為測試樣本，按照Pierce BCA Protein Assay Kit試劑說明書，用多孔板分析儀在562nm下測定OD值，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，根據標準曲線計算出樣本中總蛋白含量。

4.5 磷酸二酯酶(PDE)活性測定：

使用美國Promega公司生物發光法(Bioluminescent)PDE-Glo Phosphodiesterase Assay試劑盒測定實施例一對大鼠腦海馬組織中PDE活性的影響。

4.5.1 藥液配製：

實施例一取內容物配製成0.02mg/mL、0.05mg/mL和1.0mg/mL三個濃度。

4.5.2 樣品製備：

取一定量的海馬組織，少量生理鹽水沖洗後，按1：10(g：mL)的比例加入PDE-Glo Reaction Buffer(Tris-HCl 40mM，MgCl2 10mM，BSA 0.1mg/ml，另加入PMSF 1mM，leupetin 2μM/mL，aprotinin 2μM/mL，E-64 2μM/mL)，電子超聲器勻漿，4℃下14000rpm離心30分鐘，取上清液作為酶液，備用。

4.5.3 生物發光法測定：

按照試劑盒說明書提供的方法進行操作，酶反應液部分，加入1μL藥液，1.5μL酶液，共2.5μL；加入含有2μmol Cyclic AMP的底物溶液2.5μL，混勻，37℃反應30min，然後加入含有PDE強抑制劑IBMX的反應終止溶液2.5μL，混勻；加入測試溶液 2.5μL，混勻，室溫反應20min；最後加入發光試劑10μL，室溫反應10min後在多功能微孔板分析儀上進行測試。

5. 試驗結果

5.1 大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量：

用ELISA法測定了大鼠海馬組織勻漿液中Cyclic AMP濃度，除以稱量的組織樣本重量，得到海馬組織中含有的Cyclic AMP的含量，以pmol/g Tissue表示(第5圖)。

(實施例一組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中Cyclic AMP的含量顯著升高，*P<0.05，n=10)

5.2 大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性：

酶反應後，樣本進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀照相，進行粗略分析(第6圖)。

(泳道自左至右1-4生理鹽水組；5-8帕羅西汀組；9-11實施例一組；12正對照樣本；13負對照樣本)磷酸化的A1肽帶有負電荷，向正極方向移動；未磷酸化的A1肽帶有正電荷，向負極方向移動，將二者分開。其中向正極方向移動的已磷酸化的A1肽斑點亮度越高，表明磷酸化水準越高，樣本中cAMP-Dependent PKA活性越高。圖中可見實施例一組樣本正極方向斑點亮度較生理鹽水組和帕羅西汀組亮度更高。

切割瓊脂糖凝膠斑點，熔膠後定容，以螢光法測定大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性，以螢光強度表示(第7圖)。

(給藥8h後，實施例一組與空白對照組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性顯著升高，*P<0.05，n=10)

5.3 大鼠海馬組織中p-CREB含量：

採用BCA法測定了大鼠海馬組織樣本勻漿液中總蛋白的濃度，以標定每μg總蛋白中含有p-CREB的量。再採用sandwich ELISA法測定了大鼠海馬組織樣品勻漿液中p-CREB濃度，並以p-CREB(pg)/總蛋白(μg)表示大鼠海馬組織中p-CREB含量，結果見第8圖。

(給藥8h後，實施例一組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中p-CREB的含量升高，n=10)

5.4 藥物對大鼠海馬組織中磷酸二酯酶(PDE)活性影響：

用生物發光法測定了海馬組織中PDE的活性以及體外給予藥物後對PDE活性的抑製作用。以發光強度表示PDE活性，與對照組比較，發光強度較高，說明PDE活性較高；發光強度較低，說明PDE活性被抑制；測定的結果顯示，與空白對照組相比，實施例一(0.5mg/ml)明顯抑制了大鼠海馬組織中PDE的活性，*P<0.05，n=4。

6、結論

(1)大鼠灌胃給藥8小時後，與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，實施例一組大鼠腦海馬組織中的Cyclic AMP含量顯 著升高；cAMP-Dependent PKA活性顯著增強；p-CREB含量也有提高。

(2)本實驗證實了實施例一可以通過第二信使Cyclic AMP細胞信號轉導通路發揮藥理作用，並在給藥8小時後即可快速啟動cAMP-PKA-CREB(p-CREB)通路(與生理鹽水組和帕羅西汀組相比有顯著差異，*P<0.05)。

(3)同樣8小時給藥，陽性對照藥帕羅西汀並不能啟動cAMP-PKA-CREB(p-CREB)通路。

(4)本實驗結果尚且表明，實施例一中劑量組可顯著抑制大鼠海馬組織中磷酸二酯酶的活性，由於磷酸二酯酶是Cyclic AMP的滅活酶，其受到抑制後可使大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量升高。

實驗例二：慢性應激小鼠給藥實施例一10天，對cAMP/PKA/CREB信號轉導通路及BDNF表達量影響之動物實驗。

1. 實施例一對於重復應激小鼠海馬cAMP濃度的影響(第9圖)：

結果：給藥實施例一的小鼠海馬cAMP濃度，明顯高於未給藥的模型組，*P<0.05。

2. 實施例一對於慢性應激小鼠海馬PKA活性的影響(第10圖)：

結果：給藥實施例一的小鼠海馬PKA活性，明顯高於未給藥的模型組，*P<0.05。

3. 實施例一對於慢性應激小鼠海馬CREB磷酸化的影響(第11圖)：

結果：給藥實施例一的小鼠海馬CREB磷酸化的表達，明顯高於未給藥的模型組。

4. 實施例一對於慢性應激小鼠海馬BDNF的影響(第12圖)：

結果：給藥實施例一的小鼠海馬內BDNF的表達，明顯高於未給藥的模型組。

實驗例三：慢性應激大鼠給藥實施例一21天，對海馬cAMP、PKA以及血清BDNF和下丘腦NE、DA、5HT等表達量影響之動物實驗。

1. 實施例一對於慢性應激大鼠海馬及皮質cAMP濃度的影響(表1)：

2. 實施例一對於慢性應激大鼠海馬PKA含量的影響(表2)：

3. 實施例一對於慢性應激大鼠血清BDNF含量的影響(表3)：

4. 實施例一對於慢性應激大鼠下丘腦單胺類神經遞質表達量的影響(表4)：

5. 結論：

給藥實施例一的大鼠海馬cAMP、PKA，以及血清BDNF和下丘腦5-HT、NE、DA等單胺遞質的表達，明顯高於未給藥的模型組(*P<0.05)。

實驗例四：實施例一抗抑鬱藥效學動物實驗。

1. 行為學動物實驗：

抑鬱症的發病機制及臨床症狀，吾人選擇了小鼠懸尾、大鼠強迫游泳、小鼠強迫游泳、大鼠不可預測性長期應激、大鼠嗅球破壞模型等抗抑鬱行為學動物實驗。

1.1 實施例一灌胃給予小鼠20mg/kg/d、40mg/kg/d、80mg/kg(大鼠15mg/kg/d、30mg/kg/d、60mg/kg/d)，連續1周，即可表現出抗試驗性抑鬱的功效，其中中劑量組(小鼠40mg/kg/d、大鼠30mg/kg/d)與陽性藥帕羅西汀組(3mg/kg/d)均可明顯縮短懸尾小鼠不動時間，明顯縮短強迫游泳小鼠、大鼠的不動時間，與模型組相比具有明顯的統計學差異(P<0.05)。

1.2 實施例一灌胃給予慢性應激抑鬱模型(CUMS)大鼠15mg/kg/d、30mg/kg/d、60mg/kg/d，連續21天，結果：與正常組相比，模型組(CUMS)大鼠體重增長緩慢，蔗糖水消耗量明顯下降(P<0.01)，水準活動和垂直活動均顯著下降(P<0.01)，大鼠跳臺錯誤次數明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，實施例一小劑量組和陽性藥帕羅西汀組大鼠體重增長顯著提高、蔗糖水消耗量明顯增加(P<0.01)，實施例一小劑量組和陽性藥帕羅西汀組大鼠水準和垂直活動明顯增加(P<0.01)，實施例一小劑量組和陽性藥帕羅西汀組跳臺錯誤次數明顯減少(P<0.05、P<0.01)。

1.3 實施例一灌胃給予嗅球破壞模型大鼠15mg/kg/d、30mg/kg/d、60mg/kg/d，連續24天，在開野箱試驗中 實施例一大劑量組與模型組相比，可明顯改善嗅球毀損所造成的大鼠水準及垂直運動減少，陽性參照藥帕羅西汀(3mg/kg/d)也可以明顯改善嗅球毀損所造成的大鼠水準運動減少；在被動回避試驗中實施例一大、中劑量組和陽性藥帕羅西汀組與模型組相比，均可明顯改善嗅球毀損所造成的大鼠學習及記憶功能減退。

2. 相互作用模型動物實驗：

根據抑鬱症的發病機制及臨床症狀，吾人選擇了小鼠利血平模型(體溫下降、運動不能、眼瞼下垂)和五羥色氨誘導小鼠甩頭等試驗。

2.1 實施例一灌胃給予小鼠20mg/kg/d、40mg/kg/d、80mg/kg/d(大鼠15mg/kg/d、30mg/kg/d、60mg/kg/d)，連續1周，可明顯拮抗利血平誘導的小鼠體溫下降、運動不能及眼瞼下垂，表明實施例一抗試驗性抑鬱作用可能與影響單胺遞質有關；可明顯增加小鼠注射五羥色氨酸後的甩頭次數，表明實施例一抗抑鬱作用可能與抑制MAO有關。此外，由於試驗結果表明實施例一對小鼠自主活動無明顯影響，實施例一無中樞興奮作用。

3. 實施例一主要抗抑鬱藥效學實驗結果整理如下表(表5)：

4. 結論：實施例一具有明顯抗試驗性抑鬱作用。

各項實驗例的結果顯示：

(1)大鼠灌胃給藥實施例一8小時後，與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，海馬組織cAMP顯著升高、PKA活性顯著增強(*P<0.05)，p-CREB含量也有所升高，PDE4的活性受到明顯抑制(*P<0.05)。

(2)慢性應激小鼠灌胃給藥實施例一10天後，可以顯著提高由於重複應激導致的海馬cAMP、PKA的下降，促進小鼠海馬內磷酸化CREB和BDNF的表達(*P<0.05)。

(3)慢性應激大鼠灌胃給藥實施例一21天後，可顯著提高由于重複應激導致的海馬cAMP、PKA的下降，促進血清BDNF和下丘腦NE、5-HT等單胺遞質的表達(*P<0.05)，下調血清GSC。

(4)實施例一具有明顯抗試驗性抑鬱作用。

本發明迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物的應用範圍： 1. 本發明所述的迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物中，可以含有藥物學上可接受的添加劑；2. 本發明所述的迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物可以將其加工製成散劑、膠囊劑、片劑、等各種習知的劑型；以及3. 本發明所述的迅速增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物可以製成預防和治療體內和細胞中cAMP含量及利用度低下導致的的疾病、強化BDNF表現量、強化細胞內cAMP/PKA/CREB信號轉導通路，以及增加腦內DA、NE及5HT神經遞質含量和增強記憶力的藥物、保健食品和營養劑。

綜言之，本發明之實施例如次：

1. 一種增加體內環腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，包括：一第一主要成份：包含人參皂甙Rg1、Rb1及Re；一第二主要成份：包含一甘草酸類，係選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及一第三主要成份：包含一大棗環腺苷單磷酸製成。

2. 如實施例1所述的藥物組合物，其中該藥物組合物包括2~26重量份的該人參皂甙Rg1及Rb1、3~48重量份的該甘草酸類及0.002~0.5重量份的該大棗環腺苷單磷酸。

3. 如實施例1或2所述的藥物組合物，其中該藥物組合物包括4~13重量份的該人參皂甙Rg1及Rb1、5~16重量份的該 甘草酸類及0.01~0.1重量份的該大棗環腺苷單磷酸。

4. 如實施例1至3任何一項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物含有選自藥學上可接受的一載體、一添加劑及其組合之一。

5. 如實施例1至4任何一項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物製成一劑型，該劑型係選自一錠劑、一膠囊劑、一散劑、一片劑、一粉劑、一溶液劑、一微囊劑、一混懸劑、一乳劑、一顆粒劑、一滴丸劑、一丸劑及藥劑學上的一口服藥物劑型其中之一。

6. 如實施例1至5任何一項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物可以製成預防和治療體內及細胞中cAMP含量及利用度低下、強化細胞內cAMP/PKA/CREB信號轉導通路、強化BDNF表現量、增加腦內DA、NE及5HT神經遞質含量和增強記憶力的藥物、保健食品和營養劑。

7. 如實施例1至6任何一項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物更包含一第四主要成分，其係選自一生薑粉及生薑萃取物及其組合之一。

8. 一種增加體內環腺苷單磷酸利用度之藥物組合物，包括：一第一主要成份：包含人參皂或Rg1、Rb1及Re；一第二主要成份：包含一甘草酸類，係選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及 一第三主要成份：包含一大棗環腺苷單磷酸製成。

9. 一種製造增加體內環腺苷單磷酸含量之一藥物組合物之方法，包括：提供一第一主要成份，其中該第一主要成分包含人參皂甙Rg1、Rb1及Re；提供一第二主要成份，其中該第二主要成分包含一甘草酸類，係選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及提供一第三主要成份，其中該第三主要成分包含一大棗環腺苷單磷酸，以製成該醫藥組合物。

本案得由熟悉此技藝之人任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請範圍所欲保護者。

Claims (3)

1. 一種藥物組合物用於製備治療記憶力不足、阿茲海默症、帕金森氏症、牛皮癬、心臟病及癌症的藥物的用途，其中該藥物組合物包括：一第一主要成份：包含2~26重量份的人參皂甙Rg1、Rb1及Re；一第二主要成份：包含3~48重量份的一甘草酸類，係選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及一第三主要成份：包含0.002~0.5重量份的一大棗環腺苷單磷酸，其中該藥物組合物強化細胞內cAMP/PKA/CREB訊息傳導路徑。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該藥物組合物包括4~13重量份的該人參皂甙Rg1、Rb1及Re、5~16重量份的該甘草酸類及0.01~0.1重量份的該大棗環腺苷單磷酸。
3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該藥物組合物可以製成預防和治療體內及細胞中cAMP含量及利用度低下、強化細胞內cAMP/PKA/CREB信號轉導通路、強化BDNF表現量、增加腦內DA、NE及5HT神經遞質含量和增強記憶力的藥物、保健食品和營養劑。