TWI624279B - Patch and its use for treating oral cancer - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種貼片，其係包含有結蘭膠、氯碘羥喹、葡萄糖胺及交聯劑。藉由本發明所揭貼片，其係能夠用於抑制口腔癌細胞增生及轉移，並使口腔癌細胞走向凋亡，而能更達到治療口腔癌或延緩口腔癌惡化之功效。
Description
本發明係有關於一種醫藥組合物，特別係指一種貼片及其用於治療口腔癌之用途。
按，全世界每年有將近50萬人罹患口腔癌，其中有約15萬名患者會死亡。紅斑與白斑為口腔癌前病變之病徵，其中，白斑係為口腔內或舌頭上受到慢性刺激而逐漸形成之厚白灰色之斑塊；紅斑則為口腔黏膜上形成非正常之紅色區域或紅色斑點，而紅斑發生之區域通常容易出血。
目前臨床上對於口腔癌之治療策略大多以手術為主，放射治療及化學治療為輔，因而使口腔癌患者於治療過程中皆會面臨術後口腔內傷口照護及投藥之問題。具體來說，大多口腔癌患者於手術後須合併藥物治療，而口腔癌患者於術後口腔分泌物會增加，且口腔內細菌眾多，以致於傷口照護之難度增加，雖然目前臨床上係使用外傷敷料作為口腔癌傷口照護之用，惟，癌症治療除了要加速傷口復原外，更重者在於抑制癌細胞增生，此為一般外傷敷料所無法達成者，亦為目前臨床上口腔癌治療面臨到之問題。
本發明之主要目的係在於提供一種貼片，其係能夠於充滿液體之環境內維持其穩定性，並且長時間地釋放藥物。
本發明之另一目的係在於提供一種貼片之用途，其係能夠用於抑制口腔癌細胞增生及轉移，並使口腔癌細胞走向凋亡，而能更達到治療口腔癌或延緩口腔癌惡化之功效。
緣是，為能達成本發明之目的，本發明係揭露一種貼片，其係包含有結蘭膠、氯碘羥喹、葡萄糖胺及交聯劑。
於本發明之一實施例中，藉由將本發明所揭貼片覆蓋於口腔黏膜之傷口或是口腔癌手術後之傷口上，貼片內之藥物係能長時間地持續被釋放至患部，達到抑制口腔癌細胞持續增生或轉移之功效，並且，亦能避免傷口與外界接觸，達到照護傷口之功效。
其中，該交聯劑係為EDC，而能用於與結蘭膠及葡萄糖胺進行交聯反應，使結蘭膠及葡萄糖胺相互交聯。
其中，結蘭膠與葡萄糖胺之重量比為4：1。
而本發明所揭貼片係由下列步驟所製成：
步驟a：取氯碘羥喹、結蘭膠、葡萄糖胺，加以溶解混合，形成一組合物。
步驟b：乾燥該組合物，得到一第一薄膜。
步驟c：該第一薄膜與交聯劑反應，使結蘭膠與葡萄糖胺進行交聯反應，並使結蘭膠與氯碘羥喹共價鍵結。
步驟d：得到一結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜。
其中，於步驟c與步驟d間係更包含一乾燥程序。
更進一步來說，為能使本發明所揭貼片能夠發揮較佳之抑制癌細胞生長之功效，其更包含有銅離子或是含有銅離子之化合物，如氯化銅。以治療口腔癌來說，氯碘羥喹與氯化銅之劑量比例係為1：5～1：1。
以下將茲舉若干實例並搭配說明及圖式，進一步說明及驗證本發明之功效如下。
以下實例中之動物試驗係經過中山醫學大學實驗動物中心核准。
實例一：製造口腔癌貼片
將50毫克之氯碘羥喹（clioquinol，簡稱CQ）溶解於2毫升之DMSO，形成氯碘羥喹/DMSO溶液。將氯碘羥喹/DMSO溶液、28毫升之1％（wt）結蘭膠（Gellan gum，簡稱GG）水溶液及7毫升之1％（wt）葡萄糖胺（簡稱GS）水溶液混合後，置於37℃、1大氣壓下，進行乾燥程序而形成結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹薄膜。將GG/GS/CQ薄膜浸於含有15mM 交聯劑之蒸餾水中，於室溫下進行交聯反應，約24小時，以形成一交聯膜，其中，於本實例中所使用之交聯劑為EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide）。以蒸餾水清洗該交聯膜，以去除殘留之交聯劑，並且於室溫下乾燥，得到結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜，此即為本發明所揭口腔癌貼片。
本發明所揭口腔癌貼片（結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜）之平均厚度為22±4μm，並且呈現柔軟、具彈性、透明、固定性等特性。
實例二：分析口腔癌貼片（一）
以如實例一所述方法製備本實例所欲分析之各薄膜。
以FTIR-L396A（Perkin-Elmer）分析結蘭膠、結蘭膠/氯碘羥喹薄膜（無交聯劑）、 結蘭膠/氯碘羥喹/EDC薄膜、結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜。以傅立葉紅外光譜進行分析結果係如第一圖及第二圖所示。
由第一圖之結果可知，於結蘭膠之FTIR光譜中，於3332、2894、1600、1403、1017 cm-1處之波峰係分別來自於-OH、脂肪族-CH、不對稱之COO-、對稱之COO-、羥基C-O鍵之伸縮共振。於結蘭膠/氯碘羥喹薄膜之FTIR光譜中，氯碘羥喹之存在使得1480 cm-1處出現一個波峰，來自於雜環芳香環中之C=C與C=N之伸縮共振，而於1201 cm-1處之波峰係來自於氯碘羥喹中脂肪族C-N之拉伸；氯碘羥喹之N-H基團係顯現於3400-3250cm-1處之拉伸頻率，以及與結蘭膠之-OH間之重疊。於結蘭膠/氯碘羥喹/EDC薄膜之FTIR光譜中，由於EDC與結蘭膠/氯碘羥喹進行交聯反應，因而於1708及1556 cm-1處係出現兩個新的吸收波峰，其中，於1708 cm-1處之波峰係為結蘭膠之β-D-葡萄醣醛酸（GlcpA）上之羧基，能用以與-OH基團間產生酯鍵，證實結蘭膠確實與EDC具有交聯反應；於1556 cm-1處之波峰係用以證實結蘭膠之β-D-葡萄醣醛酸（GlcpA）上之羧基能與氯碘羥喹之-NH基團產生N=O鍵，以確認氯碘羥喹能夠藉由EDC介入反應而與結蘭膠共價結合。
由第二圖之結果可知，透過EDC進行交聯反應之結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜，於1705及1571 cm-1處係出現兩個新的吸收波峰，由此顯示氯碘羥喹係能共價結合於結蘭膠上，但是無法透過EDC與葡萄糖胺結合。
由此可知，本發明所揭口腔癌貼片必須要藉由EDC透過羥基和羧酸反應以與結蘭膠交聯，並胺和羧酸反應以交聯結蘭膠與葡萄糖胺，而藥物氯碘羥喹係透過EDC與結蘭膠/葡萄糖胺間形成穩定之共價鍵。
實例三：分析口腔癌貼片（二）
將結蘭膠/葡萄糖胺薄膜（無交聯劑）、結蘭膠/葡萄糖胺/EDC薄膜及結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜分別裁切為2cm x 2cm後，分別測量其乾重（Wd），再將各該薄膜置於磷酸鹽緩衝液中24小時，過濾後，測量各該薄膜之濕重（Ww）。而後，將各該薄膜置於50℃烘箱乾燥24小時，測量其經二次乾燥之重量（Wrd）。以下列公式計算出各該薄膜之凝膠含量及含水量，結果如下表一所示。
凝膠含量（％）＝Wrd/Wd x100%
含水量（％）＝[(Wrd-Wd)/Wrd] x100%
再者，將上述薄膜分別裁切為1cm x 5cm。藉由H1-KS機器（Tinius Olsen），以移動速度（crosshead speed）為5mm/min之條件測量各該薄膜之機械性質，結果如下表一所示。
表一：各該薄膜之物理性質
<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 薄膜種類 </td><td> 凝膠含量（％） </td><td> 含水量（％） </td><td> 機械測試 </td></tr><tr><td> 最大力（gf） </td><td> 最大強度（kgf/mm<sup>2</sup>） </td><td> 斷裂伸長率（％） </td></tr><tr><td> 蘭膠/氯碘羥喹薄膜 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1040±34 </td><td> 1.73±0.05 </td><td> 3.52±0.42 </td></tr><tr><td> 結蘭膠/葡萄糖胺/EDC薄膜 </td><td> 80.5±1.4 </td><td> 93.5±0.5 </td><td> 1266±78 </td><td> 2.11±0.13 </td><td> 25.71±0.90 </td></tr><tr><td> 結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜 </td><td> 83.5±0.6 </td><td> 92.4±0.6 </td><td> 1146±11 </td><td> 1.91±0.02 </td><td> 5.01±0.86 </td></tr></TBODY></TABLE>
由上表一之結果可知，由於氯碘羥喹能與結蘭膠形成共價鍵，而能增加結蘭膠聚合物之交聯度，使得結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜之凝膠含量係高於結蘭膠/葡萄糖胺/EDC薄膜。
再者，由於口腔癌貼片係須長時間存在於充滿口腔液體之環境中，倘若薄膜吸水率過高，會容易吸收過量水分而膨脹變形，以致於無法用於口腔內治療用。而由表一之結果可知，本發明所揭口腔癌貼片之含水量係不因增加藥物而降低，亦即本發明所揭口腔癌貼片應能長時間且不變形地存在於充滿液體之環境中，顯示本發明所揭口腔癌貼片係適合用於治療口腔內傷口。
實例四：體外釋放試驗
本實例係於15毫升管中進行。將1平方公分大小之結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜浸置於1毫升磷酸鹽緩衝液（0.02M、PH 7.2）中，置於37℃下，並搖晃45天，而於測定之時間點，以新鮮磷酸鹽緩衝液進行置換，並且以分光光度計於波長255nm下檢測氯碘羥喹之含量，結果如第三圖所示。
更進一步地，藉由Higuchi模型來分析氯碘羥喹釋放動力學，結果如第四圖所示，其中，Qt為時間內藥物溶解之總量。
由第三圖之結果可知，氯碘羥喹係釋放量係會隨著時間而增加，並於測試45天後，結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜釋放氯碘羥喹之釋放率為86.8％。由此顯示本發明所揭口腔癌貼片置於口腔癌患部或傷口時，係能快速地氯碘羥喹被口腔液體稀釋及清除，並且，藥物能夠長時間地持續被釋放，具體來說，每隔一天之藥物釋放率約為6～8％（8.0～10.8μM）。
實例五：細胞毒性測試
將人類口腔癌細胞（OC-2細胞）置於96孔盤中，每孔細胞數量為5000。過夜培養後，分別以2、5、10μM之氯碘羥喹、與10μM氯化銅混合之2、5、10μM之氯碘羥喹處理人類口腔癌細胞，並以DMSO處理之細胞作為控制組。為能定量細胞存活率，將培養基置換為含有10％MTT之培養基（150μL），於37℃下培養1小時後，移除MTT溶液，再加入100μL之DMSO至細胞中，再藉由ELISA讀取機（Power Wave 340; BioTek Instruments, Inc.）於波長595nm下或微量盤式分析儀（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA）檢測細胞，以得到經不同條件處理之細胞之存活率，結果如第五圖所示。
由第五圖之結果可知，細胞存活率係隨著氯碘羥喹之劑量增加而下降，並且，10μM氯化銅係能增加抑制細胞生長之效果，具體來說，單獨使用氯碘羥喹之IC50為9.59μM，而同時使用氯碘羥喹與氯化銅之IC50為2.22μM。
由此顯示，藉由將本發明所揭口腔癌貼片貼於口腔癌患部，係能夠透過釋放出氯碘羥喹達到殺死癌細胞或抑制癌細胞生長之效果，並且，本發明所揭口腔癌貼片所釋放出之藥物係能與銅離子具有協同作用，增加其毒殺細胞之能力。
實例六：動物試驗
自國家實驗動物中心購入4週齡之雄性敘利亞金倉鼠。以0.5％之DMBA（7, 12-dimethyl-1,2-benz[a]anthracene）/礦物油溶液塗抹於倉鼠左臉頰之黏膜表面，每週三次，連續14週，以誘導倉鼠左臉頰內黏膜致癌，以形成口腔鱗狀細胞癌動物模式，如第六圖所示。將倉鼠之腫瘤及週邊組織移除，並於傷口處貼附實例一所製備之口腔癌貼片，如第七圖所示，作為實驗組，而以未貼附口腔癌貼片者作為對照組；移除腫瘤及週邊組織7天後，將倉鼠犧牲，分別取倉鼠傷口部位，以10％福馬林固定，再以組織免疫染色法觀察上皮生長因子受體之表現，結果如第八圖所示。
由第八圖之結果可知，未貼附口腔癌貼片之倉鼠，其癌細胞係持續過度增值並且浸潤至皮下組織，並且，由第八圖A中之紅點處可清楚觀察到上皮生長因子受體係呈現陽性反應，表現量顯著增加。而有貼附口腔癌貼片之倉鼠，其癌組織區域明顯變小，腫瘤細胞排列係較未貼附口腔癌貼片者鬆散，表示癌細胞之生長係有被抑制，並且走向凋亡。
由第八圖之結果顯示，本發明所揭口腔癌貼片係能夠抑制口腔癌細胞增值與移轉，能夠作為口腔癌臨床治療之一環或是輔助療法，並且，能夠有效地使傷口復原速度增加，以避免感染病症之發生。
無
第一圖係為以FTIR-L396A（Perkin-Elmer）分析結蘭膠（GG）、結蘭膠/氯碘羥喹薄膜（GG/CQ）、 結蘭膠/氯碘羥喹/EDC薄膜（GG/CQ/EDC）之結果。 第二圖係為以FTIR-L396A（Perkin-Elmer）分析結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜之結果。 第三圖係顯示結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜進行藥物釋放試驗之結果。 第四圖係以Higuchi模型來分析氯碘羥喹釋放動力學之結果，其中，Qt為時間內藥物溶解之總量。 第五圖係顯示人類口腔癌細胞經由不同條件處理後之細胞存活率。 第六圖係為口腔鱗狀細胞癌模式倉鼠之照片。 第七圖係為口腔鱗狀細胞癌模式倉鼠於患部貼上本發明所揭口腔癌貼片之照片。 第八圖A係以免疫染色法觀察未以本發明所揭口腔癌貼片治療之口腔癌患部之結果。 第八圖B係以免疫染色法觀察以本發明所揭口腔癌貼片治療後之口腔癌患部之結果。
Claims (10)
- 一種貼片，其係包含有結蘭膠、氯碘羥喹、葡萄糖胺及交聯劑，其中，交聯劑為EDC。
- 依據申請專利範圍第1項所述貼片，其更包含銅離子。
- 依據申請專利範圍第1項所述貼片，其更包含氯化銅。
- 依據申請專利範圍第3項所述貼片，其中，氯碘羥喹與氯化銅之劑量比例係為1：5~1：1。
- 依據申請專利範圍第1項所述貼片，其中，結蘭膠與葡萄糖胺之重量比為4：1。
- 依據申請專利範圍第1項所述貼片，其係由下列步驟所製成者：步驟a：取氯碘羥喹、結蘭膠、葡萄糖胺，加以溶解混合，形成一組合物；步驟b：乾燥該組合物，得到一第一薄膜；步驟c：該第一薄膜與結蘭膠反應，使結蘭膠與葡萄糖胺進行交聯反應，並使結蘭膠與氯碘羥喹共價鍵結；步驟d：得到一結蘭膠/葡萄糖胺/氯碘羥喹/EDC薄膜。
- 一種貼片，其係包含有結蘭膠、氯碘羥喹、葡萄糖胺、交聯劑及銅離子。
- 一種貼片，其係包含有結蘭膠、氯碘羥喹、葡萄糖胺、交聯劑及氯化銅。
- 依據申請專利範圍第8項所述貼片，其中，氯碘羥喹與氯化銅之劑量比例係為1：5~1：1。
- 一種將申請專利範圍第1、7或8項所述貼片用於製造治療口腔癌之醫藥組合物之用途。
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Non-Patent Citations (2)
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| Mol.Cancer Ther.,Vol.5,no.7,July 2006 * |
| Mol.Cancer Ther.,Vol.5,no.7,July 2006。 |
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