TWI617665B - 用於重建神經血管組織之細胞層片結構物 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種用於重建神經血管組織之細胞層片結構物，包含一血管內皮細胞層與一神經幹細胞層，且該血管內皮細胞層與該神經幹細胞層直接接觸，該血管內皮細胞層形成血管分枝，該神經幹細胞層分化出神經元。
Description
本發明係關於一種用於重建神經血管組織之細胞層片結構物，特別是一種將血管內皮細胞與神經幹細胞直接接觸相互作用，以分化出血管分枝及神經元所形成的細胞層片結構物。
細胞療法(cell-based therapies)已成為治療受損或病變器官及組織的關鍵治療方式。然而，將細胞療法應用於具有高度複雜性的神經系統，例如以細胞療法進行腦中風病患的腦組織重建，依然是有待突破的治療領域。若要藉由細胞療法來恢復中樞神經系統功能，需要使神經元在腦部適當的環境裡，正常地發揮傳遞神經訊號的功能。由於負責傳遞神經訊號的神經元受到血管內皮細胞的調控，並與血管內皮細胞相互作用，因此神經元必須在神經血管單元(the neurovascular unit)內發揮其功能。
一些研究團隊試圖以組織工程(tissue engineering)方法在體外提供再生之神經血管組織。然而，這些團隊無法藉由共同培養神經幹細胞和血管內皮細胞以形成具有神經血管組織的細胞層片[Hicks C, Stevanato L, Stroemer RP, Tang E, Richardson S, Sinden J. In vivo and in vitro characterization of the angiogenic effect of CTX0E03 human neural stem cells. Cell transplantation. 2013; 22:1541-1552]。這些研究的主要困難在於，神經幹細胞與血管內皮細胞進行適當分化所需要的環境條件不同。例如，Hicks等人採用Matrigel基質提供了血管內皮細胞形成血管分枝狀組織，卻無法供應神經幹細胞分化成為神經元的條件。此外，Matrigel為混合物基質，不同供應商及貨號的Matrigel所含的蛋白質與生長因子濃度不同，無法提供一致的環境條件促使神經幹細胞進行分化。
是以，研發出具有分化的神經元及血管分枝的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物，對於重建神經血管組織的應用來說，是必要且刻不容緩的事。
本發明提供一種用於重建神經血管組織之細胞層片結構物，包含一血管內皮細胞層以及一神經幹細胞層；該血管內皮細胞層具有血管內皮細胞，該神經幹細胞層具有神經幹細胞；其中該血管內皮細胞層與該神經幹細胞層直接接觸，且該血管內皮細胞層形成血管分枝，該神經幹細胞層分化出神經元。
本發明提供一種用於重建神經血管組織之細胞層片結構物。該細胞層片結構物包含一血管內皮細胞層以及一神經幹細胞層，該血管內皮細胞層具有血管內皮細胞，該神經幹細胞層具有神經幹細胞，該血管內皮細胞層與該神經幹細胞層直接接觸相互作用，且該血管內皮細胞層可提供培養該神經幹細胞層分化所需的細胞與胞外基質，進而使該神經幹細胞層分化出神經元且該血管內皮細胞層形成血管分枝，該血管分枝可提供神經幹細胞需要的養分。
如本文所用，術語「血管內皮」意指位於血管內表面的單層扁平細胞，該單層細胞形成血管內壁，是血管管腔中血液與血管壁其餘部分之間的界面；術語「血管內皮細胞」意指形成該血管內皮的細胞，包括但不限於冠狀動脈內皮細胞、主動脈內皮細胞、腦微血管內皮細胞、臍靜脈內皮細胞，以及真皮層血管內皮細胞。於某些實施例中，該血管內皮細胞為人類腦微血管內皮細胞。
如本文所用，術語「神經幹細胞」意指具有自我更新、多潛能分化能力，並且可分化為神經系統中主要表型的細胞，神經幹細胞主要分化為神經元、星狀細胞以及寡樹突細胞等神經系細胞；神經幹細胞包括但不限於腦神經幹細胞、神經嵴幹細胞、中樞神經幹細胞，或周邊神經幹細胞。於某些實施例中，該神經幹細胞為人類腦神經幹細胞。
於某些實施例中，該血管內皮細胞層進一步包含胞外基質(extracellular matrix)，該胞外基質與該血管內皮細胞可作為一載體。該胞外基質係由該血管內皮細胞合成並分泌到細胞外，其為分佈在細胞表面及/或細胞之間的大分子，這些大分子構成複雜的網架結構，支持並連接組織結構、調節組織的發生和細胞的生理活動。該胞外基質包含聚胺基酸(polypeptide)、膠原蛋白(collagen)、聚多糖(polysaccharide)、透明質酸(hyaluronic acid)、纖維連接蛋白(fibronectin)、玻璃粘連蛋白(vitronectin)、層連結蛋白(laminin)，或其混合物。
本發明所提供之細胞層片結構物可進一步被轉移至目標處，而繼續分化出神經元以及形成血管分枝。該目標處包含但不限於腦部、肢體或心臟等器官內的神經血管組織。於某些實施例中，該目標處為哺乳動物的大腦皮層。在某些實施例中，該哺乳動物為一大鼠、小鼠、山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬或人類。
本發明並提供一種新的細胞培養方法，以製造如前述之細胞層片結構物，供重建神經血管組織之用。該細胞層片結構物的形成，取決於神經幹細胞和血管內皮細胞之間的直接接觸和相互作用；因此，將單層血管內皮細胞做為培養神經幹細胞的培養基質和特定環境，以促使該神經幹細胞進行分化，同時，神經幹細胞亦可促使血管內皮細胞形成血管分枝，形成具有神經血管組織功能的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片。該方法包含下列步驟：將血管內皮細胞培養於一培養基質上至形成一血管內皮細胞層，以及將神經幹細胞培養於該血管內皮細胞層之上，使該神經幹細胞與該血管內皮細胞層直接接觸，並培養至分化出血管分枝及神經元，以形成一細胞層片結構物。
於某些實施例中，該培養基質含有膠原蛋白。該膠原蛋白包含但不限於第一型至第二十八型膠原蛋白。於某些實施例中，該膠原蛋白為第一型膠原蛋白。
於某些實施例中，該血管內皮細胞層的細胞密度約為100,000個細胞/cm2
至300,000個細胞/cm2
。於某些實施例中，該神經幹細胞的培養密度為10,000個細胞/cm2
至100,000個細胞/cm2
。
於某些實施例中，該血管內皮細胞係以內皮細胞培養液培養。於某些實施例中，該內皮細胞培養液為包含1-10% (v/v)胎牛血清以及0.1-5% (v/v) 10,000 U/mL青黴素與0.1-5% (v/v) 10,000 U/mL鏈黴素的EGM-2細胞培養液。
於某些實施例中，該神經幹細胞與該血管內皮細胞層直接接觸並以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液培養。在某些實施例中，該神經幹細胞/內皮細胞共同培養液不包含血清，以減少血清等混合物可能產生的變異性，並藉由共同培養神經幹細胞與內皮細胞，以互相支持神經幹細胞與內皮細胞的生長及分化。於某些具體實施例中，該神經幹細胞/內皮細胞共同培養液含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培養液，以及0.001-0.03% (v/v)人類白蛋白溶液、100-5000 µg/ml運鐵蛋白、0.1-100 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、0.1-10 µg/ml胰島素、1-100 ng/ml黃體素、0.1-10 mM左旋麩醯胺酸以及1-100 ng/ml亞硒酸鈉。
於某些實施例中，該方法進一步包含轉移該細胞層片結構物至一新的培養基質上，並繼續培養，以增進該神經幹細胞分化成神經元的比例，同時維持血管分支的形成和內皮細胞的分化。於某些具體實施例中，先以感溫性基質材料培養該血管內皮細胞與神經幹細胞以形成神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片，接著在室溫下使該細胞層片脫離感溫性基質材料，而附著於轉移膜上，以轉移該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片至新的膠原蛋白基質之上繼續培養，結果神經幹細胞分化成神經元的比例增加了一倍多，因而增進神經血管組織的功能。
於某些實施例中，該新的培養基質含有膠原蛋白。該膠原蛋白包含但不限於第一型至第二十八型膠原蛋白。於某些實施例中，該膠原蛋白為第一型膠原蛋白。
於本發明中所使用之單數形式「一」、及「該」包含複數形式，除非文中另有清楚指明者。因此，例如，當提及「一樣本」時，包含複數個該等樣本及對該領域具有通常技藝者所知之同等物。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例限制。
實施例一 人類腦神經幹細胞株的培養
細胞培養用的以下材料係商業上購買得到。人類腦神經幹細胞株來自於Merck Millipore公司(麻州，美國)。DMEM/F-12培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)、運鐵蛋白(Transferrin)、丁二胺二鹽酸鹽(Putrescine DiHCl)、胰島素(Insulin)、黃體素(Progesterone)、左旋麩醯胺酸(L-glutamine)、亞硒酸鈉(Sodium selenite)、4-羥基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen)、Accutase酵素等購自Sigma-Aldrich公司(密蘇里州，美國)。人類白蛋白溶液(Human albumin solution)購自GemBio公司(加州，美國)。人類再重組上皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自PeproTech公司(紐澤西州，美國)。
將上述人類腦神經幹細胞播植於培養皿內，以神經幹細胞培養液(含有0.03%人類白蛋白溶液、100 µg/ml運鐵蛋白、16.2 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、5 µg/ml胰島素、60 ng/ml黃體素、2 mM左旋麩醯胺酸、40 ng/ml亞硒酸鈉、10 ng/ml鹼性纖維母細胞生長因子、20 ng/ml上皮生長因子以及100 nM 4-羥基三苯氧胺的DMEM/F-12培養液)於37°C、5% CO2
下進行培養48小時後，以Accutase酵素處理使細胞自培養皿表面剝離，取得人類腦神經幹細胞懸浮液，以進行人類腦神經幹細胞和人類腦微血管內皮細胞的共同培養。
實施例二 人類腦微血管內皮細胞株的培養
細胞培養用的以下材料係商業上購買得到。人類腦微血管內皮細胞株來自於Lonza公司(紐澤西州，美國)。EGM-2細胞培養液購自Lonza公司(紐澤西州，美國)。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自PAA公司(安大略省，加拿大)。抗生素溶液[含有10,000U/mL青黴素(penicillin)與10,000U/mL鏈黴素(streptomycin)]購自Invitrogen公司(加州，美國)。
將上述人類腦微血管內皮細胞播植於培養皿內，以內皮細胞培養液(含有5%胎牛血清以及1%的上述抗生素溶液的EGM-2細胞培養液)於37°C、5% CO2
下進行培養48小時後，以Accutase酵素處理使細胞自培養皿表面剝離，取得人類腦微血管內皮細胞懸浮液，以進行人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養。
實施例三 人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養
首先，將上述實施例二所得之人類腦微血管內皮細胞懸浮液播植於覆蓋有膠原蛋白(collagen type I，BD Biosciences公司，美國)的培養皿內，以內皮細胞培養液[含有5%胎牛血清以及1%抗生素溶液(含有10,000 U/mL青黴素與10,000 U/mL鏈黴素)的EGM-2細胞培養液於37°C、5% CO2
下培養至細胞密度約200,000 cells/cm2
，以形成一內皮細胞層。接著，將上述實施例一所得到之人類神經幹細胞懸浮液以約50,000 cells/cm2
的密度播種於該內皮細胞層上，使神經幹細胞與內皮細胞直接接觸並相互作用，並以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液(含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培養液，以及0.015%人類白蛋白溶液、500 µg/ml運鐵蛋白、8.1 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、2.5 µg/ml胰島素、30 ng/ml黃體素、1 mM左旋麩醯胺酸與20 ng/ml亞硒酸鈉)於37°C、5% CO2
下培養細胞7天，每2天更換一次培養液，至分化出血管分枝與神經元及其他神經系細胞(neural lineage cells)，以形成一神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物。並將該細胞層片結構物以4%三聚甲醛固定10分鐘，並以磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline, PBS)清洗後，於4°C下保存於PBS中，待進行免疫螢光染色(immunocytochemistry)分析。
另外，分別以單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)、單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)，以及以Transwell®通透性支持物(Corning公司，美國)隔開人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養物(對照組3)作為對照組，以比較本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物血管分枝與神經元及其他神經系細胞分化的情形。
單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)之培養方法如下。將上述實施例一所得到之人類腦神經幹細胞懸浮液以約25,000 cells/cm2
的密度播種於覆蓋有層連結蛋白(laminin, Sigma-Aldrich公司，美國)的培養皿內，以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液(含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培養液，以及0.015%人類白蛋白溶液、500 µg/ml運鐵蛋白、8.1 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、2.5 µg/ml胰島素、30 ng/ml黃體素、1 mM左旋麩醯胺酸與20 ng/ml亞硒酸鈉)於37°C、5% CO2
下培養細胞，每2天更換一次培養液，細胞培養7天後以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定10分鐘，並以PBS清洗後，於4°C下保存於PBS中，待進行免疫螢光染色分析。
單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)之培養方法如下。將上述實施例二所得之人類腦微血管內皮細胞懸浮液以約40,000 cells/cm2
的密度播植於覆蓋有膠原蛋白(collagen type I，BD Biosciences公司，美國)的培養皿內，以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液(含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培養液，以及0.015%人類白蛋白溶液、500 µg/ml運鐵蛋白、8.1 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、2.5 µg/ml胰島素、30 ng/ml黃體素、1 mM左旋麩醯胺酸與20 ng/ml亞硒酸鈉)於37°C、5% CO2
下培養細胞，每2天更換一次培養液，細胞培養7天後以4%三聚甲醛固定10分鐘，並以PBS清洗後，於4°C下保存於PBS中，待進行免疫螢光染色分析。
以Transwell®通透性支持物隔開人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養物(對照組3)之培養方法如下。將上述實施例一所得到之人類腦神經幹細胞懸浮液以約15,000 cells/cm2
的密度播種於覆蓋有層連結蛋白(laminin, Sigma-Aldrich公司，美國)的Transwell®通透性支持物(0.4 µm孔徑的聚酯膜，Corning公司，美國)上，以神經幹細胞培養液(含有0.03%人類白蛋白溶液、100 µg/ml運鐵蛋白、16.2 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、5 µg/ml胰島素、60 ng/ml黃體素、2 mM左旋麩醯胺酸、40 ng/ml亞硒酸鈉、10 ng/ml鹼性纖維母細胞生長因子、20 ng/ml上皮生長因子以及100 nM 4-羥基三苯氧胺的DMEM/F-12培養液)於37°C、5% CO2
下培養至80%滿盤(confluency)。另一方面，將上述實施例二所得之人類腦微血管內皮細胞懸浮液以約40,000 cells/cm2
的密度播植於覆蓋有膠原蛋白(collagen type I，BD Biosciences公司，美國)的培養皿內，以內皮細胞培養液(含有5%胎牛血清以及1%的上述抗生素溶液的EGM-2細胞培養液)於37°C、5% CO2
下培養7天後，將含有人類腦神經幹細胞的Transwell®通透性支持物置於該內皮細胞上方，Transwell®通透性支持物與該內皮細胞底部的距離約為850 µm，並以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液(含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培養液，以及0.015%人類白蛋白溶液、500 µg/ml運鐵蛋白、8.1 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、2.5 µg/ml胰島素、30 ng/ml黃體素、1 mM左旋麩醯胺酸與20 ng/ml亞硒酸鈉)於37°C、5% CO2
下培養細胞，每2天更換一次培養液，細胞培養7天後以4%三聚甲醛固定10分鐘，並以PBS清洗後，於4°C下保存於PBS中，待進行免疫螢光染色分析。
接著，分別將本實施例中獲得的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物樣本、對照組1-3的細胞樣本以免疫螢光染色進行分析，以確認血管分枝、神經元以及其他神經系細胞分化的情形。各細胞樣本先以含有10%山羊血清與0.1% Triton X-100介面活性劑(Sigma公司)的PBS溶液處理30分鐘，以阻隔非專一性結合。接著以小鼠抗膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)抗體[mouse anti-GFAP，該抗體可標定神經幹細胞及星狀細胞(astrocyte)上的特殊抗原GFAP，該抗體的稀釋倍數為1:3000，Sigma公司，美國]以及兔抗CD31/血小板內皮細胞黏附分子1 (platelet endothelial cell adhesion molecule 1)抗體[rabbit anti-CD31，該抗體可標定血管內皮細胞上的特殊抗原CD31/血小板內皮細胞黏附分子1，該抗體的稀釋倍數為1:200，Abcam公司，英國]於4°C下進行免疫染色18小時，移除抗體後以PBS清洗3次，並以適當的二級抗體(標定Alexa 488綠色螢光染劑的山羊抗-小鼠二級抗體以及標定Alexa 555紅色螢光染劑的山羊抗-兔二級抗體，二者的稀釋倍數皆為1:1000，Invitrogen公司，美國)於室溫下染色1小時。接著以帶有二脒基-2-苯基吲哚(diamidino-2-phenylindole, DAPI)的Vectashield溶液(Vector Laboratories公司，美國)對細胞核進行染色。最後，以螢光顯微鏡(Axiolmager M2，Zeiss公司，德國)捕捉螢光影像，以分析細胞組織結構(cytoarchitecture)，包括血管分枝，以及神經幹細胞分化成神經元或其他神經系細胞的比例。結果如圖1A至圖1D所示。
圖1A為單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)樣本以小鼠抗GFAP抗體(可標定神經幹細胞及星狀細胞，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖1A所示，單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)樣本中並無血管內皮細胞的存在。
圖1B為單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)樣本以小鼠抗GFAP抗體(可標定神經幹細胞及星狀細胞，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖1B所示，單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)樣本中並無神經幹細胞的存在，亦無分化的血管分枝存在。
圖1C為以Transwell®通透性支持物隔開人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養物(對照組3)樣本以小鼠抗GFAP抗體(可標定神經幹細胞及星狀細胞，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖1C所示，以Transwell®通透性支持物隔開人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養物(對照組3)樣本中，由於神經幹細胞與血管內皮細胞無直接接觸，無法促使血管分枝的形成，且無神經幹細胞或分化的神經系細胞的存在。
圖1D為本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物樣本以小鼠抗GFAP抗體(可標定神經幹細胞及星狀細胞，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖1D所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物具有進行分化的神經幹細胞(綠色螢光標示處)和血管分枝(紅色螢光標示處，形成分枝狀結構)，該細胞層片結構物係由共同培養神經幹細胞與內皮細胞直接接觸並相互作用所生成。
由圖1A至圖1D可知，神經幹細胞與內皮細胞必須藉細胞之間的直接接觸相互作用，才能形成具有分化的神經系細胞與血管分枝的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物。
實施例四 神經幹細胞
-
血管內皮細胞
(NSC-EC)
細胞層片結構物的轉移
本實施例所採用之覆蓋感溫性材料的細胞培養皿(Nunc® UpCell Surface)係購自Thermo Scientific公司(美國)。該感溫性材料在37°C的環境中呈現疏水性，使培養於其上的細胞能貼附於該感溫性材料的表面並且增殖；當溫度下降至32°C以下時，由於32°C為該感溫性材料的最低臨界溶解溫度，該感溫性材料內的高分子鏈會急速地水合化而呈現親水性，使培養於其上的細胞自該感溫性材料的表面分離。
首先，將上述實施例二所得之人類腦微血管內皮細胞懸浮液播植於覆蓋感溫性材料的細胞培養皿(Nunc® UpCell Surface，Thermo Scientific公司，美國)上，以內皮細胞培養液[含有5%胎牛血清以及1%抗生素溶液(含有10,000 U/mL青黴素與10,000 U/mL鏈黴素)的EGM-2細胞培養液]於37°C、5% CO2
下培養至細胞密度約200,000 cells/cm2
，以形成一內皮細胞層。接著，將上述實施例一所得到之人類神經幹細胞懸浮液以約50,000 cells/cm2
的密度播種於該內皮細胞層上，使神經幹細胞與內皮細胞直接接觸並相互作用，並以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液(含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培液，以及0.015%人類白蛋白溶液、500 µg/ml運鐵蛋白、8.1 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、2.5 µg/ml胰島素、30 ng/ml黃體素、1 mM左旋麩醯胺酸與20 ng/ml亞硒酸鈉)於37°C、5% CO2
下培養細胞2天後，形成一神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片。然後，將培養皿置於22°C，使該感溫性材料由疏水性轉變為親水性，並將轉移膜(transfer membrane)覆蓋於該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片之上，約20分鐘後，該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片會自親水性的培養皿表面分離，而附著於該轉移膜上。接著，將帶有該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片的轉移膜置於覆蓋有膠原蛋白之玻璃片上，於37°C靜置約30分鐘，使該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片貼覆於該玻璃片上之後，移除轉移膜，並以神經幹細胞/內皮細胞共同培養液(含有1/2體積的DMEM/F-12培養液與1/2體積的EGM-2細胞培養液，以及0.015%人類白蛋白溶液、500 µg/ml運鐵蛋白、8.1 µg/ml丁二胺二鹽酸鹽、2.5 µg/ml胰島素、30 ng/ml黃體素、1 mM左旋麩醯胺酸與20 ng/ml亞硒酸鈉)於37°C、5% CO2
下繼續培養5天，每2天更換一次培養液。最後，將該細胞層片結構物以4%三聚甲醛固定10分鐘，並以PBS清洗後，於4°C下保存於PBS中，待進行免疫螢光染色分析，以確認血管分枝、神經元以及其他神經系細胞分化的情形。
另外，分別以單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)、單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)，以及實施例三得到的共同培養7天不轉移的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)，比較本實施例得到的共同培養2天後轉移培養5天的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)的血管分枝與神經元分化的情形。對照組1、對照組2，以及實驗7天組的細胞培養方法如實施例三所述。
免疫螢光染色分析的方法如實施例三所述。採用之抗體包含：小鼠抗微管結合蛋白2 (microtubule associate protein-2, MAP2)抗體(mouse anti-MAP2，該抗體可標定神經元特殊抗原MAP2，該抗體的稀釋倍數為1:500，Abcam公司，英國)、小鼠抗閉鎖連接蛋白1 (zonula occludens 1, ZO1)抗體 (mouse anit-ZO1，該抗體可標定血管內皮細胞上的特殊抗原ZO1，該抗體的稀釋倍數為1:500，Zymed公司，美國)，以及兔抗CD31/血小板內皮細胞黏附分子1 (platelet endothelial cell adhesion molecule 1)抗體(rabbit anti-CD31，該抗體可標定血管內皮細胞上的特殊抗原CD31/血小板內皮細胞黏附分子1，該抗體的稀釋倍數為1:200，Abcam公司，英國)。並以帶有DAPI的Vectashield溶液(Vector Laboratories公司，美國)對細胞核進行染色。
上述實驗進行3重複，每個重複實驗皆重複操作3次，每次重複操作皆自培養皿的5個不同區域上攝取細胞影像，並計算細胞核數目與螢光染色之細胞數。使用SPSS for Mac統計軟體(IBM公司，美國)進行數據分析。使用Mann-Whitney U test測試法來比較單一細胞培養樣本與神經幹細胞-血管內皮細胞共同培養樣本之間螢光標記的差異。以Prism 5軟體(GraphPad公司，美國)繪製統計圖。
免疫螢光染色分析的結果如圖2A至圖2F所示。圖2A為單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)樣本以小鼠抗MAP2抗體(可標定神經元，綠色螢光)以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖2A所示，單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)樣本中只有少數的神經元存在。
圖2B為單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)樣本以小鼠抗ZO1抗體(可標定血管內皮細胞，綠色螢光)以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖2B所示，單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)樣本中並無分化的血管分枝存在。
圖2C為實施例三得到的共同培養7天不轉移的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)樣本以小鼠抗MAP2抗體(可標定神經元，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖2C所示，該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)具有分化的神經元(綠色螢光標示處)和血管分枝(紅色螢光標示處)。圖2D則為實施例三得到的共同培養7天不轉移的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)樣本以小鼠抗ZO1抗體(可標定血管內皮細胞，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖2D所示，該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)具有明顯的血管分枝(綠色與紅色螢光標示處)。
圖2E為本實施例得到的共同培養2天後轉移培養5天的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)樣本以小鼠抗MAP2抗體(可標定神經元，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖2E所示，該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)所具有之分化的神經元(綠色螢光標示處)數量明顯增加，且其亦具有分化的血管分枝(紅色螢光標示處)。圖2F則為本實施例得到的共同培養2天後轉移培養5天的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)樣本以小鼠抗ZO1抗體(可標定血管內皮細胞，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)，以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖2F所示，該神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)具有明顯的血管分枝(綠色與紅色螢光標示處)。
免疫螢光染色的統計分析之結果如圖3所示，與單一種類細胞培養相比(對照組1、對照組2)，共同培養7天不轉移的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)，以及共同培養2天後轉移培養5天的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)中，神經幹細胞分化成神經元(被抗MAP2抗體標定的細胞)的比例，自8%分別增加為31%以及64%，而血管內皮細胞呈現ZO1閉鎖連接蛋白1的比例則無顯著變化。由此可知，本實施例所提供之製造神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物的方法，可增進神經幹細胞分化成神經元。
實施例五 神經幹細胞
-
血管內皮細胞
(NSC-EC)
細胞層片結構物的胞外基質成分分析
取上述實施例三得到的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物進行免疫螢光染色分析胞外基質成分。免疫螢光染色分析方法如實施例三所述。分別以雞抗層連結蛋白(laminin)抗體(chicken anti-laminin，該抗體的稀釋倍數為1:500，Abcam公司，美國)、小鼠抗纖維連接蛋白(fibronectin)抗體(mouse anti-fibronectin，該抗體的稀釋倍數為1:200，Abcam公司，美國)、綿羊抗透明質酸(hyaluronic acid)抗體(sheep anti-hyaluronic acid，該抗體的稀釋倍數為1:100，Abcam公司，美國)、小鼠抗玻璃粘連蛋白(vitronectin)抗體(mouse anti-vitronectin，該抗體的稀釋倍數為1:1000，Abcam公司，美國)、兔抗第I型膠原蛋白(collagen I)抗體(rabbit anti-collagen I，該抗體的稀釋倍數為1:500，Abcam公司，美國)、山羊抗第IV型膠原蛋白(collagen IV)抗體(goat anti-collagen IV，該抗體的稀釋倍數為1:200，Millipore公司，美國)，以及DAPI進行免疫螢光染色。免疫螢光染色分析結果如圖4A至圖4F所示。
圖4A為以雞抗層連結蛋白抗體(可標定層連結蛋白，綠色螢光)與DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖4A所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物中含有大量的層連結蛋白。
圖4B為以小鼠抗纖維連接蛋白抗體(可標定纖維連接蛋白，綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖4B所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物中含有纖維連接蛋白。
圖4C為以綿羊抗透明質酸抗體(可標定透明質酸，綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖4C所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物中含有大量的透明質酸。
圖4D是以小鼠抗玻璃粘連蛋白抗體(可標定玻璃粘連蛋白，綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖4D所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物中含有大量的玻璃粘連蛋白。
圖4E是以兔抗第I型膠原蛋白抗體(可標定第I型膠原蛋白，綠色螢光) 與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖4E所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物中含有大量的第I型膠原蛋白。
圖4F是以山羊抗第IV型膠原蛋白抗體(可標定第IV型膠原蛋白，綠色螢光) 與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。如圖4F所示，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物中含有第IV型膠原蛋白。
由圖4A至圖4F可知，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物的胞外基質至少含有膠原蛋白(collagen)、透明質酸(hyaluronic acid)、纖維連接蛋白(fibronectin)、玻璃粘連蛋白(vitronectin)，以及層連結蛋白(laminin)。
實施例六 神經幹細胞
-
血管內皮細胞
(NSC-EC)
細胞層片結構物於重建神經血管組織的應用
本實施例採用健康成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠，體重介於280公克至300公克之間，作為試驗對象。SD大鼠以異氟烷(isoflurane)進行麻醉(濃度4% 誘導，2% 維持)，並進行開顱術取下右側顱骨，接受右側大腦頂葉皮層挫傷後，施以本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物的移植治療。藉由轉移膜將長寛各1公分大小的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物置於SD大鼠右側大腦頂葉挫傷處軟腦膜(pia mater)下方大腦皮層表面之上，30分鐘後，待細胞層片自轉移膜剝離，附著於大腦皮層表面後，移除轉移膜，將軟腦膜、蛛網膜(arachnoid mater)及硬腦膜(dura mater)縫合，並將開顱術取下之顱骨以骨水泥(bone cement)復位。7天後，採用4%三聚甲醛經心臟灌流以固定大鼠的腦組織，並冷凍切片該腦組織。將該冷凍切片的腦組織分別以小鼠抗MAP2抗體(可標定神經元)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞)、小鼠抗Nestin抗體(mouse anti-Nestin，該抗體可標定神經幹細胞)、兔抗HuN抗體(rabbit anti-HuN，該抗體可標定人類細胞核)，以及DAPI(對細胞核染色)進行免疫螢光染色。結果如圖5A至圖5D所示。
圖5A與圖5B所示為小鼠大腦皮層挫傷後以本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物移植治療後的腦組織切片，以小鼠抗MAP2抗體(可標定神經元，綠色螢光)、兔抗CD31抗體(可標定血管內皮細胞，紅色螢光)以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。在大腦皮層表面細胞層片結構物植入處可見到神經幹細胞分化形成之神經元(如圖5A與圖5B綠色螢光處所示)以及形成血管內皮的內皮細胞(如圖5A與圖5B紅色螢光處所示)。
此外，再將小鼠大腦皮層挫傷後以本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物移植治療後的腦組織切片，以兔抗HuN抗體(可標定人類細胞核，綠色螢光)、小鼠抗Nestin抗體(可標定神經幹細胞，紅色螢光)以及DAPI (對細胞核染色，藍色螢光)進行免疫螢光染色。結果如圖5C與圖5D所示，在小鼠受損失去的腦組織區域中，有植入的人類細胞(綠色螢光)生長於其中，表示圖5A與圖5B所見之神經幹細胞分化形成之神經元以及形成血管內皮的內皮細胞為人類細胞，係來自本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物。
由圖5A至圖5D可知，本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物可應用於移植治療手術，於受傷處重建神經血管組織。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖1為在實施例三中細胞樣本以小鼠抗GFAP抗體(綠色螢光)、兔抗CD31抗體(紅色螢光)，以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖1A之細胞樣本為單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)樣本；圖1B之細胞樣本為單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)樣本；圖1C之細胞樣本為以Transwell®通透性支持物隔開人類腦神經幹細胞與人類腦微血管內皮細胞的共同培養物(對照組3)樣本；圖1D之細胞樣本為本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物樣本。
圖2為在實施例四中細胞樣本進行免疫螢光染色的結果。圖2A為單獨培養的人類腦神經幹細胞(對照組1)樣本以小鼠抗MAP2抗體(綠色螢光)以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖2B為單獨培養的人類腦微血管內皮細胞(對照組2)樣本以小鼠抗ZO1抗體(綠色螢光)以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖2C為共同培養7天不轉移的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)樣本以小鼠抗MAP2抗體(綠色螢光)、兔抗CD31抗體(紅色螢光)，以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖2D為共同培養7天不轉移的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗7天組)樣本以小鼠抗ZO1抗體(綠色螢光)、兔抗CD31抗體(紅色螢光)，以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖2E為共同培養2天後轉移培養5天的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)樣本以小鼠抗MAP2抗體(綠色螢光)、兔抗CD31抗體(紅色螢光)，以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖2F為共同培養2天後轉移培養5天的神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物(實驗2+5天組)樣本以小鼠抗ZO1抗體(綠色螢光)、兔抗CD31抗體(紅色螢光)，以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。
圖3為在實施例四中細胞樣本進行免疫螢光染色分析後的統計分析結果。
圖4為實施例三之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物進行免疫螢光染色的結果。圖4A為以雞抗層連結蛋白抗體(綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖4B為以小鼠抗纖維連接蛋白抗體(綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖4C為以綿羊抗透明質酸抗體(綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖4D是以小鼠抗玻璃粘連蛋白抗體(綠色螢光)與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖4E是以兔抗第I型膠原蛋白抗體(綠色螢光) 與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖4F是以山羊抗第IV型膠原蛋白抗體(綠色螢光) 與DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。
圖5為小鼠大腦皮層挫傷後以本發明之神經幹細胞-血管內皮細胞(NSC-EC)細胞層片結構物移植治療後的腦組織切片進行免疫螢光染色的結果。圖5A與圖5B為以小鼠抗MAP2抗體(綠色螢光)、兔抗CD31抗體(紅色螢光)以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖5B為圖5A中白色方框內的放大圖。圖5C與圖5D為以兔抗HuN抗體(綠色螢光)、小鼠抗Nestin抗體(紅色螢光)以及DAPI (藍色螢光)進行免疫螢光染色的結果。圖5D為圖5C中白色方框內的放大圖。
Claims (5)
- 一種用於重建神經血管組織之細胞層片結構物，包含：一血管內皮細胞層，具有血管內皮細胞、血管分枝，與一胞外基質，該血管分枝係分化自該血管內皮細胞，該胞外基質係由該血管內皮細胞分泌而成，該胞外基質包含膠原蛋白(collagen)、透明質酸(hyaluronic acid)、纖維連接蛋白(fibronectin)、玻璃粘連蛋白(vitronectin)，以及層連結蛋白(laminin)；以及一神經幹細胞層，係位於該血管內皮細胞層之上，具有神經幹細胞與神經元，該神經幹細胞與該血管內皮細胞直接接觸，該神經元係分化自該神經幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞層片結構物，其中該血管內皮細胞為人類腦微血管內皮細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞層片結構物，其中該神經幹細胞為人類腦神經幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞層片結構物，其中該血管內皮細胞層可作為一載體。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞層片結構物，其中該胞外基質進一步包含聚胺基酸(polypeptide)、聚多糖(polysaccharide)，及其混合物。
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Citations (1)
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| US20060153815A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Agnieszka Seyda | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue |
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2014
- 2014-08-15 TW TW105141109A patent/TWI617665B/zh active
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| 朱曉峰等人，神經幹細胞共移植體的體外構建，中國組織工程研究與臨床康復，第11卷第24期，2007年6月17日，第4756~4759頁。 |
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