TWI608098B - 新型固化微生物加工原料及其製備方法與用途 - Google Patents

新型固化微生物加工原料及其製備方法與用途 Download PDF

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Description

新型固化微生物加工原料及其製備方法與用途
本發明是有關於一種固定化微生物顆粒暨其製備方法。本發明亦有關於使用該固定化微生物顆粒來製備微生物複合樹脂。
微生物固定化技術(microbial immobilization technology)是指以一種限制微生物自由移動的方法來將活的微生物侷限在一特定的空間區域中，藉此可使該微生物所展現出的流體動力學特徵(hydrodynamic characteristic)是不同於周圍環境中的其他微生物所具者，並且能保持該微生物的催化活性而使其可以被重複地使用。微生物固定化技術具有微生物密度高、反應速度快、耐毒害能力強、微生物流失量少以及易於控制等優點，因而已被廣泛地應用於各個領域(諸如：環境汙染的修復、農業、水產養殖業、發酵食品產業、生物能源產業以及生物醫藥產業等)中。
目前，微生物固定化技術主要是藉由使用下列5種方法來將微生物固定於一適合的載體，該等方法包括：包埋法(entrapment)、吸附法(adsorption)、膠囊封裝法(encapsulation)、交聯法(cross linking)以及共價結合法(covalent bonding)。在上述方法當中，包埋法是藉由將微生物包埋在一載體的內部來達致固定微生物之目的，它具有操作簡單、對微生物活性的影響小以及成本低廉等優點，因而成為一最常被使用的方法(奚悅等人(2013)，生命的化學，33：567-580；鄧福(2010)，廣東化工，37：218-220；王娜等人(2008)，污染防治技術，21：62-65)。
適用於固定微生物的載體可以分為3大類，其中包括：(1)天然有機高分子材料，諸如屬於多醣(polysaccharide)的澱粉(starch)、纖維素(cellulose)、海藻酸鈉(sodium alginate)、瓊脂(agar)以及卡拉膠(carrageenan)，以及屬於多肽的(polypeptide)的明膠(gelatin)等；(2)合成有機高分子材料，諸如聚(己二酸-共-對苯二甲酸丁二酯)[poly(butylene adipate-co-terephthalate),PBAT]、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚丙烯醯胺(polyacrylamide,ACAM)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)以及聚丁二酸丁二醇酯 [Poly(butylene succinate),PBS]等；以及(3)無機材料，諸如活性碳(active carbon)以及矽藻土(diatomaceous earth)等。
在進行包埋法的過程，需使用高溫來對上述材料以及微生物進行成形處理(forming treatment)[例如，造粒成型(granulation molding)]，而為了避免微生物在高溫下死亡，一般是先對微生物進行預處理(pretreatment)以使其形成內孢子(endospore)，再將內孢子拿來進行成形處理。例如，CN 103172444 A揭示一種微生物肥料顆粒，其製備方法包括：於室溫下，將一益生菌內孢子培養液(其中該益生菌為芽孢桿菌)、10.3至15.4wt%的多元醇水溶液、56.7至77.3wt%的生物可分解填充材料(例如澱粉)、10.3至30.9wt%的生物可分解聚合物(例如PBS)以及2.1至8.2wt%的營養物質混合均勻以形成一原料，接著將該原料藉由通過一擠壓器(擠壓溫度115至120℃、平均加工滯留時間3至5分鐘、轉速40至50rpm)進行成形處理而得到微生物肥料顆粒。
然而，供用於內孢子形成的額外處理步驟會提高所需的成本，不敷產業上的實際應用。因此，若能開發出一種無需內孢子形成步驟之微生物固定化處理，以簡化操作程序並且降低成本與耗能，將會是吾人所企望達成的。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於製備一固定化微生物顆粒的方法，其包括：將一芽孢桿菌屬物種或地芽孢桿菌屬物種的培養物、一生物可分解多醣、一多元醇、一營養物質以及一貼附劑混合均勻，俾以形成一第一微生物混合物；以及令該第一微生物混合物於一範圍落在50至100℃內的溫度下進行一第一成形處理，藉此而得到該固定化微生物顆粒。
在第二個方面，本發明提供一種固定化微生物顆粒，它是藉由使用一如上所述的方法而被製備。
在第三個方面，本發明提供一種用於製備一微生物複合樹脂的方法，其包括：將具有一濃度落在25至50%(w/w)內之一如上所述的固定化微生物顆粒以及一具有一濃度落在50至75%(w/w)內的聚(己二酸-共-對苯二甲酸丁二酯)混合均勻，俾以形成一第二微生物混合物；以及令該第二微生物混合物於一範圍落在120至160℃內的溫度下進行一第二成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。
在第四個方面，本發明提供一種微生物複合樹脂，它是藉由使用一如上所述的方法而被製備。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。
為了開發出無需內孢子形成步驟之微生物固定化處理，申請人嘗試選用澱粉來作為包埋載體，並且以不同的配方比例、加工溫度以及芽孢桿菌來製備出多種固定化微生物顆粒，繼而將它們拿來進行內孢子、磷酸根以及伊枯草菌素A的釋放測試。而實驗結果發現：依據本發明的方法所製得的固定化微生物顆粒具有優異的內孢子、磷酸根以及伊枯草菌素A的釋放能力。
於是，本發明提供一種用於製備一固定化微生物顆粒的方法，其包括：將一芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)或地芽孢桿菌屬物種(Geobacillus spp.)的培養物、一生物可分解多醣(biodegradable polysaccharide)、一多元醇(polyol)、一營養物質(nutrient substance)以及一貼附劑(adhesion agent)混合均勻，俾以形成一第一微生物混合物；以及令該第一微生物混合物於一範圍落在50至100℃內的溫度下進行一第一成形處理，藉此而得到該固定化微生物顆粒。
依據本發明，該微生物混合物包含有具有一濃度落在11.9至12.4%(w/w)內的芽孢桿菌屬物種或地芽孢桿菌屬物種的培養物、具有一濃度落在69至71.9%(w/w)內的生物可分解多醣、具有一濃度落在10.3至10.7%(w/w)內的多元醇、具有一濃度落在4.2至8%(w/w)內的營養物質以及具有一濃度落在0.8至0.9%(w/w)內的貼附劑。
依據本發明，該第一成形處理是藉由使用一熱成形裝置(thermoforming device)而被進行。較佳地，該熱成形裝置是選自於由下列所構成的群組：熱壓機(hot press machine)、單軸擠壓機(single-screw extruder)以及雙軸擠壓機(twin-screw extruder)。在本發明的一個較佳具體例中，該熱成形裝置是雙軸擠壓機。
依據本發明，該第一成形處理依序包括一於一範圍落在50至65℃內的溫度以及一範圍落在1至3分鐘內的時間下所進行的第一擠壓處理，以及一於一範圍落在85至100℃內的溫度以及一範圍落在1至3分鐘內的時間下所進行的第二擠壓處理。
適用於本發明的芽孢桿菌屬物種或地芽孢桿菌屬物種可以是一可供用於農業(例如，堆肥或作為生物肥料)與環境修復的菌株。較佳地，該芽孢桿菌屬物種是選自於下列所構成的群組：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、黑胸敗血芽孢桿菌(Bacillus bombyseptieus)、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌。在本發明的另一個較佳具體例中，該芽孢桿菌屬物種是納豆芽孢桿菌。
依據本發明，該生物可分解多醣是選自於下列所構成的群組：澱粉、纖維素，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該生物可分解多醣是澱粉。
依據本發明，該多元醇是選自於下列所構成的群組：二元醇(diol)、三元醇(triol)，以及它們的組合。較佳地，該多元醇是一選自於由下列所構成之群組中的二元醇：乙二醇、丙二醇、丁二醇，以及它們的組合。較佳地，該多元醇是一選自於由下列所構成之群組中的三元醇：甘油、丁三醇、戊三醇，以及它們的組合。。在本發明的一個較佳具體例中，該多元醇是甘油。
依據本發明，該營養物質包含有氮源以及無機鹽。
依據本發明，該氮源是選自於下列所構成的群組：酵母菌萃取物、大豆粉、蛋白腖，以及它們的組合。
依據本發明，該無機鹽是磷酸鹽(phosphate)。較佳地，該磷酸鹽是選自於下列所構成的群組：磷酸鈣(calcium phosphate)、磷酸鎂(magnesium phosphate)、磷酸鉀(potassium phosphate)、磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該磷酸鹽是磷酸鈣。
依據本發明，該貼附劑可以是飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的飽和 脂肪酸：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸以及花生酸。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的不飽和脂肪酸：油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸以及二十烯酸。在本發明的一個較佳具體例中，該貼附劑是油酸。
本發明亦提供一種固定化微生物顆粒，它是藉由使用一如上所述的方法而被製備。
另外，申請人嘗試使用生物可分解聚酯(biodegradable polyester)聚(己二酸-共-對苯二甲酸丁二酯)[poly(butylene adipate-co-terephthalate),PBAT]來將該固定化微生物顆粒進一步製成微生物複合樹脂，繼而將它拿來進行內孢子、磷酸根以及蛋白酶的釋放測試。而實驗結果發現：依據本發明的方法所製得的微生物複合樹脂具有優異的內孢子、磷酸根以及蛋白酶的釋放能力。
基於上述，本發明提供一種用於製備一微生物複合樹脂的方法，其包括：將具有一濃度落在25至50%(w/w)內之一如上所述的固定化微生物顆粒以及一具有一濃度落在50至75%(w/w)內的PBAT混合均勻，俾以形成一第二微生物混合物；以及令該第二微生物混合物於一範圍落在120至160℃內的溫度下進行一第二成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。
依據本發明，該第二成形處理是藉由使用一如上所述的熱成形裝置而被進行。
依據本發明，該第二成形處理是一於一範圍落在120至135℃內的溫度以及一範圍落在1至3分鐘內的時間下所進行的第三擠壓處理。
此外，本發明亦提供一種微生物複合樹脂，它是藉由使用一如上所述的方法而被製備。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：
圖1顯示將實施例5當中所製得的高PBAT組1的微生物複合樹脂吹製成膜後拿來進行蛋白酶釋放能力的評估所得到的結果。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 實施例1. 製備本發明的固定化微生物顆粒(immobilized microbial particle)
A、培養芽孢桿菌菌株(Bacillus strains)：
在本實施例中使用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BCRC 16048以及納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)BCRC 17438是分別購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。
首先，將呈凍乾粉末(lyophilized powder)的枯草芽孢桿菌BCRC 16048以及納豆芽孢桿菌BCRC 17438分別以接種環(inoculating loop)塗抹於營養瓊脂培養基(nutrient agar medium,NA medium)(購自於Difco)上，並於一恆溫振盪培養箱(37℃)內進行培養歷時24小時以活化菌株。接著，對所形成之各菌株的菌落分別接種至營養肉湯培養基(nutrient broth medium,NB medium)(購自於Difco)中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、140rpm)內進行培養歷時24小時。之後，對所形成之各菌株的培養物取出1mL並將之分別接種至具有如下面表1中所示的配方之增殖肉湯培養基(enrichment broth medium)(250mL)中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、125rpm)內進行培養歷時24小時。接著，添加以等體積之一含有5g/L MgSO4以及25mg/L MnCl2的溶液，藉此而所得到各菌株的增殖培養物。
B、製備固定化微生物顆粒：
首先，將下列作為固定化載體(immobilization carrier)的各個成分進行滅菌處理：(i)生物可分解多醣(biodegradable polysaccharide)：澱粉(購自於宏崎)；(ii)多元醇(polyol)：甘油(購自於Sigma)；(iii)營養物質(nutrient substance)：酵母菌萃取物(購自於Difco)、大豆粉(soybean flour)(購自於宏崎)、蛋白腖(購自於Difco)以及Ca3(PO4)2(購自於Sigma)；以及(iv)貼附劑(adhesion agent)：油酸(oleic acid)(購自於第一化工)；其中，固態成分的滅菌處理是藉由UV照射歷時24小時而被進行，而液態成分的滅菌處理是藉由於121℃下加熱歷時30分鐘而被進行。
接著，申請人依據下面表2中所示的配方與加工條件來製備各種不同的固定化微生物顆粒，其中包括11個實驗組(亦即實驗組1至11)、3個對照組(亦即對照組1至3)以及1個空白對照組。
實驗組1至11是依照下面所示的製備步驟來進行製備(實驗組1至6的總重量皆為121g，實驗組7與8的總重量皆為123g，以及實驗組9至11的總重量皆為126g)：首先，於經UV滅菌的塑膠袋中先將芽孢桿菌菌株的增殖培養物、甘油以及油酸進行混合，繼而混合以上面表2所示的其他組分，藉此而得到一呈黏土團狀的微生物混合物(microorganism blend)，其中芽孢桿菌菌株是均勻地分布於該微生物混合物中。接著，使用一具有四段套筒的擠壓機(extruder)(型號為25ψ，購自於亞靖機械)並在一為25至40rpm的螺桿轉速以及如上面表2所示的套筒溫度與滯留時間下來對該微生物混合物進行擠壓處理，藉此而得到具有一直徑約為3mm的條狀擠出物，繼而將之裁切成重量約為1g的顆粒，藉此而得到實驗組1至11的固定化微生物顆粒。
對照組1至3大體上是參照上面實驗組1至11的製備步驟來進行製備(對照組1至3的總重量皆為121g)，不同之處在於：套筒溫度皆高於100℃。
空白對照組大體上是參照上面實驗組1至11的製備步驟來進行製備(空白對照組的總重量為106g)，不同之處在於：不添加任何的芽孢桿菌菌株的增殖培養物。
實施例2. 本發明的固定化微生物顆粒在內孢子釋放能力(endospore releasing ability)上的評估
為了瞭解固定化微生物顆粒的配方與加工條件對於內孢子形成的影響以及固定化微生物顆粒在一液態環境中的內孢子釋放能力，申請人使用實施例1當中所製得的固定化微生物顆粒來進行下面的測試。
實驗方法：
首先，將各組的固定化微生物顆粒(1g)分別置於100mL的無菌水中，繼而在一恆溫培養箱(37℃、140rpm)中進行內孢子釋放測試歷時5天。之後，對所形成的待測溶液收取10mL，並且於80℃下加熱歷時10分鐘，俾以去除營養細胞(vegetative cell)。接著，置於冰浴中進行冷卻歷時5分鐘。然後，以適量的無菌水予以適當的稀釋，繼而對所形成的稀釋溶液各取適量並分別塗佈於一NA培養基上，並且在一恆溫培養箱(37℃)中進行培養歷時24小時。接著，藉由使用平板菌落計數法(flat colony counting method)來計算菌數，繼而計算出待測溶液所含有的內孢子數(CFU/mL)。
結果：
各組所測得的內孢子數被顯示於下面的表3中。由表3可見，實驗組1至11皆有測得大量的內孢子，而對照組1至3皆無測到內孢子的存在。這個實驗結果顯示：擠壓機的套筒溫度大於100℃時，所製得的固定化微生物顆粒皆不具有內孢子釋放能力。相對地，擠壓機的套筒溫度在50至100℃內時，無論是使用何種芽孢桿 菌菌株或營養物質，所製得的固定化微生物顆粒皆具有優異的內孢子釋放能力。申請人據此而認為：溫度範圍落在50至100℃內的擠壓處理能夠在製備固定化微生物顆粒的同時促使芽孢桿菌菌株的內孢子形成，因此，本發明的固定化微生物顆粒可用來釋放大量存活的芽孢桿菌菌株至環境中。
實施例3. 本發明的固定化微生物顆粒在磷酸根釋放能力(phosphate group releasing ability)上的評估
為了瞭解本發明的固定化微生物顆粒在一液態環境中的磷酸根釋放能力，申請人使用實施例1當中所製得的實驗組與空白對照組的固定化微生物顆粒來進行下面的測試。
實驗方法：
首先，將實驗組1至11與空白對照組的固定化微生物顆粒(1g)分別置於100mL的無菌水中，繼而在一恆溫培養箱(37℃、140rpm)中進行磷酸根釋放測試歷時3天。之後，對所形成的待測溶液收取1mL。另外，將25g的鉬酸銨(ammonium molybdate)配於400mL的純水而得到一鉬酸銨溶液。然後，將1.25g的偏釩酸銨(ammonium metavanadate)配於300mL之煮沸的純水中，在冷卻後予以加入250mL的濃硝酸，接而在冷卻後予以加入該鉬酸銨溶液並進行混合，繼而以純水將體積補足至1,000mL，藉此而得到硝酸-釩酸-鉬酸呈色劑。之後，將1mL的待測溶液加入等體積的硝酸-釩酸-鉬酸呈色劑並靜置20分鐘，繼而將所形成的反應混合物以分光光度計(型號為Jasco Model V-550，購自於尚偉儀器)在波長420nm下測量吸光值(OD420)。
另一方面，將各個磷標準溶液的磷酸根濃度(0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L以及50mg/L)與其相對應的吸光值(OD420)作圖，可得到一標準曲線(standard curve)。各組所測得的吸光值(OD420)是藉由該標準曲線而被換算成磷酸根濃度(mg/L)。
結果：
各組所測得的磷酸根濃度被顯示於下面的表4中。由表4可見，實驗組1至11皆有測得大量的磷酸根。這個實驗結果顯示：本發明的固定化微生物顆粒具有優異的磷酸根釋放能力。申請人據此而認為：在本發明的固定化微生物顆粒中的芽孢桿菌菌株能夠有效地使Ca3(PO4)2解離，因此，本發明的固定化微生物顆粒而可用來釋放大量的磷酸根至環境中。
實施例4. 本發明的固定化微生物顆粒在伊枯草菌素A釋放能力(iturin A releasing ability)上的評估
為了瞭解本發明的固定化微生物顆粒在一液態環境中的伊枯草菌素A釋放能力，申請人使用實施例1當中所製得的實驗組與空白對照組的固定化微生物顆粒來進行下面的測試。
實驗方法：
首先，將實驗組1至11與空白對照組的固定化微生物顆粒(1g)分別置於100mL的無菌水中，繼而在一恆溫培養箱(37℃、140rpm)中進行伊枯草菌素A釋放測試歷時6天。之後，對所形成的待測溶液收取1mL，繼而藉由高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析來測定伊枯草菌素A的濃度。所使用的HPLC分析儀器如下：Waters 600E高效能液相層析儀(Waters 600E high performance liquid chromatography)以及Waters 486可調式吸光值偵測器(Waters 486 tunable absorbance detector)，而有關HPLC的各項操作參數與條件被顯示於下面的表5中。
此外，為供比對，使用不同濃度之伊枯草菌素A(0-50mg/L)(購自於Sigma)來作為校正標準品(control standard)並進行相同的分析。
結果：
各組所測得的伊枯草菌素A濃度被顯示於下面的表6中。由表6可見，實驗組1至11皆有測得大量的伊枯草菌素A，其中，實驗組10與11所測得的伊枯草菌素A濃度是明顯地高於其他組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的固定化微生物顆粒具有優異的伊枯草菌素A釋放能力，特別地，含有納豆芽孢桿菌的固定化微生物顆粒具有更為優異的伊枯草菌素A釋放能力。
實施例5. 製備本發明的微生物複合樹脂(microbial complex resins)
為了測試本發明的固定化微生物顆粒是否可經歷進一步的加工處理以製成各種產品，申請人依據下面表7中所示的配方來製備各種不同的微生物複合樹脂，其中包括2個低PBAT組(亦即低 PBAT組1與2)、2個高PBAT組(亦即高PBAT組1與2)以及2個空白對照組(亦即空白對照組1與2)。
各組(總重量皆為100g)是依照下面所示的製備步驟來進行製備：首先，依據下面表7中所示的配方將生物可分解聚酯(biodegradable polyester)聚(己二酸-共-對苯二甲酸丁二酯)[poly(butylene adipate-co-terephthalate),PBAT](購自於Ecoflex)分別與實施例1當中所製得的實驗組9與10與空白對照組的固定化微生物顆粒進行混合。然後，使用一具有四段套筒的擠壓機並在一為40rpm的螺桿轉速、分別為120℃、135℃、130℃以及120℃的四段套筒溫度以及一為2.5分鐘的滯留時間下來對所得到的微生物混合物進行擠壓處理，藉此而得到具有一直徑約為3mm的條狀擠出物，亦即各組的微生物複合樹脂。
實施例6. 本發明的微生物複合樹脂的機械性質分析(mechanical property analysis)
在本實施例中，申請人依據ASTM 638-96 Type IV規範將實施例5當中所製得的微生物複合樹脂製成待測樣品來進行機械性質分析。
實驗方法：
首先，將各組的微生物複合樹脂置於符合ASTM 638-96 Type IV規範的熱壓模具中，並使用一熱壓機進行預熱2分鐘，繼而在一為1000psi的壓力下進行熱壓處理歷時1.5分鐘，接著在一為2000psi的壓力下進行熱壓處理歷時1.5分鐘，然後冷卻至室溫，藉此而得到各組的待測樣品。之後，各組的待測樣品是藉由使用一物性測試機(型號為4400R，購自於Instron)並依照廠商所提供的操作指引，在一為500kg的荷重(load)下來進行抗張強度(tensile strength)、伸長率(elongation)、破裂能量(fracture energy)以及楊氏模數(Young’s modulus)的測定。
結果：
各組所測得的機械性質被顯示於下面的表8中。由表8可見，高PBAT組的抗張強度、伸長率、破裂能量以及楊氏模數皆明顯地優於低PBAT組所具者。這個實驗結果顯示：可藉由提高PBAT的含量來提升本發明的微生物複合樹脂的機械強度。
實施例7. 本發明的微生物複合樹脂在內孢子釋放能力上的評估
為了瞭解本發明的微生物複合樹脂在一液態環境中的內孢子釋放能力，申請人使用實施例5當中所製得的微生物複合樹脂來進行下面的測試。
實驗方法：
首先，各組微生物複合樹脂裁切成重量約為1g的待測樣品，接著，大體上參照實施例2當中所述的方法來進行內孢子釋放測試，不同之處在於：用來進行測試的無菌水的體積為200mL，並且沒有對所得到的待測溶液進行加熱。
結果：
各組所測得的內孢子數被顯示於下面的表9中。由表9可見，低PBAT組與高PBAT組皆有測得大量的內孢子。申請人據此而認為：本發明的固定化微生物顆粒在被製成微生物複合樹脂後仍可展現良好的內孢子釋放能力。
實施例8. 本發明的微生物複合樹脂在釋放磷酸根的能力上的評估
為了瞭解本發明的微生物複合樹脂在一液態環境中的磷酸根釋放能力，申請人使用實施例5當中所製得的微生物複合樹脂來進行下面的測試。
實驗方法：
首先，將實施例5當中所製得的各組微生物複合樹脂裁切成重量約為1g的待測樣品，接著，參照實施例3當中所述的方法來進行磷酸根釋放測試。
結果：
各組所測得的磷酸根濃度被顯示於下面的表10中。由表10可見，低PBAT組與高PBAT組皆有測得大量的磷酸根。申請人據此而認為：本發明的固定化微生物顆粒在被製成微生物複合樹脂後仍可展現良好的磷酸根釋放能力。
實施例9. 本發明的微生物複合樹脂在蛋白酶釋放能力(protease releasing ability)上的評估
為了瞭解本發明的微生物複合樹脂的蛋白酶釋放能力，申請人使用實施例5當中所製得的高PBAT組1的微生物複合樹脂來進行下面的測試。
實驗方法：
首先，使用一吹膜機並在130℃下將高PBAT組1的微生物複合樹脂吹製成膜，接著將之裁切成具有大約1cm×1cm的面積大小之正方形並置於一牛奶瓊脂培養基(milk agar medium)(含有5g/L的牛奶)上，繼而在一恆溫培養箱(37℃)中進行培養歷時48小時。之後，觀察在牛奶瓊脂培養基上的變化。
結果：
圖1顯示經吹製成膜的微生物複合樹脂在牛奶瓊脂培養基上進行培育所得到的結果。由圖1可見，在經吹製成膜的微生物 複合樹脂旁有菌落的形成，並且在周圍形成直徑約為3cm的透明區域(clear zone)。這個實驗結果顯示：本發明的微生物複合樹脂不僅能夠釋放芽孢桿菌菌株，並且芽孢桿菌菌株能夠在經歷內孢子萌發之後保留蛋白酶的製造與釋放的能力。申請人據此而認為：本發明的微生物複合樹脂可被加工製成不同形式的產品且保有芽孢桿菌菌株的性質與活性。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (9)

  1. 一種用於製備一固定化微生物顆粒的方法，其包括：將一具有一濃度落在11.9至12.4%(w/w)內的芽孢桿菌屬物種的培養物、一具有一濃度落在69至71.9%(w/w)內的生物可分解多醣、一具有一濃度落在10.3至10.7%(w/w)內的多元醇、一具有一濃度落在4.2至8%(w/w)內的營養物質以及一具有一濃度落在0.8至0.9%(w/w)內的貼附劑混合均勻，俾以形成一第一微生物混合物，其中，該生物可分解多醣是澱粉，該多元醇是甘油，該營養物質包含有氮源以及無機鹽，以及該貼附劑是油酸；以及令該第一微生物混合物於一範圍落在50至100℃內的溫度下進行一第一成形處理，藉此而得到該固定化微生物顆粒，其中，該第一成形處理依序包括一於一範圍落在50至65℃內的溫度以及一範圍落在1至3分鐘內的時間下所進行的第一擠壓處理，以及一於一範圍落在85至100℃內的溫度以及一範圍落在1至3分鐘內的時間下所進行的第二擠壓處理。
  2. 如請求項1的方法，其中該芽孢桿菌屬物種是選自於下列所構成的群組：枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、液化澱粉芽孢桿菌、黑胸敗血芽孢桿菌、仙人掌桿菌，以及它們的組合。
  3. 如請求項1的方法，其中該氮源是選自於下列所構成的群組：酵母菌萃取物、大豆粉、蛋白腖，以及它們的組合。
  4. 如請求項1的方法，其中該無機鹽是磷酸鹽。
  5. 如請求項4的方法，其中該磷酸鹽是選自於下列所構成的群組：磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鉀、磷酸二氫鉀，以及它們的組合。
  6. 一種固定化微生物顆粒，它是藉由使用一如請求項1至5中任一項所述的方法而被製備。
  7. 一種用於製備一微生物複合樹脂的方法，其包括：將具有一濃度落在25至50%(w/w)內之如請求項6的固定化微生物顆粒以及一具有一濃度落在50至75%(w/w)內的聚(己二酸-共-對苯二甲酸丁二酯)混合均勻，俾以形成一第二微生物混合物；以及令該第二微生物混合物於一範圍落在120至160℃內的溫度下進行一第二成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。
  8. 如請求項7的方法，其中該第二成形處理是一於一範圍落在120至135℃內的溫度以及一範圍落在1至3分鐘內的時間下所進行的第三擠壓處理。
  9. 一種微生物複合樹脂，它是藉由使用一如請求項7或8的方法而被製備。
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