TWI535845B

TWI535845B - 用於製備微生物複合樹脂的方法及其成品

Info

Publication number: TWI535845B
Application number: TW103144491A
Authority: TW
Inventors: 陳志成; 段國仁; 何錦玟; 蔡怡韋; 楊美蓮; 蔡東元
Original assignee: 水滋源生物科技股份有限公司
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2016-06-01
Also published as: TW201623610A

Description

用於製備微生物複合樹脂的方法及其成品

本發明是有關於一種用於製備微生物複合樹脂(microbial complex resins)的方法以及其所製得的成品，該方法包括將一具有一濃度落在40至75%(w/w)內的生物可分解聚酯(biodegradable polyester)、一具有一濃度落在1至10%(w/w)內的生長刺激物質以及一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的微生物材料混合均勻，俾以形成一微生物混合物，其中該生物可分解聚酯具有一範圍落在55至90℃內的熔點；以及，令該微生物混合物於一範圍落在65至90℃內的溫度以及一範圍落在30至60秒內的時間下進行一成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。

微生物固定化技術(microbial immobilization technology)是指以一種限制微生物自由移動的方法來將活的微生物侷限在一特定的空間區域中，藉此可使該微生物所展現出的流體動力學特徵(hydrodynamic characteristic)是不同於周圍環境中的其他微生物所具者，並且能保持該微生物的催化活性而使其可以被重複地使用。微生物固定化技術具有微生物密度高、反應速度快、耐毒害能力強、微生物流失量少以及易於控制等優點，因而已被廣泛地應用於各個領域(諸如：環境汙染的修復、農業、水產養殖業、發酵食品產業、生物能源產業以及生物醫藥產業等)中。

目前，微生物固定化技術主要是藉由使用下列5種方法來將微生物固定於一適合的載體，該等方法包括：包埋法(entrapment)、吸附法(adsorption)、膠囊封裝法(encapsulation)、交聯法(cross linking)以及共價結合法(covalent bonding)。在上述方法當中，包埋法是藉由將微生物包埋在一載體的內部來達致固定微生物之目的，它具有操作簡單、對微生物活性的影響小以及成本低廉等優點，因而成為一最常被使用的方法(奚悅等人(2013)，生命的化學，33：567-580；鄧福(2010)，廣東化工，37：218-220；王娜等人(2008)，污染防治技術，21：62-65)。

適用於固定微生物的載體可以分為3大類，其中包括：(1)天然有機高分子材料，諸如海藻酸鈉(sodium alginate)、瓊脂(agar)、卡拉膠(carrageenan)以及明膠(gelatin)等；(2)合成有機高分子材料，諸如聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚丙烯醯胺(polyacrylamide,ACAM)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)以及聚丁二酸丁二醇酯[Poly(butylene succinate),PBS]等；以及(3)無機材料，諸如活性碳(active carbon)以及矽藻土(diatomaceous earth)等。

就適用於包埋法的載體而言，聚乙烯醇(PVA) 包埋顆粒，其製備方法包括：將一芽孢桿菌(Bacillus sp.)種子液與一凝膠液(含有2至3wt%海藻酸鈉)予以混合均勻，並於25至40℃下通過一製粒器(直徑1至4mm、流速20至30滴/min)而形成微生物固定化顆粒。之後，將所得到的微生物固定化顆粒以一交聯劑(含有2至4wt%氯化鈣)進行交聯反應歷時10至18小時，接著以一固定劑(含有1wt%殼聚糖或0.6mol/L乙二胺或4wt% PVA)進行加固反應歷時23至58小時，繼而以無菌水浸泡歷時24至72小時，最後將該微生物固定化顆粒進行增殖培養後備用。依據此件大陸專利案所製得的微生物固定化顆粒具有高機械強度，且可供用於修復經多環芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)汙染的土壤。

CN 102250867 B揭示一種聚乙烯醇(PVA)固定化微生物顆粒，其製備方法包括：將PVA(8至12.5wt%)、海藻酸鈉(0.5至1wt%)以及水(87至91wt%)混合均勻，並加熱攪拌至溶化而形成一混合溶液，接著加入微量的矽酸鈉(Na₂SiO₃)並予以混合均勻。之後，將一微生物懸浮液以一為1：2的體積比加入至所得到的混合溶液中並予以混合均勻，接著藉由使用一注射器或滴管而將所形成的混合物滴入至一溫度為30至45℃的交聯劑(含有2至5wt%氯化鈣以及40至60wt%硝酸鈉)中，藉此而生成灰色球型的固定化顆粒。依據此件大陸專利案所製得的固定化顆粒具有水溶膨脹性(亦即培養前後的顆粒粒徑百分比)顯著降低、相對生物活性增加約30%以及使用期間延長等優點。

此外，CN 103172444 A揭示一種微生物肥料顆粒，其製備方法包括：於室溫下，將一益生菌內孢子培養液(其中該益生菌為芽孢桿菌)、10.3至15.4wt%的多元醇水溶液、56.7至77.3wt%的生物可分解填充材料、10.3至30.9wt%的生物可分解聚合物(例如PBS)以及2.1至8.2wt%的營養物質混合均勻以形成一原料，接著將該原料藉由通過一擠壓器(擠壓溫度115至120℃、平均加工滯留時間3至5分鐘、轉速40至50rpm)進行成形處理而得到微生物肥料顆粒。特別地，當使用PBS來作為生物可分解聚合物時，必須在一範圍落在115至120℃的高溫下進行成形處理才能夠形成所欲的微生物肥料顆粒。因此，適用於製備該微生物肥料顆粒的微生物必須是耐高溫的益生菌(例如芽孢桿菌)，而無法選用其他非耐高溫的益生菌。

雖然上述專利前案所揭示的方法是使用PVA或PBS作為載體來包埋微生物，然而這些習知方法的製程較為複雜並且在微生物的選用上會受到限制，因而不利於實廠工業上大規模的應用。

聚己內酯(PCL)是一種單體為己內酯(caprolactone)的聚酯類高分子聚合物，它具有良好的生物可分解性、生物相容性以及熱塑性(其熔點為55至65℃)，因而已被廣泛地應用於醫藥產業(例如作為生醫材料或手術縫合線)以及綠色塑膠產業(例如作為包裝材料)。已有文獻報導，聚己內酯(PCL)可被用來作為吸附法的載體。例如，CN 100999728 A揭示一種供用於吸附微生物的固定化微生物載體(它是一種奈米級高分子纖維膜)，它的製備方法包括：將聚己內酯(PCL)溶於一溶劑中以形成一電紡溶液，接著藉由使用一或多個噴射頭(其連接直流高壓電場，電壓為正或負3至120千伏)來對該電紡溶液進行電紡，而得到一聚己內酯纖維膜(其纖維直徑為100至5000奈米)。之後，將該聚己內酯纖維膜進行一等離子體處理(例如，在氬氣、空氣、氨氣或氮氣中進行輝光放電)歷時10秒至1小時，藉此而得到一具有超高比表面積並且可供用於表面吸附溶藻菌(例如芽孢桿菌)的親水性聚己內酯纖維膜。

基於在各個領域(例如環境工程、農業或醫藥產業等)上對於微生物固定化技術存在有一廣大的需求，若能開發出一可快速且有效地包埋具有不同溫度耐受性的微生物的方法，將會是吾人所企望達成的。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於製備一微生物複合樹脂的方法，其包括：將一具有一濃度落在40至75%(w/w)內的生物可分解聚酯、一具有一濃度落在1至10%(w/w)內的生長刺激物質以及一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的微生物材料混合均勻，俾以形成一微生物混合物，其中該生物可分解聚酯具有一範圍落在55至90℃內的熔點；以及令該微生物混合物於一範圍落在65至90℃內的溫度以及一範圍落在30至60秒內的時間下進行一成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。

在第二個方面，本發明提供一種微生物複合樹脂，它是藉由使用一如上所述的方法而被製備。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

為了開發出快速且可有效地包埋具有不同溫度耐受性的微生物的方法，申請人嘗試選用聚己內酯來作為包埋載體，並且以不同的配方比例、加工條件(包括時間、溫度與壓力)以及微生物種類來製備出多種微生物複合樹脂，繼而將它們拿來進行微生物釋放測試、生物活性分析以及穩定性評估。而實驗結果發現：依據本發明的方法所製得的微生物複合樹脂具有優異的微生物釋放能力與生物活性(亦即，可顯著地降低汙水中的化學需氧量以及清除水中的銨離子或亞硝酸鹽)，並且不會隨著時間的增加而快速崩解。

於是，本發明提供一種用於製備一微生物複合樹脂的方法，其包括：將一具有一濃度落在40至75%(w/w)內的生物可分解聚酯、一具有一濃度落在1至10%(w/w)內的生長刺激物質以及一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的微生物材料混合均勻，俾以形成一微生物混合物，其中該生物可分解聚酯具有一範圍落在55至90℃內的熔點；以及令該微生物混合物於一範圍落在65至90℃內的溫度以及一範圍落在30至60秒內的時間下進行一成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。

如本文中所用的，術語“生物可分解聚酯(biodegradable polyester)”意指可藉由微生物(諸如細菌、真菌以及藻類)、環境中的熱(environmental heat)、水份(moisture)或其他環境因子的作用而被降解的聚酯。較佳地，該生物可分解聚酯具有一範圍落在55至80℃內的熔點。更佳地，該生物可分解聚酯具有一範圍落在55至70℃內的熔點。

依據本發明，該生物可分解聚酯是選自於下列所構成之群組：聚己內酯(Polycaprolactone,PCL)以及聚丁二醇己二酸酯(polybutylcne adipate,PBA)。在本發明的一個較佳具體例中，該生物可分解聚酯是聚己內酯。

較佳地，該成形處理是於一範圍落在65至90℃內的溫度以及一範圍落在30至50秒內的時間下被進行。更佳地，該成形處理是於一範圍落在65至70℃內的溫度以及一範圍落在30至40秒內的時間下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該成形處理是在一為65℃的溫度以及一為30秒的時間下被進行。

依據本發明，該成形處理是藉由使用一熱成形裝置(thermoforming device)而被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該熱成形裝置是一熱壓機或一擠壓機。較佳地，該熱成形裝置是選自於由下列所構成的群組：熱壓機、單軸擠壓機以及雙軸擠壓機。

依據本發明，該成形處理是藉由使用一熱壓機並於一範圍落在500至1000psi的壓力下而被進行。較佳地，該成形處理是藉由使用一熱壓機並於一範圍落在500至800psi的壓力下而被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該成形處理是藉由使用一熱壓機並在一為500psi的壓力下而被進行。

在本發明的一個較佳具體例中，該成形處理是藉由使用一熱壓機並於一為65℃的溫度、一為30秒的時間以及一為500psi的壓力下而被進行。

依據本發明，該生長刺激物質是選自於下列所構成的群組：單醣、雙醣、果寡醣、醣類代謝中間產物，以及它們的組合。依據本發明，該生長刺激物質是一選自於由下列所構成之群組中的醣類代謝中間產物：檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸，以及它們的鹽類。在本發明的一個較佳具體例中，該生長刺激物質是琥珀酸鈉。

依據本發明，適用於本發明的微生物材料可以是一天然的材料或者一經加工處理的產物。

依據本發明，該微生物材料是一天然的材料。較佳地，該微生物材料是將一微生物培養於一培養基中而被獲得的培養物。

依據本發明，該微生物材料是一經加工處理的產物。較佳地，該微生物材料是經冷凍乾燥或噴霧乾燥的產物。在本發明的一個較佳具體例中，該微生物材料是冷凍乾燥菌粉。

適用於本發明的微生物材料可以是一可清除廢水中的含氮鹽類(例如硝酸鹽、亞硝酸鹽或銨鹽)的微生物。該可清除廢水中的含氮鹽類的微生物包括，但不限於：關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)、產氣單孢菌屬物種(Aeromonas spp.)、不動菌屬物種(Acinetobacter spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)、無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、甲基桿菌屬物種(Methylobacterium spp.)、亞硝酸菌屬物種(Nitrosomonas spp.)、硝化螺旋菌屬物種(Nitrospira spp.)、硝化菌屬物種(Nitrobacter spp.)、蒼白桿菌屬物種(Ochrobactrum spp.)、假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、Parococcus spp.、硫球菌屬物種 (Thiosphaera ap.)、Thauera spp.以及釀母菌屬物種(Saccharomyces spp.)。較佳地，該可清除廢水中的含氮鹽類的微生物是選自於由下列所構成的群組：氧化節桿菌(Arthrobacter oxydans)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、鰻魚氣單孢菌(Aeromonas encheleia)、抗輻射不動桿菌(Acinetobacter radioresisten)、糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonas europaea)、Nitrospira moscoviesis、維氏硝酸菌(Nitrobacter winogradskyi)、人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)、Parocaccus denitrificans、Thiosphaera pantotropha、Thauera mechernichensis，以及它們的組合。

適用於本發明的微生物材料可以是一可供用於作為生物肥料的微生物(例如固氮菌、溶磷菌、根圈有益菌或菌根真菌等)。該可供用於作為生物肥料的微生物包括，但不限於：無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、產氣桿菌屬物種(Aerobacter spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)、固氮螺菌屬物種(Azospirillum spp.)、固氮根瘤菌屬物種(Azorhizobium spp.)、固氮菌屬物種(Azotobacter spp.)、氮單胞菌屬物種(Azomonas spp.)、拜葉林克氏菌屬物種(Beijerinckia spp.)、慢生根瘤菌屬物種(Bradyrhizobium spp.)、短桿菌屬物種(Brevibacterium spp.)、紅色硫黃細菌屬物種(Chromatium spp.)、綠菌屬物種(Chlorobium spp.)、脫硫弧菌屬物種(Desulfovibri spp.)、德克斯氏菌屬物種(Derxia spp.)、腸桿菌屬物種(Enterobacter spp.)、弗蘭克菌屬物種(Frankia spp.)、克留氏菌屬物種(Klebsiella spp.)、泡囊-叢枝菌根(vesicular-arbuscular Mycorrhiza,VAM)、分枝桿菌屬物種(Mycobacterium spp.)、甲基球菌屬物種(Methylococcus spp.)、亞硝酸菌屬物種(Nitrosomonas spp.)、紅色螺旋細菌屬物種(Rhodospirillum spp.)、紅假單胞菌屬物種(Rhodopseudomonas spp.)、根瘤菌屬物種(Rhizobium spp.)、鋸桿菌屬物種(Serratia spp.)、聚球菌屬物種(Synechococcus spp.)、硫桿菌屬物種(Thiobacillus spp.)、黃色桿菌屬物種(Xanthobacter spp.)、頂套黴屬物種(Acrothecium spp.)、分枝孢子菌屬物種(Cladosporium spp.)、Cunnirghumella spp.、彎孢菌屬物種(Curvularia spp.)、腐質黴屬物種(Humicola spp.)、樹粉孢屬物種(Oideodendron spp.)、莖點黴屬物種(Phoma spp.)、假裸囊菌屬物種(Pseudogymnoascus spp.)、腐黴屬物種(Pythium spp.)、紅酵母屬物種(Rhodotorula spp.)以及小核菌屬物種(Sclerotium spp.)。

適用於本發明的微生物材料可以是一可供用於堆肥的微生物(例如會分解纖維素、半纖維素或木質素者)。該可供用於堆肥的微生物包括，但不限於：關節桿菌屬物種、織維桿菌屬物種(Cellulomonas spp.)、棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)、噬細胞菌屬物種(Cytophaga spp.)、乳桿菌屬物種(Lactobacillus spp.)、多囊菌屬物種(Polyangium spp.)、瘤胃球菌屬物種(Ruminococcus spp.)、生孢噬纖維細菌屬物種(Sporocytophaga spp.)、游動放線菌屬物種(Actinoplanes spp.)、微孢藻屬物種(Microspora spp.)、小單孢菌屬物種(Micromonospora spp.)、土壤絲菌屬物種(Nocardia spp.)、鏈孢子囊菌屬物種(Streptosporangium spp.)、高溫單孢菌屬物種(Thermomonospora spp.)、蘑菇屬物種(Agaricus spp.)、交錯道黴菌屬物種(Alternaria spp.)、松蕈屬物種(Armillaria spp.)、灰黴屬物種(Botrytis spp.)、金錢菌屬物種(Collybia spp.)、杯傘屬物種(Clitocybe spp.)、珊瑚菌屬物種(Clavaria spp.)、毛殼菌屬物種(Chaetomium spp.)、鬼傘屬物種(Coprinus spp.)、白蕈屬物種(Cortinellus spp.)、層孔菌屬物種(Fomes spp.)、靈芝屬物種(Ganoderma spp.)、地絲菌屬物種(Geotrichum spp.)、小叢殼屬物種(Glomerella spp.)、黏鞭黴屬物種(Gliomastix spp.)、褶孔菌屬物種(Lenzites spp.)、Monilia spp.、白黴菌屬物種(Mucor spp.)、小皮傘屬物種(Marasmius spp.)、小菇屬物種(Mycena spp.)、漆斑黴屬物種(Myrothecium spp.)、茯苓屬物種(Poria spp.)、革耳菌屬物種(Panus spp.)、鱗傘屬物種(Pholiota spp.)、側耳屬物種(Pleurotus spp.)、多孔菌屬物種(Polyporus spp.)、雲芝屬物種(Polystictus spp.)、根黴菌屬物種(Rhizopus spp.)、裂褶菌屬物種(Schizophyllum spp.)、韌革菌屬物種(Stereum spp.)、栓菌屬物種(Trametes spp.)、木黴屬物種(Trichoderma spp.)、單端孢屬物種(Trichothecium spp.)、炭焦菌屬物種(Ustulina spp.)、輪黴菌屬物種(Verticillium spp.)以及接黴屬物種(Zygorhynchus spp.)。

適用於本發明的微生物材料可以是一可供用於作為生物肥料以及用於堆肥的微生物。該可供用於作為生物肥料以及用於堆肥的微生物包括，但不限於：芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)、被孢黴屬物種(Mortierella spp.)、擬青黴屬物種(Paecilomyces spp.)、青黴菌屬物種(Penicillium spp.)、念珠菌屬物種(Candida spp.)、鏈絲菌屬物種(Streptomyces spp.)、黃單胞菌屬物種(Xanthomonas spp.)、黃桿菌屬物種(Flavobacterium spp.)、假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、麴菌屬物種(Aspergillus spp.)、許旺酵母屬物種(Schwanniomyces spp.)、絲核菌屬物種(Rhizoctonia spp.)、梭黴菌屬物種(Fusarium spp.)、梭菌屬物種(Clostridium spp.)以及微球菌屬物種(Micrococcus spp.)。較佳地，該可供用於作為生物肥料以及用於堆肥的微生物是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。有關上述這些微生物材料的選用與培養方式是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該微生物材料可以包含一或多種微生物。在本發明的一個較佳具體例中，該微生物材料是選自於由下列所構成的群組：氧化節桿菌、施氏假單胞菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌，以及它們的組合。

在本發明的一個較佳具體例中，該微生物材料是由呈一比例為1：1：1：1(w/w/w/w)的氧化節桿菌、施氏假單胞菌、枯草芽孢桿菌以及啤酒酵母菌所構成。

依據本發明，在製備該微生物混合物時，可進一步添加一具有一濃度落在2.5至5%(w/w)內的貼附劑。

依據本發明，該貼附劑是植物性油或動物性油。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的植物性油：橄欖油、花生油、玉米油、大豆油以及葵花油。在本發明的一個較佳具體例中，該貼附劑是橄欖油。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的動物性油：豬油、牛油以及魚油。在本發明的一個較佳具體例中，該貼附劑是豬油。

依據本發明，該貼附劑亦可以是飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的飽和脂肪酸：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸以及花生酸。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的不飽和脂肪酸：油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸以及二十烯酸。

依據本發明，該貼附劑亦可以是二元醇或一由二元醇與二元酸所形成的酯化物。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的二元醇：乙二醇、丙二醇以及丁二醇。較佳地，該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的由二元醇與二元酸所形成的酯化物：丁二酸丁酯、己二酸丁酯以及乙二酸二丁酯(dibutyl ethanedioate)。

依據本發明，在製備該微生物混合物時，可進一步添加一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的含鈣礦物鹽。

依據本發明，該含鈣礦物鹽是選自於下列所構成的群組：碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、矽酸鈣，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該含鈣礦物鹽是碳酸鈣。

依據本發明，在製備該微生物混合物時，可進一步添加一具有一濃度落在2.5至5%(w/w)內的貼附劑以及一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的含鈣礦物鹽。

在本發明的一個較佳具體例中，該微生物混合物是藉由將呈一濃度為40%(w/w)的生物可分解聚酯、呈一濃度為5%(w/w)的生長刺激物質、呈一濃度為5%(w/w)的貼附劑、呈一濃度為25%(w/w)的含鈣礦物鹽以及呈一濃度為25%(w/w)的微生物材料混合均勻而被製得。

在本發明的一個更佳的具體例中，該微生物混合物是藉由將呈一濃度為40%(w/w)的聚己內酯(PCL)、呈一濃度為5%(w/w)的琥珀酸鈉、呈一濃度為5%(w/w)的橄欖油、呈一濃度為25%(w/w)的碳酸鈣以及呈一濃度為25%(w/w)的冷凍乾燥菌粉混合均勻而被製得。

在本發明的另一個較佳具體例中，該微生物混合物是藉由將呈一濃度為72.5%(w/w)的生物可分解聚酯、呈一濃度為5%(w/w)的生長刺激物質、呈一濃度為2.5%(w/w)的貼附劑、呈一濃度為10%(w/w)的含鈣礦物鹽以及呈一濃度為10%(w/w)的微生物材料混合均勻而被製得。

在本發明的另一個更佳的具體例中，該微生物混合物是藉由將呈一濃度為72.5%(w/w)的聚己內酯(PCL)、呈一濃度為5%(w/w)的琥珀酸鈉、呈一濃度為2.5%(w/w)的橄欖油、呈一濃度為10%(w/w)的碳酸鈣以及呈一濃度為10%(w/w)的冷凍乾燥菌粉混合均勻而被製得。

此外，本發明亦提供一種微生物複合樹脂，它是藉由使用一如上所述的方法而被製備。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實施例1. 製備本發明的微生物複合樹脂(microbial complex resin) 實驗材料： 1.製備氧化節桿菌(Arthrobacter oxydans)BCRC 11573、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)BCRC 17221、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BCRC 10448以及啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BCRC 21679的冷凍乾燥菌粉：

在下面的實驗中所使用的氧化節桿菌BCRC 11573、施氏假單胞菌BCRC 17221、枯草芽孢桿菌BCRC 10448以及啤酒酵母菌BCRC 21679是分別購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。

首先，將氧化節桿菌BCRC 11573、施氏假單胞菌BCRC 17221、枯草芽孢桿菌BCRC 10448以及啤酒酵母菌BCRC 21679分別依據下面表1所示的培養基以及培養條件來進行培養歷時24小時。接著，收取各菌株的培養物並委託大同大學生物工程學系來進行冷凍乾燥處理，藉此所得到的4種冷凍乾燥菌粉各自具有一為3×10⁹CFU/g的細菌濃度。

實驗方法：

首先，將作為固定化載體(immobilization carrier)的聚己內酯(PCL)(Capa^TM 6800/6500,Perstorp UK Ltd.)、碳酸鈣(calcium carbonate)(購自於第一化工原料股份有限公司)、琥珀酸鈉(sodium succinate)(購自於第一化工原料股份有限公司)以及橄欖油(olive oil)(購自於第一化工原料股份有限公司)分別以UV光進行滅菌處理歷時24小時。接著，申請人依據下面表2中所示的配方比例與加工條件來製備各種不同的微生物複合樹脂，其中包括23個實驗組(亦即實驗組1至23)以及1個對照組。

實驗組1至20是依照下面所示的製備步驟來進行製備(各組的總重量為100g)：首先，在無菌操作台中，將上面表2所示含量的冷凍乾燥菌粉、琥珀酸鈉、橄欖油以及1/2含量的碳酸鈣添加至一1000mL燒杯中並於室溫下進行攪拌歷時2分鐘。之後，將聚己內酯以及剩餘1/2含量的碳酸鈣加入至該燒杯中並繼續攪拌歷時1分鐘，藉此而得到一呈黏土團狀的微生物混合物(microorganism blends)，其中所添加的冷凍乾燥菌粉是均勻地分布於該微生物混合物中。接著，將該微生物混合物平鋪於一熱壓機(型號PT-3110B，購自於吉盈油壓股份有限公司)的熱壓模具(它的長度、寬度以及厚度分別為30cm、30cm以及0.1cm)上，並依據如上面表2所示的加工溫度、加工壓力以及加工時間來進行熱壓處理。之後，藉由使用該熱壓機的冷卻循環系統來將所形成的微生物複合樹脂的溫度冷卻至室溫，繼而將之封存於一滅菌包裝袋中並供隨後的實驗之用。

實驗組21大體上是參照上面實驗組1至20的製備步驟以及使用相同的熱壓機來進行製備，不同之處在於：所添加的冷凍乾燥菌粉是一由氧化節桿菌BCRC 11573的冷凍乾燥菌粉、施氏假單胞菌BCRC 17221的冷凍乾燥菌粉、枯草芽孢桿菌BCRC 10448的冷凍乾燥菌粉以及啤酒酵母菌BCRC 21679的冷凍乾燥菌粉所混合形成的混合物[它佔總重量的25%，其中該4株菌株的相對比例為1：1：1：1(w/w/w/w)]。

實驗組22以及23大體上是參照上面實驗組1至20的製備步驟來進行製備，不同之處在於：所添加的冷凍乾燥菌粉是一由氧化節桿菌BCRC 11573的冷凍乾燥菌粉、施氏假單胞菌BCRC 17221的冷凍乾燥菌粉、枯草芽孢桿菌BCRC 10448的冷凍乾燥菌粉以及啤酒酵母菌BCRC 21679的冷凍乾燥菌粉所混合形成的混合物[它佔總重量的25%，其中該4株菌株的相對比例為1：1：1：1(w/w/w/w)]；以及使用一具有四段套筒的單軸擠壓機(Single extruder)(型號YJ-PS25，購自於亞靖機械有限公司)來取代該熱壓機，其中該四段套筒的溫度設定皆相同(亦即，如上面表2所示的65℃或80℃)，套筒轉速為45rpm，滯留時間(亦即加工時間)為30秒，藉此而得到具有一直徑約為5mm的條狀擠出物(亦即實驗組22以及23的微生物複合樹脂)，繼而將之封存於一滅菌包裝袋中並供隨後的實驗之用。

對照組大體上是參照上面實驗組1至20的製備步驟以及使用相同的熱壓機來進行製備，不同之處在於：不添加任何冷凍乾燥菌粉。

實施例2. 本發明的微生物複合樹脂在微生物釋放能力(microorganism releasing ability)上的評估

為了瞭解本發明的微生物複合樹脂在一液態環境中的微生物釋放能力，申請人使用實施例1當中所製得的微生物複合樹脂來進行下面的微生物釋放測試。

實驗材料： 1.製備各組的微生物複合樹脂的測試樣品：

將依據上面實施例1所得到的實驗組1至23以及對照組的微生物複合樹脂分別置於一無菌操作台中並裁切成重量皆為1g的測試樣品。

實驗方法：

首先，各組的測試樣品中所含有的理論菌數是藉由將冷凍乾燥菌粉的原始細菌濃度(亦即3×10⁹CFU/g)乘以各組冷凍乾燥菌粉所佔的重量百分比而被計算出。之後，將各組的測試樣品(1g)分別置於一含有100mL無菌水的500mL錐形瓶中，繼而在一恆溫培養箱(30℃、150rpm)中進行微生物釋放測試歷時30天。在這30天的測試過程當中，每隔10天即移除該等錐形瓶中的所有液體，所殘留的該等測試樣品分別以100mL無菌水予以洗滌2次，接著重新加入100mL無菌水，繼而將該等錐形瓶置於該恆溫培養箱(30℃、150rpm)中繼續進行微生物釋放測試。

在開始進行微生物釋放測試之後的第1天、第10天(移除液體之前)以及第30天(移除液體之前)，分別自各組的錐形瓶中取出1mL的待測溶液來進行菌數的計算。有關菌數的計算是依照下面的步驟來進行：首先，將1mL的待測溶液以等量的無菌水予以適當的稀釋，繼而對所形成的稀釋溶液各取適量並分別塗佈於一營養瓊脂培養基(Nutrient agar medium,NA medium)上，之後在一恆溫培養箱(30℃)中進行培養歷時24小時。接著，藉由使用平板菌落計數法(flat colony counting method)來計算菌數(CFU/g)。

結果：

各組的測試樣品中所含有的菌數以及在開始進行微生物釋放測試之後的第1天、第10天(移除液體之前)以及第30天(移除液體之前)之時所測得的菌數分別被顯示於下面的表3中。由表3可見，當配方比例以及加工的溫度與壓力是在相同的條件下，以一為90秒的加工時間而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組3以及6)所測得的菌數是接近或低於對照組所具者，而以一為30或60秒的加工時間而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組1-2、4-5以及7至21)所測得的菌數皆有明顯的增加，特別地，以一為30秒的加工時間所製得的微生物複合樹脂具有一相對較高的菌數。這個實驗結果顯示：在進行熱壓處理時，以一為30秒的加工時間所製得的微生物複合樹脂具有一較佳的微生物釋放能力。

當配方比例以及加工時間是在相同的條件下，以一為65℃的加工溫度以及一為500psi的加工壓力而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組1至2、7至8、11至12以及15至16)所測得的菌數是明顯高於以一為80℃的加工溫度以及一為1000psi的加工壓力而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組4至5、9至10、13至14以及17至18)所具者。這個實驗結果顯示：在進行熱壓處理時，以一為65℃的加工溫度以及一為500psi的加工壓力所製得的微生物複合樹脂具有一較佳的微生物釋放能力。

當菌粉種類、琥珀酸鈉的濃度以及加工的溫度、壓力與時間是在相同的條件下，藉由使用一含有40wt%聚己內酯、25wt%冷凍乾燥菌粉、25wt%碳酸鈣以及5wt%橄欖油的配方而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組7-8、9-10、15-16以及17-18)所測得的菌數是明顯高於使用一含有72.5wt%聚己內酯、10wt%冷凍乾燥菌粉、10wt%碳酸鈣以及2.5wt%橄欖油的配方而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組1-2、4-5、11-12以及13-14)所具者。這個實驗結果顯示：藉由使用一含有40wt%聚己內酯、25wt%冷凍乾燥菌粉、25wt%碳酸鈣以及5wt%橄欖油的配方所製得的微生物複合樹脂具有一較佳的微生物釋放能力。

當所有的配方比例以及加工的溫度、壓力與時間是在相同的條件下，藉由使用氧化節桿菌BCRC 11573、施氏假單胞菌BCRC 17221、枯草芽孢桿菌BCRC 10448、啤酒酵母菌BCRC 21679或者包含有上述4種菌株的組合的冷凍乾燥菌粉而被製得的微生物複合樹脂(包括實驗組7、15、19、20以及21)所測得的菌數是明顯高於對照組所具者，進而呈現一優異的微生物釋放能力。這個實驗結果顯示：本發明的微生物複合樹脂可以適用於各種不同的微生物(例如氧化節桿菌BCRC 11573、施氏假單胞菌BCRC 17221、枯草芽孢桿菌BCRC 10448以及啤酒酵母菌BCRC 21679)或者它們的組合。

當所有的配方比例以及加工的溫度與時間是在相同的條件下，藉由使用一熱壓機而被製得的微生物複合樹脂(亦即實驗組21)以及藉由使用一單軸擠壓機而被製得的微生物複合樹脂(亦即實驗組22)皆具有一優異的微生物釋放能力。特別地，使用一熱壓機所製得的微生物複合樹脂能夠展現一較佳的微生物釋放能力。

當使用相同的配方比例並且利用一單軸擠壓機在一為30秒的加工時間下來進行成形處理時，以一為65℃的加工溫度而被製得的微生物複合樹脂(亦即實驗組22)所測得的菌數是明顯高於以一為80℃的加工溫度而被製得的微生物複合樹脂(亦即實驗組23)所具者。這個實驗結果顯示：當使用單軸擠壓機來製備本發明的微生物複合樹脂時，在一為65℃的加工溫度下所製得的微生物複合樹脂具有一較佳的微生物釋放能力。

綜合上述實驗結果，申請人認為：選用一含有40wt%聚己內酯、25wt%冷凍乾燥菌粉、25wt%碳酸鈣、5wt%琥珀酸鈉以及5wt%橄欖油的配方，並且在一為30秒的加工時間與一為65℃的加工溫度下來進行成形處理時，所製得的微生物複合樹脂可展現一優異的微生物釋放能力。此外，當使用一熱壓機來進行成形處理時，將加工壓力設定在500psi，可以讓所得到的微生物複合樹脂達至本發明所欲訴求的效用。

實施例3. 本發明的微生物複合樹脂的生物活性 (biological activity)以及穩定性(stability)的評估

在本實驗中，生物活性是以化學需氧量(chemical oxygen demand,COD)、銨離子(ammonium ion)以及亞硝酸鹽(nitrite)的相對濃度百分比來作為評估指標，而穩定性是以重量損失率(rate of weight loss)來作為評估指標。

實驗方法： A、生活汙水中的化學需氧量(COD)的分析：

首先，將250mL的取自於家樂福汐止分店(家福股份有限公司)的生活汙水分別添加至24個500mL錐形瓶中，之後將該等錐形瓶置於一滅菌釜(121℃、1.5atm)中進行滅菌處理歷時15分鐘。接著，依據上面實施例2的“實驗材料”的「1.製備各組的微生物複合樹脂的測試樣品」當中所述方法來製備測試樣品(各組皆為1g)，然後分別加入至該等含有250mL經滅菌的生活汙水的錐形瓶中，繼而在一恆溫培養箱(30℃、150rpm)中進行培養歷時7天。

在開始反應之前以及在進行反應之後的第1天與第7天，分別自各組的錐形瓶中取出2mL的待測液體來分析化學需氧量的濃度(ppm)。有關化學需氧量的濃度分析是依照下面的步驟來進行：首先，將2mL的待測液體添加至一試管中並以6000rpm進行離心歷時1分鐘，繼而移除上澄液(supernatant)。之後，加入適量的CHEMetrics COD試劑(CHEMetrics COD Reagent)(K-7350S,CHEMetrics,Inc) 並予以混合均勻，繼而在150℃下進行加熱歷時2小時。接著，將所得到的混合物靜置冷卻至室溫，並使用一分光光度計(spectrophotometer)(V-40000,CHEMetrics,Inc)來測量化學需氧量的濃度(ppm)。

在第1天或第7天的化學需氧量(COD)的相對濃度百分比(%)是藉由將上面所得到的各個化學需氧量的濃度(ppm)代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100

其中：A=化學需氧量的相對濃度百分比(%)

B=在進行反應之後的第1天或第7天所測得的化學需氧量的濃度(ppm)

C=在開始反應之前所測得的化學需氧量的濃度(ppm)

B、水中的銨離子濃度的分析：

首先，將50mg的氯化銨(NH₄Cl)(購自第一化工原料股份有限公司)配於1000mL的無菌水中，繼而以一孔徑為0.2μm的過濾膜來進行過濾，藉此而得到一具有一濃度為50ppm的無菌銨離子溶液。接著，依據上面實施例2的“實驗材料”的「1.製備各組的微生物複合樹脂的測試樣品」當中所述方法來製備測試樣品(各組皆為1g)，然後分別加入至一含有250mL銨離子溶液(50ppm)的500mL錐形瓶中，繼而在一恆溫培養箱(30℃、150rpm)中進行反應歷時7天。

在進行反應之後的第1天與第7天，分別自各組的錐形瓶中取出1mL的待測液體來分析銨離子的濃度(ppm)。有關銨離子的濃度分析是依照下面的步驟來進行：首先，將1mL的待測液體添加至一含有10μL礦物安定劑(Mineral Stabilizer)(型號23766-26，Hach Company)、10μL聚乙烯醇分散劑(Polyvinyl Alcohol Dispersing Agent)(23765-26，Hach Company)以及40μL內斯勒試劑(Nessler Reagent)(21194-49，Hach Company)的試管中並予以混合均勻，之後立即以一分光光度計(spectrophotometer)(型號Jasco V-550，尚偉股份有限公司)來讀取各試管的反應溶液於波長425nm下的吸光值(OD₄₂₅)。將所得到的OD₄₂₅數值分別根據預先以具有不同已知濃度的氯化銨(NH₄Cl)相對於它們自身的OD₄₂₅數值所作出的一標準曲線而被換算成銨離子濃度(ppm)。

在第1天或第7天的銨離子(NH₄ ⁺)的相對濃度百分比(%)是藉由將上面所得到的各個銨離子濃度(ppm)代入下列公式(2)而被計算出：公式(2)：D=(E/F)×100

其中：D=銨離子的相對濃度百分比(%)

E=在進行反應之後的第1天或第7天所測得的銨離子濃度(ppm)

F=銨離子溶液的初始濃度(亦即50ppm)

C、水中的亞硝酸鹽濃度的分析：

首先，將50mg的亞硝酸鈉(NaNO₂)(購自第一化工原料股份有限公司)配於1000mL的無菌水中，繼而以一孔徑為0.2μm的過濾膜予以過濾，藉此而得到一具有濃度為50ppm的無菌亞硝酸鹽溶液。接著，依據上面實施例2的“實驗材料”的「1.製備各組的微生物複合樹脂的測試樣品」當中所述方法來製備測試樣品(各組皆為1g)，然後分別加入至一含有250mL亞硝酸鹽溶液(50ppm)的500mL錐形瓶中，繼而在一恆溫培養箱(30℃、150rpm)中進行反應歷時7天。

在開始反應之後的第1天與第7天，分別自各組的錐形瓶中取出10mL的待分析液體來分析亞硝酸鹽的濃度(ppm)。有關亞硝酸鹽的濃度分析是依照下面的步驟來進行：首先，將10mL的待分析液體添加至一試管中，接著加入一包NitriVer^® 2亞硝酸鹽試劑粉枕(NitriVer^® 2 Nitrite Reagent Powder Pillows)(型號2107569，Hach Company)並在室溫下進行反應歷時10分鐘。之後，以一分光光度計(型號Jasco V-550，尚偉股份有限公司)來讀取各試管的反應溶液於波長585nm下的吸光值(OD₅₈₅)。將所得到的OD₅₈₅數值分別根據預先以具有不同已知濃度的亞硝酸鈉(NaNO₂)相對於它們自身的OD₅₈₅數值所作出的一標準曲線而被換算成亞硝酸鹽濃度(ppm)。

在第1天或第7天的亞硝酸鹽(NO₂ ^-)的相對濃度百分比(%)是藉由將上面所得到的各個亞硝酸鹽濃度(ppm)代入下面的公式(3)而被計算出：公式(3)：G=(H/I)×100

其中：G=亞硝酸鹽的相對濃度百分比(%)

H=在開始反應之後的第1天或第7天所測得的亞硝酸鹽濃度(ppm)

I=亞硝酸鹽溶液的初始濃度(亦即50ppm)

D、重量損失率(rate of weight loss)的測定：

首先，依據上面實施例2的“實驗材料”的「1.製備各組的微生物複合樹脂的測試樣品」當中所述方法來製備測試樣品(各組皆為1g)，然後分別加入至一含有250mL 0.8%生理鹽水(normal saline)的500mL錐形瓶中，繼而在一恆溫培養箱(30℃、150rpm)中進行培養歷時30天。

在進行培養之後的第30天，分別測量各組的微生物複合樹脂的殘餘重量(g)。而有關各組的微生物複合樹脂的重量損失率(%)是藉由將上面所得到的殘餘重量(g)代入下列公式(4)而被計算出：公式(4)：J=(K-L)/K×100

其中：J=微生物複合樹脂的重量損失率(%)

K=微生物複合樹脂的初始重量(亦即1g)

L=微生物複合樹脂的殘餘重量(g)

結果：

有關各組的微生物複合樹脂在第1天以及第7天所測得的化學需氧量(COD)、銨離子以及亞硝酸鹽的相對濃度百分比以及第30天所測得的重量損失率分別被顯示於下面的表4中。由表4可見，就化學需氧量(COD)以及銨離子而言，在與對照組相較之下，實驗組1、2、4、5以及7至23在第1天以及第7天所測得的化學需氧量(COD)以及銨離子的相對濃度百分比皆有降低，並且會隨著培養時間的增加而更趨於明顯。這個實驗結果顯示：當藉由本發明的方法來製備微生物複合樹脂時，在一為30秒或60秒的加工時間下所製得之分別含有氧化節桿菌BCRC 11573、施氏假單胞菌BCRC 17221、枯草芽孢桿菌BCRC 10448或啤酒酵母菌BCRC 21679的微生物複合樹脂以及同時含有上述4種細菌菌株的微生物複合樹脂可供用於降低汙水中的化學需氧量(COD)以及清除水中的銨離子，特別地，在一為30秒的加工時間下所製得的微生物複合樹脂可以達至最佳的效用。

就亞硝酸鹽而言，在與對照組相較之下，實驗組11至18以及21至23在第1天以及第7天所測得的亞硝酸鹽的相對濃度百分比皆有降低，並且會隨著培養時間的增加而更趨於明顯，其中實驗組21在第7天的亞硝酸鹽的相對濃度百分比甚至可達至0%。這個實驗結果顯示：含有施氏假單胞菌BCRC 17221的微生物複合樹脂可供用於清除一水體中的亞硝酸鹽，特別地，在一為30秒的加工時間下所製得的微生物複合樹脂具有一較佳的清除效用。另外，實驗組21相較於實驗組15具有一更佳的清除亞硝酸鹽的效用，這表示：使用含有4種細菌菌株(包括氧化節桿菌BCRC 11573、施氏假單胞菌BCRC 17221、枯草芽孢桿菌BCRC 10448或啤酒酵母菌BCRC 21679)的微生物複合樹脂相較於僅含有施氏假單胞菌BCRC 17221的微生物複合樹脂具有一更為優異的清除亞硝酸鹽的效用。

就重量損失率而言，各個實驗組在第30天所測得的重量損失率大致落在一為0.2至5.3%的範圍內。這個實驗結果顯示：本發明的微生物複合樹脂不會隨著時間的增加而造成快速崩解的情形，因而具有一良好的穩定性。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims

一種用於製備一微生物複合樹脂的方法，其包括：將一具有一濃度落在40至72.5%(w/w)內的聚己內酯、一具有一濃度落在1至10%(w/w)內的生長刺激物質、一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的微生物材料、一具有一濃度落在2.5至5%(w/w)內的貼附劑以及一具有一濃度落在10至25%(w/w)內的含鈣礦物鹽混合均勻，俾以形成一微生物混合物，其中該聚己內酯具有一範圍落在55至90℃內的熔點，以及該生長刺激物質是選自於下列所構成的群組：單醣、雙醣、果寡醣、醣類代謝中間產物，以及它們的組合；以及令該微生物混合物於一範圍落在65至90℃內的溫度以及一範圍落在30至60秒內的時間下進行一成形處理，藉此而得到該微生物複合樹脂。
如請求項1的方法，其中該成形處理是藉由使用一熱成形裝置而被進行。
如請求項2的方法，其中該熱成形裝置是一熱壓機或一擠壓機。
如請求項3的方法，其中該成形處理是藉由使用一熱壓機並於一範圍落在500至1000psi的壓力下而被進行。
如請求項4的方法，其中該成形處理是在一為65℃的溫度、一為30秒的時間以及一為500psi的壓力下而被進行。
如請求項1的方法，其中該生長刺激物質是一選自於由下列所構成之群組中的醣類代謝中間產物：檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸，以及它們的鹽類。
如請求項6的方法，其中該生長刺激物質是琥珀酸鈉。
如請求項1的方法，其中該微生物材料包含有一選自於下列群組中的微生物：氧化節桿菌、施氏假單胞菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌，以及它們的組合。
如請求項1的方法，其中該微生物材料是天然的材料。
如請求項1的方法，其中該微生物材料是經加工處理的產物。
如請求項10的方法，其中該微生物材料是經冷凍乾燥或噴霧乾燥的產物。
如請求項1的方法，其中該貼附劑是一植物性油或動物性油。
如請求項12的方法，其中該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的植物性油：橄欖油、花生油、玉米油、大豆油以及葵花油。
如請求項13的方法，其中該貼附劑是橄欖油。
如請求項12的方法，其中該貼附劑是一選自於由下列所構成之群組中的動物性油：豬油、牛油以及魚油。
如請求項15的方法，其中該貼附劑是豬油。
如請求項1的方法，其中該含鈣礦物鹽是選自於下列所構成的群組：碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、矽酸鈣，以及它們的組合。
如請求項17的方法，其中該含鈣礦物鹽是碳酸鈣。
一種微生物複合樹脂，它是藉由使用一如請求項1至18中任一項所述的方法而被製備。