TWI589697B - 重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇 - Google Patents

重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇 Download PDF

Info

Publication number
TWI589697B
TWI589697B TW104127385A TW104127385A TWI589697B TW I589697 B TWI589697 B TW I589697B TW 104127385 A TW104127385 A TW 104127385A TW 104127385 A TW104127385 A TW 104127385A TW I589697 B TWI589697 B TW I589697B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
gene
flammulina velutipes
hbv
vaccine composition
transgenic
Prior art date
Application number
TW104127385A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201610156A (zh
Inventor
呂映慈
Original Assignee
蘑法生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 蘑法生物科技股份有限公司 filed Critical 蘑法生物科技股份有限公司
Publication of TW201610156A publication Critical patent/TW201610156A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI589697B publication Critical patent/TWI589697B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇
本發明係關於一重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇(Flammulina velutipes)。特定地說，本發明之該重組聚核苷酸包含一經截短之甘油醛-3-磷酸去氫酶(gpd)啟動子與一經修飾B型肝炎病毒表面(HBV S)蛋白質基因，又被稱為小B型肝炎病毒表面蛋白質(small HBV surface protein)或B型肝炎表面抗原(HBsAg)，帶有所述蛋白質之該基因轉殖金針菇可作為對抗HBV感染之疫苗。
B型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染肝臟並造成發炎反應被稱為病毒性肝炎。該疾病為發生於特定族群中的地方性疾病，例如中國大陸與亞洲其他地區。全世界約有三分之一的人口，超過24億人曾經感染HBV。HBV感染可為急性的，又稱為自限性的(self-limiting)，或是慢性的，又稱為長期的(long-standing)。急性HBV感染與急性病毒性肝炎有關，此疾病初始會有一般性的身體不適、食慾不佳、噁心、嘔吐、全身痠痛、輕微發燒、深色尿，之後進一步發展為黃疸。此疾病可能持續數週，並在多數感染者中漸漸好轉。少數患者可能會有更嚴重的肝疾病如爆發性肝功能衰竭(fulminant hepatic failure)，而因此死亡。該感染亦可能完全沒有症狀而未被察覺。慢性HBV感染可能是沒有症狀的或與肝臟的慢性發炎有關(即慢性肝炎)， 其在數年之內可導致肝硬化。此類型之感染顯著地增加了肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)的發生率。慢性帶原者應避免攝入酒精，因其會增加肝硬化及肝癌的風險。已被核准用於治療HBV感染的藥物包含拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(adefovir)、替諾福韋(tenofovir)、替比夫定(telbivudine)與恩替卡韋(entecavir)。然而HBV基因突變所致之藥物治療的抗藥性為一主要問題。
HBV屬於肝病毒科(Hepadnaviridae)，其係為一群趨肝性的DNA病毒。HBV為一血源性(blood-borne)病毒，其包含一小且部分為雙股的DNA基因體，內有四個大量相互重疊的蛋白質編碼區域(open reading frame)，包含一含有HBV核心蛋白質(HBcAg)的內核殼蛋白質(nucleocapsid)、病毒聚合酶與病毒DNA，並由一含有HBV表面抗原(HBsAg)之膜狀外殼所圍繞。該病毒之膜狀外殼包含三種不同卻相互關聯的大(L)、中(M)、小(S)表面抗原蛋白質，其擁有共通的蛋白質C端(carboxy terminal)區域，但其蛋白質N端(amino terminal)區域卻不相同，係因在連續的蛋白質編碼區域中使用不同位點的啟始碼(initiation triplets)所致。
US 20060159705提供一製備適用於疫苗使用之B型肝炎表面抗原之方法，該方法包含在半胱胺酸存在時純化上述抗原，該發明亦包含含有上述抗原之疫苗。US 20070280962提供HBV核心蛋白質顆粒，其特徵為具有多種免疫原特異性。US 20110165194係關聯至一包含完整HBV大、中、小表面抗原蛋白質之HBV疫苗，其中該抗原形成類病毒顆粒，該專利亦包含一多抗原疫苗及其製備方法，其除了完整的HBV表面抗原蛋白質以外進一步包含一HBV核心抗原。儘管許多HBV疫苗已被揭露，此等疫苗大多係經注射投與，其需要較高的成本與技術純熟之醫療人員。口服疫苗在投與時較為便利而因此可廣泛應用以降低HBV感染。
以分子農場製造各種醫藥蛋白質已吸引廣泛注意，包括酶、疫苗、抗體、荷爾蒙等。Liz Richter et al.,Nat Biotechnol.2000 Nov；18(11)：1167-71使用菸草葉及馬鈴薯塊莖以製備口服HBV疫苗。可食用蕈類被認為是生產重組蛋白的適當宿主，特別是可食性疫苗的開發。Arakawa et al.使用馬鈴薯葉及塊莖、菸草葉、番茄、萵苣、稻米生產霍亂疫苗。然而，基因轉殖植物係種植於開放環境，故使用基因轉殖植物生產蛋白質可能對健康與環境產生衝擊。使用蕈類作為分子農場具有以植物為基礎之系統所有優點，更同時包括完整複製、快速生長、在控制條件下大規模製造及較低的基因汙染等特殊優點。US 20140123345提供一種截短之gpd啟動子以及一構築體，該構築體包含操作性連結至一異源可轉錄之聚核苷酸分子之該啟動子，以及包含該構築體之蕈類。然而，此等先前技術僅提供可在蕈類中表現之截短之gpd啟動子，尚需廣泛的研究工作並克服技術問題，以達到使用蕈類作為分子農場的目標。
本發明提供一重組聚核苷酸，其包含一核苷酸序列選自SEQ ID NO：1之經截短之gpd啟動子與一核苷酸序列選自SEQ ID NO：2之經修飾HBV S蛋白質基因。在一實施例中，本發明之重組聚核苷酸可於蕈類中表現。在特定實施例中，該蕈類係火菇屬(Flammulina)、傘菇屬(Agaricus)、側耳屬(Pleurotus)或香菇屬(Lentinula)；較佳地，金針菇(F.velutipes)、鮑魚菇(Pleurotus ostreatus)、肺形側耳(Pleurotus pulmonarius)或泡囊側耳(Pleurotus populinus)；最佳地，金針菇。
本發明亦提供包含該重組核苷酸之載體。在一實施例中，該載體包含一蕈類質體；較佳地，該質體係pCAMBIA-0390。在一實施例中，該載體係pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001。
本發明亦提供一基因轉殖金針菇，其包含一經截短之gpd啟動 子，其具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列，與一經修飾之HBV S蛋白質基因，其具如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。
本發明進一步提供一疫苗組合物，其包含本發明之基因轉殖金針菇。在一實施例中，該疫苗組合物可作為藥劑或食物使用。在一實施例中，本發明之疫苗組合物可作為藥劑或是食物使用。在一實施例中，該疫苗組合物包含本發明之基因轉殖金針菇菌絲體或子實體。在一實施例中，該疫苗組合物係經鼻內投與、經噴劑、經靜脈注射、經皮內注射、經皮下注射、經口、經霧化滴(aerosol)或經肌肉注射。在另一實施例中，該基因轉殖金針菇之劑量每公斤體重係由2.0克至200克該基因轉殖金針菇乾重。在一進一步實施例中，該疫苗組合物進一步包含佐劑、免疫增強物或免疫刺激物。
圖1顯示經修飾之B型肝炎表面抗原(mHBsAg)之合成程序。
圖2顯示載體pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001之圖譜。
圖3顯示以聚合酶鏈鎖反應(PCR)偵測基因轉殖金針菇之mHBsAg基因。P：使用質體pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001之正對照組；M：DNA分子量標準品；WT：野生型金針菇。
圖4顯示以西方墨點法偵測基因轉殖金針菇之HBsAg蛋白質。P：使用購買自Abcam之商用HBsAg蛋白質；M：蛋白質分子量標準品；WT：野生型金針菇。
圖5顯示以基因轉殖金針菇菌絲體投與豬隻所產生的HBs抗體效價。
圖6顯示以基因轉殖金針菇子實體投與豬隻所產生的HBs抗體效價。
本發明創造一種重組聚核苷酸，其包含一經截短之甘油醛-3-磷 酸去氫酶(gpd)啟動子與一經修飾的B型肝炎病毒表面(HBV S)蛋白質基因，與一帶有該重組核苷酸之基因轉殖金針菇。本發明驚訝地發現將該基因轉殖金針菇投與至一個體，該個體可成功產生對抗HBV之抗體。因此，該基因轉殖金針菇可作為對抗HBV之疫苗。
以下僅為經由實施例所描述之實施方式，並不限制為有效實施本發明所生之必要特徵之結合。本發明之標題並無意圖限制本發明之各類實施方式。如「包含」、「包括」等用語並無限制意圖。此外，使用單數之「一」係包含其複數形式；除非有另外說明，「或」表示「與/或」。除非本文中有另外定義，所有本文中之技術及科學的用語與所屬技術領域具有通常知識者之理解是相同的。
本文中之用語「HBV」與「B型肝炎病毒」可互換使用，且其係指肝病毒科(Hepadnaviridae)中的任何成員(參考如Ganem and Schneider in Hepadnaviridae[2001]"The viruses and their replication"[pp 2923-2969],Knipe D M et al.,eds.Fields Virology,4th ed.Philadelphia,Lippincott Williams & Wilkins or subsequent edition)。HBV經由廣泛的系統學分析可被分類為8種主要基因型(A至H)，其中顯示至少有8%的序列歧異性。上述各類HBV基因型顯示出不同地理學分布且可表現出異質的疾病症狀與/或臨床結果。該各類HBV依HBsAg關聯血清學被分類為9種不同亞型(awy1、awy2、awy3、awy4、ayr、adw2、adw4、adrq+與adrq-)(見Mamum-Al Mahtab et al.,2008,Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5：457；Schaeffer,2007,World Gastroenterol.7：14；Norder et al.,1993,J.Gen Virol.74：1341)，各基因型與血清型包含不同品系與分離群。一分離群對應至由一特定HBV來源分離的特定病毒(例如：一個患者的檢體或其他生物性的HBV儲存宿主)，然而一個品系包含各類以基因序列而言彼此非常相近的分離群。
本文中之用語「載體」係指表現及非表現載體二者且包含病毒及非病毒載體，其包含染色體外載體(例如：多複製數質體)與被設計用於併入宿主染色體的嵌入性質體(integrating plasmid)。在本發明背景中尤為重要的是能夠在一病毒基因體中轉移核酸分子之載體(所稱轉移載體)、用於免疫療法的載體(亦即，其能夠運送核酸分子至一宿主生物)與用於各類表現系統或宿主生物中的表現載體。
本文中之用語「操作性連結」係指二物理上或功能上相關的核酸序列。例如，一啟動子或調節性DNA序列與一編碼為RNA或蛋白質的DNA序列，上述二者若為操作性連結或其座落位置使調節性的DNA會影響蛋白質編碼或結構性DNA表現量，則二者被稱為「有關聯」。
本文中之用語「聚核苷酸構築體」係指衍生自任何來源之任何重組聚核苷酸(例如：質體、黏質體(cosmid)、病毒、自動複製聚核苷酸分子、噬菌體、或線性或環狀單股或雙股DNA或RNA聚核苷酸分子)，能夠進行基因體嵌入或獨立複製，包含由一或多個聚核苷酸分子以功能性操作方式連結成之聚核苷酸分子。用語「聚核苷酸構築體」及「構築體」在本文中可交換使用。
本文中之用語「經轉形的(transformed)」係指經導入外來聚核苷酸分子(如構築體)之細胞、組織、器官或生物。較佳地，導入之聚核苷酸分子嵌入受體細胞、組織、器官或生物之基因體DNA，致使導入之聚核苷酸分子傳承至後代。
本文中之用語「表現」包含任何涉及該聚核苷酸生產的步驟，包含(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾與分泌。
在一態樣中，本發明提供一重組聚核苷酸，其包含一gpd啟動子，其具有選自SEQ ID NO：1之核苷酸序列，與一經修飾之HBV S蛋白質基因，其具有選自SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
SEQ ID NO：1之序列及其生產可參考US 20140123345，其完整內容亦於本文中納入。SEQ ID NO：1與2之序列如下所示：SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
本發明中使用之經修飾之B型肝炎表面抗原(mHBsAg)係經由HBV S蛋白質基因修飾而得，使其因此可於蕈類中表現。該HBV S蛋白質可作為一抗原以誘導免疫反應。B型肝炎表面抗原粒子可以從慢性HBV帶原者血漿中回收，大小約為22nm，該粒子係由被稱為P24及其糖基化衍生物GP27的二種蛋白質所組成，二種蛋白質皆由HBV基因體上被稱為S蛋白質編碼序列(或HBV S-gene)的226個胺基酸所編碼。本發明修飾HBV S蛋白基因，並驚訝地發現經修飾之序列(如SEQ ID NO：2所示)最適合於蕈類中表現；較佳地，火菇屬(Flammulina)、傘菇屬(Agaricus)、側耳屬(Pleurotus)與香菇屬(Lentinula)；更佳地，金針菇(F.velutipes)、鮑魚菇(Pleurotus ostreatus)、肺形側耳(Pleurotus pulmonarius)與泡囊側耳(Pleurotus populinus)；最佳地，金針菇(Flammulina velutipes)。
本發明中，gpd啟動子係操作性連結至mHBsAg；較佳地，其係連 結至一聚核苷酸分子之3'轉錄終止處。該重組聚核苷酸可包含額外之調節性聚核苷酸分子，此等額外之調節性聚核苷酸分子包含(但不限於)mRNA聚核苷酸分子之5'-不轉譯區域(5'-UTR)，其可在轉譯起始扮演重要角色，且亦能在蕈類表現構築體中作為一基因組份。此等額外之上游及下游調節性聚核苷酸分子可衍生自原存在於此啟動子構築體之其他元件或異源之來源。
在一態樣中，本發明提供一載體，其包含本發明之重組聚核苷酸。許多各類表現系統可作為本發明之載體使用。此等載體包含染色體內的、染色體外的(episomal)與衍生自病毒的載體尚有例如：衍生自各類蕈類質體的載體、衍生自細菌質體之載體、自噬菌體、自轉位子(transposons)、自酵母菌游離基因體(episome)、自插入元件(insertion elements)自酵母菌染色體元件、自病毒如桿狀病毒(baculoviruses)、乳多泡病毒(papovaviruses)、如猿猴空泡病毒40(SV40)、痘瘡病毒(vaccinia viruses)、腺病毒(adenoviruses)、禽痘病毒(fowl pox viruses)、假性狂犬病病毒(pseudorabies viruses)與反轉錄病毒(retroviruses)，以及衍生自其之結合，例如衍生自質體與噬菌體基因元件，如黏質體(cosmid)或噬粒(phagemid)。上述表現系統載體可包含進行調節與引起表現的控制區域。一般而言，任何系統或載體適合於在宿主中維持、增殖或表現該重組聚核苷酸，可在此被用於表現。適當的DNA序列可藉由任何各類熟知或常規的技術被插入該表現系統，例如在Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual中所闡述的。較佳地，該載體包含pCAMBIA-0390；更佳地，該載體係pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001。
本發明提供之基因轉殖金針菇其包含經修飾之小B型肝炎病毒表面蛋白質基因(mHBsAg)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，以及gpd啟動子(序列如SEQ ID NO：1)。
藉由使用本發明之表現載體可將金針菇細胞轉形，如前所述，宿主細胞藉由一或多個本發明之重組聚核苷酸而被轉形。一包含本發明之啟動子之轉形構築體可藉由任何轉形方法被導入金針菇細胞中。實施本發明時，藉由導入一蕈類表現構築體至一蕈類基因體以轉形蕈類的方法及材料包含任何習知及已被實證的方法，所述方法包含電穿孔、農桿菌(Agrobacterium)媒介之轉形及原生質體轉形。如此產生的轉形金針菇細胞經數代之培養並獲得一可表現HBV抗原的金針菇。
在另一態樣中，本發明提供一疫苗組合物，包含本發明之該基因轉殖金針菇。在一實施例中，該疫苗組合物可作為藥劑或是食物使用。在一實施例中，該疫苗組合物包含本發明之該基因轉殖金針菇之菌絲體或子實體。
本發明之基因轉殖金針菇通常被調配為醫藥學上可接受之疫苗組合物。該疫苗組合物依據給藥途徑而制定，且其係可與活性抗原劑(active antigenic agent)相容。該活性抗原劑係例如，依據本發明之一或多個基因轉殖金針菇。
本發明之疫苗組合物投與之有效劑量，隨年齡、體重、接種動物、給藥途徑及模式、接種試圖對抗之病原體類型而改變。該疫苗可包含任何足以引起免疫反應之劑量之基因轉殖金針菇。該劑量係由每公斤體重2.0克至200克之該基因轉殖金針菇乾重。較佳劑量係每公斤體重由3.0克至150克、3.0克至100克、3.0克至50克、3.0克至30克、3.0克至25克、3.0克至20克、3.0克至15克、3.0克至10克、3.0克至6.0克之該基因轉殖金針菇乾重，更佳地，每公斤體重由3.0克至5.5克、3.0克至4.3克、或4.3克至5.6克之該基因轉殖金針菇乾重。
視需要地，一或多個具有佐劑活性之化合物可被加入至疫苗中。佐劑為非專一性之免疫系統刺激因子，其增強宿主對疫苗的免疫反應。為技藝人士所熟知之佐劑實施例為弗氏完全與非完全佐劑 (Freund’s Complete and Incomplete adjuvant)、維生素E、非離子性阻斷聚合物(non-ionic block polymers)、胞壁醯肽(muramyl dipeptides,MDP)、免疫刺激複合體(immune stimulating complexes,SCOMs)、皂素、礦物油、植物油、聚羧乙烯(Carbopol)。視需要地，該疫苗組合物包含免疫增強劑或刺激劑(同時投與或依序投與，例如接種前或接種後)。合適的免疫刺激劑包含(但不限於)細胞激素、生長因子、化學激活素、淋巴球或單核球或淋巴器官細胞之細胞培養上清液、細胞制劑(cell preparations)或細胞萃取物(例如，金黃色葡萄球菌或脂多醣制劑)、或有絲分裂促進劑。
在一實施例中，該疫苗組合物可包含一醫藥學上可接受之載體。一醫藥學上可接受之載體可單純至例如水。另一合適的載體係例如，一具生理鹽濃度之溶液。其他在本發明中有用的醫藥學上可接受之載體或稀釋劑，其包含穩定劑如SPGA(蔗糖-磷酸-麩胺酸-白蛋白)、碳水化合物(例如：山梨醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、聚葡萄糖)、蛋白質如白蛋白或酪蛋白、含有蛋白質之試劑如小牛血清或脫脂牛奶、緩衝溶液(如：磷酸緩衝液)。
為投與動物或人類，依據現呈發明該疫苗除了可經鼻內投與以外還可藉噴劑、靜脈注射、皮內注射、皮下注射、經口投與、藉霧化滴(aerosol)或肌肉注射。考慮便利性，較佳的方法係藉噴劑投與、經鼻內投與及經口投與。
實例 實例1 製備帶有本發明之重組聚核苷酸之載體
如SEQ ID NO：2所示之mHBsAg序列係由聚合酶鏈鎖反應(PCR)合成，mHBsAg序列合成之步驟如圖1所示。依據金針菇密碼子使用偏好(codon usage bias)，設計20條引子(1至10與1'至10')用以連續性地合成SEQ ID NO：2中之片段，隨後以重疊PCR(overlap PCR)將此等片段組 合藉以合成SEQ ID NO：2。
具有SEQ ID NO：1序列之截短之gpd啟動子在本文實施例中被稱為「Fve D1」。6.8kb大小之質體pCAMBIA-0390(CAMBIA,Canberra,Australia)為一用於農桿菌(Agrobacterium)媒介轉形系統之雙元載體(binary vector)。LBA4404之582bp T-DNA帶有NOS(nopaline synthase)3'不轉譯區域(UTR)poly A訊號與pUC9之多種限制酶酵素切位(Multiple cloning site,MCS)被構築至該質體長25bp之左界(left border,LB)與長25bp之右界(Right border,RB)之間。該載體之骨幹包含胺基苷類磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphotransferase)，其係作為細菌篩選標記之卡那黴素(kanamycin)抗性基因。
該pCAMBIA-039-MM-Fv-B-001載體(圖2)之構築，係藉由插入包含Fve D1的第一個內含子(intron)、mHBsAg、作為農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)篩選標記之潮黴素B(hygromycin B)抗性基因(即潮黴素B磷酸轉移酶，hph)至pCAMBIA-0390的多種限制酶酵素切位。該構築體之序列係經由定序確認(Genomics,Taipei)。
DH5α大腸桿菌係於37℃使用Luria-Bertani(GIBCOBRL,Life Technologies,Grand Island,NY,USA)液態培養基以250rpm震盪培養或洋菜平板培養基培養，該大腸桿菌係作為DNA操作之宿主細胞與質體保存之用。
帶有pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001之DH5α大腸桿菌培養於含有50μg/ml卡那黴素之LB中，以37℃、250rpm震盪培養16小時。離心去除上清液後，藉由小量質體純化套組(Plasmid miniprep purification kit；Genemark,Taipei)提取質體。
在洋菜平板培養基上之農桿菌單一菌落被挑選並被接種至3毫升之LB液態培養基，於30℃、250rpm震盪培養，48小時後，加入1毫升該農桿菌溶液至100毫升LB培養過夜，培養條件同前所述。當農桿菌 生長至OD600值為1.5-2.0，將該細菌溶液以3000g、4℃離心10分鐘。去除上清液並以100毫升之4℃無菌水重新懸浮細胞沉澱。所述離心與重新懸浮之步驟重複6次。最後以400μl、4℃、10%已滅菌之甘油重新懸浮該細胞，以每管40μl之體積分裝至微量離心管中，並保存於-80℃作為農桿菌勝任細胞(competent cell)。
將2μl之質體加入至40μl之農桿菌勝任細胞並將所得到之混合液於冰上保持2分鐘，接著將混合液移至槽寬為0.2cm之光析管(BTX,San Diego,CA,USA)。隨後藉由BTX Electro Cell manipulator 630以電穿孔(電容：25μF、電阻：200歐姆、電壓：1.25kV/cm、電場強度：12.5kV/cm、脈波時間：5.0毫秒)將該質體轉形進入農桿菌。電穿孔後，加入400μl LB至該細菌溶液，並將溶液移至微量離心管中。2.5小時後，將50μl該溶液塗抹於含有50μg/ml卡那黴素之LB洋菜平板培養基上並於30℃培養48小時。以專一性引子藉由菌落PCR分析挑選轉形株(transformants)。
金針菇菌絲體於含有0.2%胰化蛋白質、0.2%酵母萃取物、1%麥芽糖、2%葡萄糖之CYM洋菜平板或液態培養基，於25℃生長與維持2至3週，並將培養有菌絲體之洋菜平板培養基以打孔器打孔，作為經修飾之菌絲體粒(modified mycelial pellets,MMPs)。將帶有目標質體的農桿菌品系以含有50μg/ml卡那黴素之LB培養基於28℃、250rpm震盪培養24小時，接著將其與金針菇MMPs於含有200μM乙酰丁香酮(acetosyringone)之誘導培養基(induction medium,IM)中混合，於23℃培養6小時。培養後，該MMPs隨後被轉移至新鮮的IM洋菜平板培養基，於23℃培養3至6天。接著以無菌水清洗MMPs五次以去除農桿菌，並將其轉移至含有30μg/ml潮黴素B與200mM頭孢子菌素(cefotaxime,MDBio,Taipei,Taiwan)之選擇性洋菜平板培養基，於25℃培養2-3週至對潮黴素B具抗性之金針菇菌絲體出現為止。(IM； 見下表1)
該對潮黴素B具抗性之金針菇菌絲體轉形株，其經數次繼代培養以取得穩定菌株，隨後經由PCR分析以確認mHBsAg之基因嵌入至染色體中。以染色體DNA小量套組(Geneaid,Taipei)提取轉形株之染色體DNA。以膠體電泳分析PCR產物確認mHBsAg之專一性片段於0.7kb大小出現。該實驗數據如圖3所示。
實例2 藉由投與本發明之基因轉殖金針菇於體內生產抗HBV抗體
將實例1中所得之基因轉殖金針菇菌絲體培養於木屑(sawdust)瓶中，於25℃培養1至2個月。菌絲體長滿後，置於15℃ 2至4週以誘導子實體生長。收集並乾燥該子實體以取得粉末。將50毫克樣品粉末與0.5毫升蛋白質萃取緩衝液(50mM磷酸鈉、300mM氯化鈉、1mM PMSF、0.1% Triton X-100，pH=7.4)於冰上混合1小時。以13,000g離心30分鐘後，收集上清液為總可溶蛋白質(total soluble protein,TSP)。以PierceTM BCA蛋白質分析套組(Pierce Biotechnology,USA)定量蛋白質濃度。使用小牛血清白蛋白(Pierce,Rockford,USA)配製標準品(0毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.4毫克/毫升、0.6毫克/毫升、0.8 毫克/毫升與1毫克/毫升)。於96孔微量盤中加入200μl之BCA試劑(Reagent A：B，50：1，體積/體積)至10μl之標準品及樣品，於黑暗中反應30分鐘。使用96孔盤讀取儀(VERSAmax,Sunnyvale,CA)量測562nm之吸光度值。
總可溶蛋白質中之mHBsAg係由西方墨點法分析。收集轉形株與野生型之金針菇子實體與菌絲體，隨後將其以研缽與研杵在液態氮中研磨。將總量50毫克樣品粉末與0.5毫升蛋白質萃取緩衝液於冰上混和1小時。以13,000g離心30分鐘後，收集上清液為TSP，將其與樣品溶液[50mM Tris-鹽酸(pH 7.4)、2%十二基硫酸鈉、0.1%溴酚藍、10%甘油、400mM二硫蘇糖醇、與800mM 2-巰基乙醇]混合煮沸20分鐘，將其以12%十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離。蛋白質樣品經由Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell(Bio-Rad,USA)轉印至一PVDF膜(Millipore,Bedford,MA,USA)。使用小鼠抗-HBsAg單株抗體(Abcam,Taiwan,Taipei)與接有鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)之山羊抗小鼠IgG抗體，並依製造商描述使用NBT/BCIP反應液(PerkinElmer)進行蛋白質偵測。實驗數據如圖4所示。
以SURASE B-96(GENERAL BIOLOGICALS CORP.,Taiwan,Taipei)進行量測以定量子實體與菌絲體TSP中之mHBsAg。塗佈抗HBsAg抗體之盤孔與50μl之TSP及接有過氧化酶之抗HBsAg抗體於37℃培養90分鐘。每個樣品進行三重複測定。當此培養期間結束，以清洗溶液清洗盤孔6次，再於每個孔中加入100μl之TMB-HRP微孔受質(BioFX,Owings Mills,MD)。於37℃、30分鐘後加入2N硫酸100μl以終止反應，使用96孔盤讀取儀(VERSAmax,Sunnyvale,CA)量測450nm之吸光度值。
每3天投與9g該基因轉殖金針菇菌絲體粉末至豬隻，共投與6 週。隨後每週投與豬隻，共投與2週。完成投與之第二天後，取豬隻血液樣本以Elecsys Anti-HBs(Roche)量測抗體效價。之後每10天取血液樣本進行ELISA測定。如圖5所示，於投與44天、57天與75天之後，血液樣本含有抗HBV抗體，故其顯示實例1中之基因轉殖金針菇菌絲體確實可於豬隻誘導免疫反應。
每3天投與9g該基因轉殖金針菇子實體粉末至豬隻，共投與6週。隨後每週投與豬隻，共投與14週。投與6週後每2週採取1次豬隻血液樣本以ELISA量測抗體效價，共採取8次。如圖6所示，於投與12與18週之後，血液樣本含有抗HBV抗體，故其顯示實例1中之基因轉殖金針菇子實體確實可於豬隻誘導免疫反應。
<110> 蘑法生物科技股份有限公司
<120> 重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇
<130> M52295/184405
<140>
<141>
<150> US 14/464,779
<151> 2014-08-21
<160> 2
<170> Patent In version 3.5
<210> 1
<211> 1205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子序列
<400> 1
<210> 2
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾HBV S蛋白質基因
<400> 2

Claims (15)

  1. 一種重組聚核苷酸，其包含一甘油醛-3-磷酸去氫酶(gpd)啟動子，其具有選自SEQ ID NO：1之核苷酸序列，與一經修飾之B型肝炎病毒表面(HBV S)蛋白質基因，其具有選自SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之重組聚核苷酸，其係於火菇屬(Flammulina)、傘菇屬(Agaricus)、側耳屬(Pleurotus)或香菇屬(Lentinula)表現。
  3. 如請求項1之重組聚核苷酸，其係於金針菇(Flammulina velutipes)、鮑魚菇(Pleurotus ostreatus)、肺形側耳(Pleurotus pulmonarius)或泡囊側耳(Pleurotus populinus)表現。
  4. 一種載體，其包含如請求項1之重組聚核苷酸。
  5. 如請求項4之載體，其包含蕈類質體。
  6. 如請求項5之載體，其中該質體為pCAMBIA-0390。
  7. 如請求項4之載體，其係圖2所示之pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001。
  8. 一種基因轉殖金針菇菌株，其包含一截短之甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子與一經修飾之B型肝炎病毒表面(HBV S)蛋白質基因，其中該截短之甘油酸-3-磷酸去氫酶啟動子之核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且該經修飾之B型肝炎病毒表面(HBV S)蛋白質基因之核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
  9. 一種疫苗組合物，其包含如請求項8之基因轉殖金針菇菌株。
  10. 如請求項9之疫苗組合物，其係作為藥劑或食物使用。
  11. 如請求項9之疫苗組合物，其中包含該基因轉殖金針菇菌株之基因轉殖金針菇之劑量係由每公斤體重2.0克至200克該基因轉殖金針菇乾重。
  12. 如請求項9之疫苗組合物，其投與係經鼻內、經噴劑、經靜脈注射、經皮內注射、經皮下注射、經口、經霧化滴或經肌內注射。
  13. 如請求項9之疫苗組合物，其進一步包含佐劑、免疫增強物或免疫刺激物。
  14. 如請求項9之疫苗組合物，其係為口服形式。
  15. 如請求項9之疫苗組合物，其包含如請求項8之基因轉殖金針菇菌株之菌絲體或子實體。
TW104127385A 2014-08-21 2015-08-21 重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇 TWI589697B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/464,779 US9528093B2 (en) 2014-08-21 2014-08-21 Recombinant polynucleotide and a transgenic Flammulina velutipes carrying the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201610156A TW201610156A (zh) 2016-03-16
TWI589697B true TWI589697B (zh) 2017-07-01

Family

ID=55347351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104127385A TWI589697B (zh) 2014-08-21 2015-08-21 重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9528093B2 (zh)
JP (1) JP2016042862A (zh)
CN (1) CN105385698B (zh)
TW (1) TWI589697B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9163250B2 (en) 2012-10-26 2015-10-20 Mycomagic Biotechnology Co., Ltd. Truncated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter
TWI541349B (zh) 2012-10-26 2016-07-11 蘑法生物科技股份有限公司 經截短之甘油醛－３－磷酸脫氫酶啟動子

Also Published As

Publication number Publication date
US9528093B2 (en) 2016-12-27
CN105385698B (zh) 2020-07-17
US20160051664A1 (en) 2016-02-25
JP2016042862A (ja) 2016-04-04
TW201610156A (zh) 2016-03-16
CN105385698A (zh) 2016-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rybicki Plant-based vaccines against viruses
TWI575070B (zh) Ｈｂｖ聚合酶突變體
CN105535960B (zh) 用于治疗hbv感染的组合物
Sureau et al. Production of infectious hepatitis delta virus in vitro and neutralization with antibodies directed against hepatitis B virus pre-S antigens
KR20180082485A (ko) B형 간염 바이러스에 대한 백신
CN106318955B (zh) 表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒、由其制备的疫苗和应用
Rahimian et al. Plant-based vaccines and cancer therapy: Where are we now and where are we going?
CN101036784B (zh) 一种乙型肝炎治疗性细胞毒性t细胞表位疫苗及其制备方法
WO2017113050A1 (zh) 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物
TWI589697B (zh) 重組聚核苷酸與帶有相同重組聚核苷酸之基因轉殖金針菇
JP6877788B2 (ja) ブタのＦｃ断片と融合した抗原およびこれを含むワクチン組成物
CN115010813B (zh) 一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用
CN110669142A (zh) 融合rgd的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用
JP2004175665A (ja) タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤
CN115992152A (zh) 一种用于乙型肝炎病毒治疗性mRNA疫苗及其制备方法与应用
Elkholy et al. Expression of hepatitis B surface antigen (HBsAg) gene in transgenic banana (Musa Sp.)
KR20020065559A (ko) 센티넬 바이러스 ｉ형 간염 바이러스 (ｓｖⅰ)
CN104353071B (zh) 用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt
EP1578791B1 (en) Inclusion bodies for the oral vaccination of animals
Pniewski Plant-based vaccines against hepatitis B
WO2010085162A2 (en) Expression cassettes, T-DNA molecules, plant expression vectors, transgenic plant cells as well as the use thereof in the production of a vaccine
CN114085293B (zh) 用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用
CN110055228B (zh) 用于乙肝病毒感染的重组巨细胞病毒与应用
RU2295570C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pUC8HBc-preS1, КОДИРУЮЩАЯ ГЕН БЕЛКА КОРОВОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ЭПИТОП pre-S1 РАЙОНА ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА ВИРУСА ГЕПАТИТА В (27-37 А.О.), И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА HBc-preS1
PL213496B1 (pl) Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanie