TWI583432B

TWI583432B - 自細胞提取胞器的方法

Info

Publication number: TWI583432B
Application number: TW104106905A
Authority: TW
Inventors: 林佳玟; 蔡新庭; 鄭漢中
Original assignee: 台灣粒線體應用技術股份有限公司
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2017-05-21
Also published as: US9738871B2; US20160257924A1; TW201632240A

Description

自細胞提取胞器的方法

本發明揭露一種自細胞提取胞器的方法，特別是一種以研磨件研磨細胞並從中提取胞器的方法。

胞器(organelle)是細胞中功能獨立的生物組織。在眾多的胞器當中，粒線體(mitochondrion)是細胞內進行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所。由於三磷酸腺苷為細胞活動的能量來源，所以粒線體又有「細胞能量工廠」之稱。除了為細胞提供能量外，粒線體還參與細胞分化、細胞資訊傳遞和細胞凋亡等過程，並擁有調控細胞生長周期的能力。由於分析粒線體的基因組有助於進行遺傳學以及部分疾病之研究，因此發展能自細胞內提取品質良好的粒線體之方法有助於促進相關研究領域發展。

目前有採用化學方式或物理方式破壞細胞膜以取得細胞內部之胞器。然而，上述各傳統方法皆容易於破壞細胞膜的同時，也將胞器的胞器膜一併破壞，使得能成功提取的完整胞器數量極為稀少。因此，發展一種能破壞細胞膜但又能保持胞器完整性的提取方法，是目前業界亟欲解決的問題之一。

發明人發現習知提取胞器的方法容易於細胞液中產生氣泡，使得氣泡破裂時產生的衝擊力容易對胞器產生破壞，這情形在自動化操作時尤為嚴重。有鑒於此，本發明提供一種自細胞提取胞器的方法，有助於改善破壞細胞膜的同時一併對胞器膜產生破壞的問題。

本發明所揭露之自細胞提取胞器的方法包含以下步驟：將複數個細胞和溶液均勻混合以得到混合物；將混合物置入容器內；將容器置入研磨裝置中，研磨裝置包含研磨件和連接於研磨件的機械動力源；將研磨件浸入位於容器內的混合物；進行混合物研磨，係對研磨裝置設定研磨參數，而使機械動力源根據研磨參數控制研磨件研磨混合物，以得到均質化混合物；將均質化混合物離心以得到上清液；以及將上清液離心以得到含有複數個胞器的沉澱物。於進行混合物研磨之步驟時，係保持研磨件的至少部分體積位於混合物中。

本發明所另揭露之自細胞提取胞器的方法包含以下步驟：將複數個細胞和溶液均勻混合以得到混合物；將混合物置入容器內；將研磨件浸入位於容器內的混合物；進行混合物研磨，使研磨件與容器之間以一軸心為旋轉軸而產生相對旋轉，以及使研磨件沿軸心而相對容器往復移動以得到均質化混合物；將均質化混合物離心以得到上清液；以及將上清液離心以得到含有胞器的沉澱物。於進行混合物研磨之步驟時，係保持研磨件的至少部分體積位於混合物中。

根據本發明所揭露之自細胞提取胞器的方法，研磨件與容器之間以一軸心為旋轉軸而產生相對旋轉，並且至少局部的研磨件於混合物中沿軸心而相對容器往復移動研磨含有細胞的混合物。於進行混合物研磨之步驟時，係保持研磨件的至少部分體積位於混合物中。藉此，搭配適當的研磨力道、研磨速度、操作溫度以及研磨頻率等參數，本發明所揭露的方法能在破壞大量細胞的細胞膜的同時維持胞器的完整性，以成功自細胞內提取大量品質良好的胞器。

以上之關於本發明內容之說明及以下之實施方式之說明係用以示範與解釋本發明之原理，並且提供本發明之專利申請範圍更進一步之解釋。

10‧‧‧研磨管

20‧‧‧研磨棒

30‧‧‧機械動力源

200‧‧‧研磨頭

R‧‧‧旋轉軸

S‧‧‧液面

第1圖為根據本發明一實施例自細胞提取胞器的步驟流程圖。

第2圖為根據本發明一實施例之研磨件研磨混合物的立體示意圖。

以下在實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵以及優點，其內容足以使任何熟習相關技藝者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露之內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技藝者可輕易地理解本發明相關之目的及優點。以下之實施例進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。

首先說明本發明所用之細胞的取得方式。欲從中提取胞器的細胞為人工培養於培養皿的生物細胞，亦可以為人工培養於細胞培養瓶的生物細胞。舉例來說，此細胞為貼附於一T75培養瓶(T75 Flask)內表面上的動物細胞，並且T75培養瓶內的細胞數量大於等於1X10⁸個。

使用一吸取器(例如為一可調式微量吸管，eppendorf)移除培養基內的舊細胞培養基(Culture Medium)。細胞培養基可以為添加重量百分濃度為10%的胎牛血清溶液(10wt% FBS)的Dulbecco’s改良培養基(DMEM medium)。

接著，以吸取器取適量磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)加入至培養瓶內，並且適度搖晃培養瓶以令磷酸鹽緩衝生理鹽水清除黏附於細胞膜的細胞代謝物，之後再以吸取器移除培養瓶內的磷酸鹽緩衝生理鹽水。此步驟可反覆執行數次以加強細胞代謝物的清除效果。舉例來說，加入至T75培養瓶內的磷酸鹽緩衝生理鹽水為1毫升(ml)至5毫升。較佳地，加入至T75培養瓶內的磷酸鹽緩衝生理鹽水為3毫升。另外，當細胞貼附於具有較大的細胞培養面積的一T175培養瓶(T175 Flask)內時，加入至培養瓶內進行清潔的磷酸鹽緩衝生理鹽水為10毫升。

接著，以吸取器取適量胰蛋白酶(trypsin)加入培養瓶內，並且將培養瓶置於攝氏37度無菌環境下3分鐘至5分鐘，以令胰蛋白酶產生水解反應而切斷連接細胞膜和培養瓶的肽鍵，進而使細胞脫離培養瓶的內表面。舉例來說，加入T75培養瓶內的胰蛋白酶為1毫升至3毫升。較佳地，加入T75培養瓶內的胰蛋白酶為1毫升。另外，當細胞貼附於T175培養瓶內時，加入培養瓶內的胰蛋白酶為5毫升。

接著，以吸取器取適量且未使用過的新細胞培養基加入至培養瓶內以抑止胰蛋白酶的水解反應，並且將培養瓶內的細胞以及細胞培養基移入一離心管中。舉例來說，加入T75培養瓶內的新細胞培養基為1毫升至3毫升。較佳地，加入T75培養瓶內的新細胞培養基為2毫升。另外，當細胞貼附於T175培養瓶內時，加入培養瓶內的新細胞培養基為5毫升。此外，前述離心管的容量為15毫升。

接著，以離心力300G值，離心時間5分鐘，離心溫度攝氏22度的參數進行離心，而令細胞沉澱至離心管底部。進行離心後，用吸取器移除離心管內的液體。

接著，以吸取器取適量SEH緩衝液(SEH buffer)加入離心管中，並以離心力300G值，離心時間5分鐘，離心溫度攝氏22度的參數進行離心以清洗細胞。進行離心後，用吸取器移除離心管內的液體。舉例來說，加入離心管中的SEH緩衝液為1毫升至3毫升。較佳地，加入離心管中的SEH緩衝液為2毫升。本步驟可重複數次以加強清潔效果。沉澱於離心管底部細胞即為以下步驟中所使用的細胞。

前述SEH緩衝溶液具備有維持浸泡於其中的胞器的雙層膜結構穩定之功能。SEH緩衝溶液的製備方式為混合蔗糖(Sucrose)、乙二醇雙氨乙基醚四乙酸(ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra-acetic acid,EGTA)、4-羥乙基乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid,HEPES)於溶液中，使溶液中蔗糖之體積莫耳濃度為0.25M、乙二醇雙氨乙基醚四乙酸之體積莫耳濃度為0.5mM及4-羥乙基乙磺酸之體積莫耳濃度為3mM後，再以氫氧化鈉(NaOH)溶液及鹽酸(HC1)溶液調整前述混合溶液的酸鹼值(pH值)至7.2。製備完成之SEH緩衝溶液必須儲存於攝氏4度(4℃)的環境中。

執行上述取得細胞的過程中，除了有特別說明操作溫度的步驟之外，操作溫度皆須保持小於等於攝氏4度(4℃)，所有欲使用的容器及溶液在使用前皆須先降溫至攝氏4度或是攝氏4度以下。例如，容器與溶液在使用前與使用過程中，皆置於一碎冰堆或是一冰磚內，其用意在於將容器與溶液的溫度先降至攝氏4度，並保持操作溫度在攝氏4度。藉此，可避免細胞以及胞器的蛋白質成分在執行各步驟時因溫度上升而產生變性。然而，操作溫度並非用以限制本發明。於本發明其他實施例中，亦可根據細胞與胞器蛋白質成分的不同，採用不同的操作溫度。

接下來說明將胞器自細胞內提取出來的方法，請同時參照第1圖和第2圖。第1圖為根據本發明一實施例自細胞提取胞器的步驟流程圖。第2圖為根據本發明一實施例之研磨件研磨混合物的立體示意圖。

首先，將複數個細胞和一溶液均勻混合以得到一混合物(步驟S10)。

詳細來說，將上述沉澱於離心管底部的細胞及溶液置入一混合用容器，接著以吸取器反覆吸取及釋放混合用容器內的溶液，以令沉澱的複數個細胞和溶液均勻混合，即能得到前述之混合物。步驟S10所用之溶液例如為SEH緩衝溶液或是Dulbecco’s改良培養基(DMEM medium)等培養液，並且置入混合用容器的溶液為1~5毫升。混合用容器可以為乾淨的新離心管，也可以繼續使用原先盛裝細胞的離心管。

於完成步驟S10後，可自混合用容器內取10~40微升(microlitre，μl)的混合物置放於細胞計數器(Cell Count)以確認混和物中的細胞數量。較佳地，可取20微升的混合物作計數用。

接著，將混合物置入一容器內(步驟S20)。

詳細來說，將前述步驟之全部混合物或部分混合物加入研磨用容器內，使研磨用容器內的細胞數量大於等於1x10⁷個，以取得較佳的研磨效果。較佳地，研磨用容器內的細胞數量為1x10⁷~2x10⁷個。研磨用容器可以為第2圖所示之研磨管10。

接著，將容器置入一研磨裝置中，且研磨裝置包含一研磨件和連接於研磨件的一機械動力源30(步驟S30)。

詳細來說，研磨裝置的研磨件可以為第2圖所示之研磨棒20。研磨裝置的機械動力源30例如為一液壓馬達或是氣缸。

接著，將一研磨件浸入位於容器內的混合物(步驟S40)。

詳細來說，將研磨件緩緩地浸入位於容器內的混合物中，以避免研磨件接觸混合物的液面時將空氣一併帶入混合物中而產生氣泡。如此一來，可避免混合物中的氣泡破裂時產生的衝擊力對胞器產生的破壞，進而提升自細胞內提取出的胞器的完整性。於本實施例中，係先將混合物置入容器內，再將研磨件浸入位於容器內的混合物中，但不以此為限。於本發明其他實施例中，係先將研磨件置入容器內，再將混合物置入容器內，並且使部分的研磨件位於混合物的液面之下。

接著，進行混合物研磨，係對研磨裝置設定一研磨參數，而使機械動力源根據研磨參數控制研磨件研磨混合物，以得到一均質化混合物，且於進行研磨時，研磨件的至少部分體積保持位於混合物中(步驟S50)。

詳細來說，對研磨裝置設定之研磨參數包含一旋轉參數和一推壓參數。如第2圖所示，研磨裝置根據旋轉參數而控制研磨管10(容器)以一旋轉軸R(容器之自身軸心)相對研磨棒20(研磨件)旋轉。研磨裝置的機械動力源30根據推壓參數而控制研磨棒20的研磨頭200於混合物中沿旋轉軸R相對研磨管10往復移動。由於研磨管10的內壁面與研磨頭200之間的僅有不到0.1公厘(mm)的間隙，因此在研磨棒與研磨管之間相對移動的過程中，混合物中之細胞的細胞膜與研磨棒表面或研磨管表面彼此摩擦而受到破壞。如此一來，細胞內的胞器自細胞中穿過破損的細胞膜而均勻散布於溶液中以得到均質化混合物。值得注意的是，於進行混合物研磨的過程中，研磨頭200保持浸入混合物中。也就是說，如第2圖所示，研磨頭200於進行混合物研磨的過程中保持位於混合物的一液面S下方。如此一來，可避免研磨頭接觸混合物的液面時將空氣帶入混合物中而產生氣泡，防止混合物中的氣泡破裂時產生的衝擊力對胞器產生的破壞，進而提升自細胞內提取出的胞器的完整性。

進一步來說，上述研磨參數的旋轉參數為每分鐘3~7轉(Revolution Per Minute，RPM)，上述研磨參數的推壓參數為2公斤重(kgw)至5公斤重，且研磨件於混合物中沿軸心而相對容器往復移動的次數為10~20次。上述之容器轉速、研磨力道和研磨次數並非用以限制本發明。在其他實施例中，這些參數可視需求調整，使得停止研磨時，混合物中細胞數量的80%~90%破裂而得到前述均質化混合物。在本實施例中，研磨裝置可以為杜恩斯勻漿器(Dounce Homogenizer)，但不以此為限。

停止研磨時間點的判定方法係以光學顯微鏡觀察滴入染劑的混合物。詳細來說，可隨時將部分混合物取出，接著將台盼蘭(trypan blue)等染劑滴入取出的混合物中，並將滴入染劑的混合物置於光學顯微鏡下進行觀察。由於破裂死亡的細胞會被染劑染色，而存活的細胞則會將染劑排出，因此當觀察到混合物中80%~90%的細胞被染色時，即可推斷已有足夠數量的胞器離開破裂死亡的細胞而均勻分布於混合物中。

接著，將均質化混合物離心以得到一上清液(步驟S60)。

詳細來說，係將均質化混合物自容器(研磨管10)移至離心管內，並且以離心力1000G值，離心時間10分鐘，離心溫度攝氏4度的參數進行1~3次離心。離心後，存活的細胞以及較大較重的死亡細胞殘骸沉澱至離心管底部，胞器、較小較輕的死亡細胞殘骸懸浮在上清液(Supernatant)中。以吸取器吸取包含胞器、較小較輕的死亡細胞殘骸和溶液的上清液，並且置入另一離心管內。

最後，將上清液離心以得到含有複數個胞器的一沉澱物(步驟S70)。

詳細來說，係將步驟S60中得到的上清液以離心力7000G值，離心時間15分鐘，離心溫度攝氏4度的參數進行1~3次離心，而使上清液中相對較重的胞器沉澱至離心管底部。進行離心後，以吸取器移除上清液並加入適量新的溶液(例如為SEH緩衝溶液)。加入新的溶液後，以吸取器反覆吸取釋放離心管內的溶液，以令含有胞器的沉澱物和溶液均勻混合。步驟S70中所加入溶液的需求量視步驟S10中的細胞數量而定，每1x10⁷至2x10⁷ 數量的細胞需加入50微升(μl)的溶液。

於完成步驟S70後，加入以1：100的比例稀釋之濃縮即用溶液的蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor)以利於之後胞器的保存。

最後，將胞器和SEH緩衝溶液冷藏於攝氏4度環境中進行保存。

值得注意的是，上述步驟S10至S70於執行過程中，操作溫度皆保持小於等於攝氏4度(4℃)，所有欲使用的容器及溶液在使用前皆須先降溫至攝氏4度或是攝氏4度以下。例如，在步驟S50執行前與步驟S50執行過程中，研磨件和容器皆置於一碎冰堆或是一冰磚內，以保持操作溫度在攝氏4度。藉此，可避免細胞以及胞器的蛋白質成分在執行各步驟時因溫度上升而產生變性。然而，操作溫度並非用以限制本發明。於本發明其他實施例中，亦可根據細胞與胞器蛋白質成分的不同，採用不同的操作溫度。

此外，由細胞中提取的胞器可以牛血清白蛋白(BSA)的濃度作為參照標準品進行蛋白質定量分析(Protein Determination)，以推估SEH緩衝溶液中健康胞器的濃度。在進行蛋白質定量分析時，將濃度為0微克/微升(μg/μl)、0.25μg/μl、0.5μg/μl、1μg/μl、1.5μg/μ以及2μg/μl的牛血清白蛋白標準品與細胞中提取的胞器分別與定量試劑混合均勻後，置於攝氏37度下30分鐘。接著利用機器測量牛血清蛋白標準品的吸光值，並利用標準品的吸光值製作標準曲線。最後，利用細胞中提取的胞器的吸光值以及吸光值標準曲線，以內插法求出細胞中提取的胞器的濃度。

以下藉由本發明二實施例及二比較例說明本發明所揭露之自細胞提取胞器的方法，並且進行實驗測試以比較其性質差異。

實施例一

首先，將2X10⁷個動物細胞加入2微毫升SEH緩衝溶液而得到混合物。本實施例欲提取的胞器為粒線體。

接著，將混合物置入一杜恩斯勻漿器的一研磨管內。

接著，將一杜恩斯勻漿器的一研磨棒浸入位於研磨管內的混合物。

接著，進行混合物研磨。在研磨的過程中，研磨棒的一研磨頭保持位於混合物中。研磨管相對研磨棒旋轉的轉速為每分鐘5轉，杜恩斯勻漿器的研磨頭施予混合物2公斤重(kgw)的外力，並在混合物中相對研磨管往復移動15次以得到均質化混合物。

接著，將均質化混合物移入一離心管內，並且以離心力1000G值，離心時間10分鐘，離心溫度攝氏4度的參數進行2次離心。完成離心後，以吸取器吸取離心管內的一上清液，並將上清液移入另一離心管中。

最後，將上清液以離心力7000G值，離心時間15 分鐘，離心溫度攝氏4度的參數進行1次離心，以得到一沉澱物。進行離心後，以吸取器移除上清液並加入50微升新的SEH緩衝溶液。以吸取器反覆吸取釋放離心管內的SEH緩衝溶液，而令沉澱物和SEH緩衝溶液均勻混合。

實施例二

實施例二中，各製程步驟大致與實施例一相同，其差異僅在於混合物研磨之步驟。

於進行混合物研磨時，在研磨的過程中，研磨頭保持在混合物中。研磨管相對研磨棒旋轉的轉速為每分鐘5轉，杜恩斯勻漿器的研磨頭施予混合物5公斤重(kgw)的外力，並且在混合物中相對研磨管往復移動15次以得到均質化混合物。

比較例一

比較例一中，各製程步驟大致與實施例一相同，其差異僅在於混合物研磨之步驟。

於進行混合物研磨時，研磨頭於混合物研磨的過程中並未保持位於混合物的一液面下方。也就是說，當研磨頭朝遠離研磨管底部的方向移動時，研磨頭整個自混合物液面抽離。當研磨頭朝接近研磨管底部的方向移動時，研磨頭自外部由混和物液面插入混和物內。研磨管相對研磨棒旋轉的轉速為每分鐘5轉，杜恩斯勻漿器的研磨頭施予混合物2公斤重(kgw)的外力，並在混合物中相對研磨管往復移動15次以得到均質化混合物。

比較例二

比較例二中，各製程步驟大致與實施例一相同，其差異僅在於混合物研磨之步驟。

於進行混合物研磨時，在研磨的過程中，研磨頭保持在混合物中。研磨管相對研磨棒旋轉的轉速為每分鐘5轉，以手動的方式驅動研磨頭施予混合物外力，並在混合物中相對研磨管往復移動15次以得到均質化混合物。

接下來，以蛋白質定量分析分別推估以實施例一、實施例二、比較例一以及比較例二的方式所取得的沉澱物和SEH緩衝溶液混合物中的粒線體濃度，以及以顯微鏡確認粒線體完整性。其結果如下表一所示。

根據實施例一與實施例二的操作方法所取得的粒線體具有較高的粒線體濃度以及較佳的粒線體完整度。在實施例一和實施例二中，研磨頭於進行混合物研磨的過程中保持在混合物的液面下方，有助於避免進行混合物研磨的過程中，研磨頭將大量空氣帶入混合物中而產生過多氣泡。如此一來，研磨頭研磨細胞的效率得到提升，並且可避免氣泡破裂產生的衝擊力破壞胞器，有助於提高自細胞內提取出的胞器的完整性。此外，研磨棒藉由機械動力源驅動，而可避免研磨力道變化過大，有助於參數的標準化以維持粒線體的品質。

由上表比較實施例一與比較例一可知，比較例一的粒線體的濃度較低，完整度也較差。其原因在於比較例一的研磨頭於進行混合物研磨的過程中並未保持位於混合物的液面下方，而容易產生過多氣泡而破壞胞器，使自細胞內提取出的胞器的完整性下降。

由上表比較實施例一與比較例二可知，比較例二的粒線體的濃度較低，完整度也較差。其原因在於比較例二的研磨棒係由手動驅動而相對研磨管往復移動。如此一來，容易因使用者手感不同而難以穩定控制研磨力道大小以及研磨棒移動方向，使得最後得到的粒線體濃度與品質不穩定。

綜上所述，本發明揭露的自細胞提取胞器的方法中，研磨件與容器之間以一軸心為旋轉軸而產生相對旋轉，並且至少局部的研磨件於混合物中沿軸心而相對容器往復移動研磨含有細胞的混合物。於進行混合物研磨之步驟時，係保持研磨件的至少部分體積位於混合物中。藉此，搭配適當的研磨力道、研磨速度、操作溫度以及研磨頻率等參數，本發明所揭露的方法能在破壞大量細胞的細胞膜同時維持胞器的完整性，以成功自細胞內提取大量品質良好的胞器。

雖然本發明以前述之較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習相像技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種自細胞提取胞器的方法，其步驟包含：將複數個細胞和一溶液均勻混合以得到一混合物；將該混合物置入一容器內；將該容器置入一研磨裝置中，該研磨裝置包含一研磨件和連接於該研磨件的一機械動力源；將該研磨件浸入位於該容器內的該混合物；進行該混合物研磨，係對該研磨裝置設定一研磨參數，而使該機械動力源根據該研磨參數控制該研磨件研磨該混合物，以得到一均質化混合物；將該均質化混合物離心以得到一上清液；以及將該上清液離心以得到含有複數個胞器的一沉澱物；其中，進行該混合物研磨包含有如下之子步驟：利用該研磨參數中的一推壓參數來控制該機械動力源，以使該研磨件沿該容器自身的一軸心於該容器中進行往復移動而研磨該混合物；其中，於進行該混合物研磨之步驟，係保持該研磨件的至少部分體積位於該混合物中。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中進行該混合物研磨更包含有如下之子步驟：利用該研磨參數中的一旋轉參數來控制該機械動力源，以使該容器以自身之該軸心為旋轉軸相對該研磨件旋轉。
如請求項2所述之自細胞提取胞器的方法，其中該旋轉參數為每分鐘3轉(Revolution Per Minute，RPM)至每分鐘7轉。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中當進行該混合物研磨時，於該混合物中的該些細胞數量的80%~90%破裂時停止研磨，以得到該均質化混合物。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中該推壓參數為2公斤重(kgw)至5公斤重。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中該研磨件於進行該混合物研磨的步驟中，沿該軸心相對該容器往復移動10次至20次。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中該溶液為包含蔗糖(Sucrose)、乙二醇雙氨乙基醚四乙酸(EGTA)以及4-羥乙基乙磺酸(HEPES)的一緩衝溶液(Buffer)，蔗糖之體積莫耳濃度為0.25M，乙二醇雙氨乙基醚四乙酸之體積莫耳濃度為0.5mM，且4-羥乙基乙磺酸之體積莫耳濃度為3mM。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中該些步驟的操作溫度皆小於等於攝氏4度(4℃)。
如請求項1所述之自細胞提取胞器的方法，其中該些胞器為粒線體(mitochondrion)。
一種自細胞提取胞器的方法，其步驟包含：將複數個細胞和一溶液均勻混合以得到一混合物；將該混合物置入一容器內；進行該混合物研磨，使該容器內的一研磨件與該容器之間以一軸心為旋轉軸而產生相對旋轉，以及使該研磨件沿該軸心而相對該容器往復移動以得到一均質化混合物；將該均質化混合物離心以得到一上清液；以及將該上清液離心以得到含有複數個胞器的一沉澱物；其中，於進行該混合物研磨之步驟，係保持該研磨件的至少部分體積位於該混合物中。