TWI567088B - 能結合人類白血球抗原（ｈｌａ）分子的胜肽、由此胜肽衍生出的癌症疫苗及其用途 - Google Patents
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Description
本發明是關於免疫抗原性及胜肽化學。
癌症是一種威脅生命的疾病，並且是在世界各地主要的健康問體。已持續進行密集的研究，以確定癌症的起源及起因並瞭解正常細胞變成癌細胞的轉型。不幸地，尚未完全發現這些議題的解答。
口腔癌是一種使人衰弱的疾病，並且在世界各地最常見的惡性腫瘤中，男性口腔癌和女性口腔癌分別位居第8位和第13位，如Cheong等學者於2009年所發表之文章「Gene Expression in Human Oral Squamous Cell Carcinoma(OSCC)is Influenced by Risk Factor Exposure」中所述。雖然口腔癌的流行病學已建立良好，但口腔癌患者的預後(prognosis)及存活率在過去30並沒顯著地改善。再者，近年來已嘗試的許多治療方法在療效上是有限的，特別是關於三分之一的罹患復發性或續發性腫瘤的口腔癌患者。因此，需要有效作用在復發腫瘤的禁止、診斷和預後的治療方法。
由於此領域之技藝者已知免疫系統在癌細胞的消除上扮演一種要角色，因此免疫療法一直是一大的研究領域。然而，由於哺乳動物的免疫系統在外來物或不相容材料的辨識或反映上的複雜性，因此結果總是不正面。不過，這些結果已導致並指出許多不同型態的治療方法的成果。主要基於免疫療法的治療方法中之一是治療性單株抗體的使用，例如：西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼
單抗(panitumumab)和matuzumab。它們在調制免疫系統上的能力允許它們是為更成功的免疫療法中之一。基於此，治療性單株抗體已使用在頭頸癌的治療。然而，治療性單株抗體的生產是相當昂貴，並且生產治療性單株抗體的成本似乎是此些治療性單株抗體的生產及商業發展上的主要限制。再者，此些治療性單株抗體對頭頸癌的治療功效被認為偏低。
在一臨床試驗中，其標題為「Phase I Clinical Trial of Survivin-derived Peptide Vaccine Therapy for Patients with Advanced or Recurrent Oral Cancer」，Mizayaki等學者所發表之存活蛋白衍生胜肽衍疫苗(稱之為survivin-2B80-88)用在具有擴散性或復發性口腔癌之患者上的結果。Mizayaki等學者在臨床試驗中亦述及「存活蛋白(survivin)」是凋亡家族的抑制劑的近來的特徵成員，其大量地表現在大部分的惡性腫瘤上但在正常成人組織上幾乎察覺不到。然而，僅管胜肽特異性的毒殺性T淋巴細胞的增加，但10個患者當中只有一個顯示出腫瘤縮小，因此在臨床試驗上所獲得的結果是負面的。
在不同的臨床試驗中，其標題為「Effect of Dendritic Cell Vaccine Against a Tongue Squamous Cell Cancer Cell Line(Tca8113)in vivo and in vitro」，Wang等學者在樹突狀細胞(dendritic cells；DC)的致敏反應上利用來自Tca8113的細胞溶解物證實在小鼠上樹突狀細胞對於殺死Tca8113細胞及抑制腫瘤成長的能力。然而，在臨床實務上，總是不能產生自體腫瘤裂解物。再者，樹突狀細胞疫苗在其擴展尚需要特殊的設施因而非常昂貴。因為細胞需要
重新注入至患者中，因此利用樹突狀細胞的治療方法亦是昂貴的。
在另一臨床試驗中，其標題為「Genetically Engineered Tumor Cell Vaccine in a Head and Neck Cancer Model」，Couch等學者說明利用表現顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor；GM-CSF)的放射線損害細胞為疫苗進行小鼠的接種。接種的結果顯示：與控制組相比，接種後的小鼠是免受隨後的腫瘤挑戰。即使有揭露正面的結果，GM-CSF未必是口腔癌的理想標靶，並且具有可作為疫苗之高水準特定蛋白質之癌細胞的產生會需要使用不易得到食品藥物管理局(Food and Drug Administration；FDA)許可之病毒方法。
至今，能發現許多專利文件中描述了在治療不同類型癌症上免疫療法的使用。此些專利文件已揭露涉及免疫療法的概念之治療、抑制或預防腫瘤復發的方法，但在多數專利文件中已進行的作用是具體表現在特定癌症上。因此，揭露的方法不能必定作用在治療或抑制口腔癌或預防口腔癌的復發。除了涉及免疫療法的方法，一些使用為單一模式治療或用在口腔癌的治療上的組合的方法包括外科手術、放射線療法及化學療法。然而，對於口腔癌患者，因為口為極其重要的器官並且手術治療將嚴重影響生活品質，所以外科手術與高發病率特別相關。再者，由於口位在靠近關鍵血管和解剖構造的地方，因此有時不能進行廣泛的外科手術來確保手術切緣是明確的。另外，典型的口腔癌患者為其年齡超過60歲且常具有共病因子的患者，並且他們可能不適合進行外科手術。化學療法和放射線療法的使用因在標靶腫瘤體積附近的正
常細胞上的放射線毒性而比外科手術有更多限制。而且，化學療法和放射線療法的治療方法會造成負作用。其中，負作用的性質、嚴重性和長壽源是取決於接收到放射線的器官、放射線的種類、劑量、次數、併行的化學療法和患者。
基於上述，一種替代的治療策略對於延長口腔癌患者的生活極為重要。因此，本發明的目的是藉由採用胜肽、由此胜肽衍生出的癌症疫苗及此癌症疫苗的用途來解決前述的技術問題，並且胜肽、由此胜肽衍生出的癌症疫苗及此癌症疫苗的用途能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。其中，主體為口腔癌患者。
本發明是關於一種胜肽，其包括選自至少一部分的黑素瘤抗原家族D4b(Melanoma antigen family D4b；MAGE-D4b)蛋白質之至少一胺基酸序列，其中此胜肽具有與人類白血球抗原(human leukocyte antigen；HLA)分子結合的能力。於此述及之胺基酸序列是選自如表1所列之MAGE-D4b蛋白質的序列識別號(SEQ ID NO.)1到序列識別號12中之任一者或任意組合。根據本發明，胜肽序列的結構能被修飾或改變，並且於此的修飾或改變包括，但不限於此，替換、刪除或插入。關於替換，在此胜肽中至少一胺基酸以另一胺基酸替換之。關於刪除，在此胜肽中至少一胺基酸被刪除。關於插入，此胜肽插入至少一胺基酸。較佳地，額外的胺基酸插入在C端或N端。在與HLA分子結合上，此胜肽能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。於此，主體是
指口腔癌患者。如同本發明所述，此胜肽適用以生產癌症疫苗，其中此癌症疫苗能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。
再者，一種癌症疫苗包括如本發明所請求之至少一胜肽。由於HLA與胜肽之間的獨特的結合特異性，因此利用本發明之胜肽特別地發展癌症疫苗，並且此癌症疫苗為其抗原能粘附在HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24中之任一者或任意組合上之主體而配製。並且，此癌症疫苗更包括增進癌症疫苗的效用之佐劑。較佳地，此佐劑可為顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor；GM-CSF)。本發明亦揭露一種癌症疫苗的用途。於此，此癌症疫苗的用途能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。
本發明的一目的是提供一種胜肽，其具有選自如表1所列之MAGE-D4b蛋白質的序列識別號1到序列識別號12中之任一者或任意組合之至少一胺基酸序列。
本發明的另一目的是提供一種胜肽，其能與至少一HLA分子結合。
本發明的又一目的是提供一種胜肽，此種與HLA分子結合之胜肽能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。
本發明的又一目的是提供一種胜肽的用途，以產生癌症疫苗。
本發明的又一目的是提供一種癌症疫苗，其能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。
本發明的又一目的是提供一種癌症疫苗，其為其HLA為
HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24中之任一者或任意組合之主體而配製。
本發明的又一目的是提供一種癌症疫苗的用途，其能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。
上述及本發明的其他特徵和目的透過參照下列詳細說明將更明顯易懂。應了解的是，本發明能採取各種替代形式，因而以下的詳述說明並不打算面面俱到，亦非用以限制本發明為所揭露的確切形式。相反地，除非請求項明確記載，否則詳細說明涵蓋構成本發明之所有有關的修改態樣和選擇態樣。
免疫療法已用於癌症的治療，其透過訓練患者的自體免疫系統去辨識並消滅癌細胞。在人類免疫系統中扮演必要角色的分子中之一是主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex；MHC)分子。此分子決定許多宿主免疫反應的結果。一般有兩種類型的MHC分子。MHC第一型(Class I)分子存在於大部分的有核細胞上，而MHC第二型(Class II)分子是存在於專職性抗原提呈細胞(professional antigen presenting cell；professional APC)上。形成在MHC第一型分子和胜肽之間的複合體是由CD8+毒殺性T細胞所辨識，其後引發來自CD8+毒殺性T細胞的反應。同樣地，形成在MHC第二型分子和胜肽之間的複合體是由CD4+毒殺性T細胞所辨識。然而，MHC分子具有相當高的多型性。由於每個MHC分子具有獨特的結合特異性，因而MHC分子的多型性構成對T細胞抗原決定位發限的挑戰。考慮到大量
的人類MHC分子，其又已知為人類白血球抗原(human leukocyte antigen；HLA)分子，成功結合HLA分子與胜肽的可能性更低。
用以辨識可使用在療法上的胜肽的準則中之一是測定在口腔癌細胞上的抗原是否大量表現。在本發明中，口腔癌的分子圖譜顯示相較於正常口腔黏膜組織，在口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)中，黑色素瘤抗原家族D4b(Melanoma antigen family D4b；MAGE-D4b)是大量表現的，如同發明人的成果，其標題為「Gene Expression in Human Oral Squamous Cell Carcinoma is Influenced by Risk Factor Exposure(Cheong et al.2009)」所揭露。並且，已完成進一步的研究，以進一步確認在mRNA與蛋白質含量上OSCC組織中之MAGE-D4b的大量表現。此些研究結果顯示在第1、6(a)及6(b)圖中。在第1圖中，定量即時聚合酶連鎖反應(quantitative real-time polymerase chain reaction；quantitative real-time PCR)資料顯示在OSCC組織中之MAGE-D4b表現的範圍，其顯著地高於正常組織。在第6(b)圖中顯示MAGE-D4b染色的免疫組織化學照片。為了測定MAGE-D4b是否可能發展為有關於毒性之具有可忽略的重要器官的治療標靶，已完成進一步的分析。此分析利用PCR在人類組織的互補去氧核糖核酸(cDNA)群組(panel)上，並且如第2圖所示，分析的結果顯示除了卵巢、胸腺和結腸，在測試的正常組織中多數的MAGE-D4b表現出非常低的含量。
根據MAGE-D4b的表現可由DNA甲基化及去甲基化程序規範之理論，本發明的發明人更透過以5-氮脫氧胞苷(5
Aza-deoxycitidine)之去甲基藥物處理OSCC細胞株來分析OSCC細胞株。發明人觀察在以去甲基藥物處理後，在OSCC細胞株中之MAGE-D4b的再表現。觀察結果明確說明在癌化期間，MAGE-D4b的表現是因為DNA甲基化的減少。所以，MAGE家族蛋白質易於表現在腫瘤上而非正常組織。
根據上述結果和觀察結果，已說明了此蛋白質是表現在超過50%的口腔癌中，但表現在非常少的正常組織中，此結果指出MAGE-D4b被認為是治療口腔的理想方法。因此，本發明揭露一種胜肽，其包括至少一胺基酸，並且至少一胺基酸是選自至少一部分的MAGE-D4b蛋白質。其中，此胜肽能與HLA分子結合。在本發明中，亦揭露此胜肽與HLA分子的結合能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。
正如較早所揭露的，在HLA與胜肽之間的結合是特殊的。為了誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物，主體必須具有獨特的HLA去接收且專一結合胜肽。於此述及之主體可為任亦哺乳動物，但較佳為人類。更佳地，此人類為具有有MAGE-D4b的表現之腫瘤的口腔癌患者。MAGE-D4b的表現能由免疫組織化學染色、PCR或任何可指出相較於正常組織在腫瘤組織中之MAGE-D4b的表現是否存在和/或升高之其他方法。
若MAGE-D4b大量表現在主體中，此主體將視為部分符合治療資格，並且此主體將需要進一步接受測試以判定此主體是否具有為HLA-A2、HLA-A11或HLA-A24之主要組織相容性抗原血型。
此種HLA分類是利用在本領域中之技藝者所熟知的方法來
執，例如：PCR、流式細胞儀(Luminex)或螢光激活細胞分選分析法(fluorescence activated cell sorting analysis；FACS)。一旦判定主體所具有之HLA的類型，將使用對應相同HLA類型之胜肽。換句話說，若主體不具有HLA-A2、HLA-A11和HLA-24中之任一種，將給予第二型(Class II)胜肽。由於本發明涉及之HLA專一的胜肽，因此在利用本發明所揭露之任何治療之前，此些測試先確定主體擁有的與HLA專一的胜肽相匹配之基因型。
於此述及之胺基酸序列是選自如表1所列之MAGE-D4b蛋白質的序列識別號1到序列識別號12中之任一者或任意組合。
依照本發明，胜肽會合成地製備或由諸如活體內腫瘤或致病菌等天然來源自然分離。合成製備可包括重組DNA技術或化學合成法。
再者，對於上述表列之序列，胜肽序列的結構能進行修飾或改變。於此所述及之修飾或改變是指在胜肽序列中至少一胺基酸的修飾或改變。胺酸酸的改變包括替換、刪除或插入，但本發明不限於此。關於替換，以具有相似化學特性之另一胺基酸替換表1中之任一胜肽序列的至少一胺基酸。關於插入，將至少一額外的胺基酸插入至選自表1之胜肽序列的任意部分中。更佳地，額外的胺基酸插入在胜肽序列的N端或C端。關於刪除，是將選自表1之一胜肽序列的任一胺基酸移除。於此，是以不會劣化胜肽的免疫特性的方式選擇胺基酸。其中，胜肽的免疫特性包括在HLA分子與胜肽之間的結合親合力及誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物的能力。然而，修飾後或改變後的胜肽序列會增強胜肽的特性，例如：在表現系統中胜肽的穩定性或蛋白質與蛋白質結合的穩定性，例如：HLA-胜肽結合。下表2是用以作為表1中表列之胜肽序列的參考。
根據本發明，胜肽能用以製造藥物，或特別是能用以製造癌症疫苗，並且此癌症疫苗能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。在癌症疫苗中的胜肽包括選自至少一部分的MAGE-D4b蛋白質之至少一胺基酸序列，並且此胺基酸序列是選自表1中所表列之序列識別號1到序列識別號12中之任一者或任意組合。依照本發明，癌症疫苗可為預防處理或治療製劑。由於在HLA與胜肽之間的獨特的結合特異性，因此利用本發明之胜肽特別地發展癌症疫苗，以致使胜肽可與HLA分子成功地結合，其後引發來自CD8+毒殺性T細胞的反應以根除口腔癌細胞。基於此
理由，此癌症疫苗是根據特定主體所具有的抗原的類型而製備。若主體具有HLA-A2、HLA-A11、HLA-A24或其組合，此癌症疫苗可基於如表1所列之序列識別號1到序列識別號12的胺基酸序列製備。換句話說，若主體不具有HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24中之任一者或其組合，此癌症疫苗可基於如表1所列之序列識別號10到序列識別號12的胺基酸序列製備。
根據本發明的癌症疫苗有需多實施例。如先前所述，在序列識別號1到序列識別號12中的胺基酸藉由替代、插入和刪除的非限制範例進行改變或修飾。因此，多數的癌症疫苗可由此些修飾後的胜肽序列產生。並且，在此些癌症疫苗會產生相等或增大的T細胞刺激特性的方面上，於此所進行的改變或修飾是不會劣化癌症疫苗的免疫特性。
根據本發明的疫苗是根據癌症疫苗對主體的投藥方式而發展，並且施用的方式包括非限制的例如，口服施用(在固體生理能接受基礎上或在生理能接受的分散作用上)、靜脈施用、或氣霧施用等等。
靜脈施用的一個例子是注射，其包括皮內(intradermal/intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、皮下(subcutaneous)、脊髓內(intrathecal)、十二指腸內(intraduodenal)、內腹腔內(intraperitoneally)等注射位置。在口服施用的配方上，通常是利用賦形劑，並且於此利用的賦形劑是甘露醇(mannitol)、乳糖(lactose)、澱粉(starch)、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、糖精鈉(sodium saccharine)、纖維素(cellulose)、碳酸
鎂(magnesium carbonate)等的醫藥級。此些口服配方的劑型為液劑、懸液劑、錠劑、丸劑、膠囊、持久性釋放劑或粉劑。對於氣霧施用而言，癌症疫苗較佳是以精細分割形式與介面活性劑和推進劑同時提供。於此，介面活性劑必須是無毒的，並且較佳是可溶於推進劑中。介面活性劑的非限制範例為包含6到22個碳原子之脂肪酸的偏酯或酯，例如：具有脂族多元醇(aliphatic polyhydric alcohol)或其環酐之己酸(Caproic acid)、辛酸(octanoic acid)、月桂酸(lauric acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、硬脂酸(stearic acid)、亞麻油酸(linoleic acid)、次亞麻油酸(linolenic acid)、油硬脂酸(olesteric acid)和油酸(oleic acid)。諸如混合或天然甘油酯(glyceride)之混合酯亦可使用。然而，根據本發明之癌症疫苗較佳是經由注射施用於主體。
癌症疫苗可根據在此領域可適用之任意手段配製為凍乾或液體製劑。當凍乾移除水並將密封在藥瓶中時，癌症疫苗的凍乾會增進儲存壽命且易於儲存。在投藥以前，癌症疫苗再恢復成原始形式以預備注射至主體。液體形式的製劑包括，但不限於此，液劑、懸液劑、糖漿、泥漿和乳劑。癌症疫苗亦可與醫藥能接受或相容於在癌症疫苗中之活性成分之賦形劑或合適的載液混合。合適的載液或賦形劑可為有機或無機溶劑。無機溶劑的範例可包括水、酒精、食鹽溶、緩衝鹽溶液、生理食鹽水溶液、葡萄糖溶液、水丙烯乙二醇溶液等，且較佳為無菌形式。較佳地，根據本發明的癌症疫苗是製備成水溶液。
癌症疫苗亦可製備成中性態或鹽態。醫學可接受鹽包括以有
機酸或無機酸形成之酸加成鹽。於此使用之無機酸的範例可包括鹽酸(hydrochloric acid)、磷酸(phosphoric acid)等。於此使用之有機酸的範例可包括醋酸(acetic acid)、草酸(oxalic acid)、酒石酸(tartaric acid)、扁桃酸(mandelic acid)等。以無羧基形成之鹽亦可由無機鹼，例如：鈉(sodium)、鉀(potassium)、銨(ammonium)、鈣(calcium)或氫氧化鐵(ferric hydroxide)，得到。以無羧基形成之鹽亦可從有機鹼，例如：異丙胺(isopropylamine)、三甲胺(trimethylamine)、2-乙胺基乙醇(2-ethylamino ethanol)、組氨酸(histidine)、普魯卡因(procaine)等，得到。
並且，癌症疫苗生成在持續性釋放配方或長效劑型製劑。此類配方可為膠囊、藥棉或例如由多醣類構成之凝膠。此類配方可利用本領域適用之任意手段製備。癌症疫苗可經由接種、植入、口腔或直腸施用而給予到主體內。在此事項上，植入可為皮下注射、肌肉注射、或較佳地植入在一預定目標位置上。包括本發明之胜肽的癌症疫苗配方能分散在載體基質中和/或容置在由控釋膜所環繞之儲藥器內。在投藥時，控釋膜影響癌症疫苗在主體內緩慢釋放。於此使用之載體或膜較佳地為生物相容性或生物可分解性。載體或膜的非限制範例可包括聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide))、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、乳膠、澱粉、纖維素和葡萄聚糖的微粒。
再者，癌症疫苗能製備成包括特定量之助劑以增進癌症疫苗的效力，舉例來說，能增進由胜肽誘發之免疫響應和/或能穩定胜
肽。另外，助劑亦可為減少產生保護免疫響應之必要的投藥的頻率。助劑能包括潤濕劑、乳化劑、酸鹼(pH)緩衝劑、佐劑等中之任一者。較佳地，於本發明中所使用之助劑是為一佐劑。佐劑的非限制範例是乳化劑、胞壁酰二肽(muramyl dipeptide；MDP)、吡啶(pyridine)、水性佐劑、油以及此領域所熟知之其他物質。水性佐劑例如：鋁、氫氧化物、幾丁聚醣基佐劑和任何各式皂素。
較佳地，在本發明中使用免疫調節細胞素(immunomodulatory cytokine)，且此免疫調節細胞素亦作為一種佐劑。還可使用之免疫調節細胞素的其他非限制範例包括干擾素(interferon)、咪喹莫特(imiquimods)、顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor；GM-CSF)等。較佳地，在本發明中所使用之免疫調節細胞素為GM-CSF。如文中所述，更包括佐劑之癌症疫苗可利用本領域中熟知技術來製備，其包括(但不限於此)混合法、聲裂法(sonication)及微流體化(microfluidation)。
在本發明的一些方面，癌症疫苗可基於一基質或本文表一中所述之胜肽序列的組合而配製。如先前所述，胜肽序列能以替換、刪除或插入之非限制手段而修飾或改變。因此，大多數的癌症疫苗能由修飾後的胜肽序列而配製。再者，此些胜肽序列能用以作為一混合物，或與本發明所揭露之胜肽或其他已發現或被發現的可能的胜肽結合。於此述及之可能的胜肽能相關於MAGE-D4b或其他蛋白質。然而，在此些癌症疫苗會產生相等或增大的T細胞刺激特性的方面上，於此形成的混合物或結合體不會降低癌症疫
苗的免疫特性。癌症疫苗以能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物的劑型施加給主體。癌症疫苗施加給主體的有效量取決於各種因子，例如：主體的免疫系統合成抗體的能力、投藥的途徑和預計保護的程度。主體的其他生理因子包括：物種、品系、尺寸、身高、體重、年齡和主體的整體健康狀況。
癌症疫苗能基於任何排程投藥給主體，藉以提供癌症疫苗能的投藥能誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物，或維持對抗口腔癌復發的保護免疫力。投藥的排程和劑型能根據主體的上述因子而修改並更符合於主體的特定需要。較佳地，用以投藥之佐劑和癌症疫苗的精確量和投藥的排程是取決於醫師的判斷。在本發明中，在癌症疫苗的投藥後能立即伴隨著一個或多個加強劑(booster)，以加強和/或維持保護免疫力。能根據需要而進行加強劑的投藥。
在本發明的另一些方面，用以投藥的癌症疫苗的劑量在投藥程序的一開始能較低，而在投藥的期間為較高的劑量。另一方面，癌症疫苗的劑量在投藥程序的一開始能較高，而在投藥的期間為較低的劑量。
在本發明的另一方面，投藥排程會包括在投藥程序的一開始較高的投藥頻率以及在投藥的期間較低的投藥頻率，以維持保護免疫力。
理論上，在癌症疫苗投藥到主體之後，癌症疫苗的胜肽即靠近抗原提呈細胞(antigen-presenting cells；APC)，並且此些胜肽隨後攝入、消化並顯出在HLA分子上，其中HLA分子是存在在
抗原提呈細胞的細胞表面。接著，將與MAGE-D4b胜肽結合之HLA第一型分子被呈現給隨後被活化以辨識MAGE-D4b胜肽之CD8+毒殺性T細胞。然後，活化後的CD8+細胞偵測身體並搜尋具有MAGE-D4b表現的細胞。於此，只有表現MAGE-D4b的口腔癌細胞會具有其細胞表面結合有HLA分子的胜肽。因此，此些細胞會被觸發並且由CD8+毒殺性T細胞消滅。同樣地，對於與MAGE-D4b胜肽結合之HLA第二型分子，其會被呈現給CD4+毒殺性T細胞，並且此些細胞會被活化以分泌細胞激素(cytokine)進而活化CD8+毒殺性T細胞。在本發明中，實驗顯示在MAGE-D4b胜肽與HLA第一型分子之間的結合。進一步的實驗亦顯示在特定主體上MAGE-D4b大量表現之口腔癌細胞在觸發CD8+毒殺性T細胞的響應上的能力。
第3圖顯示從MAGE-D4b得到之7種不同胜肽對於HLA分子之結合親合力。在第3圖中清楚說明，相較於負控制組，7種胜肽對於HLA分子全部具有較高的結合親合力。因此，由此些結果得知，此些胜肽能與HLA分子結合。
在第4圖中，在表列在二聚體(dimer)試驗中的各個患者的負控制組之上的量測量已顯示在多個患者的周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)中已直接量測得MAGE-D4b專一之CD8+毒殺性T細胞。因此，由此結果得知，MAGE-D4b-HLA複合體具有誘導並結合CD8+毒殺性T細胞的能力。其中，「IgG-FITC+ve」和「CD8-PE+ve」為用以指出胜肽能與患者的毒殺性T細胞相互作用的標記。
在第5(a)及5(b)圖中，酶聯免疫斑點(enzyme-linked immunosorbent spot；ELISPOT)試驗已證實CD8+毒殺性T細胞暴露於MAGE-D4b大量表現的口腔癌細胞時的毒殺活性(cytotoxic activity)。MAGE-D4b大量表現的口腔癌細胞對CD8+毒殺性T細胞的暴露已造成CD8+毒殺性T細胞去分泌顆粒溶解酶(granzyme)和丙型干擾素(IFN-γ)。在第5(a)及5(b)圖的ELISPOT試驗中的水平線分別指出顆粒溶解酶和IFN-γ的分泌。因而，由此結果所顯示出的誘出說明了，CD8+毒殺性T細胞能消滅口腔癌細胞。然而，胜肽3和6例外地只誘發溶解活性(lytic activity)(其為顆粒溶解酶的分泌)，而胜肽5則例外地只誘發發炎活性(其為IFN-γ的分泌)。其中，「1X」表示此組患者的T細胞暴露在對應胜肽中1次，而「2X」表示此組患者的T細胞暴露在對應胜肽中2次。
然而，對於發明所屬技術領域中具有通常知識者應能瞭解於此所獲得的結果指出MAGE-D4b胜肽具有誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物。更多的實驗則已揭露在範例中，以進一步揭露及說明此胜肽具有識別口腔癌細胞為外來物的能力。
下列範例進一步說明本發明的較佳實施例。此些範例接續呈現發明人所發現之技術，以充分運用在本發明的實施上。本領域之技藝者應能領會此些範例所揭露之技術，因此能融會貫通此些範例以構成實施的較佳模式。然而，在本揭露的觀點上，本領域之技藝者應能領會能用在所揭露的特殊實施例上之變化並且在不違反本發明的範圍下仍能得到相同或相似的結果。
過量診斷的10個正常口腔黏膜組織和44個腫瘤組織在患者的知情同意下從馬大醫藥中心吉隆坡中央醫院(Hospital Kuala Lumpur,University Malaya Medical Centre)和巴生中央醫(Hospital Tengku Ampuan Rahimah)獲得。此些組織用以進行MAGE-D4b表現的mRNA(訊患核糖核甘酸)量的分析。人類口腔癌細胞株RL-48,ORL-150和ORL-195由初級組織塊培養獲得，其中初級組織塊培養的方法如同先前在Hamid等學者於2007年所發表之文章「Establishment and Characterization of Asian Oral Cancer Cell Lines as in vitro Models to Study a Disease Prevalent in Asi」中所述。所有的細胞株維持在添加有10%血清(fetal bovine serum；FBS)之DMEM-F12(Dulbecco's modified eagle's medium-F12；F12培養液)(美國Lonza公司)。用在慢病毒株(lentiviral stock)的生產上之293FT細胞株(美國Invitrogen公司)是培養在添加有10%FBS及500μg/ml Geneticin®(選擇性抗生素)(美國Invitrogen公司)之高糖DMEM(美國Lonza公司)中。在器官型共培養下之作為餵養細胞的人類胎兒包皮纖維母細胞1(Human foetal foreskin fibroblast 1；HFFF1)是培養在添加有10%FBS之DMEM(美國Lonza公司)中。此研究是由馬大倫理審查委員會(University Malaya ethical review board)所認可(倫理核准號碼：DF OP 03/06/0018/(L))。
所有樣品進行RNA萃取的準備工作如同先前在Cheong等學者於2009年所發表之文章「Gene Expression in Human Oral Squamous Cell Carcinoma is Influenced by Risk Factor Exposure」中所述及。分別利用RNA萃取試劑組(RNeasy® Micro kit)(德國Qiagen公司)和核酸蛋白質三相萃取試劑(Tri-Reagent)(美國俄亥俄州MRC公司)根據製造商的說明從新先冷凍組織和細胞株中萃取全體的RNA。然後，使用超微量分光光度計(Nanodrop spectrophotometer)和生化分析儀(Agilent 2100 bioanalyzer)(美國Agilent Technologies公司)評估RNA的質和量。具有260/280比為1.8-2.1或RNA完整度(RNA integrity number；RIN)在6以上的RNA用以合成cDNA，其中合成的方法如同Cheong等學者於2009年所發表之文章中所述。
qPCR是利用ABI PRISM® 7000序列偵測系統(ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System)(德國Applied Biosystems公司)以標準SYBR Green程序執行，其執行的方法如同Cheong等學者於2009年所發表之文章中所述。所使用的正向(sense)引物(primer)和反向(antisense)引物如下表。
全長MAGE-D4b基因是由pCMV6-SPORT6-MAGE-D4b表現克隆(美國Invitrogen Life Technologies公司；產品編號# MGC：74882)增幅，並且根據製造商的說明克隆至pLentiviral6.3/V5表現構築載體中。MAGE-D4b外源地表現在ORL-48、ORL-150和ORL-195上。對於病毒生產，MAGE-D4b慢病毒構築體或單獨的載體是利用LipofectamineTM轉染劑(美國Invitrogen公司)與ViraPowerTM包裝混合物(packaging mix)共轉染至293FT病毒製造細胞株。於24小時後收成病毒懸浮液，並使用0.45μm的針筒過濾器過濾。利用10μg/ml的polybrene(聚凝胺)(美國Sigma公司)以病毒懸浮液轉導ORL-48、ORL-150和ORL-195。並且，利用5μg/ml的blasticidin(保米黴素)(美國Invitrogen公司)選擇外源地表現MAGE-D4b的細胞和載體控制
細胞。MAGE-D4b轉導細胞會稱之為ORL-48/MAGE-D4b、ORL-150/MAGE-D4b或ORL-195/MAGE-D4b，並且於此只有以載體轉導之細胞稱作ORL-48/pLenti、ORL-150/pLenti或ORL-195/pLenti。
MAGE-D4b的表現是使用萬靈(DakoCytomation)的Envision+ Dual Link System-HRP(DAB+)套組藉由免疫組織化學染色法在40個OSCC和11個正常口腔黏膜組織。包括在IHC分析中的OSCC患者的統計學特徵總結於下表3。在ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti異種皮移植上測定RHO表現。利用MAGE-D4b(1：100；美國Sigma公司)及Pan Rho+RAC(1,2)+CDC42(1：300；美國Abcam公司)基於在Saleh等學者在2010年發表的文章「Transcriptional Profiling of Oral Squamous Cell Carcinoma Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Samples」中所做的工作進行IHC。就由利用4點強度評分系統(0為負表現；1為弱正表現；2為中等正表現；3為強正表現)來評定免疫反應性。接收者操作特徵(receiver operating characteristic；ROC)曲線是用以識別在評定MAGE-D4b的表現上敏感度(sensitivity)及特異度(specificity)的最佳切截點。討論任何差異並達成一致的意見已獲得最後決定性的分數。
在Hamid等學者在2008年發表的文章「Establishment and Characterization of Asian Oral Cancer Cell Lines as in vitro Models to Study a Disease Prevalent in Asia」中所揭露的工作萃取全體的蛋白質。以SDS-PAGE分解的50μg/lane的粗蛋白質(crude protein)萃取在轉印緩衝液中利用Bio-Rad迷你凝膠電泳設備(Bio-Rad
mini gel electrophoresis apparatus)轉印到硝化纖維膜(nitrocellulosemembrane)上。於此，轉印時間為1小時。轉印緩衝液具有25mM Tris base(Tris鹼)、192mM glycine(甘氨酸)及20% methanol(甲醇)，且酸鹼值(pH)為8.3。硝化纖維膜在室溫下以封閉液(5%脫脂奶粉/PBS)處理1小時，並以一級抗體(MAGE-D4b(1：100；美國Santa Cruz公司)；Pan Rho+RAC(1,2,3)+CDC42(1：300；美國Abcam公司)；ROCK1(1：200；美國Abcam公司))探查。在與一級抗體培養後，接續以PBS/0.1% Tween 20清洗墨點，並將墨點與接合有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)之二級抗體於室溫下作用1小時，隨後以PBS/0.1% Tween 20清洗。於此，以增強型化學冷光方法(enhanced chemiluminescence method)(美國Pierce公司)偵測MAGE-D4b的表現，並且利用ChemiImagerTM影像系統(美國Alpha Innotech公司)觀察MAGE-D4b的表現。為了負載的正規化，將墨點與抗α微管(anti-α-tubulin)單株抗體(1：1,000；美國Sigma公司)於室溫下作用1小時，並且如同上述處理墨點。
MAGE-D4b或載體誘導細胞以5x104的密度種入60mm組織培養皿中，並每24小時收成並利用CASY®細胞計數(德國Innovatis公司)器計數，為期9天。每個細胞株的倍增時間是以繪製總細胞數的對數2(log2)刻度對時間的關係來計算。其中，資料數據是來自3個實驗的平均。
MAGE-D4b過表現在腫瘤成長上的影響亦以4周大之Foxn1nu
無胸腺裸鼠(美國Harlan實驗室)進行評估。簡單地說，ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti細胞以2x106個細胞的濃度皮下注射至動物的側腹。每種細胞株使用5隻小鼠進行評估。在移植後，每隔日診察小鼠的腫瘤發展。基於公式(長×寬2)/2測量腫瘤體積。在6周的觀察後，將所有動物安樂死，並且割下腫瘤進行組織學評估。實驗執行2回。所有實驗程序是根據美國國家衛生院(National Institute of Health；NIH)之機構之動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC)規範實施。
在此研究中是使用紫外線(ultraviolet；UV)照射以誘發凋亡。透過使細胞暴露於紫外線劑量(0-100J/m2)的變化來測定每種細胞株對抗紫外線的敏感性。在紫外線照射後，允許細胞恢復超過16小時的期間。隨後，利用CASY®細胞計數器測定活細胞和死細胞。再者，使用30J/m2和70J/m2的劑量照射細胞，並收成細胞以藉由PI(propidium iodide；碘化丙錠)(美國Sigma公司)染色進行細胞週期分析以及藉由PI和Annexin V-FITC(附件素V-異硫氰酸螢光素)(美國BD Bioscience公司)雙染色測定凋亡指數(apoptotic index；AI)，並且利用流式細胞儀(美國BD Bioscience公司)分析細胞。
於此，基於在Valster等學者在2005年發表的文章「Cell Migration and Invasion Assays」中所做的工作實施單層傷口癒合試
驗。簡單地說，4x105個細胞在60mm培養皿中接種兩孔，並成長超過16小時。然後，細胞以10μg/ml絲裂黴素C(mitomycin C)治療2小時，並且利用黃色移液管(pipette tip)在單層上進行兩次平行擷取。在第0小時和第20小時的時間點，以顯微鏡記錄傷口區域。然後，使用如在Gebäck等學者在2009年發表的文章「A Novel and Simple Software Tool for Automated Analysis of Monolayer Wound Healing Assays」中所述之TScratch分析軟體分析開放式傷口區域的影像。
基於在Nyström等學者在2005年發表的文章「Development of a Quantitative Method to Analyse Tumour Cell Invasion in Organotypic Culture」中所做的工作執行侵犯試驗(invasion assay)。簡單地說，1ml凝膠混合物(第一型膠原蛋白、基質膠(Matrigel)、10倍DMEM及DBS，其比例為4：4：1：1，且含有1x106個纖維母細胞)在pH7下加入至位在12孔培養盤的孔洞中之各個12孔插入物中。留下凝膠混合物以在37℃下固化30分鐘，並且加入纖維母細胞培養液(含有體積百分比為10%之FBS(foetal bovine serum；胎牛血清)和2mM L-glutamine)，然後培養盤在37℃下培養過夜。懸浮在500μl上皮培養液(添加10%FBS之DMEM-F12(美國Lonza公司))中之1x106角化細胞(keratinocyte)加入至內部腔室。在過夜培養之後，所有的培養液置換成新鮮上皮培養液，以致使只有凝膠混合物的底部與培養液接觸，而頂部則暴露在空氣中。於此，每2-3天更換一次培養液，
並且在凝膠混合物的頂部暴露在空氣中的情況下，於第10天收成器官型培養。含有凝膠混合物的內部腔室在甲醛盐溶液(formal-saline)中室溫下固定24小時，並且嵌入在1%瓊脂溶液(內含有體積百分比為10%之甲醛(formaldehyde))中以便於操作。瓊脂凝膠被切開、嵌入石蠟中、切片並以蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin；HE)染色。利用如在Gaggioli等學者在2007年發表的文章「Fibroblast-led Collective Invasion of Carcinoma Cells with Differing Roles for RhoGTPases in Leading and Following Cell」中所述之影像J軟體(Image J software)計算侵犯指數。
利用統計軟體組件SPSS16(美国伊利诺伊州芝加哥SPSS股份有限公司)執行所有統計分析。使用曼-懷特尼U檢定(Mann-Whitney U test)以比較在腫瘤組織和正常組織上MAGE-D4b mRNA表現量(expression level)。使用卡普蘭-邁耶存活曲線(Kaplan-Meier survival curve)以呈現無疾病存活率與MAGE-D4b表現的關連性，並且以對數-標等檢定(log-rank test)比較存活機率差異。使用獨立t檢定(independent t-test)進行細胞倍增時間、單層傷口癒合試驗、侵犯及凋亡研究的分析。使用皮爾森χ2(Pearson χ2)及費雪精確性檢定(Fisher exacttest)以研究在腫瘤上MAGE-D4b mRNA表現與各種臨床病理參數之間的關係。於此，小於0.05之p值視為有統計顯著性。
在mRNA量和蛋白質量上均發現MAGE-D4b在多數的OSCC組織上為過表現。在mRNA表現上，相較於正常口腔黏膜組織上的量，在OSCC組織上平均MAGE-D4b表現顯著地較高(p=0.001)，如第1圖所示，並且在44個OSCC組織中有20個(54.5%)具有超過2倍的增加。一貫地，IHC分析證明40個OSCC組織中有39個(97.5%)具有MAGE-D4b蛋白質的表現(p<0.001)。當觀察一些組織的膜染色，發現MAGE-D4b顯著地表現在多數OSCC組織的細胞質。相對，發現正常組織具有較少MAGE-D4b的量，並且11個正常組織中有8個完全未表現MAGE-D4b，如第6(a)及6(b)圖所示。特別是，大量的MAGE-D4b表現關連於OSCC細胞對淋巴結(lymph node)的侵犯，如表4所表列，且關連於較差之無疾病存活(p=0.031)，如第6(c)圖所示。
因為在大比例的OSCC上MAGE-D4b為一貫地過表現，因此我們確定其影響細胞增生。在兩種口腔癌細胞株(ORL-48和ORL-150)上，MAGE-D4b為外源地表現。我們確認，在轉導後，ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b細胞均具有增量的MAGE-D4b，如第7(a)圖所示，並且相對於控制細胞，此些細胞具有增生率的增加，如第7(b)圖所示。其中，ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b的平均倍增時間分別顯著地短於控制細胞(33.1±0.3小時對37.6±0.6小時，且p=0.003；32.0±1.3小時對38.8±0.6小時，且p=0.008)。再者，於體內(in vivo)清楚觀察到MAGE-D4b的增生效用，於此，相較於ORL-48/pLenti細胞，ORL-48/MAGE-D4b細胞在裸鼠的腹側形成較大的腫瘤，如第7(c)
及7(d)圖所示。兩者合併評估，於體外(in vitro)和體內(in vivo)資料強烈地支持MAGE-D4b的促進生長特性。
因為細胞增生的控制主要是由細胞週期蛋白質支配，因此我們確定MAGE-D4b的外源表現是改變包括CCNA1、CCNB1、CCNE1、CCND1和Ki67之增生標記和細胞軸其蛋白質的表現中之任一者。意料外地，在以MAGE-D4b轉導之細胞和載體控制細胞之間的mRNA量(CCNA1、CCNB1、CCNE1和Ki67)和蛋白質量(CCND1和Ki67；資料未顯示)上，我們未看見任何顯著的增加在增生標記和細胞週期蛋白質的表現上，如第7(e)圖所示。一貫地，相較於ORL-48/pLenti腫瘤，未觀察到形成在小鼠上之ORL-48/MAGE-D4b腫瘤的Ki67標記指數(labelling index)的增加，如第7(f)及7(g)圖所示。
我們證明細胞增生的增加不是由細胞週期蛋白質驅動，並且我們更確定外源表現MAGE-D4b的細胞的細胞數量的淨值增加能歸因於在逃避細胞死亡的能力上的增益。我們以0、20、40、60、80和100J/m2的紫外線C(ultraviolet C；UVC)照射ORL-48/MAGE-D4b和ORL-195/MAGE-D4b細胞和他們各自的載體控制細胞，並且於24小時候測定細胞毒性效用(cytotoxicity effect)。從毒殺曲線，我們證實相較於載體控制細胞，ORL-48/MAGE-D4b和ORL-195/MAGE-D4b細胞均相對地抗細胞毒殺，如第8(a)圖所示。再者，在細胞以30和70J/m2的UVC處
理後，細胞週期分析指出在ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti兩者的細胞週期圖譜均無改變，如第8(b)圖所示。然而，與以UVC處理之ORL-48/MAGE-D4b細胞比較時，在ORL-48/pLenti細胞上觀察到sub-G1族群(凋亡細胞和壞死細胞)的增加。在細胞表現MAGE-D4b上，凋亡指數亦較各自的載體控制細胞低，如第8(c)圖所示。
單層傷口癒合試驗是一種研究腫瘤細胞轉移之簡單且有效的方法。ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b細胞相較於各自的載體控制細胞的轉移能力是由傷口癒合(wound closure)的速率來量測。在實施層傷口癒合試驗之前，我們以絲裂黴素C處理細胞，於此指出MAGE-D4b增加細胞增生速率且這可導致傷口癒合。再者，為了確保絲裂黴素C有效地中斷在轉移試驗期間的細胞增生，我們在絲裂黴素C處理後的第0小時和第20小時測定細胞週期蛋白質的量。我們證明包括CCNA1、CCNB1、CCNE1和Ki67的細胞週期蛋白質的量在整個試驗(第0小時和第20小時，資料未顯示)中一貫地低。如第9(a)圖所示，在ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b細胞的開放式傷口區域的癒合顯著地較控制細胞快(p<0.001)。為了證實細胞能動性是直接地因MAGE-D4b的表現而增加，我們抑制(knock-down)ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b細胞上的MAGE-D4b，並且證明具有MAGE-D4b抑制之
ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b細胞均喪失其轉移潛力(migratory potential)，因此證實轉移潛力的增加是由MAGE-D4b過表現直接賦予，如第9(b)圖所示。
僅管賦予轉移潛力的增加，我們利用器官型共培養證明在ORL-48上MAGE-D4b的外源表現未增加口腔癌細胞的侵犯能力，如第9(c)及9(d)圖所示。合併評估可得，這些資料強烈地支持MAGE-D4b在增進口腔癌細胞的轉移能力上的作用。然而，觀察到在細胞侵犯上無效用。
我們更研究MAGE-D4b是否選擇性調節涉及細胞轉移之Rho家族的GTPases(Rho、Rac和CDC42)的表現。相較於ORL-48/pLenti細胞，ORL-48/MAGE-D4b細胞之Rho/RAC/CDC42蛋白質的表現顯示為提升，如第9(e)圖所示。再者，形成在注入ORL-48/MAGE-D4b細胞或載體控制細胞之小鼠上的腫瘤的IHC分析亦證明在ORL-48/MAGE-D4b腫瘤中Rho/RAC/CDC42蛋白質的高度表現，於此此表現在膜和細胞質上均有觀察到，如第9(f)圖所示。
儘管治療策略的進步在過去的幾十年裡，，OSCC的存活率沒有顯著地改善，並且惡性腫瘤的關鍵驅動力的辨識已顯示在改善患者照顧上的承諾。在此之前，我們發現，相較正常口腔黏膜組織，在OSCC上MAGE-D4b為差異性地表現。此為第一項研究，以證明在OSCC上MAGE-D4b為過表現，如Cheong等學者於2009年所做的工作中所揭露。於此，我們確認在大多數的OSCC樣本
中MAGE-D4b的表現，同時證明此基因不表現在多數的正常口腔黏膜組織。有趣地，雖然MAGE-D4b是第II型(Type II)MAGE家族的成員且預期相對第I型(Type I)MAGE蛋白質更普遍地表現，所以越來越多的證據表明在正常組織上MAGE-D4b的表現是有限的，如在Sasaki等學者於2001年所發表之文章「MAGE-E1,ANew Member of the Melanoma-associated Antigen Gene Family and its Expression in Human Glioma」和Germano等學者於2011年所發表之文章「MAGE-D4B is a Novel Marker of Poor Prognosis and Potential Therapeutic Target Involved in Breast Cancer Tumourigenesis」中所述。尤其是，Sasaki等學者於2001年所發表之文章「MAGE-E1,A New Member of the Melanoma-associated Antigen Gene Family and its Expression in Human Glioma」、Germano等學者於2011年所發表之文章「MAGE-D4B is a Novel Marker of Poor Prognosis and Potential Therapeutic Target Involved in Breast Cancer Tumourigenesis」和Ito等學者於2006年所發表之文章「Expression of MAGE-D4,A Novel MAGE Family Antigen,is Correlated with Tumor-cell Proliferation of Non-small Cell Lung Cancer」等先前文獻已顯示在包括神經膠質瘤(glioma)、乳房(breast)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer；NSCLC)之許多不同癌中MAGE-D4b為過表現。合併來看，此強烈地表明MAGE-D4b是癌特異性抗原，並且在正常組織上其有限的表現更表明MAGE-D4b能為一良好的治療標的。比較我們病患的臨床病理特姓，我們證明MAGE-D4b的高度表現是顯著地關聯於在OSCC患者上淋巴結轉移和低存活，此表明了MAGE-D4b是驅動
OSCC發展(progression)的重要基因。在乳房癌患者上，亦發現MAGE-D4b關聯於腫瘤發展和病變結果，如在Germano等學者於2011年所做的工作中所揭露，因此指出MAGE-D4b的表現具有預後值且進一步加強其作為預後標記的使用。
已廣泛地研究MAGE蛋白質在免疫治療中的使用。然而，因為在癌症上許多基因消除僅是不一定會導致癌症發展的「旁觀者(by-stander)」改變，所以有效治療策略的發展常需要在驅使癌病變(carcinogenesis)上的基因的腳色的瞭解。已發現在頭頸癌為過表現的MAGE蛋白質只來自MAGE-A家族的蛋白質，如Ries等學者於2008年所發表之文章「Expression of Melanoma-associated Antigens in Oral Squamous Cell Carcinoma」、Mollaoglu等學者於2008年所發表之文章「Expression of MAGE-A12 in Oral Squamous Cell Carcinoma」和Glazer等學者於2011年所發表之文章「The Role of MAGEA2 in Head and Neck Cancer」中所揭露。由此可知，只有一個文獻證明在頭頸癌中MAGE-A2的作用，此文獻中的工作是由Glazer等學者於2011年所做。在癌發展中MAGE-D4b的腳色的資訊是缺乏的，僅一個文獻述及乳房癌中基因功能，如Germano等學者於2011年所做的工作所述。因為MAGE-D4b提升OSCC的顯著數量，我們以體外和體內實驗研究MAGED4B的生物角色。第一次在口腔癌上，我們證明在體外和體內實驗中MAGE-D4b的表現均能增加細胞成長。我們更證明細胞成長的增加並未伴隨著細胞週期蛋白質的表現的改變，此結果促使我們去測定細胞成長是否起因於細胞死亡的減少。有趣地，我們證明相較於僅以載
體誘導之細胞，MAGE-D4b過表現細胞對於UV誘發細胞死亡不敏感，並且顯著地低MAGE-D4b過表現細胞經歷細胞凋亡，此些結果表明MAGE-D4b保護細胞免於經歷細胞凋亡。Ki-67是細胞增生的標記。MAGE-D4b表現關聯於高Ki-67標記指數，如Ito等學者於2006年和Germano等學者於2011年所做的工作所揭露，其提供MAGE-D4b可能涉及細胞增生的跡象。這是第一次，我們證明在體外和體內MAGE-D4b均為驅使細胞增生的直接角色，並且其能由賦予抗細胞凋亡來達到此作用。這也許不令人驚訝，因為已有文獻記載包括MAGE-A2之其他MAGE家族成員能扮演增加頭頸癌細胞株的細胞成長的腳色，如Glazer等學者於2011年所做的工作所揭露。再者，已顯示MAGE蛋白質用以調制細胞凋亡。特別是，已顯示MAGE-A2用以調降BAX的表現，同時已顯示MAGE-D1與凋亡抑制(inhibitor of apoptosis protein；IAP)家族的成員XIAP相互影響，如在Jordan等學者於2001年所發表的文章「Neurotrophin Receptor-interacting MAGE Homologue is an Inducible Inhibitor of Apoptosis Protein-interacting Protein that Augments Cell Death」中所揭露。近年來已提出許多引起此現象的機制。舉例來說，已指出MAGE-A2用以與p53結合並且吸收組蛋白去乙醯酶3(histone deacetylase 3；HDAC)以調降p53的轉活化功能，如在Monte等學者於2006年所發表的文章「MAGE-A Tumor Antigens Target p53 Transactivation Function Through Histone Deacetylase Recruitment and Confer Resistance to Chemotherapeutic Agents」中所揭露，其能造成促凋亡蛋白(pro-apoptotic protein)
的調降，如在Glazer等學者於2011年所做的工作中所揭露。有趣地，最近的證據指出MAGE保守序列(MAGE homology domain；MHD)常保存在MAGE家族成員之間，其能直接結合至包括E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligases)一族之RING(Really Interesting New Gene；誘人的新基因)序列蛋白，以增進p53的泛素化作用(ubiquitination)並抑制在癌細胞中之p53依賴性凋亡，如分別在Wang等學者於2005年所發表的文章「MDM2 Interaction with Nuclear Corepressor KAP1 Contributes to p53 Inactivation」、Doyle等學者於2010年所發表的文章「MAGE-RING Protein Complexes Comprise A Family of E3 Ubiquitin Ligases」和Yang等學者於2007年所發表的文章「MAGE-A,mMage-b,and MAGE-C Proteins Form Complexes with KAP1 and Suppress p53-dependent Apoptosis in MAGE-positive Cell Lines」中所揭露。由MAGE-D4b所賦予的凋亡的逃避是否依賴於p53，其仍有待測定，並且研究在MAGE-D4b和p53之間是否存在相互影響將令人關注。癌正的其他特徵為在細胞轉移能力上的增益，如在Hanahan和Weinberg於2000年所發表的文章「The Hallmarks of Cancer」和於2011年所發表的文章「Hallmarks of Cancer：The Next Generation」中所述。在此研究中，我們證明MAGE-D4b增加口腔癌細胞轉移能力，但令人驚訝的是，不增加侵犯能力。這個結果相反於在乳房癌上所公開之證明MAGE-D4b增加乳房癌細胞的轉移和侵犯之研究，如在Germano等學者於2011年所做的工作中所述。在試圖了解MAGE-D4B驅使轉移的機制上，我們分析Rho家族的小單體GTPases的表現，
其涉及促進轉移，如在Ridley AJ於2001年所發表的文章「Rho GTPases and Cell Migration」和Schmitz等學者於2000年所發表的文章「Rho GTPases：Signaling,Migration,and Invasion」中所述。在此研究中的體外實驗和體內實驗的資料中均證明在外源表現MAGE-D4b的細胞中Rho是調升的，此表明MAGE-D4b能誘發Rho表現以促進細胞轉移。MAGE-D4b過表現細胞在增加轉移潛力上的能力是與在患者上高MAGE-D4b表現與淋巴結轉移之間的關係同軸，並且表明在治療轉移性疾病上標靶MAGE-D4b是有效的。
總結，這是第一次研究，以確定在大比例的OSCC上MAGE-D4b是過表現的且在癌症上MAGE-D4b的存在直接驅使細胞成長、凋亡的逃避和轉移，而此些都是癌症的特徵。我們亦證明細胞轉移的增加至少部份起因於Rho的MAGE-D4b誘發調升。當MAGE-D4b顯著地關聯於淋巴結轉移和存活時，應進一步研究其作為預後標記的腳色。再者，於此得到MAGE-D4b在OSCC的一個子集中為調升的且在正常口腔黏膜組織中並不存在，因此MAGE-D4b能作為免疫治療的理想標靶。另外，MAGE-D4b在驅使口腔癌病變的直接角色強烈地表明其會是口腔癌的良好治療標靶。
按照本揭露無需過度實驗即能作出並執行於此所揭露及請求保護之所有的組合物和方法。雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發
明的範疇內。更具體地，在能達到相同或相似的結果之下，化學上和生理學上相關的某些藥劑能作為與此所描述之藥劑的替代物。所有這類的替代物和變型為本領域技術人員所明瞭，並且其被認為是在如由所附的申請專利範圍所界定之發明的範圍和概念之內。
針對引用在上文中理由，下述參考文獻和上述引用文獻中之每一者的全部公開內容均通過引用而合併於本發明中。
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第1圖顯示qPCR資料，其說明MAGE-D4b mRNA量的過表現，於此相較於正常組織，在OSCC組織上mRNA量顯著地較高。
第2圖顯示在人類組織cDNA群組上MAGE-D4b的表現，其中1)肝；2)骨骼肌；3)腎；4)胰腺；5)脾；6)胸腺；7)前列腺；8)睾丸；9)子房；10)小腸；11)結腸；12)周邊白血球；13)204T口腔癌細胞株；14)A549肺癌細胞株。
第3圖顯示不同胜肽對於MHC分子之結合能力，於此利用T2細胞進行結合試驗以測試胜肽是否能結合MHC分子。
第4圖顯示在誘導並結合CD8+毒殺性T細胞上不同胜肽的傾向之二聚體(dimer)試驗，其用以測試在在樹突狀細胞上之結合MHC的胜肽是否能誘導並結合CD8+細胞以將其活化。
第5圖顯示ELISPOT試驗的結果：(a)當暴露於MAGE-D4b-HLA複合體時，在分泌顆粒溶解酶(Granzyme)上CD8+毒殺性T細胞的毒殺活性(抗口腔癌細胞株ORL-195T之毒殺試驗)；(b)當暴露於MAGE-D4b-HLA複合體時，在分泌IFN-γ上CD8+毒殺性T細胞的毒殺活性(抗口腔癌細胞株ORL-195T之毒殺試驗)。
第6圖顯示在OSCC組織上MAGE-D4b的過表現：(a)OSCC組織和正常口腔黏膜組織的IHC染色的強度分布，於此顯示在OSCC組織上高量的MAGE-D4b，而在正常口腔黏膜組織上低量的MAGE-D4b；(b)I、II和III為OSCC組織的IHC染色，而IV為正常口腔黏膜組織的IHC染色，於此顯示在OSCC組織上3+(I)、2+(II)及1+(III)強度的表現，而在正常口腔黏膜組織上無表現；(c)卡普蘭-邁耶曲線，其指出MAGE-D4b表現關連於無疾病存活。
第7圖顯示在促進細胞成長上MAGE-D4b的過表現：(a)qPCR資料，其證明在轉導細胞上具有高量的MAGE-D4b；(b)ORL-48/MAGE-D4b細胞、ORL-150/MAGE-D4b細胞及其各自的控制組的成長曲線(*表示p<0.05、**表示p<0.001，而***表示p<0.0001)；(c)在注射ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti之小鼠上的腫瘤體積(*表示p<0.05、**表示p<0.001，而***表示p<0.0001)；(d)影像，其顯示相較於注射ORL-48/pLenti之小鼠，注射ORL-48/MAGE-D4b之小鼠上具有較大的腫瘤；(e)qPCR資料，比較在ORL-48/MAGE-D4b、ORL-150/MAGE-D4b和其各自
的控制組之間的細胞週期標記的量；(f)在注射ORL-48/MAGED4B和ORL-48/pLenti後，形成在小鼠上的腫瘤的Ki67的免疫組織化學；(g)形成在小鼠上之ORL-48/MAGED4B腫瘤和ORL-48/pLenti腫瘤的Ki67染色。
第8圖顯示在促進凋亡逃避上MAGE-D4b的過表現：(a)相較於各自的控制組，ORL-48/MAGE-D4b和ORL-195/MAGE-D4b的毒殺曲線；(b)相較於載體控制細胞(控制組)，ORL-48/MAGE-D4b的細胞週期分析；(c)相較於載體控制細胞(控制組)，ORL-48/MAGE-D4b的凋亡指數。
第9圖顯示在促進細胞轉移但不侵犯上MAGE-D4b的過表現：(a)在絲裂黴素C處理後，第0及第20小時ORL-48/MAGE-D4b、ORL-150/MAGE-D4b及其各自的控制組的層傷口癒合影像，並且統計圖指出相較於各自的載體控制細胞，ORL-48/MAGE-D4b和ORL-150/MAGE-D4b的傷口癒合有增加；(b)在有和無MAGE-D4b siRNA(small interfering RNA；小干擾RNA)抑制的情狀下，ORL-48/MAGE-D4b、ORL-150/MAGE-D4b及其各自的控制組的層傷口癒合影像，並且統計圖指出有MAGE-D4b抑制的細胞的傷口癒合有減少；(c)ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti的器官型3D培養的影像；(d)ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti的侵犯指數；(e)在ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti細胞上MAGE-D4b、Pan Rho+RAC(1,2,3)+CDC42及ROCK1的西方墨點；(f)在注射ORL-48/MAGE-D4b和ORL-48/pLenti後，形成在小鼠上之腫瘤的
MAGE-D4b和Pan Rho+RAC(1,2,3)+CDC42之THC。
<110> 馬來西亞癌症學術基金會(Cancer Research Initiatives Foundation)
<120> 能結合人類白血球抗原(HLA)分子的胜肽、由此胜肽衍生出的癌症疫苗及其用途
<150> PI 2011003259
<151> 2011-07-11
<160> 24
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<220>
<223>
(i)股數：單股
(ii)拓撲：線型
(iii)分子型：胜肽
<400> 1
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<212> PRT
<220>
<223>
(i)股數：單股
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<212> PRT
<220>
<223>
(i)股數：單股
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<220>
<223>
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(i)股數：單股
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<223>
(i)股數：單股
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<223>
(i)股數：單股
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<220>
<223>
(i)股數：單股
(ii)拓撲：線型
(iii)分子類型：胜肽
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(i)股數：單股
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<223>
(i)股數：單股
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(i)股數：單股
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<212> DNA
<220>
<223> 在qPCR中使用之MAGE-D4b的正向引物
<400> 13
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<212> DNA
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<223> 在qPCR中使用之MAGE-D4b的反向引物
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<212> DNA
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<223> 在qPCR中使用之GAPDH的正向引物
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<223> 在qPCR中使用之GAPDH的反向引物
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<212> DNA
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<223> 在qPCR中使用之Ki67的正向引物
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<212> DNA
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<223> 在qPCR中使用之CCNA1的正向引物
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 在qPCR中使用之CCNE1的正向引物
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<212> DNA
<220>
<223> 在qPCR中使用之CCNE1的反向引物
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<212> DNA
<220>
<223> 在qPCR中使用之CCNB1的正向引物
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<211> 22
<212> DNA
<220>
<223> 在qPCR中使用之CCNB1的反向引物
<400> 24
Claims (19)
- 一種胜肽，包括選自MAGE-D4b蛋白質中至少-部分的至少一胺基酸序列，其中該胜肽具有與至少一人類白血球抗原(HLA)分子結合的能力，以及該胜肽用以誘發一主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物，以及其中該至少一胺基酸序列是選自該MAGE-D4b蛋白質的序列辨識編號1到序列識別號12中之一或一組合。
- 如請求項1所述之胜肽，其中在該胜肽中的至少一胺基酸是以另一胺基酸替代。
- 如請求項1所述之胜肽，其中在該胜肽中的至少一胺基酸是被刪除的。
- 如請求項1所述之胜肽，其中至少一胺基酸插入該胜肽中。
- 如請求項4所述之胜肽，其中至少一額外的胺基酸是插入在N端。
- 如請求項4所述之胜肽，其中至少一額外的胺基酸是插入在C端。
- 如請求項1所述之胜肽，其中該主體為一口腔癌患者。
- 一種如請求項1至7中之任一項所述之胜肽在製備誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物的藥物中的用途。
- 如請求項8所述之用途，其中該主體為一口腔癌患者。
- 一種癌症疫苗，包括至少一如請求項1至7中之任一項所述之胜肽，其中該胜肽用以誘發一主體的免疫系統以辨識口腔癌細 胞為外來物。
- 如請求項10所述之癌症疫苗，其中該癌症疫苗是為該主體而製備，且該主體的抗原為HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24中之一或一組合。
- 如請求項11所述之癌症疫苗，其中該主體為一口腔癌患者。
- 如請求項10至12中之任一項所述之癌症疫苗，更包括：一佐劑。
- 如請求項13所述之癌症疫苗，其中該佐劑為一免疫調節細胞素。
- 如請求項14所述之癌症疫苗，其中該免疫調節細胞素為一顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子。
- 如請求項10至12中之任一項所述之癌症疫苗，其中該癌症疫苗是經由注射投藥給一主體。
- 如請求項10至12中之任一項所述之癌症疫苗，其中該癌症疫苗製備成一液體溶液。
- 一種如請求項10至17中之任一項所述之癌症疫苗在製備誘發主體的免疫系統以辨識口腔癌細胞為外來物的藥物中的用途。
- 如請求項18所述之用途，其中該主體為一口腔癌患者。
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