KR20200139188A - 미세 잔존 암을 치료하는 방법 - Google Patents

미세 잔존 암을 치료하는 방법 Download PDF

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KR20200139188A
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줄리오 에이. 아기레-기소
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이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이
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Abstract

본 발명은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 뼈 형태형성 단백질 7(BMP 7) 유도 단백질로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체의 접촉된 DCC에서 휴지기를 유도하거나 유지한다. 또한 본 발명은 대상체에서 DCC를 LY2, LY3, 및 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK) 억제제로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체에서 DCC를 제거한다.

Description

미세 잔존 암을 치료하는 방법
본 출원은 2018년 3월 26일 자로 출원된 미국 가특허출원 제62/648,166호의 우선권을 주장하고, 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
본 발명은 국립 보건원/국립 암 연구소가 수여하는 R01 CA109182, U54 CA16131, 및 P30 CA196521 및 국방부-의회 주도 의학 연구 프로그램이 수여하는 BC 132674에 따른 정부의 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
분야
본 발명은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법과 관련된다.
소포체(“ER”) 루멘 내 단백질의 미접힘(unfolding)은 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response)(“UPR”)으로 또한 알려져 있는 세 가지 주요 경로인 PEPK, IRE1α, 및 ATF6를 활성화시키며, 이는 세포가 이 스트레스를 교정하고 생존하는 것을 가능하게 한다(문헌[Walter et al., “The Unfolded Protein Response: From Stress Pathway to Homeostatic Regulation,” Science 334:1081-1086 (2011) 및 Ron et al., “Signal Integration In the Endoplasmic Reticulum Unfolded Protein Response,” Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8:519-529 (2007)]). 최근의 증거는, 다양한 타입의 암에서, UPR이 다른 신호들 가운데, 종양유전자(oncogene) 및 저산소증(hypoxia)에 의해 야기되는 향상된 번역 부하에 의해 부과된 ER 및 산화적 조건에 대한 요구량에 반응하는 것을 가능하게 하는 메커니즘이라는 것을 시사한다(문헌[Blais et al., “Activating Transcription Factor 4 is Translationally Regulated by Hypoxic Stress,” Mol. Cell. Biol. 24:7469-7482 (2004); Chevet et al., “Endoplasmic Reticulum Stress-Activated Cell Reprogramming in Oncogenesis,” Cancer Discov. 5:586-597 (2015); Tameire et al., “Cell Intrinsic and Extrinsic Activators of the Unfolded Protein Response in Cancer: Mechanisms and Targets for Therapy,” Semin. Cancer Biol. 33:3-15 (2015); Hart et al., “ER Stress-Mediated Autophagy Promotes Myc-Dependent Transformation and Tumor Growth,” J. Clin. Invest. 122:4621-4634 (2012); Martin-Perez et al., “Activated ERBB2/HER2 Licenses Sensitivity to Apoptosis Upon Endoplasmic Reticulum Stress Through a PERK-Dependent Pathway,” Cancer Res. 74:1766-1777 (2014); Rajasekhar et al., “Postgenomic Global Analysis of Translational Control Induced by Oncogenic Signaling,” Oncogene 23:3248-3264 (2004); Rajasekhar et al., “Oncogenic Ras and Akt Signaling Contribute to Glioblastoma Formation by Differential Recruitment of Existing mRNAs to Polysomes,” Mol. Cell 12:889-901 (2003); Rojo et al., “4E-Binding Protein 1, A Cell Signaling Hallmark in Breast Cancer that Correlates With Pathologic Grade and Prognosis,” Clin. Cancer Res. 13:81-89 (2007); 및 Sequeira et al., “Inhibition of eIF2alpha Dephosphorylation Inhibits ErbB2-Induced Deregulation of Mammary Acinar Morphogenesis,” BMC Cell Biol. 10:64 (2009)]). 종양유전자에 의해 활성화된 경로는 mTOR 신호전달 및 번역 개시를 통해 ER 클라이언트 단백질 부하를 증가시킨다(문헌[Hart et al., “ER Stress-Mediated Autophagy Promotes Myc-Dependent Transformation and Tumor Growth,” J. Clin. Invest. 122:4621-4634 (2012); Ozcan et al., “Loss of the Tuberous Sclerosis Complex Tumor Suppressors Triggers the Unfolded Protein Response to Regulate Insulin Signaling and Apoptosis,” Mol. Cell 29:541-551 (2008); 및 Tameire et al., “Cell Intrinsic and Extrinsic Activators of the Unfolded Protein Response in Cancer: Mechanisms and Targets for Therapy,” Semin. Cancer Biol. 33:3-15 (2015)]). PERK 및 IRE1α-XBP-1 경로는 저산소증 및 미세환경 스트레스에 대한 적응에 기여하는 것으로 더 밝혀졌고(문헌[Bi et al., “ER Stress-Regulated Translation Increases Tolerance to Extreme Hypoxia and Promotes Tumor Growth,” EMBO J. 24:3470-3481 (2005); Blais et al., “Activating Transcription Factor 4 is Translationally Regulated by Hypoxic Stress,” Mol. Cell. Biol. 24:7469-7482 (2004); Chen et al., “XBP1 Promotes Triple-Negative Breast Cancer by Controlling the HIF1alpha Pathway,” Nature 508:103-107 (2014); Romero-Ramirez et al., “X box-Binding Protein 1 Regulates Angiogenesis in Human Pancreatic Adenocarcinomas,” Transl. Oncol. 2:31-38 (2009); Rouschop et al., “The Unfolded Protein Response Protects Human Tumor Cells During Hypoxia Through Regulation of the Autophagy Genes MAP1LC3B and ATG5,” J. Clin. Invest. 120:127-141 (2010); Schewe et al., “ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells In Vivo,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 105:10519-10524(2008); 및 Ye et al., “The GCN2-ATF4 Pathway is Critical for Tumour Cell Survival and Proliferation in Response to Nutrient Deprivation,” EMBO J. 29:2082-2096 (2010)]), 이는 UPR이 변화되는 환경(changing milieu)에 대한 적응을 가능하게 할 수 있다는 것을 시사한다.
PERK 활성화는 항산화(antioxidant) 및 오토파지(autophage) 반응을 조율하여, 기저막에 대한 접착이 소실되는 동안, 유방 상피 세포를 보호한다(문헌[Avivar-Valderas et al., “PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment,” Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011)]). 이 생존 반응은, mTOR을 억제하는 LKB1-AMPK-TSC2 경로의 신속한 활성화와 연결된(문헌[Avivar-Valderas et al., “Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK,” Oncogene 32(41):4932-40 (2013)]), ATF4 및 CHOP 전사 프로그램(transcriptional program)을 포함한다(문헌[Avivar-Valderas et al., “PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment,” Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011)]). 인간 DCIS 병변은 향상된 PERK 인산화 및 오토파지를 나타내고(문헌[Avivar-Valderas et al., “PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment,” Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011) 및 Espina et al., “Malignant Precursor Cells Pre-Exist in Human Breast DCIS and Require Autophagy for Survival,” PloS One 5:e10240 (2010)]), 유방 상피에서의 PERK의 조건부 제거는 HER2 종양유전자에 의해 촉진되는 유방 발암(carcinogenesis)을 지연시킨다(문헌[Bobrovnikova-Marjon et al., “PERK Promotes Cancer Cell Proliferation and Tumor Growth by Limiting Oxidative DNA Damage,” Oncogene 29:3881-3895 (2004) 및 Bobrovnikova-Marjon et al., “PERK-Dependent Regulation of Lipogenesis During Mouse Mammary Gland Development and Adipocyte Differentiation,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 105:16314-16319 (2008)]). 추가적으로, HER2는 종양 세포에서 단백질독성의 수준을 증가시켜, JNK 및 IRE 신호전달을 활성화시키고 HER2+ 암 세포가 이 스트레스에 대처하는 것을 가능하게 한다(문헌[Singh et al., “HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive,” Sci. Signal. 8:ra52 (2015)]). 따라서, cBIO 데이터베이스(문헌[Cerami et al., “The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data,” Cancer Discov. 2:401-404 (2012)])는 HER2가 증폭된 인간 유방 종양의 ~14%가 PERK mRNA의 상향조절을 나타내는 것을 보여주며, HER2+ 종양은 생존을 위해 PERK 및/또는 UPR 경로에 의존적일 수 있다는 개념을 더욱 지지한다.
휴지(dormant)(휴면(quiescent)) 종양 세포는 또한, 생존을 위해 PERK 및 ATF6 신호전달에도 의존적이라는 것이 알려져 있다(문헌[Ranganathan et al., “Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase in Tumor Cell Growth Arrest and Survival,” Cancer Res. 68:3260-3268 (2008); Ranganathan et al., “Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,” Cancer Res. 66:1702-1711 (2006); 및 Schewe et al., “ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells In Vivo,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 105:10519-10524(2008)]). 간에서의 휴면 췌장 파종성 암 세포(“DCC”)는 또한 PERK-의존적 UPR을 나타내며, 이는 E-캐드헤린(cadherin) 발현의 소실 및 MHC-I의 하향조절과 관련되어, 휴지기 동안의 면역 회피를 지지한다(문헌[Pommier et al., “Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases,” Science 360(6394):eaao4908 (2018), 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨]). MMTV-HER2 모델에서, 골수 및 폐에서의 휴면 DCC는 E-캐드헤린 음성인 것으로 발견되었으나(문헌[Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)]), UPR과의 관련성은 테스트되지 않았다. 이들 데이터는 함께, UPR이 DCC에 대한 스트레스 및 면역 미세환경 적응 생존 메커니즘으로 작용할 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명은 기술분야 내 결함을 극복하는 것과 관련된다.
요약
본 발명의 일 측면은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법과 관련된다. 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 뼈 형태형성 단백질 7(Bone morphogenic protein 7)(“BMP7”) 유도 단백질로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체의 접촉된 DCC에서 휴지기를 유도하거나 유지한다. 이 측면의 방법은 대상체에서 미세 잔존 암이 공격적인 성장으로 진행하는 것으로부터 보호하는 데 이용될 수 있다.
또 다른 측면은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법과 관련되고, 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 LY2, LY3, 및 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제-유사 소포체 키나제(“PERK”) 억제제로 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체에서 DCC를 제거한다.
또 다른 측면은 대상체에서 후기 암을 치료하는 방법과 관련된다. 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 LY2, LY3, 및 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK)로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 후기 암을 치료하기 위해 대상체에서 DCC를 제거한다.
아래에 기술된 것은, 다른 것들 가운데, PERK에 대한 선택적이고 강력한 억제제인 LY4가, 휴지 DCC의 제거를 특이적으로 야기할 수 있는 이의 능력의 결과로, HER2로 유도된 전이를 차단할 수 있다는 것에 대한 설명이다. 본 발명에서, PERK 억제제는, 단독으로 또는 치명적인 전이를 예방하는 데 도움이 되는 항-증식 치료법과 병용되어, 미세 잔류 질환 병기(stage) 동안 고립 휴지 세포를 타겟팅하는 새로운 전략을 제시한다. 또한 아래에 기술된 것은 뼈 형태형성 유도 단백질이 파종성 종양 세포에서 휴지기를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
도 1A 내지 1C는 휴면 파종성 HER2+ 세포가 높은 수준의 ER 스트레스 경로 활성화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 1A는 HER2, Ki67(증식), 및 GADD34(ER 스트레스)에 대해 염색된 MMTV-HER2 동물의 폐 절편 이미지를 보여준다. 도 1A 내 그래프는 두 마커 모두에 양성인 세포/전이의 정량화를, 전체 세포에 대한 백분율로 보여준다. 도 1B는 사이토케라틴(cytokeratin), Ki67(증식), 및 GADD34(ER 스트레스)에 대해 염색된, 상이한 위치(림프절, 간, 폐)로부터의 인간 유방암 전이에 대한 이미지를 보여준다. 도 1B 내 그래프는 두 마커 모두에 양성인 세포/전이의 정량화를, 전체 세포에 대한 백분율로 보여준다. 도 1C는 단일 세포(폐 파종성 종양 세포(“DTC”))(행)의 고-처리량(high-throughput) 타겟 유전자 발현(열) 프로파일에 대한 계층적 클러스터(hierarchical clustering)를 보여준다.
도 2A 내지 2G는 PERK 억제가 HER2+ 암 세포 환자에서 상향조절된다는 것을 입증한다. 도 2A는 C1 및 바이오마크 HD 플루이다임(Biomark HD Fluidigm)을 이용한 단일 세포 유전자 발현 분석에 따른 단계에 대한 흐름도이다. 전체 255 개의 DCC 및 90 개의 원발 종양(“PT”) 세포가 분석되었다. 도 2B는 고-처리량 qPCR로 분석된 유전자 목록을 보여준다. 도 2C는, 24 시간 동안 현탁액에 둠으로써 스트레스를 가한 MCF10A-HER2 세포에서 LY 시리즈 억제제(LY2, LY3, 및 LY4) 및 GSK2656157(2 μM)에 의한 PERK 인산화의 억제를 보여주는 면역블롯이다. *는 비특이적 밴드를 나타낸다. 도 2D는 MCF10A-HER2 세포에서, 스트레스(저용량의 타프시가진, Tg 2 nM)의 부재(-) 또는 존재 하에서, 48 시간 후 LY4의 용량-반응 세포 생존가능성 곡선(세포 역가 블루(Cell Titer Blue), CTB)을 보여준다. 파선은 IC50(
Figure pct00001
9 nM)을 나타낸다. 도 2E는, 효소 생화학 어세이로 평가된, PERK 억제제인 LY4, LY2, LY3, 및 GSK2656157의 키나제 선택성을 보여준다. 도 2F는 2 주 간 치료된 MMTV-HER2 암컷에서, 전체 골수 세포(두 하지(lower limb) 유래)에 대한 LY4의 효과를 보여준다.
도 3A 내지 3G는, 단일 파종성 종양 세포 수준에서, LY4 PERK 억제가 폐 및 골수 내 전이성 질환을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 3A는 밤새 혈청이 결핍되고 15 분 간 EGF(100 ng/ml)로 처리된 MCF10A-HER2 세포에서, PERK 억제제인 LY4(2 μM)에 의한 PERK 인산화(T980)의 억제를 보여주는 면역블롯이다. 도 3B에서, MMTV-HER2+ 암컷(24 주 령)은 2 주 간 매일 비히클 또는 LY4(50 mpk)로 주사되었다. P-PERK 및 P-EIF2α에 대한 항체로 염색한 췌장 및 유선 절편의 면역조직화학(“IHC”)이 보여진다. 삽입된 것은 고배율을 보여준다. 스케일 바는 100 μm이다. 도 3C는 H&E 염색으로 검출되고 5 개의 폐 절편/동물(n=16)에서 정량화된 거대-전이(>100 개의 세포)의 이미지 및 정량화(우측 그래프)를 보여준다. 스케일 바는 100 μm이다. p는 맨-휘트니 테스트(Mann-Whitney test)에 의한 것이다. 도 3D는 항-HER2 항체를 사용한 IHC 염색에 의해 검출되고, 폐 절편/동물 ± s.d.(n=6)에 대해 정량화된 미세-전이(2 내지 100 개의 세포)의 이미지 및 정량화(우측 그래프)를 보여준다. 스케일 바는 25 μm이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 3E는 HER2에 대한 IHC 염색으로 검출되고, P-Rb+ 또는 P-Rb-로 분류되고, 폐 절편 ± s.d.(n=6)에 대해 정량화된 고립 파종성 종양 세포(DTC)의 이미지 및 정량화(우측 그래프)이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 이미지 내 화살표 및 원은 고립 DTC를 나타낸다. 도 3F는 성숙 조혈모세포-결핍 골수 조직(n=8)으로부터, 사이토스핀(cytospin)에서 CK8/18 및 HER2에 대한 IF 염색에 의해 검출된, 골수 내 파종성 종양 세포(n=8)의 이미지 및 정량화(우측 그래프)를 보여준다. 스케일 바는 25 μm이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 화살표는 Her2+ 세포를 가리킨다. 도 3G는 저밀도(단일 세포)로 매트리젤(Matrigel)에 시딩된 Dendra로 태깅(Dendra-tagged)된 H2B 단백질을 발현하도록 조작된 ZR75.1 HER2+ 세포의 이미지를 보여준다. 0 일차에, Dendra 태그(녹색 형광)는 단일 UV-광 펄스를 통해 적색 형광으로 광전환되었고, 휴면기(quiescence)의 지표로 사용되었다. 웰은 2 일차부터 8 일차까지 비히클(DMSO) 또는 LY4(2 μM)로 처치되었다. 그래프는 8 일차에 측정된 생존 세포의 백분율 ± s.d.(n=4)을 보여준다. p는 스튜던트 t 테스트(Student's t test)에 의한 것이다.
도 4A 내지 4F는, 전이 및 순환 종양 세포(“CTC”)에 대한 LY4 처치의 효과를 보여준다. 도 4A는 비히클 및 LY4로 처치된 동물(n=21 및 15)에서 단일 거대-전이의 정규화된 영역을 보여준다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 4B는 사이토스핀의 HER2 염색에 의한 순환 종양 세포/ml 혈액의 정량화를 보여주는 그래프이다. 도 4C는 폐 절편/동물(n=4 및 6)에 대한 P-Rb+ 미세-전이의 백분율을 보여주는 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 4D는 3D 매트리젤 내 시딩된 후, 0 일차에 ZR75.1-H2B-Dendra에서, 녹색 형광으로부터 적색 형광으로의 100%의 광전환을 보여주는 이미지이다. 도 4E에서, ZR75.1-H2B-Dendra 광전환된 세포는 저(단일 세포) 또는 고밀도로 시딩되었다. 그래프는 단일 세포 또는 고밀도로 시딩된 세포 내 잔존 적색 라벨의 백분율 ± s.d.(n=4)을 보여주는 그래프이다. p는 스튜던트 t 테스트에 의한 것이다. 도 4F는 도 4D에서와 같지만, 고밀도로 시딩된 세포가 2 일차부터 8 일차까지 비히클(DMSO) 또는 LY4(2 μM)로 처치되었다. 그래프는 8 일차에 측정된 생존 콜로니의 백분율 ± s.d.(n=4)을 보여준다. p는 스튜던트 t 테스트에 의한 것이다.
도 5A 내지 5C는 PERK 억제가 Her2+ 세포에서 상향조절된다는 것을 나타낸다. 도 5A는 PERK(EIF2AK3)가 HER2+ 유방암 환자의 서브집단에서 상향조절된다는 것을 보여준다. cBioPortal을 사용한, TCGA 유방암 데이터 HER2+ 케이스(58 개의 종양)의 분석이다. 도 5B는 비히클 및 LY4로 처치된 MMTV-neu 유선 홀 마운트(whole mount)와 대비하여, 홀 마운트 FVB 정상 유선에 대한 카민 염색의 이미지를 보여준다. 도 5C는 H&E 염색된 유선 절편에 존재하는 조직학적 구조(정상적인 빈 관부터 DCIS-유사 유선 상피내 신생물까지), 맨 위의 이미지 및 아래 행의 고배율)의 정량화를 보여준다.
도 6A 내지 6C는, MMTV-HER2+ 유방암 모델에서, PERK 억제제인 LY4가 유선 “정상화”를 야기한다는 것을 보여준다. 도 6A는 홀 마운트 유선에 대한 카민 염색의 이미지, 및 비히클로 처치된 및 LY4로 처치된 동물로부터의 H&E 염색된 유선 절편을 보여준다. 스케일 바는 100 μm이다. 도 6B는 비히클로 처치된 및 LY4로 처치된 동물에서 발견된 H&E로 염색된 유선 절편(n=50/동물, 동물 n=13)에 존재하는 조직학적 구조물(빈 관 e.d., 폐쇄된 관 o.d., 폐쇄된 과형성 o.h., 및 DCIS-유사 유방 상피내 신생물 M.I.N)의 정량화 ± s.e.m.를 보여준다. 통계학적 유의도(p)는 맨-휘트니 테스트로 계산되었다. 도 6C는, 유선 절편에서, 상피 루멘 마커인 사이토케라틴 8/18(CK8/18) 및 근상피 마커인 평활근 액틴(“SMA”)에 대한 IHC를 보여준다. 그래프는 동물 당 CK8/18+ 및 SMA+ 구조에 대한 스코어를 보여준다, n=12. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 스케일 바는 75 μm이다.
도 7A 내지 7F는 P-PERK의 수준, P-히스톤 H3의 수준, 및 종양 크기에 대한 LY4 처치의 효과를 보여준다. 도 7A는 비히클로 처치된 및 LY4로 처치된 동물로부터의 MMTV-neu 종양 용해물 내 P-PERK의 수준에 대한 웨스턴 블롯이다. 도 7B는 비히클(위)로 처치된 및 LY4(아래)로 처치된 암컷으로부터의 종양 부피(mm3)를 보여준다. 각 선은 종양을 나타낸다. 도 7C는 LY4로 처치된 암컷에서의 종양 크기 감소의 백분율을 보여주며, 이는 종양 위축(shrinkage)을 보여준다. 각 선은 종양 및 동물을 나타낸다. 도 7D는 유선 종양 절편에서의 P-히스톤 H3에 대한 IHC, 이미지 및 정량화(우측 그래프)를 보여준다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 7E에서, HER-2를 과발현하는 ZR75.1 세포가 매트리젤에 시딩되었고, 선포 형성 후(10 일차) 웰은 비히클(대조군) 또는 LY4(2 μM)로 10일 간 처치되었다. 그래프는 선포(n=20) 당 절단된 카스파제-3 양성 세포의 백분율 ± s.d.를 보여준다. p는 스튜던트 t 테스트에 의한 것이다. 도 7F에서, MCF10A-HER2 세포가 메트리젤에 시딩되었고, 선포 형성 후(4일 차) 웰은 비히클(대조군) 또는 LY4(2 μM)로 10일 간 처치되었다. 그래프는 선포(n=20) 당 P-히스톤 H3-양성 세포의 백분율 ± s.d.를 보여준다. p는 스튜던트 t 테스트에 의한 것이다.
도 8A 내지 8D는 MMTV-HER2+ 암컷에서 PERK 억제가 종양 성장을 손상시킨다는 것을 보여준다. 도 8A에서, 현성(overt) 종양을 갖는 MMTV-neu 암컷(24 내지 32 주 령)은 비히클 또는 LY4(50 mpk)로 2주 간 매일 주사되었다. 그래프는 비히클 및 LY4로 처치된 동물에서의 종양 크기 변화 백분율 ± s.d.(n=16)을 보여준다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 8B는 최종 종양 부피(mm3)를 보여주는 그래프이다. 휘스커(whiskers)는 데이터(n=16)의 최소 및 최댓값을 나타낸다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 8C는 종양 절편에서 세포자멸사(apoptosis) 수준을 측정하기 위한 TUNEL 염색의 대표적인 IHC를 나타낸다. 스케일 바는 10 및 50 μm이다. 그래프는 비히클 및 LY4로 처치된 종양 절편(n=5) 내 TUNEL 양성 세포의 백분율을 보여준다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 8D에서, HER2+ MCF10A-HER2 또는 SKBR3 세포가 매트리젤에 시딩되었고, 선포 형성 후(4 일차) 웰은 비히클(대조군) 또는 LY4(2 μM)로 10일 간 처치되었다. 그래프는 선포(n=20) 당 절단된 카스파제-3 양성 세포의 백분율 ± s.d.를 보여준다. p는 스튜던트 t 테스트에 의한 것이다. MCF10A-HER2 선포의 공초점 이미지(confocal image)는 절단된 카스파제-3에 대해 염색되었다.
도 9A 내지 9F는 LY4 처치가 포스포-HER2의 수준 및 다운스트림 신호전달 경로를 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 9A는 MMTV-HER2 유방 종양 절편 내 P-HER2, P-PERK, 및 P-EIF2α에 대한 IHC의 이미지를 보여준다. P-HER2 양성 가장자리(rim)가 P-PERK 및 P-EIF2α 염색과 겹친다는 것에 주목하라. 스케일 바는 100 μm 이다. 도 9B는 MMTV-HER2 암컷으로부터의 단일 세포(원발 유방 종양)(행)의 고-처리량 타겟 유전자 발현(열) 프로파일의 계층적 클러스터링을 보여준다. 도 9C는 비히클로 처치된 및 LY4로 처치된 유방 종양 내 대표적인 P-HER2 및 전체 HER2 IHC 염색을 보여준다. 그래프는 비히클 및 LY로 처치된 종양에서의 P-HER2 스코어를 보여준다. 종양 절편에서 P-HER2 수준의 정량화는, IHC 강도 및 스코어링 영역(n=11)에 의한다(도 10A 참조). 스케일 바는 50 μm이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 9D는 MCF10A-HER2A 세포가 밤새 결핍되고, +/- LY4(2 μM)으로 처치되고, 이후 +/-EGF (100 ng/ml)이 수집 전 15분 간 첨가되었다. 전체 HER2 및 EGFR 뿐만 아니라, P-HER2, P-EGFR, P-AKT, P-S6, 및 P-ERK의 수준이 웨스턴 블롯으로 평가되었다. GAPDH 및 β-TUB는 로딩 대조군으로 사용되었다. 대표적인 세 개의 블롯이 보여진다. 밀도측정 분석(densiometry analysis)은 P-HER2(n=3) ± s.d를 보여준다. p는 스튜던트 t 테스트에 의한 것이다. 도 9E에서, MCF10A-HER2 세포는 도 9D에서와 같이 처치되었고, 표면 수용체 비오티닐화 어세이가 수행되었다. 전체 HER2 및 P-HER2의 표면 수준이 평가되었다. P-HER2에 대한 밀도측정이 보여진다. 도 9F에서, MCF10A-HER2 세포는 도 9D에서와 같이 처치되었고, 가역적 표면 수용체 비오티닐화 어세이가 수행되었다. 전체 HER2 및 P-HER2의 엔도사이토시스 수준이 평가되었다. 두 실험 중 하나가 보여진다.
도 10A 내지 10C는 MCF10A-HER2 세포에서 P-HER2 수준의 정량화를 보여준다. 도 10A는 유선 종양 절편 내 P-HER2 수준의 정량화에 사용된 스코어링 시스템을 보여준다. IHC P-HER2 양성 영역은 이들 대표 이미지에 보여진 확립된 스코어에 따른 강도 스코어와 곱해졌다. 스케일 바는 100 μm이다. 도 10B에서, MCF10A-HER2 세포는 밤새 결핍되고, +/- LY4(2 μM)로 처치되고, 이후 +/- EGF(100 ng/ml)이 수집 전에 20분 간 첨가되었다. P-HER2/Y1112 및 P-HER2/Y877의 수준이 웨스턴 블롯으로 평가되었다. GAPDH 및 HSP90은 로딩 대조군으로 사용되었다. 도 10C는 표면 비오티닐화 어세이에 사용된 추출물에 대한 인풋을 보여준다.
도 11A 내지 11E는 CDK4/6 억제에 이어진 순차적인 PERK 억제가 LY4의 항-전이 효과를 향상시킨다는 것을 보여준다. 도 11A는 MMTV-neu/HER2+ 마우스 모델에서 아베마시클립(Abemaciclib) 및 LY4의 순차적인 처치를 평가하기 위해 디자인된 생체 내 실험에 대한 도식도이다. MMTV-neu/HER2+ 암컷 마우스(24 주 령)는 CDK4/6 억제제인 아베마시클립(50 mpk)으로 4 주 간, 이후 +/- LY4(50 mpk)로 매일 처치되었다. 도 11B는 HER2, Ki67(증식), 및 GADD3(ER 스트레스)에 대한 종양 절편에 대한 일련의 형광 IHC이다. 스케일 바는 100 μm이다. 화살표는 높은 형광을 가리킨다. 도 11C는 H&E 염색으로 검출되고, 5 개의 폐 절편/동물(n=8)에서 정량화된, 거대-전이(>100 개의 세포)를 보여주는 그래프이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 11D는 항-HER2 항체를 사용한 IHC 염색으로 검출되고, 폐 절편/동물 ± s.d.(n=8)에 대해 정량화된, 미세-전이(2 내지 100 개의 세포)의 수를 보여주는 그래프이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다. 도 11E는 HER2에 대한 IHC 염색에 의해 검출되고, Ki67+ 또는 Ki67-로 분류되고, 폐 절편 ± s.d.(n=8)에 대해 정량화된, 고립 파종성 종양 세포의 수를 보여주는 그래프이다. p는 맨-휘트니 테스트에 의한 것이다.
도 12A 내지 12G는 LY4의 사용을 포함하는 제안된 단독 또는 병용 요법, 및 흑색종 세포에 대한 CDK4/6 억제제인 아베마시클립과 LY4의 병용 처치는 2D 및 3D 배양에서의 시험관 내 세포 생존력에 차등적으로 영향을 미친다는 것을 보여주는 실험을 보여준다. 도 12A는 아베마시클립 및 LY4의 병용에 대한 근거를 보여주는 도식도이다. 도 12B는 Braf-돌연변이 흑색종 세포(WM35)를 0 nM, 10 nM, 또는 50 nM의 아베마시클립으로 1 주 간, 이후 2 μM의 LY4로 48 시간 처치한, 시험관 내 처치 결과를 보여주는 바 그래프이다. 도 12C는 1 주 간의 아베마시클립 전-처치에 이어진 2 μM의 LY4 처치 후, DAPI로 염색된 세포의 이미지를 포함한다. 5,000 개의 세포가 메트리젤에 시딩되었다. 도 12D 내지 12E에서, WM35 흑색종 세포는 아베마시클립으로 5 주 간 전-처치되었고, 이후 완전 미디아(complete media)에서 LY4 및 아베마시클립으로 처치되었다. 생존가능 세포를 식별하기 위해, 세포는 트립판 블루(Trypan blue)로 염색되었다. 도 12D는 아베마시클립 감수성 세포를 보여주는 그래프이다. 도 12E는 아베마시클립-저항성 세포를 보여주는 그래프이다. 도 12F는 5 주 간의 아베마시클립 전-처치와 2 μM의 LY4 및 아메바시클립의 공동-처치 후, DAPI로 염색된 세포의 이미지를 보여준다. 1,000 개의 세포가 메트리젤에 시딩되었다. 도 12G는 아베마시클립으로 성장 중단이 유도될 때, 세포가 PERK 타겟(GADD34)을 상향조절한다는 것을 시사하며, 이는 세포가 왜 LY4에 감수성을 갖는지 설명할 수 있다. 나이브(na
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ve) 또는 아베마시클립에 대해 저항성(R)을 갖는 WM35 흑색종 세포는 배양액에서 비히클(-) 또는 150 및 300 nM의 아베마시클립으로 24 시간 동안 처치되었다. 세포는 이후 용해되었고, 웨스턴 블롯을 통해 GADD34 발현을 확인하였다. 튜불린 발현은 로딩 대조군으로 사용되었다. PERK 활성화를 시사하는, 아베마시클립 나이브 세포에서 GADD34가 상향조절되는 것에 주목하라. 저항성 세포는 GADD34의 더 높은 수준을 보여주는 것으로 보이며, 이는 추가적인 아베마시클립 처치 후 변화되거나 감소하지 않았다.
도 13A 내지 13C는 ERK/p38 활성 비율 및 다양한 mRNA에 대한 BMP7-F9의 효과를 나타낸다. 도 13A는, HEp3 HNSCC 세포에서 웨스턴 블롯에 의해 결정된 것처럼, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 및 10 ng/ml(각각, 두 번째, 세 번째, 및 네 번째 회색 바; 대조군은 첫 번째 흑색 바)의 BMP7-F9 처치가, 대조군에 비해 ERK/p38의 활성 비율을 감소시킨다는 것을 보여준다. ERK/p38 활성 비율의 효과는 2 내지 6 및 24 시간 후 관찰되었다(두 번째부터 네 번째 열 그룹). 처음 30 분 동안에, ERK 활성은 BMP7에 의해 자극되었다(첫 번째 열 세트). 도 13B는 BMP7-F9 처치가 DEC2, p53, 및 p27 mRNA를 유도한다는 것을 보여주고(10 ng/ml의 BMP7-F9, 24 시간), 이들은 휴지기 시그니처 유전자를 코딩한다. 도 13C는, 면역형광에 의해 결정된 것처럼, 동일 세포의 BMP7-F9 처치가 강력한 휴지기 유도 전사 인자인 NR2F1의 핵 축적을 유도한다는 것을 보여준다(10 ng/ml, 24 시간). 화살표는 NR2F1 형광을 가리킨다. 도 13A 및 도 13B에서의 차이는, 스튜던트 t 테스트를 사용하여 계산된 p<0.05이었다. 이들 데이터는 BMP7-F9가, 자발적인 휴지 DCC 또는 골수에서 재프로그램화 또는 TGFβ2 신호전달을 통해 유도된 것들에서 상향조절되는 것으로 발견된, 휴지기 유전자의 강력한 유도인자라는 가설을 지지한다.
도 14A 내지 14E는 시험관 내 및 생체 내 BMP7-F9가 어떻게 T-HEp3 세포의 성장 정지를 유도하는지를 보여준다. 도 14A는, 세포 역가 블루 어세이(cell titer blue assay)에 의해 결정된 것처럼, T-HEp3 세포에 대한 BMP7-F9 처치가 시험관 내에서 48 시간 동안 그들의 증식을 억제한다는 것을 보여준다(RFU, 상대적 형광 단위). 도 14B는 도 14C 내지 14D에 사용된 생체 내 실험 절차의 도식도이다. T-HEp3 세포는 시험관 내에서 BMP7-F9으로 24 시간 동안 전-처치되고, 이후 닭 배아 융모요막("CAM")에 접종되고, 종양의 수집 및 HEp3 HNSCC 세포 수(도 14D) 및 P-H3 수준(도 14E)의 정량화 이전에, 비히클 또는 BMP7-F9(50 ng/ml)로 매일 생체 내 투여되었다. 도 14E에서 화살표는 P-H3 및 DAPI 형광의 겹침을 가리킨다. 이들 데이터는 CAM 시스템에서의 단기간 실험에서, 도 13B에서 식별된 휴지기 마커가 시험관 내 및 생체 내에서의 성장 억제와 연관된다는 가설을 지지한다.
도 15A 내지 15C는 마우스 질환 모델에서 BMP7-F9 처치에 대한 평가를 보여준다. 도 15A는 전이 개시에 대한 BMP7-F9의 효과를 평가하기 위해 사용된 생체 내 실험 절차에 대한 도식도이다. HEp3-GFP HNSCC 종양은 대략 300 mm3이 될 때까지 성장되었고, 이후 종양이 대략 600 mm3이 될 때까지 네오-어쥬번트 세팅에서 50 μg/kg의 BMP7-F9으로 처치되었다. 종양은 이후 수술을 통해 제거되었다. 수술 1 내지 2 일 후, BMP7-F9으로의 어쥬번트 처치는 또 다른 3, 4, 또는 6 주 동안 지속되었다. 동물은 이후 안락사되었고, 폐 내 DCC 부하는 형광 현미경을 사용하여 스코어링 되었다. 도 15B는 BMP7이 종양 수술 후 국소 및 원격 재발의 발생을 제한한다는 것을 보여준다. NSG 마우스는 도 15A의 프로토콜에 따라 3 및 6 주 간 처치되었다. 이들 시점에, 국소 재발 및 DCC 발생 백분율이 스코어링 되었다. 도 15C에서 마우스는, 어쥬번트 처치가 4 주 간 진행되었다는 것을 제외하고, 도 15A에서와 같이 처치되었다. 분리된 폐 내 GFP 양성 세포의 수는 처치 후에 스코어링 되었다. 이는 폐 내 DCC 부하에 대한 측정치이고, BMP7-F9 처치에 의해 유의하게 감소되었다. DCC 부하의 중앙값이 일 로그 떨어진다는 것 및 BMP-7이 7 마리 중 3 마리의 동물을 DCC로부터 명백히 치유시킨다는 것에 주목하라.
본원에 개시된 것은 대상체에서의 미세 잔존 암을 치료하는 방법이다. 본 발명의 일 측면은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법과 관련된다. 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 뼈 형태형성 단백질 7(Bone morphogenic protein 7)(BMP7) 유도 단백질로 접촉시키는 것을 포함한다. 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 뼈 형태형성 단백질 7(BMP7) 유도 단백질로 접촉시키는 것은, 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해, 대상체의 접촉된 DCC에서 휴지기를 유도하거나 유지한다.
본원에 사용된 용어 “미세 잔존 암”은, 실제로 대상체가 혈액(CTC 등) 또는 골수 또는 림프절(DTC 등) 내 잔존 암 세포(즉, DCC)를 갖더라도, 표준 방사선 및 조직학적 기준에 의해, 대상체에서 암의 증거가 결핍되어 있는 상황 또는 상태을 포함한다. 미세 잔존 암은 화학요법, 수술, 및/또는 방사선 치료법에 의한 암 치료 후에 발생할 수 있다. 표준 방사선 및 조직학적 검출 방법은, 예를 들어, 이미징 테스트(X-선, 초음파, MRI); 알려진 종양 마커 또는 순환 종양 마커, 예컨대 PSA를 포함하는 혈액 또는 면역화학 테스트(immunochemical test); 예를 들어, 존재하는 종양 세포의 수 또는 이들 세포의 상대적 희귀성을 평가하기 위한, 알려진 종양 마커에 대한, 바이옵시(biopsy) 또는 사이톨로지(cytology) 시료.
종양 세포는 초기에 원발 종양으로부터 CTC 및 DTC 처럼 파종될 수 있다는 것은 기술분야 내에 잘 알려져 있다. 실제로, DTC는 종양 수술 후 질환의 증거가 없는 대상체에서 식별되어 왔다. 암 병력이 배제되지 않는 이식편(transplant) 기증에 관한 드문 케이스에서, 심지어 공여자가 30 년까지 무-질환 상태인 경우에도, 수여자는 공여자로부터 유래된 전이가 진행될 수 있다(문헌[MacKie et al., “Fatal Melanoma Transferred in a Donated Kidney 16 Years after Melanoma Surgery,” N. Engl. J. Med. 348:567-568 (2003)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
개별 환자 내 전이에 대한 종양 계통분류(tumor phylogenetics) 및 전체 유전체 시퀀싱은 원발 종양-에서-전이 및 전이-에서-전이 전파(transmission)를 시사하고, 이는 연속적/선형 성장 모델이 후기(10+ 년) 재발을 설명하지 못한다는 증거를 제공한다(문헌[Gundem et al., “The Evolutionary History of Lethal Metastatic Prostate Cancer,” Nature 520:353-357 (2015) 및 Naxerova et al., “Using Tumour Phylogenetics to Identify the Roots of Metastasis in Humans,” Nature Reviews Clinical Oncology 12:258-272 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
단일 세포 CTC 분석결과는 또한 CTC 및 원발 종양 사이의 유전적 계열 관련성(genetic lineage link)을 보여준다(문헌[Ni et al., “Reproducible Copy Number Variation Patterns Among Single Circulating Tumor Cells of Lung Cancer Patients,” PNAS 110(52):21083-88; Heitzer et al., “Complex Tumor Genomes Inferred from Single Circulating Tumor Cells by Array-CGH and Next-Generation Sequencing,” Cancer. Res. 73:2965-75 (2013); 및 Lohr et al., “Whole-Exome Sequencing of Circulating Tumor Cells Provides a Window into Metastatic Prostate Cancer,” Nature Biotech. 32:479-484 (2014)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
또한, 인간에서, CTC/DTC는 원발 종양의 병기 또는 크기와 관련이 없다(문헌[Krishnamurthy et al., “Detection of Minimal Residual Disease in Blood and Bone Marrow in Early Stage Breast Cancer,” Cancer 116(14):3330-3337 (2010)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 대신에, CTC 및 DTC는 전이/재발성 질환을 형성하는 능력을 유지하는 것으로 생각된다. 특히, CTC 및 DTC의 검출은, 유방 및 전립선 암에서 전이 및 재발을 예측하는 것으로 알려져 왔다(문헌[Braun et al., “A Pooled Analysis of Bone Marrow Micrometastasis in Breast Cancer,” NEJM 353:793-802 (2005); Hayes et al., “Circulating Tumor Cells at Each Follow-up Time Point During Therapy of Metastatic Breast Cancer Patients Predict Progression-Free and Overall Survival,” Clin. Cancer Res. 12(14):4218-4224 (2006); 및 de Bono et al., “Circulating Tumor Cells Predict Survival Benefit from Treatment in Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer,” Clin. Cancer Res. 14:6302-6309 (2008)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
전이는 증식뿐만 아니라 재활성화를 겪은 휴지 DCC로부터 발생하는 것으로 생각되었다. 종양 절제 수 년 후 환자에게 전이가 발생될 수 있다는 점을 고려하면, 휴지 DCC가 암의 후기 재발에 원인이 되는 주요 부분을 설명할 수 있다고 생각된다. 본원에 사용된 용어 “휴지기”는 일시적인 체세포분열 및 성장 정지를 지칭하고, 내재적 및/또는 외재적 메커니즘이 고립 또는 작은 그룹의 DCC를 휴면기(가역적인 성장 정지)로 진입하게 하는, 세포성 휴지기(cellular dormancy)로 정의된다. 휴지 병변의 두 번째 카테고리는, 종양 덩어리가 분열하는 세포 및 부족한 혈관화(vascularization)에 따라 사멸하는 세포 사이의 균형에 의해 일정하게 유지되는, 혈관생성 휴지기(angiogenic dormancy)로 정의된다. 세 번째 카테고리는, 면역계가 지속적으로 성장하는 암 세포의 집단을 잘라내는 지속적인 세포독성 활성을 통해, 증식하는 종양 덩어리를 일정하게 유지하는, 면역-매개 휴지기(immune-mediated dormancy)이다(예로서 다음을 참조, 문헌[“Mechanisms of Disseminated Cancer Cell Dormancy: An Awakening Field,” Nat. Rev. Cancer 14(9):611-622 (2014)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 휴지 세포는 확립된 원발 종양, 이차 종양, 및/또는 전-침윤 병변으로부터 발생할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 방법은 접촉된 DCC가 휴지 암 세포이고, 이는 암 세포가 일시적인 체세포분열/성장 정지 또는 노화-유사 행동을 경험하는 것을 의미한다.
DCC는 골수 흡인액(bone marrow aspirates)에서, 조혈 계열 세포를 제거하는 음성 선택(negative selection) 및 이후 EpCAM 또는 CK8/18에 대해 양성적으로 염색함으로써 검출될 수 있다. 조합하여, 세포는 이들이 증식기 또는 휴지기에 있는지 여부를 결정하기 위한 휴지기 마커로 염색될 수 있다. 후자는 고정 후에 수행될 수 있다. 전체 유전체 또는 전체 전사체 분석을 수행하기 위해, 골수로부터의 EpCAM 양성 DCC는 단리되고, 전체 유전체 또는 전사체 분석을 위해 가공된다(문헌[Gu
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vi
Figure pct00004
et al., “Combined Genome and Transcriptome Analysis of Single Disseminated Cancer Cells from Bone Marrow of Prostate Cancer Patients Reveals Unexpected Transcriptomes,” Cancer Res. 74(24):7383-94 (2014)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
본 발명의 방법은, 상기 접촉 이전에, 대상체에서 DCC의 존재를 검출하는 것을 더 포함한다. 아래 표 1에 보여진 것처럼, 다른 세포 타입으로부터 표현형적으로 구별가능하기 때문에, 휴지 DCC는 식별될 수 있다(문헌[Sosa et al., “Mechanisms of Disseminated Cancer Cell Dormancy: An Awakening Field,” Nat. Rev. Cancer 14(9):611-622 (2014)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
표 1. DCC 마커
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DTC는 수술 전 전립선 암 환자의 13 내지 72%의 골수에서 및 수술 후 5 년 초과로 질환의 증거가 없는 환자의 20 내지 57 %에서 식별되어 왔다(문헌[Morgan et al., “Disseminated Tumor Cells in Prostate Cancer Patients after Radical Prostatectomy and without Evidence of Disease Predicts Biochemical Recurrence,” Clin. Cancer Res. 15:677-683 (2009) 및 Weckermann et al., “Perioperative Activation of Disseminated Tumor Cells in Bone Marrow of Patients with Prostate Cancer,” J. Clin. Oncol. 27(10):1549-56 (2009)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). DTC의 검출은 임상적 휴지기에 있는 환자의 재발의 예후인자(prognostic)이다.
본원에 사용된 용어 “임상적 휴지기”는 원발 종양의 제거 및 질환 재발 사이의 장기적인 임상적 무-질환 기간(예로서, 5 년 초과)을 지칭한다. 임상적 휴지기는 전립선암, 유방암, 식도암, 신장암, 갑상선암, B-세포 림프종, 및 흑색종에서 흔하고(문헌[Lam et al., “The Role of the Microenvironment - Dormant Prostate Disseminated Tumor Cells in the Bone Marrow,” Drug Discov. Today Technol. 11:41-47 (2014); Gelao et al., “Tumour Dormancy and Clinical Implications in Breast Cancer,” Ecancermedicalscience 7:320 (2013); Ellis et al., “Detection and Isolation of Prostate Cancer Cells from Peripheral Blood and Bone Marrow,” Urology 61:277-281 (2003); Morgan et al., “Disseminated Tumor Cells in Prostate Cancer Patients after Radical Prostatectomy and without Evidence of Disease Predicts Biochemical Recurrence,” Clin. Cancer Res. 15:677-683 (2009); 및 Pfitzenmaier et al., “Telomerase Activity in Disseminated Prostate Cancer Cells,” BJU Int. 97:1309-1313 (2006)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 일부 환자에서 임상적 전이가 진행될 수 있을 때 까지, 그들이 장기간(예로서, 10 년 초과) 휴지기로 남아있을 수 있는, 뼈, 림프절, 간, 및 폐를 비롯한 원격 장기에 상주할 수 있다.
본 발명의 수행 방법의 일부 실시태양에서, 대상체는 CTC로 진단된다.
본 발명의 수행 방법의 일부 실시태양에서, 대상체는 DTC 및/또는 비-전이성 암으로 진단된다.
본원에 사용된 “대상체”는, 예로서 환자, 예컨대 암환자, 및 임의의 동물을 아우르지만, 바람직하게는 포유류이다. 일 실시태양에서, 대상체는 인간 대상체이다. 적합한 인간 대상체는 파종성 암 세포 및/또는 비-전이성 암으로 진단된 소아, 성인, 및 노인 대상체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 실시태양에서, 대상체는 소(bovine), 양(ovine), 돼지(porcine), 고양이(feline), 말(equine), 쥐(murine), 개(canine), 늑대(lupine) 등일 수 있다.
본 발명의 수행 방법에서, 대상체에서의 DCC는, DCC의 휴지기를 유도하거나 유지하기 위해, 접촉된다. 이는 DCC의 지속적인 비-증식기의 확립 또는 DCC에서의 비-증식기의 지속을 의미한다.
일 실시태양에서, 미세 잔존 암은 암으로 진단된 대상체에서 치료된다. 예를 들어, 대상체는 유방암, 다발성 골수종, 폐암, 비소세포폐암, 뇌종양, 자궁경부암, 맨틀 세포 림프종, 백혈병, 간세포암종, 전립선암, 포도막 및 피부 흑색종, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경모세포종, 및 대장직장암 중 하나 이상으로 진단되지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 암 또한 본 발명의 방법으로 치료될 수 있다.
일 실시태양에서, 유방암과 관련되거나 연관된 미세 잔존 암은 대상체에서 치료될 수 있다. 유방암은 침윤성 유방암, 유관상피내암(DCIS), 소엽상피내암(LCIS), 및 염증성 유방암 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
호르몬 수용체 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)(HER2) 상태를 비롯한, 다양한 분자적 인자가 유방암을 분자적으로 카테고리화하는 데 사용될 수 있다. HER2 및 기저양(basal-like) 그룹은, 호르몬 수용체-음성 유방암 중에서 식별된 주요 분자적 서브타입이다(문헌[Schnitt, “Classification and Prognosis of Invasive Breast Cancer: From Morphology to Molecular Taxonomy,” Modern Pathology 23:S60-S64 (2010)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 일 실시태양에서, 유방암은 HER2+ 유방암이다.
본 발명의 방법의 일부 실시태양에서, 대상체는 종양을 제거하기 위해 수술적 절제를 겪는다. 예를 들어, 대상체는 하나 이상의 유방절제, 전립선절제, 피부 병변 제거, 소장 절제, 위절제, 개흉, 부신절제, 충수돌기절제, 대장절제, 난소절제, 갑상선절제, 자궁절제, 설절제, 대장 용종절제, 및 대장직장 절제 중 하나 이상을 겪을 수 있다.
본 발명의 방법에서, 대상체에서의 파종성 암 세포(DCC)는 뼈 형태형성 단백질 7(BMP7) 유도 단백질로 접촉된다. BMP7은, 골수 스트로마(stroma)의 골모세포(osteoblast)로부터 분비되고, DCC/DTC 미세환경에 영향을 줄 수 있는, TGFβ 슈퍼패밀리(superfamily)의 멤버이다. BMP7은 중간엽(mesenchymal) 세포가 뼈 및 연골로 변형되는 과정에 중요한 역할을 하고, 전립선암 줄기세포-유사 세포에서 노화를 가역적으로 유도하는 것으로 알려져 있다(문헌[Kobayashi et al., “Bone Morphogenetic Protein 7 in Dormancy and Metastasis of Prostate Cancer Stem-Like Cells in Bone,” J. Exp. Med. 208(13):2641-55 (2011)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). Pro-BMP7은, pre-단백질의 단백질 분해 가공을 통해 생성된 pre-BMP7 및 성숙 BMP7 사이의 중간체이고, 이는 성숙 호모다이머(homodimer)의 서브유닛을 생성한다.
인간 BMP7 단백질은 TGF-beta 슈퍼패밀리의 분비된 신호전달 분자이며, 본래 뼈 형성을 유도하는 이의 능력에 대해 식별되었으나, 이후 여러 상이한 세포 타입에서 성장 및 분화를 매개하는, 다기능성(multifunctional) 사이토카인으로 인식되었다. 인간 BMP7 단백질은 세포 내에서 292 개의 아미노산 전구 단백질 및 성숙된 것으로 발현되고, 생물학적으로 활성을 갖는 BMP7는 신호 펩티드 및 pro-펩티드의 단백질분해 제거에 의해 생성된다. 시그널 펩티드(초기 29 개의 아미노산), pro-도메인, 및 성숙 펩티드(볼드체)를 함유한 야생형 인간 BMP7 단백질 아미노산 서열은, 이어지는 서열번호 1과 같다:
Figure pct00006
.
시그널 펩티드는 단백질분해 절단에 의해 제거되어,pro-BMP7으로 지정된 온전한 pro-도메인/성숙 펩티드를 야기할 수 있다는 것은 기술분야 내 통상의 기술자로부터 이해될 수 있다.
야생형 인간 성숙 BMP7는 두 개의 당화되고(glycosylated), 이황화-결합된 139 개의 아미노산의 다이머(dimer)인, 약 35 kDa의 호모다이머 단백질이다. 각 호모다이머 단백질은 서열번호 2에 보여지는 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00007
.
BMP7 단백질의 변이체는, 서열번호 3에 보여지는 것과 같은 컨센서스(consensus) 서열에 나타난 특이적 아미노산 변화와 함께, 서열번호 2의 인간 성숙 BMP7의 변이체를 포함한다:
Figure pct00008
.
본 발명의 인간 성숙 BMP7 단백질의 특정 변이체는, 야생형 성숙 인간 BMP7 단백질과 대비하여, 증가된 특이적 활성, 개선된 용해도 성질, 개선된 생체이용성, 내재적 순환 억제제에 대한 감소된 결합, 및/또는 감소된 EBF 활성을 갖는다.
인간 BMP7 단백질의 적절한 변이체는 F93V/N110G; Y65G/I86L/T89A/N110G; Y65G/I86L/N110G/Y128F; Y65G/I86L/N110G/Y128W; Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W (BMP7-F9); Y65G/T89A/N110G/Y128F; Y65G/I86L/N110G; 및 Y65G/V114M 으로 구성된 그룹으로부터 선택된다(아래 표 2 참조).
표 2. 인간 BMP7의 예시적 변이체
Figure pct00009
일 실시태양에서, BMP7의 변이체는 Y65G/I86L/N110G/Y128W 및 Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일 실시태양에서, BMP7 유도체는 pro-BMP7의 조작된 BMP7 변이체이다. Pro-BMP7의 조작된 변이체는 BMP7 성숙 단백질 도메인에 대응되는 아미노산 위치의 아미노산 치환으로 구성될 수 있다. Pro-BMP7의 조작된 변이체는 성숙 BMP7 유도 단백질로 가공될 수 있다. 인간 성숙 BMP7 단백질 변이체의 N-말단에 연결된 pro-도메인을 함유하는 pro-BMP7의 적절한 변이체는, 표 3에 도시된, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
표 3. 인간 Pro-BMP7의 예시적 변이체
Figure pct00010
본 발명의 방법으로의 용도를 위한 적절한 BMP7 유도 단백질은 인간 pre-BMP7의 변이체(즉, 서열번호 1)를 포함한다.
일 실시태양에서, BMP7 유도 단백질은, 성숙 야생형 BMP7 단백질과 대비할 때, 향상된 생물활성(bioactivity)(예로서, 50 배 이상까지의 생물활성) 및 생물리학적 성질(biophysical properties)(예로서, 향상된 용해도 및 안정성)을 갖는 성숙 BMP7 단백질이다.
또 다른 실시태양에서, BMP7 유도체는 BMP7-F9이다(서열번호 8).
본원에서 서열번호에 대한 참조를 비롯한, 야생형 BMP7 단백질 또는 이의 변이체에 대한 참조는, 각 모노머 서브유닛이 식별된 서열을 갖는, 호모다이머를 지칭한다. 예를 들어, BMP7-F9(서열번호 8)에 대한 참조는, 각 모노머 서브유닛이 서열번호 8에 보여지는 서열을 갖고, 각 서브유닛이 이황화결합을 통해 연결된, 호모다이머를 지칭한다.
본 발명의 기능적 어세이를 위해, 특정 pro-BMP7 단백질 또는 이의 변이체로의 처치 또는 이의 투여는, 특정 성숙 BMP7, 즉, 야생형 또는 이의 변이체의 호모다이머로의 처치 또는 이의 투여를 지칭하며, 이는 일반적으로 야생형 인간 pro-도메인과의 비-공유 복합체이다.
본 발명의 방법에 따라, 접촉은 BMP7 유도 단백질을 대상체에 투여함으로써 수행될 수 있다.
대상체에 대한 BMP7의 효과는 BMP 수용체 2(BMPR2)에 의존할 수 있으며, 이의 발현은 전립선암 환자에서 재발 및 뼈 전이와 역의 상관관계를 갖는 것으로 알려져 있다(문헌[Kobayashi et al., “Bone Morphogenetic Protein 7 in Dormancy and Metastasis of Prostate Cancer Stem-Like Cells in Bone,” J. Exp. Med. 208(13):2641-55 (2011)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 따라서, 일 실시태양에서, 대상체에서 접촉된 DCC는 뼈 형태형성 단백질 수용체 양성(BMPR+)이다.
본 발명의 방법은 화학요법제, 면역요법제, 에피제네틱 작용제(epigenetic agent), 또는 이온화 방사선을 대상체에 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 “화합요법제”는, 비-암 세포에 대해 낮은 효과를 갖는 반면, 암 세포를 죽이거나 암 세포의 성장을 억제하는, 효소가 아닌, 합성, 생물학적, 또는 반-합성 화합물을 지칭한다. 임의의 적절한 화학요법제가 사용될 수 있다.
적절한 화학요법제는 안트라사이클린, 탁센, 키나제 억제제, 항체, 플루오로피리미딘, 백금 약물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 및 이다루비신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 탁센은, 도세탁셀 및 파클리탁셀을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 키나제 억제제는 라파티닙, 이마티닙, 메실레이트, 및 제네피티닙을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 항체는 알렘투주맙, 젬투주맙 오조가미신, 리툭시맙, 트라스투주맙, 및 이브리투모맙 티욱세탄을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 플루오로피리미딘은 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 테가푸르, 테가푸르-우라실, 플록스우리딘, 5-플루오로디옥시우리딘 및 S-1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 백금 약물은 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 및 네다플라틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가적인 적절한 화학요법제는 알킬화제(예로서, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜펠란, 클로람부실, 티오테파, 헥사메틸멜라민, 부설판, 카무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 디카바진, 에스트라무스틴, 스트렙토조신, 및 템졸로미드), 빈카 알칼로이드(예로서, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈), 포도필로톡신(예로서, 에토포시드 및 테니포시드), 항생제(예로서, 블레오마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 및 발루비크린), 및 캄토테신 유사체(예로서, 이리노테칸 또는 토포테칸)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 화학요법제는 트라스투주맙(Herceptin®) 및 라파티닙(Tykerb®)으로부터 선택되는 항-HER2 화학요법제이다. 트라스투주맙은 암 세포 상의 HER2/neu 수용체를 타켓팅하는 단클론성 항체다. 라파티닙은 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 HER2를 타겟팅하는 티로신 키나제 억제제이다.
본원에 사용된 용어 “면역요법제”는 대상체에서 면역반응을 유도하거나 향상시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 암의 맥락에서, 면역요법제는 면역계를 자극하여 더 효과적으로 암성 세포를 타겟팅한다. 적절한 면역요법제는 면역 관문 억제제, 인터페론, 및 종양 백신으로부터 선택될 수 있다.
면역 관문 억제제는 면역 관문 진행을 억제하는 화합물이다. 예시적인 면역 관문 억제제는 PD-1 억제제(예로서, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙), PD-L1 억제제(예로서, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 더발루맙), 및 CTLA-4 억제제(예로서, 이필리무맙)을 포함한다.
인터페론(“IFN”)은 타겟 세포에 대한 직접적인 효과 또는 면역 반응의 활성화에 의해 질환에 대항해 보호하는 사이토카인 패밀리이다. IFN은 종양 세포 및 면역 세포 모두에 의해 생산되고, 이들에 작용할 수 있다. I형 IFN은 IFNα 단백질, IFNβ, IFNε, IFNκ, 및 IFNω을 포함한다. I형 IFN은 여러 악성종양에 대항하는 항-신생물 효과를 매개하는 것으로 알려져 있다(문헌[Moschos et al., Interferons in the Treatment of Solid Tumors,” Cancer Treat. Res. 126:207-241 (2005)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
본원에 사용된 용어 “종양 백신”은, 대상체에서 종양 또는 암 세포에 대항하여 면역 반응을 자극시키는 조성물을 지칭한다. 종양 백신은 일반적으로, 다른 구성요소(예로서, 어쥬번트)와 함께 항원에 대항하여 면역 반응을 더 자극하거나 촉진시키기 위해, 대상체와 자가(autologous)(자신으로부터) 또는 동종이계(allogenic)(다른 것으로부터)인 암-연관 물질 또는 세포(항원)의 소스(source)로 구성된다. 종양 백신은, 하나 또는 여러 특이적 항원에 대한 항체를 생산하기 위해 및/또는 킬러 T 세포를 생산하여 이들 항원을 갖는 암 세포를 공격하기 위해, 대상체의 면역계를 자극시키는 것을 야기할 수 있다.
본원에 사용된 용어 “에피제네틱 작용제”는 해당 작용제가 투여되거나 접촉될 때 또는 그 이후에, 세포의 DNA의 후성유전적 상태(epigenetic state)(예로서, 메틸화 상태)를 변형시키는 작용제를 지칭한다.
적절한 에피제네틱 작용제는, 예로서, 히스톤 디아세틸라제(“HDAC”) 억제제, 5-아자시티딘, 레티노산, 삼산화 비소, 인핸서 오브 제스트 2 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(“EZH2”) 억제제, 브로모도메인(“BRD”) 억제제, 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
예시적인 HDAC 억제제는 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 벤자미드, 페닐부티레이트, 발프로산, 보리노스타트, 벨리노스타트, LAQ824, 파노비노스타트, 엔티노스타트, CI994, 및 모세티노스타트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 EZH2 억제제는 3-디아자네플라노신 A(DZNep), EPZ005687, GSK126, EI1, UNC1999, 및 EPZ-6438을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(문헌[Kim et al., “Targeting EZH2 in Cancer,” Nat. Med. 22(2):128-134 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
예시적인 브로모도메인 억제제는 JQ1, I-BET151/762, PF-1, 및 RVX-208을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(문헌[Wadhwa et al., “Bromodomain Inhibitor Review: Bromodomain 및 Extra-terminal Family Protein Inhibitors as a Potential New Therapy in Central Nervous System Tumors,” Cureus 8(5):e620 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
추가적인 예시적인 에피제네틱 작용제는, 아자시티딘 및 데시타빈을 비롯한 DNA 메틸 트랜스퍼라제(DNMT) 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
DCC/DTC 미세환경은 휴지기의 향상에 중요한 역할을 한다. 핵 수용체 서브패밀리 2 그룹 F 멤버 1(Nuclear Receptor Subfamily 2 Group F Member 1)(NR2F1)는 핵 호르몬 수용체 및 전사 조절인자로, 종양 세포 휴지기 시그니쳐(tunor cell dormancy signature)를 구성하는 전사인자 네트워크의 중요한 노드(node)이다. 에스트로젠 수용체-양성(ER+) 유방암 환자의 유전자 발현 프로파일에 적용할 때, 이 시그니쳐는 더 긴 무-전이 기간을 예측하는 것으로 알려져 있다(문헌[Kim et al., “Dormancy Signatures and Metastasis in Estrogen Receptor Positive and Negative Breast Cancer,” PloS One 7:e35569 (2012)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 이 휴지기 시그니쳐는, 7 내지 18 년 동안 무증상이었던 전립선암 환자의 휴지 DTC에서도 또한 발견되었고(문헌[Sosa et al., “NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy via SOX9- and RARbeta-Driven Quiescence Programmes,” Nat. Commun. 6:6170 (2015) and Chery et al., “Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways,” Oncotarget 5:9939-51 (2014)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 이는 인간 질환에 대한 이의 관련성을 강조한다.
NR2F1은 두경부 편평세포암종 세포(HNSCC) 환자-유래 제노그래프트(xenograft)(PDX) 모델에서, 종양 수술 후 국소 및 원격 잔존 암 세포의 휴지기를 상향조절하고 유도하는 것으로 알려져 있다(문헌[Sosa, “Dormancy Programs as Emerging Antimetastasis Therapeutic Alternatives,” Mol. Cell. Oncol. 3(1):e1029062 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). NR2F1 발현의 가소성은, 잔류 종양 세포의 후성유전체(epigenome)의 변화가 외부 및 내부 신호에 의해 조절될 수 있고, DCC의 운명을 지시할 수 있다는 것을 시사한다. NR2F1은, 아마도 염색질 재프로그램화를 조절함으로써, 유도 만능 줄기세포(iPS) 재프로그램화를 제한하는 것으로 알려져 있다(문헌[Onder et al., “Chromatin Modifying Enzymes as Modulators of Reprogramming,” Nature 483(7391):598-602 (2012)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). NR2F1은, 그 자신의 프로모터를 비롯한 특정 휴지기 유전자의 프로모터에서 활성 염색질 상태를 가능하게 하는 반면, 동시에 휴지 종양 세포에서 전반적으로 억제된 염색질을 유지하는 데에도 중요하며(문헌[Sosa et al., “NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy via SOX9- and RARbeta-Driven Quiescence Programmes,” Nat. Commun. 6:6170 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 이는 NR2F1에 의해 조절되는 조직된 후성유전적 프로그램 및 종양 세포를 휴지기로 유도하는 미세환경 신호의 존재를 강조한다. 일 실시태양에서, DTC는 NR2F1+이다.
DCC는 높은 수준의 PERK 경로 활성화를 발현하는 것으로 알려져 있고(문헌[Bragado et al., “Microenvironments Dictating Tumor Cell Dormancy,” Recent Results Cancer Res. 195:25-39 (2012); Sosa et al., “Regulation of Tumor Cell Dormancy by Tissue Microenvironments and Autophagy,” Adv. Exp. Med. Biol. 734:73-89 (2013); Goswami et al., “The Phosphoinositide 3-Kinase/Akt1/Par-4 Axis: A Cancer-Selective Therapeutic Target,” Cancer Res. 66(6):2889-92 (2006); 및 Schewe et al., “ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells in vivo,” PNAS 105(30):10519-24 (2008)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 이는 ISR의 매개인자이다. PERK 및 EIF2α 인산화를 통한 ISR 신호전달은, 종양 세포 생존에 도움이 될 수 있는, 유전자 특이적 번역, 산화 스트레스 및 ROS 생산, 단백질 분해, RNA 분해, 오토파지(autophage), 및 지질 생합성뿐만 아니라, 일반 번역의 감소를 야기한다.
또 다른 측면은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법과 관련되고, 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 LY2, LY3, 및 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK) 억제제로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체에서 DCC를 제거한다.
일 실시태양에서, DCC는 포스포-PERK 활성을 갖는다. 따라서, 방법은 대상체에서 DCC를 PERK 억제제, MEK 억제제, CDK4/6 억제제, 또는 이의 임의의 조합으로 접촉시키는 것을 더 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법의 일 실시태양에 따르면, 접촉시키는 것은 대상체에 PERK 억제제를 투여하는 것에 의해 수행될 수 있다.
일 실시태양에서, PERK 억제제는 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고,
Figure pct00011
여기서, R은
Figure pct00012
및
Figure pct00013
으로 구성되는 그룹으로부터 선택되고;
X는 CH 또는 N이고;
R1은 수소 또는 할로젠(예로서, 플로오로)이고; 및
R2는 C1 내지 C3 알킬이다.
추가적인 실시태양에서, PERK 억제제는 화학식(Ia)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고,
Figure pct00014
여기서, R는
Figure pct00015
및
Figure pct00016
로 구성되는 그룹으로부터 선택되고;
X는 CH 또는 N이고;
R1은 수소 또는 할로젠(예로서, 플루오로)이고; 및
R2는 C1 내지 C3 알킬이다.
억제제가 화학식(I) 또는 화학식(Ia)의 화합물일 때, R은
Figure pct00017
또는
Figure pct00018
일 수 있다.
본원에 사용된 용어 “알킬”은, 체인 내 약 1 내지 약 6 개의 탄소 원자 또는 1 내지 약 3 개의 탄소 원자를 갖는(또는 탄소의 수는 “Cn-Cn”으로 표기되고, 여기서 n은 탄소 원자의 수적 범위임) 선형 또는 분지형일 수 있는, 지방족 탄화수소 그룹이다. 분지형은 하나 이상의 저급 알킬 그룹, 예컨대 메틸, 에틸, 또는 프로필이 선형 알킬 체인에 부착된 것을 의미한다. 예시적인 알킬 그룹은 메틸, 에틸, n-프로필, 및 i-프로필을 포함한다.
용어 “할로젠”은 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 아이오도를 의미한다. 일 실시태양에서, 할로젠은 플루오로이다.
용어 “화합물(들)” 및 동등한 표현은 본 발명의 화합물을 의미하고, 맥락 상 허용되는 경우, 이 표현은 전구약물, 약학적으로 허용가능한 염, 산화물, 및 용매화물, 예로서, 수화물을 포함한다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 및 다른 입체 이성질체 형태가 될 수 있다. 각 카이랄 중심은 절대적 입체화학(absolute stereochemistry)의 관점에서, (R)- 또는 (S)-와 같이, 정의될 수 있다. 본 발명은 라세믹 및 광학적으로 순수한 형태를 비롯한 이의 혼합물뿐만 아니라, 이러한 모든 가능한 이성질체를 포함하는 것으로 의도된다. 광학적으로 활성이 있는 (R)- 및 (S)-, (-)- 및 (+)-, 또는 (D)- 및 (L)- 이성질체는 카이랄 신톤(chiral synthon) 또는 카이랄 시약(chiral reagent)을 통해 제조될 수 있거나, 기존의 기술을 이용하여 해결될 수 있다. 모든 토토머 형태 또한 포함되는 것으로 의도된다.
“화합물”에 대한 언급은, 그 화합물의 임의의 이러한 형태와 임의의 비율의 임의의 입체 이성질체 형태, 또는 혼합물뿐만 아니라, 그 화합물의 염, 용매화물, 산화물, 및 포접 착물을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 일부 실시태양에 따르면, 본 발명의 화합물은, 약학적 조성물, 치료 방법, 및 화합물 그 자체의 맥락을 비롯하여, 염 형태로 제공된다.
용어 “용매화물”은, 적절한 용매 분자가 결정 격자(crystal lattice)로 혼입되는 고체 상태의 화합물을 지칭한다. 치료적 투여를 위한 적절한 용매는, 투여된 투여량에서 생리학적으로 내성(physiologically tolerable)이 있다. 치료적 투여를 위한 적절한 용매의 예시는 에탄올 및 물이다. 일반적으로, 용매화물은 화합물을 적절한 용매에 용해시키고, 냉각하거나 반용매(antisolvent)를 사용하여 용매화물을 단리함으로써 형성된다. 용매화물은 일반적으로 주변 조건하에서 건조되거나 공비된다.
포접 착물은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. 1:176-177 (1995)]에 기술되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 가장 흔하게 이용되는 포접 착물은 사이클로덱스트린을 갖는 것이고, 천연 및 합성의 사이클로덱스트린 착물 모두가 본 발명에 의해 구체적으로 포함된다.
용어 “약학적으로 허용가능한 염”은, 무기 산 및 염기 및 유기 산 및 염기를 비롯한, 약학적으로 허용가능한 비-독성 산 또는 염기로부터 제조된 염을 지칭한다.
용어 “약학적으로 허용가능한”은, 철저한 의학적 판단의 범위 내에서, 인간 및 하등 동물의 세포와의 접촉을 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등 없이 사용하는 데 적합한 것을 의미하고, 합리적인 이익/위험 비율에 적합하다.
적절한 PERK 억제제는 LY2, LY3, LY4 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다(아래 표 4를 참조). PERK 억제제는, LY2, LY3, 및/또는 LY4의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
표 4. 예시적인 PERK 억제제
Figure pct00019
일부 실시태양에서, 접촉은 EIF2AK1, EIF2AK2, 또는 EIF2AK4를 억제하지 않는 PERK 억제제로 수행된다.
일 실시태양에서, PERK 억제제는 AXL을 억제하지 않는다. 이 실시태양에 따르면, PERK 억제제는 LY3 및 LY4로부터 선택된다.
또 다른 실시태양에서, PERK 억제제는 Flt3, MNK2, 또는 NTRK를 억제하지 않는다. 이 실시태양에 따르면, PERK 억제제는 LY4이다.
일 실시태양에서, 접촉은 MEK 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행된다. 예시적인 MEK 억제제는 기술분야 내에 잘 알려져 있고, 예를 들어, PD184352, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119/BAY 869766을 포함한다(예로서, 다음을 참조, 문헌[Iverson et al., “RDEA119/BAY 869766: A Potent, Selective, Allosteric Inhibitor of MEK1/2 for the Treatment of Cancer,” Cancer Res. 69(17):6839-47 (2009)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
또 다른 실시태양에서, 접촉은 CDK4/6 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행된다. 예시적인 CDK4/6 억제제는 기술분야 내에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 아베마시클립(LY2835219), 팔보시클립(PD0332991), 및 리보시클립(LEE011)을 포함한다.
일 실시태양에서, 방법은 상기 접촉 이전에, 질환의 증거가 없는 대상체를 선택하는 것을 더 포함한다. 예를 들어, 대상체는 상기 접촉 이전에 암 관해 상태에 있을 수 있다.
본 발명의 방법을 수행함에 있어, 미세 잔존 암은 대상체에서 치료된다. 이러한 치료는 미세 잔존 암의 치료를 필요로 하는 대상체에, 대상체를 치료하기 위해 병태(즉, 암, 또는 미세 잔존 암)에 효과적인 하나 이상의 화합물을 투여하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 본 발명의 치료 방법은, 파종성 종양 세포(“DTC”)의 휴지기를 유도하는 데 및/또는 휴지 DTC 사멸을 유도하는 데 효과적인 조건에서 수행된다.
본 발명의 치료 방법을 수행하는 데 있어, 대상체로의 화합물 투여는 치료적 유효량의 화합물을 함유하는 약학적 조성물(즉, 본 발명의 BMP7 유도 단백질 및 PERK 억제제)을 투여하는 것을 포함하고, 이는 대상체에서 언급된 병태 및/또는 장애를 치료하는 데 효과적인 화합물의 양을 의미한다. 이러한 양은 일반적으로, 기술분야 내 통상의 기술자의 범위 내에 있는 다양한 요인에 의해 달라진다. 이들은 대상체의 연령, 무게, 키, 일반 신체적 상태, 및 의학적 병력뿐만 아니라 특정 대상체, 조제된 담체, 이를 위해 선택된 투여 경로뿐만 아니라, 사용된 특정 화합물; 치료 기간; 및 치료될 상태의 특성 및 심각성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
투여는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 투여 형태를 투여하는 것을 포함하고, 이는 본 발명의 화합물의 투여 형태를 의미하며, 예를 들어, 리포좀 제제를 비롯한 주사를 위한 액제뿐만 아니라, 정제, 당제, 산제, 엘릭서제, 시럽제, 현탁제를 비롯한 액제, 분무제, 흡입제, 정제, 로젠지, 유제, 용액, 과립제, 캡슐제, 및 좌제를 포함한다. 기술 및 제형는 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition]에서 확인할 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
본 발명의 치료 방법을 수행함에 있어, 약물(즉, 본 발명의 BMP7 유도 단백질 및 PERK 억제제)은 임의의 적절한 양으로, 임의의 적절한 담체 물질에 함유될 수 있다. 약물은 조성물의 전체 중량에 대해, 99 중량% 까지의 양으로 존재할 수 있다. 조성물은 경구, 비경구(예로서, 정맥내, 근육내), 직장, 피부, 비강, 질, 흡입, 피부(패치), 또는 안구 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 조성물은, 예로서, 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 용액, 하이드로겔을 비롯한 겔제, 페이스트제, 연고제, 크림제, 반창고류, 드렌치(drenches), 삼투성 전달 장치(osmotic delivery device), 좌제, 관장제, 임플란트, 분무제, 에어로졸의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 투여 직후 또는 투여 후 임의의 사전결정된 시점 또는 기간에, 활성 약물을 상당히 분비하도록 조제될 수 있다. 제어 방출 제형(controlled release formulation)은 (i) 장기간에 걸쳐 체내에서 상당히 일정한 약물(들)의 농도를 형성하는 제형; (ii) 사전결정된 지연 시간 이후, 장기간에 걸쳐 체내에서 상당히 일정한 약물(들)의 농도를 형성하는 제형; (iii) 활성 약물 물질의 혈장 수준의 변동과 연관된 바람직하지 않은 부작용의 최소화와 함께, 체내에서 상대적으로 일정하고 효과적인 약물 수준을 유지함으로써, 사전결정된 기간 동안 약물(들) 작용을 유지하는 제형; (iv) 예로서, 병든 세포(들), 조직(들), 또는 기관(들)에 인접한 곳 또는 그 안에 제어 방출 조성물을 공간적으로 배치함으로써, 약물(들) 작용을 국소화하는 제형; (v) 약물을 특정 타겟 세포 타입에 전달하기 위해 담체 또는 화학적 유도체를 사용함으로써, 약물(들) 작용을 타겟팅하는 제형을 포함한다.
제어 방출 제형의 형태로의 약물의 투여는 약물이 (i) 좁은 치료 지수(therapeutic index)(즉, 해로운 부작용 또는 독성 반응을 유도하는 혈장 농도 및 치료 효과를 유도하는 혈장 농도 사이의 차이가 작은 경우; 일반적으로 치료 지수(TI)는 치사 용량 중앙값(LD50)과 유효 용량 중앙값(ED50)의 비율로 정의됨), (ii) 위장관 내 좁은 흡수 윈도우(absorption window); 또는 (iii) 혈장 수준을 치료 수준으로 유지하기 위해 하루 동안 빈번한 투여가 필요한, 매우 짧은 생물학적 반감기를 갖는 경우, 바람직할 수 있다.
문제가 되는 약물의 방출 속도가 대사 속도를 능가하는 제어 방출을 얻기 위해, 여러 전략 중 하나가 추구될 수 있다. 제어 방출은, 예로서 다양한 타입의 제어 방출 조성물 및 코팅제를 비롯한, 다양한 제형 파라미터 및 성분의 적절한 선택에 의해 얻어질 수 있다. 따라서, 약물은 적절한 부형제와 함께 약학적 조성물로 조제될 수 있고, 투여될 때, 약물의 방출은 제어되는 방식으로 방출된다(단일 또는 다중 유닛 정제 또는 캡슐제 조성물, 오일 용액, 현탁제, 유제, 마이크로캡슐제, 마이크로스피어, 나노입자, 패치, 및 리포좀).
따라서 본 발명의 방법에 따른 투여는 경구로, 국소적으로, 경피로, 비경구로, 피하로, 정맥내로, 근육내로, 복강내로, 비강내 점적으로, 강내 또는 방광내 점적으로, 안구내로, 동맥내로, 병변내로, 또는 점막 도포로 수행될 수 있다. 화합물은 단독으로 또는 적절한 약학적 담체와 함께 투여될 수 있고, 고체 또는 액체 형태, 예컨대 정제, 캡슐제, 산제, 용액, 현탁제, 또는 유제일 수 있다.
약물(즉, 본 발명의 BMP7 유도 단백질 및 PERK 억제제)은 경구로, 예를 들어 불활성 희석제, 또는 소화가능한 식용 정제와 함께 투여될 수 있거나, 경질 또는 연질 갭슐에 동봉될 수 있거나, 식사 음식에 직접 혼입될 수 있다. 치료적 경구 투여를 위해, 약물은 부형제와 혼입될 수 있고, 정제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 0.001%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 이런 조성물 내 화합물의 백분율은, 물론, 변할 수 있고, 간편히 유닛 중량의 약 0.01% 내지 약 10% 사이일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 내 활성 화합물의 양은 적절한 용량이 얻어질 수 있도록 한다. 일 실시태양에서, 조성물은, 경구 투여 유닛(oral dosage unit)이 약 1 μg 및 1 g 사이의 활성 화합물을 함유하도록 제조된다.
정제, 캡슐제 등은 또한 바인더, 예컨대 검 트라가칸트(tragacanth), 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 제2 인산 칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산; 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘; 및 감미제, 예컨대 수크로오스, 락토오스, 또는 사카린을 함유할 수 있다. 투여 유닛 형태가 캡슐제일 때, 이는 상기 타입의 재료에 더해, 액체 담체, 예컨대 기름유를 함유할 수 있다.
다른 다양한 재료가 코팅제로서 또는 투여 유닛의 물리적 형태를 변형하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제는 셸락(shellac), 당, 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽제는 유효 성분에 더해, 감미제인 수크로오스, 보존제인 메틸 및 프로필파라벤, 염료, 및 향료, 예컨대 체리 또는 오렌지 향을 함유할 수 있다.
치료제는 또한 비경구로 투여될 수 있다. 용액 또는 현탁제는 물에서 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로오스와 적절히 혼합되어 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 오일 중 이의 혼합물에서도 제조될 수 있다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 유래의 오일, 예를 들어, 피넛 오일, 대두유, 또는 미네랄 오일이다. 일반적으로, 물, 염수, 수용성 덱스트로오스, 및 관련된 당 용액, 및 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 하이알루로난 및 이의 유도체, 카복시메틸 셀룰로오스, 및 다른 수용성 다당류 유도체, 또는 폴리에틸렌 글리콜은, 특히 주사가능한 용액을 위해 바람직한 액체 담체이다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는, 무균적으로 생산되지 않은 경우, 미생물의 성장을 예방하기 위해 보존제를 함유한다.
주사가능한 용도에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산제 및 이들의 즉석 제조를 위한 멸균 산제를 포함한다. 형태는 멸균되어야 하고, 쉽게 주사가능할 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서 안정성이 있어야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균 오염에 대항하여 보호되어야 한다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올(예로서, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산제 매질일 수 있다.
치료제는 또한 에어로졸의 형태로 기도에 직접 투여될 수 있다. 에어로졸으로서의 용도를 위해, 용액 또는 현탁액 내 치료제는 가압된 에어로졸 컨테이너에 적절한 프로펠런트(propellant), 예를 들어 탄화수소 프로펠런트, 예컨대 프로판, 부탄, 또는 이소부탄과 함께, 종래의 어쥬번트와 함께 패키징될 수 있다. 치료제는 또한 비-가압된 형태, 예컨대 네뷸라이저(nebulizer) 또는 아토마이저(atomizer)로 투여될 수 있다.
일 실시태양에서, 투여는 대상체에서 검출가능한 휴지 DCC의 양을, 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 증가시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 투여는 대상체에서 검출가능한 DCC의 양을 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 감소시킬 수 있다.
본 발명의 맥락 내에서, “치료”는 대상체에서 증상이 있는 질환(예로서, 암)의 증거가 없는 상태의 유지를 의미한다.
일 실시태양에서, 용어 “치료하는” 또는 “치료”는, 특히 대상체에서의 미세 잔존 암의 제거를 가리킨다. 용어 치료는 DCC에서의 휴지기 유도를 포함한다. 용어 치료는 또한 대상체에서의 휴지 DCC의 제거를 포함한다. 용어 치료는 또한 대상체에서의 검출가능한 휴지 DCC의 양 또는 수의 감소를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를, LY2, LY3, 및 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK) 억제제로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해, 대상체에서 DCC를 제거한다.
상기에 기술된 것처럼, 본 발명의 방법은, 유방암, 다발성 골수종, 폐암, 비소세포폐암, 뇌종양, 자궁경부암, 맨틀 세포 림프종, 백혈병, 간세포암종, 전립선암, 흑색종, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경모세포종, 대장직장암, 및 다른 암 중 임의의 하나 이상으로 진단된 대상체에서, 미세 잔존 암을 치료하는 데 적합하다.
암은 침윤성 유방암, 유관상피내암(DCIS), 소엽상피내압(LCIS), 및 염증성 유방암으로부터 선택되는 유방암일 수 있다.
일 실시태양에서, 유방암은 HER2+ 유방암이다.
또 다른 실시태양에서, 대상체는 파종성 종양 세포 및/또는 비-전이성 암으로 진단된다.
상기에 기술된 것처럼, 본 발명의 방법은, 화학요법제, 면역요법제, 에피제네틱 작용제, 또는 이온화 방사선을 대상체에 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
화학요법제가 대상체에 투여될 때, 화학요법제는 트라스투주맙(Herceptin®) 및 라파티닙(Tykerb®)으로부터 선택되는 항-HER2 화학요법제일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 화학요법제는 안트라사이클린, 탁센, 키나제 억제제, 항체, 플루오로피리미딘, 및 백금 약물로부터 선택될 수 있다.
면역요법제가 대상체에 투여될 때, 면역요법제는 면역 관문 억제제, 인터페론, 또는 종양 백신으로부터 선택된다.
에피제네틱 작용제가 대상체에 투여될 때, 에피제네틱 작용제는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 5-아자시티딘, 레티노산, 삼산화 비소, 인핸서 오브 제스트 2 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(“EZH2”) 억제제, 브로모도메인(BRD) 억제제, 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
접촉은 ERPK 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행될 수 있다. 적절한 PERK 억제제는 상기에 자세히 기술되었으며, LY2, LY3, 및 LY4를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 방법은, 상기 접촉 이전에, 대상체에서 DTC의 존재를 검출하는 것을 더 포함한다. 상기에 더 자세히 기술된 것처럼, DTC는 NR2F1+, 포스포-PERK 활성, 및/또는 BMPR+일 수 있다.
방법은, 대상체에서 DCC/DTC를 BMP7 유도 단백질로 접촉시키는 것을 더 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 대상체에서 DCC/DTC를 BMP7 유도 단백질로 접촉시키는 것은, BMP7 유도 단백질을 대상체로 투여하는 것에 의해 수행된다. 적절한 BMP7 유도 단백질은 상기에 기술되어 있다. 일 실시태양에서, BMP7 유도 단백질은 BMP7-F9이다.
일 실시태양에서, PERK 억제제는 EIF2AK1, EIF2AK2, 또는 EIF2AK4를 억제하지 않는다.
상기에 기술된 것처럼, 대상체는 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다.
일 실시태양에서, 방법은 상기 접촉 이전에, 질환의 증거가 없는 대상체를 선택하는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 상기 접촉 이전에, 암 관해 상태에 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 후기 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 LY2, LY3, 또는 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK) 억제제로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체에서 DTC를 제거한다.
본원에 사용된 용어 “후기 암”은 II기 암, III기 암, 및/또는 IV기 암, 또는 임의의 전이된 암을 지칭한다. 암 질환 상태의 “후기” 특성은 의사에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
상기에 자세히 기술된 것처럼, 대상체는 유방암, 다발성 골수종, 폐암, 비소세포폐암, 뇌종양, 자궁경부암, 맨틀 세포 림프종, 백혈병, 간세포암종, 전립선암, 흑색종, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경모세포종, 또는 대장직장암으로 진단될 수 있다.
일 실시태양에서, 암은 침윤성 유방암, 유관상피내암(DCIS), 소엽상피내암(LCIS), 및 염증성 유방암으로부터 선택되는 유방암일 수 있다. 유방암은 HER2+ 유방암일 수 있다.
방법은 화학요법제, 면역요법제, 에피제네틱 작용제, 또는 이온화 방사선을 대상체에 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 화학요법제는 트라스투주맙(Herceptin®) 및 라파티닙(Tykerb®)로부터 선택되는 항-HER2 화학요법제이다. 또 다른 실시태양에서, 화학요법제는 안트라사이클린, 탁센, 키나제 억제제, 항체, 플루오로피리미딘, 및 백금 약물로부터 선택된다. 면역요법제는 면역 관문 억제제, 인터페론, 또는 종양 백신으로부터 선택될 수 있다. 에피제네틱 작용제는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 5-아자시티딘, 레티노산, 삼산화 비소, 인핸서 오브 제스트 2 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(“EZH2”) 억제제, 브로모도메인(BRD) 억제제, 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
일 실시태양에서, 접촉은 ERPK 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행될 수 있다.
방법은, 상기 접촉 이전에, 대상체에서 DCC/DTC의 존재를 검출하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기에 기술된 것처럼, DTC는 NR2F1+이거나 포스포-PERK 활성을 가질 수 있다.
실시예
실시예 1 - 실시예 2 내지 6에 대한 재료 및 방법
시약, 세포 배양, 및 처치: EGF는 펩프로테크(PepproTech)(로키 힐(Rocky Hill), NJ)로부터 얻었고, 100 ng/ml로 사용하였다. 타프시가진(Thapsigargin)은 시그마(Sigma)(세인트루이스(St. Louis), MO)로부터 얻었고, 2 nM로 사용하였다. ZR75.1-H2B-Dendra2 세포주를 H2B-Dendra2 플라스미드의 안정적인 형질주입으로 생성하였다(문헌[Gurskaya et al., “Engineering of a Monomeric Green-to-Red Photoactivatable Fluorescent Protein Induced by Blue Light,” Nat. Biotechnol. 24:461-465 (2006)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 3D 배양을 위해, 이전에 기술된 것처럼, MCF10A-HER2, SKBR3, 및 ZR75.1-H2B-Dendra2 세포를 성장 인자가 감소된 메트리젤(코닝(Corning), 코닝, NY)에 플레이팅하고 성장시켰다(문헌[Avivar-Valderas et al., “Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK,” Oncogene 32(41):4932-40 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). "저밀도"를 지칭할 때, 3,500개의 세포/8-웰을 시딩한 것이고, "고밀도"에 대해서는 20,000개의 세포/8-웰이다. 2D에 대해선 매 24 시간 마다, 3D에 대해선 매 48 시간 마다, 비히클(DMSO) 또는 LY4(2 μM)로의 처치를 대체하였다.
마우스, 종양 성장, 및 조직 가공: FBV/N-Tg(MMTVneu) 마우스 스트레인을 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratories)(사크라멘토(Sacramento), CA)로부터 얻었다. 이들 마우스는, 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터/인핸서의 전사 조절 하에서, 비-활성화된 neu(HER2)를 발현한다. 임의의 실험에 사용하기 전에, 암컷을 한 차례의 임신 및 이유(weaning) 후 수유(lactation)를 하지 않는 적어도 2 주의 기간을 겪게 하였다. 24 내지 32 주 령의 암컷에, 비히클(90 % 옥수수 오일, 10 % 에탄올) 또는 LY4(50 mpk)을 매일, 2 주 간 복강내 주사하였다. 병용 처치를 위해, 앞서 기술한 LY4로의 처치를 시작하기 전에, 24 내지 32 주 령의 암컷에 아메바시클립(50 mpk)을 경구 위관영양법으로 4 주 간 매일 처치하였다. 종양 부피는 공식 (Dxd2)/2를 사용하여 측정하였으며, 여기서 D는 장축 반지름이고 d는 단축 반지름이다. CTC 카운트를 위해, 동물을 마취하고 심장천자를 통해 전혈을 추출하였다. 유선, 폐, 및 종양을 수집하고, 파라핀에 임베딩하기 전에 10% 완충 포르말린으로 밤새 고정하였다. 두 하지로부터의 골수를 26 G 바늘로 플러싱하였고, 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리를 통해 추가적으로 가공하였다. 골수에서의 DTC 검출뿐만 아니라 CTC 검출을 위해, 4 ℃에서 20 분 간 포르말린으로 고정하기 전에, 항-마우스 항체로 라벨링된 마그네틱 비드 분리(anti-mouse antibody-labeled magnetic bead separation)(밀텐이 바이오텍(Miltenyi Biotec), 샌디애고(San Diego), CA)를 통해 조직에서 성숙 조혈모세포를 제거하였다.
유선 홀 마운트 염색: 10% 완충 포르말린에서 고정된 유선을 카민 알룸 염색(Carmine Alum stain)(0.2%의 카민, 0.5%의 황산 알루미늄 칼륨)(시그마, 세인트 루이스, MO)에 2 일 간 인큐베이션하였다. 이후, 입체현미경을 사용하여 이미징하기 전에, 이를 탈수시키고 살리실산 메틸 용액으로 옮겼다.
IHC 및 IF: 파라핀에 임베딩된 절편으로부터의 IHC 및 IF를, 이전에 기술된 것처럼 수행하였다(문헌[Avivar-Valderas et al., “Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK,” Oncogene 32(41):4932-40 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 간략하게, 슬라이드를 탈랍하고, 순차적으로 재수화시켰다. 시트레이트 완충액(10 mM, pH 6), EDTA 완충액(1 mM, pH 8), 또는 Tris/EDTA(pH 9) 중 하나에서, 열-유도 항원 회복(Heat-induced antigen retrieval)을 수행하였다. 슬라이드를 0.1% TritonTM-X100에서 더 투과화하고, 블록킹하고, 4 ℃에서 1:50 내지 1:200으로 희석한 일차 항체로 밤새 인큐베이션하였다. IHC를 위해, 일차 항체 인큐베이션 전에, 추가적인 단계인 내재 퍼옥시다제 및 아비딘/비오틴 퀀칭(quenching)을 수행하였다. 사용된 일차 항체는 항-사이토케라틴 8/18(프로젠(Progen), 하이델베르크(Heidelberg), 독일), 평활근 액틴-Cy3(시그마, 세인트 루이스, MO), P-PERK(T980)(문헌[Tenkerian et al., “mTORC2 Balances AKT Activation and eIF2alpha Serine 51 Phosphorylation to Promote Survival Under Stress,” Mol. Cancer Res. 13:1377-1388 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), P-EIF2A, 절단된 카스파제 3, P-H3(S10), P-HER2(Y1221/1222)(셀 시그널링, 댄버스, MA), P-Rb(S249/T252)(산타 크루즈(Santa Cruz), 달라스(Dallas), TX), HER2(압캄(Abcam), 캠브릿지(Cambridge), MA), HER2(밀리포아(Millipore), 다름슈타트(Darmstadt), 독일), Ki67(이바이오사이언스(eBioscience) 및 압캄), 사이토케라틴 칵테일(C11 및 ck7, 압캄; AE1 및 AE3, 밀리포아), 및 GADD34(산타 크루즈)이었다. 다음으로, 슬라이드를 이차 항체(라이프 테크놀로지(Life Technologies), 노워크(Norwalk), CT)에 인큐베이션하고, 마운팅하였다. IHC를 위해, 절편을 벡타스테인 ABC 엘라이트 키트(VectaStain ABC Elite kit)(벡터 래보러토리(Vector Laboratories), 벌링게임(Bulingame), CA) 및 퍼옥시다제 라벨링을 위한 DAB 기질 키트(DAB Substrate kit)을 이용하여 가공하였고, 벡타마운트(VectaMount) 매질(벡터 레보러토리)을 이용하여 마운팅하였다. IF를 위해, 절편을 프로롱 골드 안티페이드(ProLong Gold Antifade) 수용성 미디아(써모 피셔, 월섬, MA)로 마운팅하였다.
면역세포형광의 경우, 고정된 세포에 대한 사이토스핀(100,000 내지 200,000 개의 세포/사이토스핀)을, 폴리-프렙(poly-prep) 슬라이드 상에서, 500 rpm에서 3 분 간의 세포-원심분리(cyto-centrifugation)를 통해 준비하였고, 투과성 이후부터는 아래 설명된 것처럼 염색 프로토콜을 수행하였다. 3D 배양의 염색을 위해, 면역형광 염색 수행 전, 선포를 4%의 PFA에서 20 분 간 4 ℃에서 고정하고, PBS 중 0.5%의 TritonTM-X100로 20 분 간 실온에서 투과화하고, PBS-글리신으로 세척하고, 이후 10 % 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 1 시간 동안 37 ℃에서 블로킹하였다.
P-HER2 수준에 대한 스코어링는 도 10A에 설명되어 있다. 유관 내 CK8/18 및 SMA에 대한 점수를 매기기 위해, 동물마다 20의 저배율 시야에서 CK8/18의 발현을 음성(0), 저(1), 또는 고(2)로 평가하였고, SMA에 대해서도 동일하게 평가하였으며, 두 스코어의 합을 최종 스코어(0 내지 4)로 고려하였다.
현미경: 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TS100 현미경, 레이카(Leica) DM5500 또는 공초점 레이카 SP5 다광자 현미경을 이용하여 이미지를 캡쳐하였다.
TUNEL 제자리 세포 사멸 검출: 제자리 세포 사멸 검출 키트(Cell Death Detection kit), AP(로셰(Roche), 바젤(Basel), 스위스)을 사용하여, 세포자멸사 수준을 평가하였다. 종양으로부터의 파라핀 절편을 탈랍하고, 재수화하고, 인산 완충 염수(phosphate buffered saline)(PBS) 0.2 % TRITONTM-X100에서 8 분 간 투과화하였다. 이후, 슬라이드를 세척하고, 20% 정상 염소 혈청으로 1 시간 동안 37 ℃에서 블로킹하였다. 이후 TUNEL 반응 혼합물을 첨가하고, 1 시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 반응을 완충액 I(0.3 M의 염화 나트륨, 30 mM의 시트르산 나트륨)로 인큐베이션함으로써 중단시켰다. 다음으로, 슬라이드를 항-형광-AP 항체로 30 분 간 37 ℃에서 인큐베이션하였다. Tris 완충 염수(TBS)로 세 차례 세척 후, 슬라이드를 0.1%의 TWEENTM-20 중 알칼린 포스파타제 기질에서 20 분 간 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 수용성 마운팅 미디아를 사용하여, 슬라이드를 마운팅하였다. 이미지 J 소프트웨어(NIH)를 이용하여, TUNEL 양성 세포의 백분율을 계산하였다.
면역블롯 분석: 이전에 기술된 것처럼, 세포를 RIPA 완충액에 용해하고, 면역블롯을 통해 단백질을 분석하였다(문헌[(Ranganathan et al., “Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,” Cancer Res. 66:1702-1711 (2006)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 다음의 추가적인 항체를 이용하여, 멤브레인을 블롯하였다: P-PERK(T982)(문헌[Tenkerian et al., “mTORC2 Balances AKT Activation and eIF2alpha Serine 51 Phosphorylation to Promote Survival Under Stress,” Mol. Cancer Res. 13:1377-1388 (2015), 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨]), PERK(산타 크루즈, 달라스, TX), P-EGFR(Y1148), EGFR, P-AKT(S473), P-S6(S235/236)(셀 시그널링, 댄버스, MA), GAPDH(밀리포아, 다름슈타트, 독일), 및 β-튜불린(압캄, 캠브릿지, MA). ER 스트레스의 유도를 위해, 수집 전, MCF10A-HER2 세포를 저 접착 플레이트에 24 시간 동안 플레이팅하였다.
세포 표면 비오티닐화 및 엔도사이토시스 어세이: 세포 표면 비오티닐화를 위해, 피어스(Pierce)의 세포 표면 단백질 단리 키트를, 약간 변형한 제조사 설명서에 따라 사용하였다. 간략하게, MCF10A-HER2 세포를 혈청- 및 EGF-결핍시켰고, +/- EGF(100 ng/ml)로 20' 동안 자극시키기 전에, +/- LY4를 24 시간 동안 처치하였다. 이후, 세포를 차가운(ice-cold) PBS로 세척하고, 표면 단백질을 30 분 간 4 ℃에서 비오티닐화 하였다. 퀀칭 후, 세포를 채취하고 RIPA 완충액을 사용하여 용해시켰다. 단백질 용해물을 NeutrAvidin 아가로오스 비드와 인큐베이션하고, DTT(50 mM)를 함유한 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 인큐베이션함으로써 결합된 단백질을 방출시켰다. 엔도사이토시스 어세이를 위해(문헌[Cihil et al., “The Cell-Based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins,” J. Vis. Exp. e50867 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 세포를 유사하게 처치하였으나, EGF 처치 전에 세포 표면 단백질을 비오티닐화하였다. 37 ℃에서 +/- EGF(100 ng/ml)와 20 분의 인큐베이션 후(엔토사이토시스를 유도하기 위함), 세포를 차가운 PBS로 세척하고 스트리핑 완충액(세포 표면 비오티닐화를 제거하기 위함: 75 mM의 NaCl, 1 mM의 MgCl2, 0.1 mM의 CaCl2, 50 mM의 글루타티온 및 80 mM의 NaOH, pH 8.6)으로 30' 동안 인큐베이션하였다. 스트리핑 효율을 조절하기 위해, 세포를 37 ℃의 인큐베이션 없이 스트리핑하였다(t=0). 이전에 기술된 것처럼, 세포 용해물을 준비하고, 비오티닐화 단백질 단리를 위해 가공하였다.
단일 세포 타겟 유전자 발현 분석: 28 내지 30 주 령의 암컷 MMTV-neu로부터의 원발 종양을 콜라게나제를 통해 단일 세포 현탁액으로 분해하였다. 15 내지 30 주 령 암컷 MMTV-neu로부터의 폐를 콜라게나제를 통해 단일 세포 현탁액으로 분해하고, FACS 완충액에 재현탁하였다. 이후 항-HER2-PE, 항-CD45-APC 및 DAPI로 세포를 염색하고, HER2+/CD45- 세포 집단을 BDFACSAria 분류기를 이용하여 분류하였다. 분류된 세포를 312,500 개의 세포/ml의 농도로 미디아에 재현탁하였고, 80 μl를 20 μl의 현탁액 시약(C1 플루이다임(Fluidigm))과 혼합하였다. 단일 세포 분리를 위해, C1 단일-세포 프리엠프(Single-Cell Preamp) IFC 10 내지 17 μm을 사용하였다. 암비온(Ambion) 단일 세포-투-씨티(Single Cell-to-CT) qRT-PCR 키트 및 20x 택맨(TaqMan) 유전자 발현 FAM-MGB 어세이를 이용하여, 전-증폭을 수행하였다. 야기된 cDNA를 C1 DNA 희석 시약 1/3으로 더 희석하고, 고-처리량 qPCR을 위해 96.96 IFC(플루이다임), 주노 시스템 컨트롤러(Juno System controller) 및 바이오마크 HD(Biomark HD)를 사용하여, 유전자 발현 분석에 사용하였다. qPCR 반응을 위해, 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(TaqMan Fast Advanced Master Mix)를 사용하였다. 계층적 클러스터 히트맵을 위해, 플루이다임 리얼-타임 PCR 분석 소프트웨어 및 클러스터그래머(Clustergrammer) 웹-기반 툴(문헌[Fernandez et al., “Clustergrammer, A Web-Based Heatmap Visualization and Analysis Tool for High-Dimensional Biological Data,” Sci. Data 4:1-12 (2017)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨)을 사용하여, 분석을 수행하였다.
생화학적 어세이: 재조합 인간 EIF2AK3(PERK) 촉매 도메인(아미노산 536 내지 1116; Cat# PV5107), GFP-eIF2α(Cat# PV4809) 기질, 및 터븀으로 라벨링된 포스포-eIF2α 항체(Cat# PR8956B)를 인비트로젠(칼스배드, CA)으로부터 구입하였다. HIS-SUMO-GCN2 촉매 도메인(아미노산 584 내지 1019)를 E. coli.로부터 발현시키고 정제하였다. 억제제의 존재 또는 부재 하에서, 50 mM의 HEPES, pH 7.5, 10 mM의 MgCl2, 1.0 mM의 EGTA, 및 0.01%의 Brij-35, 및 100 내지 200 nM의 GFP-eIF2α 기질로 구성되는 반응 완충액에서, TR-FRET 키나제 어세이를 수행하였다. PERK 어세이는 6.25 ng/ml의 효소 및 1.5 μM의 ATP를 함유하고(Km, app ~1.5 μM), GCN2 어세이는 3 nM의 효소 및 90 μM의 ATP를 함유하였다(Km, app ~200 μM). 테스트 화합물의 첨가 후, 효소를 첨가하여 반응을 개시하였고, 실온에서 45 분 간 인큐베이션하였다. EDTA를 10 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 중단시키고, 터븀으로 라벨링된 포스포-eIF2α 항체를 2 nM의 최종 농도로 첨가하고, 90 분 간 인큐베이션하였다. EnVision® 멀티라벨 리더(Multilabel reader)(퍼킨엘머(PerkinElmer, 월섬, MA)로, 야기된 형광을 모니터링하였다. 적합 억제 곡선(fitted inhibition curve)으로부터, TR-FRET 비율 및 야기된 IC50 값을 결정하였다. 생화학적 특이도 프로파일링을 세렙(Cerep)(레드몬드(Redmond), WA) 및 디스커버엑스(DiscoverX)(샌디애고, CA)로 수행하였다.
세포-기반 TR-FRET 어세이: 간략하게, GFP-eIF2α를 발현하는 GripTiteTM 293 세포(인비트로젠)을 384-웰 플레이트에 웰 당 10,000 개의 세포로 시딩하고, 밤새 부착되도록 하였다. 세포를 테스트 화합물로 1 시간 동안 전-처치하였다. PERK 활성을 유도하기 위해 튜니카마이신(Tunicamycin)(1 μM)을 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 미디아를 제거하고, 20 mM의 Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA, 1%의 NP-40, 5 mM의 NaF, 프로테아제 억제제(시그마 Cat# P8340), 포스파타제 억제제(시그마 Cat# PM4312I) 및 2 nM의 터븀으로 라벨링된 항-포스포-eIF2 항체(인비트로젠 Cat# PM4312I)로 구성된 완충액에서, 세포를 용해하였다. 실온의 암실에서 2 시간 동안 세포 용해물을 인큐베이션하고, 형광을 EnVision® 멀티라벨 리더(퍼킨엘머, 월섬, MA)로 모니터링하였다. 비-유도(100%의 억제) 및 유도(0%의 억제) 웰을 대조군으로 사용하여, 적합 억제 곡선으로부터, TR-FRET 비율 및 야기된 IC50 값을 결정하였다.
ATF4-luc 어세이: ATF4-luc을 발현하는 렌티바이러스(에스에이바이오사이언스(SABiosciences), 프레더릭(Frederick), MD)로 293 개의 세포를 형질도입하고, 1 μg/ml의 퓨로마이신(puromycin)을 함유하는 성장 미디아에서 선별하였다. ER 스트레스로 유도된 ATF4 활성에 대한 화합물의 효과를 결정하기 위해, 293-ATF4-luc 세포를 폴리-D-리신으로 코팅된 96-웰 플레이트에 웰 당 15,000 개의 세포로 시딩하고, 밤새 부착되도록 하였다. 이후 테스트 화합물로 30 분 간 세포를 전-처치하였다. ER 스트레스를 유도하기 위해 튜니카마이신(2 μM)을 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 배양 미디아를 흡입하고, 수동 용해 완충액(passive lysis buffer)(프로메가(Promega) Cat# E194A)에서 플레이트 셰이커 상에서 5 분 간 세포를 용해하였다. 루시퍼라제 어세이 시약(프로메가 Cat# E1501)을 사용하여, Wallac 1420 Victor2TM 멀티라벨 카운터(Multilabel Counter)(퍼킨엘머, 월섬, MA)로, 루시퍼라제(Luciferase) 활성을 모니터링하고, 비-유도(100%의 억제) 및 유도(0%의 억제) 웰을 대조군으로 사용하여, 야기된 적합 억제 곡선으로부터, IC50 값을 결정하였다.
세포 생존가능성 어세이: PERK 억제제의 존재 또는 부재 하에서, 각각 48, 72, 또는 96 시간 동안, 96-웰 플레이트에서, Hela, HT-1080, 및 Bx-PC-3 세포의 성장을 모니터링하였다. CEllTiter-Glo® 시약(프로메가, 매디슨(Madison), WI)을 사용하여, 세포 생존가능성을 결정하였고, 비처치(0%의 억제) 및 20 μM의 스타우로스포린(staurosporine)(100%의 억제)를 대조군으로 사용하여, 야기된 적합 억제 곡선으로부터, IC50 값을 결정하였다.
통계적 분석: 모든 포인트는 표준 편차를 나타내는 에러 바(error bar)를 갖는 독립적인 생물학적 샘플을 나타내고, 크래프 패드 프리즘 소프트웨어(Graph Pad Prism Software)를 사용하여, 맨-휘트니 테스트를 사용하여, 통계적 유의성을 결정하였다.
실시예 2 - 휴면 HER2 + DTC는 ER 스트레스 반응을 나타낸다
PERK 경로 활성화는 휴지 표현형과 관련된, URP로 유도된 성장 정지 및 생존의 중요한 이펙터로 작용한다는 것이 알려져 있다(문헌[Brewer et al., “PERK Mediates Cell-Cycle Exit During the Mammalian Unfolded Protein Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12625-30 (2000); Ranganathan et al., “Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase in Tumor Cell Growth Arrest and Survival,” Cancer Res. 68:3260-3268 (2008); 및 Ranganathan et al., “Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,” Cancer Res. 66:1702-1711 (2006)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). MMTV-HER2 동물에서, 마우스의 높은 백분율에서 폐로의 전이가 진행되고, 이는 초기 DCC 또는 후기 DCC에 의해 개시될 수 있다(문헌[Guy et al., “Expression of the Neu Protooncogene in the Mammary Epithelium of Transgenic Mice Induces Metastatic Disease,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 89:10578-10582 (1992); Husemann et al., “Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,” Cancer Cell 13:58-68 (2008); Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016); Hosseini et al., “Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer,” Nature 540:552-558 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 휴지 DCC는 E-캐드헤린의 소실 및 Twist1의 발현을 나타내고(문헌[Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 췌장암 모델에서 E-캐드헤린-음성 DCC는 휴면상태가 되는 것 및 PERK로 유도된 유전자인 CHOP의 상향조절을 나타내는 것이 알려져 있다(문헌[Pommier et al., “Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases,” Science 360(6394):eaao4908 (2018)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 이 동일한 PERK 경로 활성화의 수준 및 세포 주기 정지 사이의 상관관계가, MMTV-HER2 자발적 전이 모델에서도 존재하는지 여부를 평가하기 위해, 두 가지 상이한 접근법을 사용하였다 - 면역형광(IF)을 사용한 고 해상도 이미징 및 DCC 및 전이에 대한 단일 세포 해상도 유전자 발현 분석. 큰 종양을 갖는, 따라서 휴지 및 증식 DCC를 갖는 동물의 MMTV-HER2 폐 조직 절편의 IF를 수행하였다(문헌[Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 다음으로, HER2, Ki67(증식에 대한 마커), 및 GADD34(또는 PPP1r15A)에 양성인 DCC를 검출하기 위해, 조직을 공동-염색하였다. GADD34는, 번역 억제(eIF2α 인산화에 의함)로부터 스트레스로 유도된 유전자 발현으로의 프로그램된 변동(programmed shift)을 담당하는, PERK-유도성 스트레스 유전자이다(문헌[Novoa et al., “Stress-Induced Gene Expression Requires Programmed Recovery from Translational Repression,” EMBO J. 22:1180-7 (2003)], 이는 그 전체가 본원에서 참조로 원용됨). 이미지 분석 결과는, 낮은 증식 지수(Ki67low)의 HER2+ 전이성 병변 또는 DCC가 높은 수준의 GADD34 발현으로 보여지는 높은 수준의 ER 스트레스를 나타낸다는 것을 보여준다(도 1A, 위쪽 패널 및 그래프). 반면, 높은 증식성의 DCC 또는 병변은 매우 낮은 수준의 GADD34 염색을 보여준다(도 1A, 아래쪽 패널 및 그래프). 두 가지 마커, Ki67 및 GADD34는 100%의 세포에서 음의 상관관계에 있었고, 이는 URPhigh, 휴면 DCC, 및 전이성 병변이 GADD34 검출로 바이오마킹될 수 있다는 것을 지지한다.
다음으로, 상이한 서브타입 및 소스(림프절, 폐, 간)로부터의 17 개의 유방암 전이를 테스트함으로써, 이들 상관관계가 인간 유방 전이성 병변에서도 성립될 수 있는지 여부를 평가하였다(표 5). 전이성 병변을 식별하기 위해, 유방암 전이를 사이토케라틴, Ki67, 및 GADD34에 대해 염색하였다. 진행된 인간 전이성 병변은, 마우스 모델에 비해, 상이한 환자들 사이 및 동일 병변의 상이한 영역 사이에서, 두 마커에 대해 더 불균질한 패턴의 염색을 나타냈다. 그러나 증식 수준(Ki67) 및 ER 스트레스 활성화(GADD34) 사이의 상반되는 상관관계가, 전이 타입과 독립적으로, 관찰되었다(도 1B). 이 분석결과는 마우스 모델에서의 결과 및 전이 부위에서 GADD34가 UPRhigh/휴면 종양 세포를 식별하는 데 도움이 될 수 있다는 것을 입증한다.
표 5. 인간 유방암 전이 샘플
Figure pct00020
MMTV-HER2 마우스의 폐에 존재하는 DCC, 미세-전이, 및 거대-전이에 대한 단일 세포 타겟 유전자 발현 분석을 수행함으로써, 전이 세포 내에 존재하는 증식, 휴면기, 휴지기, 및 ER 스트레스에 대한 마커를 평가하였다. MMTV-HER2 암컷으로부터의 폐를 단일 세포 현탁액으로 가공하고, HER2+/CD45- 세포를 분류하였다(도 2A). 이후, 도 2A에 보여진 C1(플루이다임) 기술을 사용한 단일 세포 분리, 용해, RT, 및 전-증폭을 위해, 분류된 세포를 가공하였다. 이 파이프라인은, 높은 정도의 신뢰도(HER2+ 단일 세포에 대한 IF 및 분자적 확인) 및 품질과 함께, 225 개의 단일 DCC 및 90 개의 원발 종양 세포 및 그들의 대응되는 풀에 대한, 단리 및 가공을 가능하게 한다. 다음으로, ER 스트레스 유전자, 세포 주기 유전자(활성화제 및 억제제 모두), 및 휴지기 유전자의 발현을 분석하기 위해, 고-처리량 qPCR을 사용하였다(문헌[Kim et al., “Dormancy Signatures and Metastasis in Estrogen Receptor Positive and Negative Breast Cancer,” PloS One 7:e35569 (2012)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨; 문헌[B'chir et al., “The eIF2α/ATF4 Pathway is Essential for Stress-Induced Autophagy Gene Expression,” Nucleic Acids Res. 41:7683-99 (2013); Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이들 각각은 본원에 그 전체가 참조로 원용됨)(도 2B). DCC에 대한 단일 세포 해상도 유전자 발현은, 세포 증식에 대한 음성 조절인자, 예컨대 Rb1 및 TP53 및 CDK 억제제인 p21, p27, p16 및 p15(Cdkn2a-Rb1을 둘러싸는 박스)와 함께, 테스트된 모든 ER 스트레스 유전자의 부수적이고 강한 상향조절(PERK 자체를 포함)(Fam123bb-Ddit3을 둘러싸는 박스)을 보여주는 세포 집단의 존재(도 1C, 그룹 1, 대략 DTC의 19%)를 나타냈다(도 1C). 휴지기 유전자, 예컨대 NR2F1, DEC2(Bhlhe41), TWIST1, CDH5, STAT3, 및 COL4a5의 발현의 강화가 또한 이들 세포에서 관찰되었다(문헌[Kim et al., “Dormancy Signatures and Metastasis in Estrogen Receptor Positive and Negative Breast Cancer,” PloS One 7:e35569 (2012) 및 Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨)(Nr2f1-Ccnd1을 둘러싸는 박스). DCC의 또 다른 그룹인, 그룹 2(22%)는 또한, p21과 마찬가지로, 높은 수준의 ER 스트레스 유전자 발현을 나타냈다. 그룹 3(6%)는 더 적은 ER 스트레스, 세포 주기 억제제, 및 휴지기 유전자를 보여주며, 이는 이들이 휴지기에서 벗어나거나, 느린 주기 모드에 있는 세포에 해당될 수 있다는 것을 시사한다. 전체적으로, DCC의 약 40%는, 세포 주기 억제제 또는 휴지기 유전자와 동시에, 높은 내지 중간 수준의 ER 스트레스 유전자 발현을 나타냈다. 이는, 진행된 MMTV-HER2 동물에서 포스포-히스톤 H3 및 포스포-Rb 검출을 사용하여 검출된, 휴지 DCC의 백분율 범위 내에 있다(문헌[Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 전체적으로, 이 데이터는, 심지어 검출가능한 전이를 갖는 동물에서도, DCC의 ~40%가 세포 주기 억제제의 높은 발현을 나타낸다는 것을 보여준다. 중요하게도, 이 모델에서, 이 휴지 DCC 서브집단은, PERK 경로 유전자의 두드러진 활성화 발현과 함께, 종결되지 않은 UPR을 나타낸다.
실시예 3 - PERK 억제는 골수 및 폐에서 휴면 DCC를 제거하고, 결과적으로 폐 전이를 억제한다
상기 실시예의 결과는, 휴지 DCC 운명 및 전이 형성에 대한 선택적 PERK 억제제의 효과의 평가를 촉발했다. LY2, LY3, 및 LY4(LY 시리즈 억제제)는, 생체 내 연구를 지지하는, 적절한 약물-유사 성질을 갖는 강력하고 선별적인 PERK 억제제로 식별되어왔다(문헌[Pytel et al., “PERK Is a Haploinsufficient Tumor Suppressor: Gene Dose Determines Tumor-Suppressive Versus Tumor Promoting Properties of PERK in Melanoma,” PLoS Genet. 12:1-22 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). eIF2α 인산화 및 이의 다운스트림 아웃풋인 ATF4를 조사하는, 시험관 내 키나제 어세이(eIF2α를 기질로 사용함) 및 세포-기반 어세이를 통해, LY 시리즈 억제제를 테스트하였다(표 6). 세 억제제 모두는, GSK2656157과 대비하여, 동일하거나 더 높은 효능을 보여주고(문헌[Axten et al., “Discovery of GSK2656157: An Optimized PERK Inhibitor Selected for Preclinical Development,” ACS Med. Chem. Lett. 4:964-968 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨); HER2를 발현하는 MCF10A 세포에서, P-PERK(P-T980) 수준 및 이의 다운스트림 타겟인 AFT4를 효과적으로 감소시키고(도 2C 및 도 3A); 이들 동일 세포를 저용량의 타프시가진 처치에 감수성을 갖게 함으로써, 어떻게 이들 PERK 억제제가 ER 스트레스에 대한 적응에 선택적으로 영향을 미치는지 보여준다(도 2D).
생화학적 효소 어세이(도 2E)를 사용하여, LY4는, 15 μM 미만의 농도에서 이차적 키나제 타겟을 나타내지 않는, 가장 높은 특이도를 보여준 반면, LY2, LY3 및 GSK2656157은 5 μM 미만, 심지어 1 μM 미만의 농도에서 여러 이차적 타겟을 나타냈다. DicoveRx scanMAXTM 키나제 프로파일링(표 6)을 사용하여, LY4은 다른 억제제와 대비하여, 심지어 고농도(20 μM)에서도, 높은 선택성을 보여주었고, GSK2656157에 의한 80 개와 대비하여 LY4는 전체 456 개 중 오직 20 개의 키나제를 >50%로 억제하였거나, 58 개와 대비하여 8 개를 >60%로 억제하였다.
이들 이차적 타겟 중 어느 것도, 다른 알려진 eIF2α 키나제, EIF2AK1(HRI로도 알려짐), EIF2AK2(PKR로도 알려짐), 및 EIF2AK4(GCN2로도 알려짐) 중 어느 하나가 아니었으며(표 7), 이는 eIF2α에 대한 측정된 활성은 PERK 억제에 고도로 특이적임을 나타낸다.
표 6. 상이한 PERK 억제제의 효소 및 세포-기반 IC50 값 및 키나제 선택성
Figure pct00021
표 7. 다른 eiF2α 키나제의 시험관 내 억제의 비교
Figure pct00022
24 내지 32 주 령의 일란생산성(uniparous) MMTV-HER2 암컷 마우스를, 비히클 또는 LY4(50 mpk) i.p.로 매일, 2 주 간 처치하였다. 추가적인 분석을 위해, 유선, 폐, 췌장, 골수, 및 종양을 수집하였다. LY4는 체중에 유의한 변화 없이 내성이 잘 생기고, 이는 혈중 포도당 수준 또는 췌장 기능에 아무런 영향이 없는 것을 보여준 최근 연구와 일치한다(문헌[Pytel et al., “PERK Is a Haploinsufficient Tumor Suppressor: Gene Dose Determines Tumor-Suppressive Versus Tumor Promoting Properties of PERK in Melanoma,” PLoS Genet. 12:1-22 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). MMTV-HER2 암컷으로부터의 전체 세포 카운트에 대한 효과가 없는 것으로 보여진 것처럼, 억제제는 골수 세포 항상성 또는 말초 혈액 백혈구에 대한 유의적인 효과를 갖지 않았다(도 2F).
PERK 억제는, 유관 및 췌장 조직(특히 췌도에서 오직 부분적임에도 불구하고)에서 P-PERK 및 P-eIF2α 수준의 유의적인 감소를 야기하였다(도 3B). 전신 LY4 전달이 PERK 활성화 및 eIF2α 인산화를 효과적으로 억제한다는 것으로 귀결되었다. PERK의 억제는 PERK 활성을 완전히 제거하지는 않았고, 이는 마우스가 그들의 췌장 기능 및 포도당 농도를 조절하는 것을 가능하게 한다(문헌[Yu et al., “Type I Interferons Mediate Pancreatic Toxicities of PERK Inhibition,” Proc. Natl. Acad. Sci. 112:15420-15425 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
MMTV-HER2 동물의 높은 백분율에서 폐로의 전이가 진행되고, 이는 진행 초기에 개시될 수 있다(문헌[Guy et al., “Expression of the Neu Protooncogene in the Mammary Epithelium of Transgenic Mice Induces Metastatic Disease,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 89:10578-10582 (1992); Husemann et al., “Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,” Cancer Cell 13:58-68 (2008); Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016), Hosseini et al., “Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer,” Nature 540:552-558 (2016); Linde et al., “Macrophages Orchestrate Breast Cancer Early Dissemination and Metastasis,” Nat. Commun. 9:21 (2018)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
따라서, 작은 종양 및/또는 촉진가능한 큰 종양을 가진 동물에서, 전이성 질환에 대한 LY4 PERK 억제제의 효과를 모니터링하였다. 비히클로 처치된 모든 동물은 H&E로 염색된 절편에서 검출가능한 전이를 나타냈다. >100 개의 세포를 나타낸 병변은 보통 증식 마커에 대해서도 또한 양성이기 때문에, 이를 거대-전이로 카테고리화하였다(도 1A). 동물(5 개의 비-연속적 폐 절편) 당 거대-전이의 정량화 결과는, 오직 2-주의 처치 후, 이들 전이의 영역에 영향을 미치지 않으면서(도 4A), LY4가 거대-전이의 수 및 발생률을 낮추었다는 것을 나타냈다(도 3C). 이는 PERK 억제가, 형성된 거대-전이를 줄이는 것보다, 전이의 초기 단계에서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, LY4 처치가 원발 부위로부터 종양 세포의 혈관내 침투(intravasation) 또는 고립 DCC로부터 미세-전이(2 내지 100 개의 세포를 함유함)로의 전환(transition)에 영향을 줄 수 있는지 여부를 이어서 평가하였다. 혈액 샘플에서 HER2+ 순환 종양 세포(CTC)의 직접적인 검출은, 비히클 및 LY4로 처치된 동물 사이에서 유의적인 차이를 보이지 않았고(도 4B), 이는 LY4가 종양 세포의 혈관내 침투에 전혀 영향을 주지 않음을 나타낸다. 반면, IHC를 통한 HER2 검출을 사용한 미세-전이 및 단일 DCC의 검출은, LY4로 처치된 암컷에서 미세-전이의 수의 유의적인 감소를 보여준다(도 3D). 폐 내 단일 DCC의 80% 이상은 P-Rb에 대해 음성이고, 이는 그들이 대부분 주기 밖에 있고, 휴지기에 있음을 나타낸다. 이 측정은 이전 연구로부터의 측정을 재현한다(문헌[Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 유의적으로, LY4는, P-Rb 양성 고립 DTC의 수(도 3E) 또는 미세전이(도 4C)에 영향을 미치지 않으면서, 보통 폐 절편 내 혈관과 연관된 비-증식성(P-Rb 음성) 단일 DCC의 수를 강력하게 감소시켰다. 중요하게도, LY4는 골수에서 발견된 DCC의 수를 유의적으로 감소시켰다(도 3F). 이 기관에서, 전이가 전혀 진행되지 않았으나, DCC는 높은 발생률로 발견되었고, 휴지기에 있었다(문헌[Bragado et al., “TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling,” Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013); Husemann et al., “Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,” Cancer Cell 13:58-68 (2008); 및 Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 이들 결과는 PERK 억제제가, 활성 PERK 및 UPR 신호전달을 나타내는 비-증식성 휴지 DCC를 선택적으로 타겟팅한다는 것을 입증한다.
LY4 처치가 주기 밖에 있는 인간 DCC의 생존을 선택적으로 타겟팅할 수 있는지 여부를 추가적으로 테스트하기 위해, 이 바이올로지(biology)를 3D 배양에서 모델링하였다. 휴면 세포에서 H2B를 함유한 뉴클레오솜의 느린 턴오버로 인해, 장기간 잔존 라벨 어세이를 수행하기 위해, 히스톤 H2B에 융합된 광-스위치가능(photo-switchable) 형광 단백질(Dendra2)을 안정적으로 발현하는 인간 ZR75.1 HER2+ 세포를 사용하였다(문헌[Wilson et al., “Hematopoietic Stem Cells Reversibly Switch From Dormancy to Self-Renewal During Homeostasis and Repair,” Cell 135:1118-1129 (2008)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 대략 1분 간 405 nm의 빛으로 노출될 때까지, H2B-DENDRA2 단백질은 녹색에서 적색 형광으로 스위치되어, 녹색 및 적색에 대해 모두 양성이 되었고; 휴지기 세포가 H2B-DENDRA2 GREEN 및 RED로 남아있는 반면, 녹색으로 되돌아간 세포는 분열하고 H2B-DENDRA2-RED 분자를 희석하였다. 거대-전이를 모방하기 위해 3D 매트리젤 매트리스에 고밀도(클러스터) 또는 단일 DCC를 모방하기 위해 저밀도(단일 세포)로 시딩된 세포는 광전환되었다(100%)(도 4D). 8 일 후, 고밀도 세포의 오직 35%만이 H2B-DENDRA2-RED 양성이었다. 반면, 저밀도 ZR75.1 HER2+ 세포의 65%는 H2B-DENDRA2-RED 양성이었고(도 4E), 이는 고립 DCC의 휴면 상태를 모방한다(문헌[Bragado et al., “TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling,” Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). PERK 억제제인 LY4로의 처치는, 고밀도로 시딩된 ZR75.1 HER2+의 생존가능성에 대해 유의적인 효과를 갖지 않았다(도 4F). 그러나, 이는 휴면 단일 ZR75.1 HER2+ 세포를 제거하였고, 이는 생체 내 DCC 결과와 유사하다(도 3G). 이들 데이터는 고립 종양 세포의 맥락에서, 내재적 및/또는 ECM 의존적 신호가 PERK 신호전달에 대한 의존성을 야기한다는 것 및 LY4가 실제로, 전이를 생산하기 위해 순차적으로 재활성화되는, 느린 주기 또는 비-증식성 DCC를 선택적으로 타겟팅한다는 것을 보여준다.
실시예 4 - PERK 억제는 HER2로 유도된 초기 및 후기 유방 종양 진행을 차단한다
휴지기와 가장 관련된 휴면 URPhigh DCC에서, PERK에 대한 의존성이 있음을 입증한 이후, 이어서 종양 병변을 평가하였다. MMTV-HER2 모델에서, HER2로 유도된 진행은 유전적으로 PERK 키나제에 의존적임이 알려져 있고(문헌[Bobrovnikova-Marjon et al., “PERK-Dependent Regulation of Lipogenesis During Mouse Mammary Gland Development and Adipocyte Differentiation,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 105:16314-16319 (2008)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), HER2+ 종양은 단백질독성에 감수성이 있고, ERAD에 의존적이라는 것이 알려져 왔다(문헌[Singh et al., “HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive,” Sci. Signal. 8:ra52 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 추가적으로, cBIO 데이터베이스(문헌[Cerami et al., “The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data,” Cancer Discovery 2:401-404 (2012)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨) 분석 결과는, HER2 증폭 인간 유방 종양의 ~14%가 PERK에 대한 mRNA의 상향조절을 나타낸다는 것을 보여준다(도 5A). 따라서, 과형성 유선으로부터 DCIS 및 침윤성 암까지, 진행의 상이한 병기가 분석될 수 있는 원발 병변에서, LY4가 HER2로 유도된 유방 종양의 진행에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다(문헌[Lu et al., “Mechanism of Inhibition of MMTV-neu and MMTV-wnt1 Induced Mammary Oncogenesis by RARalpha agonist AM580,” Oncogene 29(25):3665-76 (2010); Muller et. al., “Single-Step Induction of Mammary Adenocarcinoma in Transgenic Mice Bearing the Activated c-neu Oncogene,” Cell 54(1):105-115 (1988); Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016) ; Hosseini et al., “Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer,” Nature 540:552-558 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
24 주 령 일란생산성 암컷 유선에 대한 분석 결과는, 비히클로 처치된 MMTV-HER2 동물이 이차적 및 삼차적 조밀한 가지를 갖는 관을 나타냈다는 것을 보여주고(도 6A, 왼쪽 패널), 조직학적 분석 결과는 빈번한 유선 과형성 병변을 보여준다(도 6A, 오른쪽 패널, 흑색 화살표). 반면, LY4로 처치된 동물은 “정상화된” 덜 조밀한 가지를 갖는 선 구조를 보이며, 이는 비-형질전환된 정상 FVB 마우스의 유선 트리(tree)와 유사하다(도 3B). LY4로 처치된 동물은 또한 빈 루멘 유관의 수에 극적인 감소를 보이며, 이는 대조군 암컷에서 약 20%인 것과 대비하여, 구조물의 60%를 초과하여 구성했다(도 6B 및 도 5C). 폐쇄된 과형성 및 DCIS-유사 병변의 수 또한, 비히클로 처치된 동물에서 절반 미만으로 감소되었다. 사이토케라틴 8/18 발현의 불균등한 수준이 평가된 것처럼, 대조군 HER2+ 동물에서의 과형성 병변은 다양한 정도의 루멘 분화를 보였다(도 6C, 위쪽 패널). 정상 FVB 동물 관에서 동일하게 간격을 두고 있는 근상피 세포(평활근 액틴, SMA로 검출, 양성)가, MMTV-HER2 마우스 내 비히클로 처치된 과형성 조직에서는 불균등하게 분포되었다. 반면, LY4로 처치된 MMTV-HER2 동물은, 흔히 빈 관을 둘러싸는 루멘층 및 근상피 세포의 외부 연속 층에서, 사이토케라틴 8/18의 증가된 발현을 보였다(도 6C, 아래쪽 패널 및 그래프). 이 데이터는 분화 프로그램을 회복시키는 것처럼 보이는 메커니즘을 통해, LY4 처치가 초기 암 병변의 “정상화”를 유도하는 것을 나타낸다.
30 내지 200 mm3의 부피(두 개의 종양은 >200 mm3 이었음)의 범위의 종양을 나타낼 때, 동물을 LY4로 2 주 간 처치하였다(도 7A). 비히클 처치 그룹에서, 종양은 꾸준히 성장하였고(도 8A), 이는 2 주 내에 이의 본래 부피의 10 배까지 도달하였다(도 7B, 위쪽 그래프). 반면, LY4로 처치된 종양은, 완전한 세포정체(cytostasis)(2 주의 기간 내에 오직 한 번만 종양 부피를 2배로 늘리는 것으로 정의됨, LY-4 처치군에서 43% vs 대조군에서 7%)로 남아있는 일부 종양과 함께, 감소된 성장 속도를 보였고(도 8A), 일부 종양(25%)은 2 주의 윈도우 처치 내에 퇴행을 보였다(도 7C). 이는 최종 종양 부피 중앙값의 유의한 감소를 야기했다(도 8B). 증식 수준(P-히스톤 H3 IHC)은 비히클 및 LY4로 처치된 종양 사이에서 상이하지 않았으나(도 7D), 종양 절편의 TUNEL 염색 결과는, LY4로 처치된 동물에서 나타난 DNA 조각화 수준의 유의한 증가를 보여준다(도 8C). 따라서, 현성 원발성 병변에서, LY4 처치는 확립된 HER2+ 종양의 세포자멸사를 유도했으며, 이는 진행하는 동안 PERK의 기능을 촉진하는 맥락 의존적 적합성(context dependent fitness)을 입증한다.
HER2 과발현을 갖는 인간 암 세포(MCF10A-HER2 또는 ZR75.1) 또는 매트리젤에서의 HER2-증폭(SKBR3)(도 8D 및 도 7E) 3D 선포 배양에 대한 LY4의 처치는, 비히클 또는 LY4(2 μM)로의 10 일 간의 처치가 이들 오가노이드(organoid)에서, 특히 ECM과의 접촉이 부족한 안쪽 세포 덩어리에서, 세포자멸사의 수준(절단된 카스파제-3)을 유의하게 증가시킨다는 것을 보여준다(도 8D). 생체 내 처럼, 포스포-히스톤 H3 수준으로 검출되는 증식 수준의 유의한 변화가 관찰되지 않았다(도 7F). 초기 MMTV-HER2+ 병변은, 관 상피 조직화에서 HER2로 유도된 변이를 위해 PERK를 필요로 한다는 것으로 귀결되었다. HER2+ 인간 암 세포 및 마우스 종양에서, HER2는 생존을 위해 PERK에 의존적이다.
실시예 5 - PERK 신호전달은 최적의 HER2 인산화, 국소화, 및 AKT 및 ERK 활성화를 위해 필요하다
HER2+ 종양은 단백질독성에 감수성이 있기 때문에(문헌[Singh et al., “HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive,” Sci. Signal. 8:ra52 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 증가된 ER 클라이언트 단백질 부하로 인해, PERK 억제제가 최적의 HER2 활성에 영향을 줄 수 있는지 여부를 평가하였다. 종양에서 Y1221/1222 잔기에서의 HER2 인산화의 검출 결과는, 다른 문헌에 의해 보고된 P-HER2에 양성인 영역(문헌[DiGiovanna et al., “Active Signaling by Neu in Transgenic Mice,” Oncogene 17:1877-1884 (1998)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨)이 P-PERK 및 P-eIF2α에 대한 염색된 것과 겹친다는 것을 보여준다(도 9A). 이 결과는 PERK 및 HER2 경로의 활성화가 공동-국소화된다(co-localized)는 것을 나타낸다. 유사하게, 원발 종양 세포의 단일 세포 타겟 유전자 발현 프로파일링 결과는 또한, 높은 수준의 ER 스트레스 유전자 발현을 갖는 원발 종양 세포의 집단(약 25%)을 보여주고(도 9B), 이는 P-HER2 활성화를 보이는 것과 대응될 수 있다. 중요하게도, 염색의 영역 및 강도 모두를 고려하여, 종양 내에서 P-HER2 수준을 스코어링할 때(도 10A), LY4로 처치된 종양이 대조군 동물보다 유의하게 낮은 P-HER2 수준을 보였다는 것이 밝혀졌다(도 9C). HER2는 EGFR 및 HER3의 호모다이머 또는 헤테로다이머로서 신호를 보낸다(문헌[Moasser MM, “The Oncogene HER2: Its Signaling and Transforming Functions and its Role in Human Cancer Pathogenesis,” Oncogene 26(45):6469-87 (2007) and Negro et al., “Essential Roles of Her2/erbB2 in Cardiac Development and Function,” Recent Prog. Horm. Res. 59:1-12 (2014)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). LY4(2 μM)의 존재 또는 부재 하에서, EGF(100 ng/ml, 15 분)가 결핍되고 처치된 MCF10A-HER2 세포의 시험관 내 처치는, PERK 억제제가, 생존 경로인 P-AKT, P-S6, 및 P-ERK1/2 수준의 하향조절과 함께, P-EGFR 및 P-HER2의 기저 수준 및 EGF로 유도된 수준 모두를 감소시킨다는 것을 보여준다(도 9D 및 그래프 및 도 10B). 이들 조건하에서, 표면 비오티닐화 및 공동-면역침강(co-immunoprecipitation) 연구에 의해 결정된 전체 HER2 수준 또는 EGFR과의 헤테로다이머화에 대한 명백한 효과는 관찰되지 않았다. LY4는 HER 패밀리 멤버, AKT 또는 S6 키나제 중 임의의 것의 활성 부위에 대한 직접적인 억제 효과를 갖지 않으므로(표 8), 이 효과는 HER2 신호전달에 대한 PERK 억제의 간접적인 효과에 따른 것임이 분명하다. 다른 HER 패밀리 멤버와 대조적으로, HER2는 리간드 결합 및 다이머화 이후, 원형질 막에 남아있는 것으로 알려졌다(문헌[Hommelgaard et al., “Association with Membrane Protrusions Makes ErbB2 an Internalization-Resistant Receptor,” Mol Biol Cell. 15(4):1557-67 (2004); Bertelsen et al., “The Mysterious Ways of ErbB2/HER2 Trafficking,” Membranes (Basel) 4:424-446 (2014)], 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). LY4가 HER2 수용체의 활성화의 메커니즘을 방해할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 표면 비오티닐화 어세이를 수행하여 세포 표면의 수용체의 존재를 측정하고, 가역적인 표면 비오티닐화로 수용체 엔토사이토시스를 측정하였다(문헌[Cihil et al., “The Cell-Based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins,” J. Vis. Exp. e50867 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 부수적으로 엔토사이토시스된 포스포-HER2 및 전체 HER2를 증가시킨 반면(도 9F), 데이터는 LY4 처치가 세포 표면에서 P-HER2 및 전체 HER2의 양을 감소시킨다는 것을 보여준다(도 9E 및 도 10C). 이 데이터는, Singh 등의 문헌["HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive", Sci. Signal. 8:ra52 (2015), 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨]과 함께, PERK 신호전달 및 적절한 UPR 기능은, 최적의 수용체 국소화 및 활성화에 영향을 미침으로써, 적절한 HER2 다운스트림 신호전달을 유지하기 위해 필요하다는 것을 시사한다.
표 8. HER 패밀리 신호전달 경로에 대한 LY4의 직접적인 억제 활성
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실시예 6 - CDK 억제제에 이어지는 PERK 억제의 순차적 조합은 LY4의 항-전이 효과를 향상시킨다
원발성 병변에서 PERK의 약학적 억제에 대한 효과가 확립되었고, 가장 중요하게도, LY4가 휴지 DCC의 제거를 통해 전이를 억제할 수 있다는 것이 확립되었다. 이 정보와 함께, 휴지기를 모방할 수 있는 임상적으로 이용가능한 약물이, 휴지기로 유도된 암 세포 UPRhigh를 만드는 데 사용될 수 있고, LY4에 대한 감수성을 가질 수 있는지 여부를 평가하였다. 이 근거는 URPhigh DCC가 더 높은 수준의 CDK 억제제를 발현한다는 결과에 의해 지지되었다(도 1C). 따라서, 다음으로 CDK4/6 억제제인 아베마시클립(50 mpk, 4 주)으로 동물을 전-처치함을 통해, 기저 50% 이상으로 휴면 DCC의 풀(pool)을 증가시키는 것이(도 11A), LY4의 항-종양 효과를 더 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 실제로, MMTV-HER2 암컷에 대한 아베마시클립 단독 전-처치는, 원발 종양 절편에서 GADD34+ 세포의 두드러진 증가를 야기하였고(도 11B), 그렇지 않은 경우 매우 낮고 국소화된 수준의 GADD34 염색을 보였다(대조군). 원발 종양에서의 측정은 아베마시클립에 의해 야기된 휴면-연관 UPR의 서로게이트(surrogate) 바이오마커로 작용하였다. 기대된 것처럼, LY4로의 처치는 처치된 동물의 원발 종양에서 GADD34의 발현을 제거하였다(도 11B). 마우스에 대한 아베마시클립(휴지기-유사 개시 단계)에 이어지는 LY4(휴지 DCC 제거 단계)로의 순차적 처치는, LY4 단일 처치에서 관찰된 거대-전이 부하의 감소와 동일한 감소를 야기했다(도 11C). 그러나, 조합은 미세-전이의 존재를 거의 완전히 제거하였고, 단일 작용제에서 보인 것처럼, 휴면 단일 파종성 암 세포의 수를 크게 감소시켰다(도 11E). 이들 결과는 함께, 이들 병변을 재활성화하고 시딩하는 휴면 DCC를 타겟팅함으로써 전이를 예방하는 유망한 치료 전략인, 세포정체 작용제의 순차적 조합, 예컨대 CDK 억제제에 이어지는 LY4에 대한 근거를 지지한다.
실시예 7 - 실시예 2 내지 6에 대한 논의
HER2+ 유방암 모델에 대한 여러 연구는, HER2+ 유방암 종양생성 과정(tumorigenesis)이, 생존 및 적응을 위해, PERK 신호전달에 의존적이라는 것으로 귀결되었다(문헌[Bobrovnikova-Marjon et al., “PERK Promotes Cancer Cell Proliferation and Tumor Growth by Limiting Oxidative DNA Damage,” Oncogene 29(27):3881-95 (2010); Singh et al., “HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive,” Sci. Signal. 8:ra52 (2015); Avivar-Valderas et al., “PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment,” Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011); 및 Avivar-Valderas et al., “Regulation of Autophagy During ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK,” Oncogene 32(41):4932-40 (2013)], 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 흥미롭게도, 수술 마진(margin)에 존재하는 및 또한 타겟 기관에 휴면 파종 암 세포로 존재하는 휴면 종양 세포가(문헌[Bragado et al., “TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling,” Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013); Ch
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ry et al., “Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways,” Oncotarget 5(20):9939-51 (2014); Sosa et al., “Mechanisms of Disseminated Cancer Cell Dormancy: An Awakening Field,” Nat. Rev. Cancer 14:611-622 (2014); 및 Sosa et al., “NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy Via SOX9- and RARbeta-Driven Quiescence Programmes,” Nat. Commun. 6:6170 (2015)], 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 다른 ER 스트레스 경로와 마찬가지로, 생존을 위해, PERK 신호전달을 활성화시킨다는 것이 밝혀졌다(문헌[Adomako et al., “Identification of Markers that Functionally Define a Quiescent Multiple Myeloma Cell Sub-Population Surviving Bortezomib Treatment,” BMC Cancer 15:444 (2015); Ranganathan et al., “Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase in Tumor Cell Growth Arrest and Survival,” Cancer Res. 68:3260-3268 (2008); Ranganathan et al., “Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,” Cancer Res. 66:1702-1711 (2006); Schewe et al., “ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells In Vivo,” Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 105:10519-10524(2008); Schewe et al., “Inhibition of eIF2alpha Dephosphorylation Maximizes Bortezomib Efficiency and Eliminates Quiescent Multiple Myeloma Cells Surviving Proteasome Inhibitor Therapy,” Cancer Res. 69:1545-1552 (2009); 및 Ch
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ry et al., “Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways,” Oncotarget 5(20):9939-51 (2014)], 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 최근, Pommier 등의 문헌[“Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases,” Science 360(6394):eaao4908 (2018), 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨]은 간에 머무르는 췌장 DCC(또는 다른 모델)가 휴면기 동안 UPR을 활성화시킨다는 것을 보여줌으로써, 이 작업을 입증하였다. 상이한 암 및 모델 간 재현가능성의 수준은, 이 바이올로지에 대한 높은 수준의 생물학적 관련성을 시사한다.
본 발명의 실시예는, PERK 억제제인 LY4가 DCC 및 원발성 병변에서 HER2 의존성을 선택적으로 타겟할 수 있음을 입증한다. 논의할 두드러진 결과는, 전이에 대한 LY4의 억제성 효과이다. MMTV-HER2 모델에서, 환자에서와 같이, 전이는 원발성 종양과 비동시적일 수 있고, 현성 종양 검출보다 먼저 개시된 일부 전이와 함께, 때로는 심지어 잠복 원발성 종양(occult primary tumor)과 함께 진행될 수 있다(문헌[Husemann et al., “Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,” Cancer Cell 13:58-68 (2008); Pavlidis et al., “Cancer of Unknown Primary (CUP),” Crit. Rev. Oncol. Hematol. 54:243-250 (2005); Harper et al., “Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer,” Nature 540:588-592 (2016); 및 Hosseini et al., “Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer,” Nature 540:552-558 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). LY4 처치는 모든 전이, 초기에 개시된 것(현성 종양이 명백해지기 전) 또는 현성 원발 종양 성장과 일치하는 전이된 것을 감소시켰다(도 8). 이는 전이에 대한 효과가 단순히, LY4에 의해 야기된 감소된 원발 종양 부하에 의한 것이 아니라는 것을 입증하기 때문에 중요하다. 신기하게도, 전이 부하는 LY4 처치에 의해, 비-증식성 고립 또는 작은 P-Rb-음성 DTC 클러스터를 제거함으로써, 감소되었다. 이미징 및 단일 세포 멀티플렉스 qPCR 결과는, 세포 증식에 대한 일부 음성 조절인자의 상향조절을 나타냄으로써, 휴면 표현형을 또한 보이는 반면, 이들 DCC가 더 빈번하게 GADD34(단백질) 및 PERK 자체를 비롯한 더 큰 세트의 ER 스트레스 유전자의 상향조절을 보인다는 것을 나타낸다. PERK로 유도된 ER 스트레스 프로그램의 일부는 전사 조절을 수반하고, 다른 일부는 업스트림 ORF-함유 유전자, 예컨대 ATF4 및 GADD34의 우선적 번역이라는 것을 고려해야 한다(문헌[Young et al., “Upstream Open Reading Frames Differentially Regulate Gene Specific Translation in the Integrated Stress Response,” J. Biol. Chem. 291:16927-16935 (2016)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 유사하게, UPR로 유도된 G1 정지는 사이클린 D1의 번역을 억제함으로써 야기된다는 것이 알려져 있다(문헌[Brewer et al., “Mammalian Unfolded Protein Response Inhibits Cyclin D1 Translation and Cell-Cycle Progression,” Proc. Natl. Acad. Sci. 96:8505-8510 (1999)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨). 인간 HER2+ 암 세포주를 사용한 3D 기관형성(organogenesis) 실험은, LY4에 의한 휴면 단일 암 세포의 선택적 사멸을 입증했다. 이들 데이터는 휴면 DCC가 생존을 위해 PERK 신호전달에 더 의존하는 것 같다는 것을 입증한다. 유사하게, 유방암 환자로부터의 인간 전이 세포의 서브-집단은 또한, GADD34 및 Ki67 사이의 음의 상관관계를 보였고, 이는 마우스에서 밝혀진 연관성를 입증한다. 이들 데이터는, NR2F1과 마찬가지로(문헌[Borgen et al., “NR2F1 Stratifies Dormant Disseminated Tumor Cells in Breast Cancer Patients,” Breast Cancer Research 20:120 (2018)]. 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), GADD34 단독 또는 NR2F1과의 조합이 휴지/URPhigh DCC에 대한 강력한 바이오마커 세트로 작용할 수 있으며, 따라서 치료를 위한 환자 선택을 가이드할 수 있다는 것을 시사한다.
휴지 DCC가 능동 및 수동 메커니즘을 통해 항-증식 치료법을 회피하는 것으로 알려져 있기 때문에, 휴지 DCC를 제거할 수 있는 타겟 및 약물을 찾아내는 것은 고도로 중요하다(문헌[Aguirre-Ghiso et al., “Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer,” Nat. Med. 19:276-277 (2013); Naumov et al., “Ineffectiveness of Doxorubicin Treatment on Solitary Dormant Mammary Carcinoma Cells or Late-Developing Metastases,” Breast Cancer Res. Treat. 82(3):199-206 (2003); Oshimori et al., “TGF-Beta Promotes Heterogeneity and Drug Resistance in Squamous Cell Carcinoma,” Cell 160:963-976 (2015); 및 Fluegen et al., “Phenotypic Heterogeneity of Disseminated Tumour Cells is Preset by Primary Tumour Hypoxic Microenvironments,” Nat. Cell Biol. 19(2):120-132 (2017)], 이들 각각은 본원에 참조로 원용됨). 이들 세포가 또한 보통 휴지기에 있는 골수에서의 DCC의 제거는(문헌[Bragado et al., “TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling,” Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013); Ch
Figure pct00027
ry et al., “Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways,” Oncotarget 5(20):9939-51 (2014); Ghajar et al., “The Perivascular Niche Regulates Breast Tumour Dormancy,” Nat. Cell Biol. 15:807-817 (2013); 및 Husemann et al., “Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,” Cancer Cell 13:58-68 (2008)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 항-휴지 DCC 치료법으로서의 PERK 억제의 개념을 더 강화하고(문헌[Aguirre-Ghiso et al., “Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer,” Nat. Med. 19:276-277 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), 이는 휴지 미세 잔류 질환을 제거하기 위한 어쥬번트 세팅에 사용될 수 있다(문헌[Aguirre-Ghiso et al., “Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer,” Nat. Med. 19:276-277 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
PERK 키나제 억제가 종양 성장을 차단하는 정확한 메커니즘은 불분명하다. 단백질독성에 의해 부과된 스트레스에 대한 감소된 적응력(문헌[Singh et al., “HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive,” Sci. Signal. 8:ra52 (2015)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨)이 메커니즘으로 가능하다. 본원에 기술된 결과는, LY4가 생체 내에서 포스포-HER2 수준을 감소시키고, LY4가 향상된 엔토사이토시스를 통해 막 내 활성 수용체의 풍요를 감소시킨다는 것을 입증한다. HER2 단백질 분해에 대한 변화는 관찰되지 않았다. 어떻게 PERK가 HER2 막 국소화 또는 엔토사이토시스를 정확하게 조절하는지와 관련하여, 수용체의 세포내이동(internalization)은 수용체의 더 나은 또는 더 신속한 탈-인산화를 가능하게 하거나, 수용체가 활성화될 기회를 감소시킴으로써 감소된 다운스트림 신호전달을 야기하는 것이 가능하다. 수용체 엔토사이토시스는, 세포 표면 수용체의 농도를 물리적으로 감소시킴으로써, 원형질 막에 국소화된 여러 수용체의 신호전달 아웃풋을 감소시킬 수 있다는 것이 알려져 있다(문헌[Sorkin and Zastrow, “Endocytosis and Signaling: Intertwining Molecular Networks,” Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10:609-22 (2009)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
본원의 결과는, 초기 병변에서, LY4가 분화 표현형을 유도한다는 것을 추가적으로 입증한다. 그러나, 확립된 종양에서, 단일 작용제로서의 LY4는 종양을 정체 또는 퇴행으로 밀어낸다. 이는, 초기에, HER2+ 초기 병변에서 PERK 신호전달의 탈조절이, 아직 결정되지 않은 메커니즘을 통해, 분화 프로그램의 소실과 더 연관된다는 것을 입증한다. 이후, 종양의 바이올로지가 고도로 증식적으로 되는 변화로 인해, PERK에 대한 의존성은 이들 HER2+ 종양에 여전히 고도로 의존적이다. 이는 HER2 기능이 진행 동안 어떻게 변하는지와 연관될 수 있다; 초기 단계에서 형태형성 프로그램을 탈조절하여 아노이키스(anoikis) 저항성 및 파종을 유도하는 반면, 이후에는 증식 및 생존 프로그램에 주로 관여한다.
본원에 기술된 결과는 또한, 남아있는 휴면 세포를 제거할 수 있는 표준 항증식 치료법과 LY4의 조합의 가치를 시사한다. 이러한 접근법은 CDK4/6 억제제인 아베마시클립에 이어지는 LY4의 조합을 사용함으로써 테스트되었고, 이는 향상된 항-종양 효과를 나타냈다. 격려하듯이, 사용된 LY4의 용량은 비-종양 또는 종양을 갖는 마우스의 포도당 수준, 골수, 또는 말초 혈액 세포 수, 섭식 행동에 유의한 영향을 주지 않았다. 이는 사용된 용량이, 휴지 DCC 제거를 통해 종양 성장 및 전이를 심각하게 차단하는 반면, 숙주의 정상 기관 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다. 휴지/UPRhigh DCC는 또한 MHC-I 표면 발현을 하향조절하는 것으로 알려져 있고(문헌[Pommier et al., “Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases,” Science 360(6394):eaao4908 (2018)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨), LY4는 후천성 면역 반응이 DCC 및 확립된 것으로 보이는 종양 또한 타겟팅하도록 할 수 있다. 현재의 작업은 이러한 가능성을 다루고 있다. 본원에 기술된 결과는, 항-휴지 DCC 생존 치료법의 용도를 전이성 질환을 타겟팅하는 새로운 방법으로 이끌었다. 이는 증식, 느린-주기, 및 휴지 DCC를 포함할 수 있는, 파종성 질환에 대한 완전 표현형적 불균질성(full phenotypic heterogeneity)을 타겟팅하는 것을 가능하게 한다(문헌[Aguirre-Ghiso et al., “Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer,” Nat. Med. 19:276-277 (2013)], 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
실시예 8 - 흑색종 세포주에서 CDK4/6 억제제인 아베마시클립 및 PERK 억제제인 LY4의 조합
CDK4/6 억제제는 세포 주기 정지를 유도하고, LY4는 세포 주기가 정지된 휴지 DTC에서 세포 사멸을 유도하므로(도 12A), 이어서 CDK4/6 억제제 및 LY4가 시험관 내 세포주에서 세포 생존가능성을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. CDK4/6 억제제인 아베마시클립은, 2D 및 3D 시험관 내 세포 배양에서, WM35 흑색종 세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 1 주 간의 50 nM의 아메바시클립 전-처치(2D)에 이어지는 2 μM의 LY4의 시험관 내 급성 처치(48 시간)는, 2 μM의 LY4 단독으로의 세포 처치와 비교하여, Braf-돌연변이 흑색종 WM35 세포의 생존가능성을 감소시켰다(도 12B). 시험관 내 3D 배양에서, 1 주 간의 아베마시클립 전-처치에 이어지는 2 μM의 LY4의 첨가는 세포 생존가능성을 감소시키는 데 부가적인 효과를 가졌다(도 12C). 도 12C에 입증된 이들 결과는, 3D 세포 배양에서, 아베마시클립 전-처치가 성장 정지 및 일부 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것을 시사한다. LY4의 첨가는 이후 세포 사멸에 대한 영향을 향상시키는 것으로 보인다. 이는 GADD34 상향조절(도 12G) 및 이후 LY4에 대해 감수성을 갖게 되는 것에 의해 보여진 것처럼, 아베마시클립에 의해 정지된 세포가 ER 스트레스 반응을 상향조절할 수 있다는 개념에 부합한다.
흑색종 세포에서, 아베마시클립-저항성 표현형은 4 내지 5 주의 연속 처치 이후에 발생한다. 세포에 대한 LY4 및 아베마시클립의 공동-처치는, 2D 세포 배양에서 생존가능한 아베마시클립 저항성 세포의 수를 감소시키지만, 2D 배양에서 이들 실험을 수행하는 것으로부터 기대된 향상을 보이지 않는다. 그러나, 아베마시클립 저항성 세포의 경우, 지속적인 아베마시클립 처치 후, LY4는 3D 세포 배양에서 생존가능성을 감소시키는 데 부가적인 효과를 갖는다(도 12D 내지 12E). 이들 데이터는 흑색종 CDK4/6 억제제 저항성 세포가, 생존하기 위해, PERK에 의해 매개된 ER 스트레스 반응에 의존적으로 남아있다는 것을 입증한다. 시험관 내 3D 배양에서, 5 주 간의 아베마시클립 전-처치 후 LY4의 첨가는, DAPI를 흡수하는 세포의 세포자멸사에 의해 측정된 것처럼, 세포 생존가능성을 감소시키는 데 부가적인 효과를 갖는다(도 12F). 대조군 세포뿐만 아니라 저항성 세포가 2D 배양에서 성장하였지만, 아베마시클립 전-처치는 3D 배양에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 보인다(도 12F).
실시예 9 - BMP7-F9는 DTC의 휴지기를 유도하고 유지한다(HNSCC)
BMP-F9는 ERK/p38 활성 비율을 감소시키고, 휴지기 시그니쳐에서 다양한 mRNA를 유도한다(도 13A 내지 13C). 도 13A는, Hep3 HNSCC 세포에서의 웨스턴 블롯에 의해 결정된 것처럼, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 및 10 ng/ml에서의 BMP7-F9 처치(각각, 두 번째, 세 번째, 및 네 번째 회색 바; 대조군은 첫 번째 흑색 바)가 ERK/p38 활성 비율을 대조군에 비해 감소시킨다는 것을 보여준다. ERK/p38 활성 비율에 대한 효과는 2 내지 6 및 24 시간 후에 관찰되었다(두 번째부터 네 번째 컬럼 그룹). 초기 30 분에, ERK 활성은 BMP7에 의해 자극되었다(첫 번째 컬럼 세트). 도 13B는 BMP7-F9 처치가 DEC2, p53, 및 p27 mRNA를 유도하고(10 ng/ml의 BMP7-F9, 24 시간), 이는 휴지기 시그니쳐 유전자를 코딩한다. 도 13C는, 면역형광에 의해 결정된 것처럼(10 ng/ml, 24 시간), 동일 세포에서의 BMP7-F9 처치가, 강력한 휴지기 유도 전사 인자인 NR2F1의 핵 축적을 유도한다는 것을 보여준다. 도 13A 및 도 13B에서의 차이는 p<0.05로, 스튜던트 t 테스트를 사용하여 계산되었다.
시험관 내 및 생체 내 BMP7-F9은 T-HEp3 세포의 성장 정지를 유도하였다(도 14A 내지 14E). 도 14A는, 세포 역가 블루 어세이(RFU, 상대적 형광 단위)에 의해 결정된 것처럼, BMP7-F9 처치가 시험관 내에서 그들의 증식을 48 시간 동안 억제한다는 것을 보여준다. 도 14B는 도 14C 내지 14D에 사용된 생체 내 실험 절차에 대한 도식도이다. T-HEp3 세포를 시험관 내에서 BMP7-F9으로 24 시간 동안 전-처치하고, 이후 닭 배아 융모요막(CAM)에 접종하고(도 14C), 종양의 수집 및 HEp3 HNSCC 세포의 수/종양(도 14D) 및 P-H3의 수준(도 14E)의 정량화 이전에, 그들을 매일 생체 내에서 비히클 또는 BMP7-F9(50 ng/ml)으로 처치하였다.
NSG 마우스를 도 15A의 프로토콜에 따라 3 및 6 주 간 처치하였다. 이들 시점에서, 국소 재발 및 DTC 발생률의 백분율을 스코어링하였다. 도 15B에 대응되는 표로 작성된 결과는, 종양 수술 후, BMP7이 국소 재발의 발생률(표 9) 폐에서 DTC의 발생률(표 10)을 제한한다는 것을 보여준다(표 11).
표 9. 수술 마진에서의 국소 재발에 대한 어쥬번트 세팅에서의 BMP7-F9의 효과
Figure pct00028
표 10. 폐에서의 DCC 발생률에 대한 BMP7-F9의 효과
Figure pct00029
표 11. 도 15A 내지 15B 및 표 9 및 10에 묘사된 동일한 실험에서 GFP + /비멘틴 + 종양 세포/폐의 중앙값
Figure pct00030
HEp3-GFP HNSCC 종양을, 대략 300 mm3이 될 때까지 성장시켰고, 네오-어쥬번트 세팅(neo-adjuvant setting)에서 50 μg/kg의 BMP7-F9으로 종양이 대략 600 mm3이 될 때까지 처치하였다. 이후 수술을 통해 종양을 제거하였다. 수술 1 내지 2 일 후, BMP7-F9으로의 어쥬번트 처치를 또 다른 4 주 간 지속하였다. 동물을 이후 안락사하고, 폐에서의 DCC 부하를 형광 현미경을 사용하여 스코어링하였다. BMP7은 종양 수술 후 국소 및 원격 전이의 발생을 제한하는 것으로 관찰되었다. NSG 마우스를 도 15A의 프로토콜에 따라 4 주 간 처치하였다. 이들 시점에서, 국소 재발 및 DCC 발생률의 백분율을 스코어링하였다. 분리된 폐에서의 GFP 양성 세포의 수를, 처치에 이어 스코어링하였다. 이는, BMP7-F9 처치에 의해 유의적으로 감소되는, 폐 내 DCC부하에 대한 측정치이다. DCC 부하의 중앙값이 일 로그 떨어진다는 것 및 BMP-7이 7 마리 중 3 마리의 동물을 DCC로부터 명백히 치유시킨다는 것에 주목하라.
네오어쥬번트 + 어쥬번트 세팅에서 수술 마진에서의 국소 재발(표 12) 및 폐에서의 DCC 발생률(표 13)에 대한 BMP7-F9의 효과는 아래에 보여진다. 결과는 도 15C에서의 결과로부터 표로 작성되었고, 어쥬번트 처치가 4 주 간이라는 것을 제외하고는, 마우스를 도 15A에서와 같이 처치하였다. 분리된 폐에서의 GFP 양성 세포의 수를, 처치에 이어 스코어링하였다. 결과는, 네오어쥬번트 및 어쥬번트 처치와 종양 수술 후, BMP7이 국소 재발의 발생률(표 12) 및 폐에서의 DCC 발생률(표 13)을 제한한다는 것을 보여준다. 표 14는, BMP7-F9 처치에 의해 유의적으로 감소하는, 폐에서의 DCC 부하에 대한 측정치를 보여준다. DCC 부하의 중앙값이 일 로그 떨어진다는 것 및 BMP-7이, 7 마리 중 3 마리의 동물을 DCC로부터 명백히 치유시킨다는 것에 주목하라.
표 12. 수술 마진에서의 국소 재발에 대한 네오어쥬번트 + 어쥬번트 세팅에서의 BMP7-F9의 효과
Figure pct00031
표 13. 폐에서의 DCC 발생률
Figure pct00032
표 14. 표 12 및 13에서 보고된 마우스의 GFP+/비멘틴+ 종양 세포/폐의 중앙값
Figure pct00033
바람직한 실시태양이 본원에 자세히 묘사되고 기술되었지만, 다양한 변형, 부가, 치환 등이 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 것 및 따라서 이들은 이어지는 청구 범위에 정의된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다는 것은 관련 기술분야 내 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ICAHN SCHOOL OF MEDICINE AT MOUNT SINAI <120> METHODS OF TREATING MINIMAL RESIDUAL CANCER <130> 147535.00711 (170912) <150> 62/648,166 <151> 2018-03-26 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser 35 40 45 Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu 50 55 60 Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro 65 70 75 80 Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly 85 90 95 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser 100 105 110 Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr 115 120 125 Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys 130 135 140 Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu 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Pro Tyr Lys Ala 65 70 75 80 Val Phe Ser Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His 85 90 95 Phe Leu Thr Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu 100 105 110 His Asp Lys Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg 115 120 125 Phe Asp Leu Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu 130 135 140 Phe Arg Ile Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr 145 150 155 160 Phe Arg Ile Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu 165 170 175 Ser Asp Leu Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu 180 185 190 Gly Trp Leu Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val 195 200 205 Asn Pro Arg His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp 210 215 220 Gly Gln Ser Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly 225 230 235 240 Pro Gln Asn Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu 245 250 255 Val His Phe Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln 260 265 270 Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met 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Claims (47)

  1. 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 뼈 형태형성 단백질(“BMP7”) 유도 단백질로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체의 접촉된 DCC에서 휴지기를 유도하거나 유지하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    대상체는 유방암, 다발성 골수종, 폐암, 비소세포폐암, 뇌종양, 자궁경부암, 맨틀세포 림프종, 백혈병, 간세포암종, 전립선암, 흑색종, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경모세포종, 또는 대장직장암으로 진단된 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    암은 침윤성 유방암, 유관상피내암(DCIS), 소엽상피내암(LCIS), 및 염증성 유방암으로부터 선택되는 유방암인 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    유방암은 HER2+ 유방암인 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체는 파종성 종양 세포 및/또는 비-전이성 암으로 진단된 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    BMP7 유도체는 BMP7-F9인 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제, 면역요법제, 에피제네틱 작용제(epigenetic agent), 또는 이온화 방사선을 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    화학요법제가 대상체에 투여되고, 화학요법제는 트라스투주맙(Herceptin®) 및 라파티닙(Tykerb®)로부터 선택되는 항-HER2 화학요법제인 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    화학요법제가 대상체에 투여되고, 화학요법제는 안트라사이클린, 탁센, 키나제 억제제, 항체, 플루오로피리미딘, 및 백금 약물로부터 선택되는 것인, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    면역요법제가 대상체에 투여되고, 면역요법제는 면역 관문 억제제, 인터페론, 또는 종양 백신으로부터 선택되는 것인, 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    에피제네틱 작용제가 대상체에 투여되고, 에피제네틱 작용제는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 5-아자시티딘, 레티노산, 삼산화 비소, 인핸서 오브 제스트 2 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(Enhancer Of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit)(EZH2) 억제제, 브로모도메인(BRD) 억제제, 및 이의 유도체로부터 선택되는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉은 BMP7 유도 단백질을 대상체에 투여하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 이전에 대상체에서 DCC의 존재를 검출하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    DCC는 NR2F1+인 것인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    DCC는 뼈 형태형성 단백질 수용체 양성(“BMPR+”)인 것인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    DCC는 포스포-PERK 활성을 갖는 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 DCC를 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK) 억제제, MEK 억제제, CDK4/6 억제제, 또는 이의 임의의 조합으로 접촉시키는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 접촉은 PERK 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 접촉은 LY2, LY3, LY4, 및 이의 조합으로부터 선택되는 PERK 억제제로 수행되는 것인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉은 EIF2AK1, EIF2AK2, 또는 EIF2AK4를 억제하지 않는 PERK 억제제로 수행되는 것인, 방법.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 접촉은 MEK 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    MEK 억제제는 PD184352, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119/BAY869766으로부터 선택되는 것인, 방법.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 접촉은 CDK4/6 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    CDK4/6 억제제는 아베마시클립(LY2835219), 팔보시클립(PD0332991), 및 리보시클립(LEE011)으로부터 선택되는 것인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체는 인간인 것인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 이전에 암 관해 상태에 있는 대상체를 선택하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  27. 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 대상체에서 파종성 암 세포(DCC)를 LY2, LY3, 및 LY4로부터 선택되는 단백질 키나제 RNA-유사 소포체 키나제(PERK) 억제제로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 대상체에서 미세 잔존 암을 치료하기 위해 대상체에서 DCC를 제거하는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    대상체는 유방암, 다발성 골수종, 폐암, 비소세포폐암, 뇌종양, 자궁경부암, 맨틀세포 림프종, 백혈병, 간세포암종, 전립선암, 흑색종, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경모세포종, 또는 대장직장암으로 진단된 것인, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    암은 침윤성 유방암, 유관상피내암(DCIS), 소엽상피내암(LCIS), 및 염증성 유방암으로부터 선택되는 유방암인 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    유방암은 HER2+ 유방암인 것인, 방법.
  31. 제27항에 있어서,
    대상체는 파종성 종양 세포 및/또는 비-전이성 암으로 진단된 것인, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법제, 면역요법제, 에피제네틱 작용제, 또는 이온화 방사선을 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    화학요법제가 대상체에 투여되고, 화학요법제는 트라스투주맙(Herceptin®) 및 라파티닙(Tykerb®)으로부터 선택되는 항-HER2 화학요법제인 것인, 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    화학요법제가 대상체에 투여되고, 화학요법제는 안트라사이클린, 탁센, 키나제 억제제, 항체, 플루오로피리미딘, 및 백금 약물로부터 선택되는 것인, 방법.
  35. 제32항에 있어서,
    면역요법제가 대상체에 투여되고, 면역요법제는 면역 관문 억제제, 인터페론, 또는 종양 백신으로부터 선택되는 것인, 방법.
  36. 제32항에 있어서,
    에피제네틱 작용제가 대상체에 투여되고, 에피제네틱 작용제는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 5-아자시티딘, 레티노산, 삼산화 비소, 인핸서 오브 제스트 2 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(EZH2) 억제제, 브로모도메인(BRD) 억제제, 및 이의 유도체로부터 선택되는 것인, 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉은 PERK 억제제를 대상체에 투여하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 이전에 대상체에서 DCC의 존재를 검출하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    DCC는 NR2F1+인 것인, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    DCC는 포스포-PERK 활성을 갖는 것인, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    DCC는 뼈 형태형성 단백질 수용체 양성(“BMPR+”)인 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    대상체에서 DCC를 뼈 형태형성 단백질 7(BMP7) 유도 단백질로 접촉시키는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    대상체에서 상기 DCC를 BMP7 유도 단백질로 접촉시키는 것은 BMP7 유도 단백질을 대상체에 투여하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    BMP7 유도 단백질은 BMP7-F9인 것인, 방법.
  45. 제27항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    PERK 억제제는 EIF2AK1, EIF2AK2, 또는 EIF2AK4를 억제하지 않는 것인, 방법.
  46. 제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체는 인간인 것인, 방법.
  47. 제27항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 이전에 암 관해 상태에 있는 대상체를 선택하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
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