BR112020019023A2 - Métodos de tratamento do câncer residual mínimo - Google Patents

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BR112020019023A2
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Julio A. Aguirre-Ghiso
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Icahn School Of Medicine At Mount Sinai
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Abstract

a presente invenção refere-se a métodos de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo. os métodos envolvem o contato de células cancerosas disseminadas (dccs) em um indivíduo com uma proteína derivada da proteína morfogênica óssea 7 (bmp7), onde o contato induz ou mantém a latência nas dccs contatadas do indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo. também são descritos métodos que envolvem o contato de dccs em um indivíduo com um inibidor do retículo endoplasmático cinase similar ao rna de proteína cinase (perk) selecionado dentre ly2, ly3 e ly4, onde o referido contato erradica dccs no indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE TRATAMENTO DO CÂNCER RESIDUAL MÍNIMO".
[001] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido de Patente Provisório Norte-americano Nº de série 62/648.166, depositado em 26 de março de 2018, que é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade.
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob R01 CA109182, U54 CA16131 e P30 CA196521 concedido pelo National Institute of Health/National Cancer Institute e BC 132674 concedido pelo Department of Defense-Congressionally Directed Medical Research Programs. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
CAMPO
[003] A presente descrição se refere a métodos de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo.
ANTECEDENTES
[004] O enovelamento de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático ("ER") ativa três vias principais, PERK, IRE1α e ATF6, também conhecidas como resposta proteica enovelada ("UPR"), que permite às células corrigir e sobreviver a esse estresse (Walter et al., "The Unfolded Protein Response: From Stress Pathway to Homeostatic Regulation," Science 334: 1081-1086 (2011) e Ron et al., "Signal Integration In the Endoplasmic Reticulum Unfolded Protein Response," Nat. Rev. Mol Cell Biol. 8: 519-529 (2007)). Evidências recentes sugerem que, em vários tipos de câncer, a UPR é um mecanismo que permite que as células tumorais respondam às demandas do ER e às condições oxidativas impostas por uma carga translacional realçada causada por oncogenes e hipóxia, entre outros sinais (Blais et al., "Activating Transcription Factor 4 is Translationally Regulated by Hypoxic Stress," Mol. Cell. Biol. 24:7469-7482 (2004); Chevet et al., "Endoplasmic Reticulum Stress-Activated Cell
Reprogramming in Oncogenesis," Cancer Discov. 5:586-597 (2015); Tameire et al., "Cell Intrinsic and Extrinsic Activators of the Unfolded Protein Response in Cancer: Mechanisms and Targets for Therapy," Semin.
Cancer Biol. 33:3-15 (2015); Hart et al., "ER Stress-Mediated Autophagy Promotes Myc-Dependent Transformation and Tumor Growth," J.
Clin.
Invest. 122:4621-4634 (2012); Martin-Perez et al., "Activated ERBB2/HER2 Licenses Sensitivity to Apoptosis Upon Endoplasmic Reticulum Stress Through a PERK-Dependent Pathway," Cancer Res. 74:1766-1777 (2014); Rajasekhar et al., "Postgenomic Global Analysis of Translational Control Induced by Oncogenic Signaling," Oncogene 23:3248-3264 (2004); Rajasekhar et al., "Oncogenic Ras and Akt Signaling Contribute to Glioblastoma Formation by Differential Recruitment of Existing mRNAs to Polysomes," Mol.
Cell 12:889-901 (2003); Rojo et al., "4E-Binding Protein 1, A Cell Signaling Hallmark in Breast Cancer that Correlates With Pathologic Grade and Prognosis," Clin.
Cancer Res. 13:81-89 (2007); e Sequeira et al., "Inhibition of eIF2alpha Dephosphorylation Inhibits ErbB2-Induced Deregulation of Mammary Acinar Morphogenesis," BMC Cell Biol. 10:64 (2009)). As vias ativadas por oncogene aumentam a carga de proteína cliente do ER ativando a sinalização mTOR e o início da translação (Hart et al., "ER Stress- Mediated Autophagy Promotes Myc-Dependent Transformation and Tumor Growth," J.
Clin.
Invest. 122:4621-4634 (2012); Ozcan et al., "Loss of the Tuberous Sclerosis Complex Tumor Suppressors Triggers the Unfolded Protein Response to Regulate Insulin Signaling and Apoptosis," Mol.
Cell 29:541-551 (2008); e Tameire et al., "Cell Intrinsic and Extrinsic Activators of the Unfolded Protein Response in Cancer: Mechanisms and Targets for Therapy," Semin.
Cancer Biol. 33:3-15 (2015)). PERK e as vias IRE1α-XBP-1 também mostraram contribuir para a adaptação à hipóxia e estresse microambiental (Bi et al., "ER
Stress-Regulated Translation Increases Tolerance to Extreme Hypoxia and Promotes Tumor Growth," EMBO J. 24:3470-3481 (2005); Blais et al., "Activating Transcription Factor 4 is Translationally Regulated by Hypoxic Stress," Mol. Cell. Biol. 24:7469-7482 (2004); Chen et al., "XBP1 Promotes Triple-Negative Breast Cancer by Controlling the HIF1alpha Pathway," Nature 508:103-107 (2014); Romero-Ramirez et al., "X box-Binding Protein 1 Regulates Angiogenesis in Human Pancreatic Adenocarcinomas," Transl. Oncol. 2:31-38 (2009); Rouschop et al., "The Unfolded Protein Response Protects Human Tumor Cells During Hypoxia Through Regulation of the Autophagy Genes MAP1LC3B and ATG5," J. Clin. Invest. 120:127-141 (2010); Schewe et al., "ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells In Vivo," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 105:10519-10524(2008); e Ye et al., "The GCN2-ATF4 Pathway is Critical for Tumour Cell Survival and Proliferation in Response to Nutrient Deprivation," EMBO J. 29:2082-2096 (2010)), sugerindo que a UPR pode permitir a adaptação a mudanças no meio.
[005] A ativação de PERK coordena uma resposta antioxidante e autofágica para proteger as células epiteliais mamárias durante a perda de adesão à membrana basal (Avivar-Valderas et al., "PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment," Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011)). Esta resposta de sobrevivência envolve um programa de transcrição ATF4 e CHOP (Avivar-Valderas et al., "PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment," Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011)) acoplado a uma rápida ativação da via LKB1- AMPK-TSC2 que inibe mTOR (Avivar-Valderas et al., "Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK," Oncogene 32(41):4932-40 (2013)). Lesões de
DCIS humano exibiram fosforilação e autofagia realçadas de PERK (Avivar-Valderas et al., "PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment," Mol. Cell. Biol. 31:3616-3629 (2011) and Espina et al., "Malignant Precursor Cells Pre-Exist in Human Breast DCIS and Require Autophagy for Survival," PloS One 5:e10240 (2010)) e ablação condicional de PERK no carcinogênese mamária retardada do epitélio mamário promovida pelo oncogene HER2 (Bobrovnikova-Marjon et al., "PERK Promotes Cancer Cell Proliferation and Tumor Growth by Limiting Oxidative DNA Damage," Oncogene 29:3881-3895 (2004) e Bobrovnikova-Marjon et al., "PERK-Dependent Regulation of Lipogenesis During Mouse Mammary Gland Development and Adipocyte Differentiation," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 105:16314- 16319 (2008)). Além disso, o HER2 aumenta os níveis de proteotoxicidade em células tumorais, ativando a sinalização JNK e IRE e permitindo que as células cancerosas HER2+ lidem com esse estresse (Singh et al., "HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive," Sci. Signal. 8:ra52 (2015)). Assim, o banco de dados cBIO (Cerami et al., "The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data," Cancer Discov. 2:401-404 (2012)) mostraram que ~ 14% dos tumores de mama humanos amplificados por HER2 exibem super-regulação de mRNA de PERK, apoiando ainda mais a noção de que os tumores HER2+ podem ser dependentes de PERK e/ou outras vias de UPR para sobrevivência.
[006] As células tumorais latentes (quiescentes) também mostraram ser dependentes da sinalização de PERK e ATF6 para a sobrevivência (Ranganathan et al., "Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase in Tumor Cell Growth Arrest and Survival," Cancer Res. 68:3260-3268 (2008); Ranganathan et al.,
"Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells," Cancer Res. 66:1702-1711 (2006); e Schewe et al., "ATF6alpha-Rheb- mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells In Vivo," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 105:10519-10524(2008)). Células cancerosas disseminadas pancreáticas quiescentes ("DCCs") em fígados também exibiram uma UPR dependente de PERK que foi associada à perda de expressão de E-caderina e subregulação de MHC-I, favorecendo a evasão imunológica durante a latência (Pommier et al., "Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases," Science 360(6394):eaao4908 (2018), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). No modelo MMTV- HER2, as DCCs quiescentes na medula óssea e nos pulmões também foram consideradas E-caderina negativas (Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer", Nature 540:588-592 (2016)) mas o link para a UPR não foi testado. Juntos, esses dados sugerem que a UPR pode servir como um mecanismo de sobrevivência adaptativa microambiental e imunológico para DCCs.
[007] A presente descrição é direcionada para a superação de deficiências na técnica.
SUMÁRIO
[008] Um aspecto da descrição se refere a um método de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo. Este método envolve o contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com uma proteína derivada de proteína morfogênica óssea 7 ("BMP7"), onde o referido contato induz ou mantém a latência nas DCCs contatadas do indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo. Os métodos deste aspecto podem ser utilizados para evitar que o câncer residual mínimo progrida para um crescimento agressivo no indivíduo.
[009] Outro aspecto se refere a um método de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo, cujo método envolve o contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com um inibidor de retículo endoplasmático cinase similar ao RNA de proteína cinase ("PERK") selecionado de LY2, LY3, e LY4, onde o referido contato erradica DCCs no indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo.
[0010] Ainda outro aspecto se refere a um método de tratamento de câncer em estágio avançado em um indivíduo. Este método envolve o contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com um inibidor de retículo endoplasmático cinase similar a RNA de proteína cinase (PERK) selecionado de LY2, LY3 e LY4, onde o referido contato erradica DCCs no indivíduo para tratar o câncer em estágio avançado em o indivíduo.
[0011] A seguir é descrita, entre outras coisas, a demonstração de que LY4, um inibidor seletivo e potente de PERK, pode bloquear a metástase induzida por HER2 como resultado de sua capacidade de causar especificamente a erradicação de DCCs latentes. A partir desta descrição, os inibidores de PERK representam uma nova estratégia para alvejar células latentes solitárias durante os estágios residuais mínimos da doença, sozinhos ou em combinação com terapias antiproliferativas para ajudar a prevenir metástases letais. Também descrito a seguir está a demonstração de que proteínas derivadas morfogênicas ósseas podem induzir latência em células tumorais disseminadas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0012] As Figuras 1A-1C mostram que células HER2+ disseminadas quiescentes exibem altos níveis de ativação da via de estresse de ER. Figura 1A mostra imagens de seções de pulmão de animais MMTV-HER2 corados para HER2, Ki67 (proliferação) e GADD34 (estresse de ER). O gráfico da Figura 1A mostra a quantificação de células/metástases positivas para ambos os marcadores como uma porcentagem do total de células. Figura 1B mostra imagens de metástases de câncer de mama humano de diferentes locais (linfonodo, fígado, pulmão) coradas para citoqueratinas, Ki67 (proliferação) e GADD34 (estresse de ER). O gráfico da Figura 1B mostra a quantificação de células/metástases positivas para ambos os marcadores como uma porcentagem do total de células. Figura 1C mostra o agrupamento hierárquico do perfil de expressão gênica direcionada de alto rendimento (colunas) de células individuais (células tumorais disseminadas de pulmão ("DTCs")) (linhas).
[0013] As Figuras 2A-2G demonstram que a inibição de PERK é super-regulada em um paciente com células cancerígenas HER2+. Figura 2A é um diagrama de fluxo das etapas seguidas para a análise de expressão gênica de célula única com C1 e Biomark HD Fluidigm. Um total de 255 DCCs e 90 células de tumor primário ("PT") foi analisado. A Figura 2B mostra uma lista dos genes analisados por qPCR de alto rendimento. A Figura 2C é um imunomanchamento que mostra a inibição da fosforilação de PERK por inibidores da série LY (LY2, LY3 e LY4) e GSK2656157 (2 µM) em células MCF10A-HER2 estressadas, colocando-as em suspensão por 24 horas. * indica bandas não específicas. A Figura 2D mostra uma curva de viabilidade celular de resposta à dose LY4 (Cell Titer Blue, CTB) em células MCF10A-HER2, na ausência (-) ou na presença de estresse (tapsigargina em dose baixa, Tg 2 nM) após 48 horas. A linha tracejada indica IC50 (≈ 9 nM). A Figura 2E mostra a seletividade da cinase dos inibidores PERK LY4, LY2, LY3 e GSK2656157 conforme avaliado por ensaio bioquímico enzimático. A Figura 2F mostra o efeito de LY4 nas células da medula óssea total (em dois membros inferiores) em fêmeas MMTV-HER2 tratadas por duas semanas. A Figura 2G mostra o efeito de LY4 em glóbulos brancos totais em fêmeas MMTV-HER2 tratadas por duas semanas.
[0014] As Figuras 3A-3G mostram que a inibição de LY4 PERK diminui a doença metastática nos pulmões e na medula óssea no nível de células tumorais disseminadas. A Figura 3A é um imunomanchamento que mostra a inibição da fosforilação de PERK (T980) pelo inibidor de PERK LY4 (2 µM) em células MCF10A-HER2 privadas de soro durante a noite e tratadas com EGF (100 ng/ml) por 15 min. Na Figura 3B, fêmeas MMTV-HER2+ (24 semanas de idade) foram injetadas diariamente com veículo ou LY4 (50 mpk) por duas semanas. A imunohistoquímica ("IHC") de seções de pâncreas e glândulas mamárias com anticorpos para P-PERK e P-EIF2α são mostradas. As inserções mostram ampliações maiores. Barras de escala, 100 µm. A Figura 3C mostra uma imagem e quantificação (gráfico à direita) de macrometástases (> 100 células) detectadas por manchamento H&E e quantificadas em 5 seções de pulmão/animal (n = 16). Barra de escala, 100 µm. p por pelo teste de Mann-Whitney. A Figura 3D mostra uma imagem e quantificação (gráfico à direita) de micrometástases (2-100 células) detectadas por manchamento IHC usando um anticorpo anti-HER2 e quantificadas por seção de pulmão/animal ± d.s. (n = 6). Barra de escala, 25 µm. p pelo teste de Mann-Whitney. A Figura 3E mostra uma imagem e quantificação (gráfico à direita) de células tumorais disseminadas solitárias (DTCs) detectadas por manchamento IHC para HER2, classificadas como P- Rb+ ou P-Rb- e quantificadas por seção pulmonar ± s.d. (n = 6). Barra de escala, 25 µm. p pelo teste de Mann-Whitney. A seta e o círculo na imagem indicam uma DTC solitária. A Figura 3F mostra uma imagem e quantificação (gráfico à direita) de células tumorais disseminadas na medula óssea detectadas por manchamento IF para CK8/18 e HER2 em cytospinas de tecido de medula óssea depletado de células hematopoiéticas maduras (n = 8). Barra de escala, 25 µm. p pelo teste de Mann-Whitney. As setas indicam células Her2+. A Figura 3G mostra imagens representativas de células ZR75.1 HER2+ projetadas para expressar proteínas H2B marcadas com Dendra semeadas em Matrigel em baixa densidade (células individuais). No dia 0, o marcador Dendra (fluorescência verde) foi fotoconvertido com um único pulso de luz UV para fluorescência vermelha e usado como uma indicação de quiescência. As cavidades foram tratadas do dia 2 ao dia 8 com veículo (DMSO) ou LY4 (2 µM). Os gráficos mostram a porcentagem de células vivas no dia 8 medidas ± dp. (n = 4). p pelo teste t de Student.
[0015] As Figuras 4A-4F mostram o efeito do tratamento com LY4 na metástase e nas células tumorais circulantes ("CTCs"). A Figura 4A mostra a área normalizada de macro metástases únicas em animais tratados com veículo e LY4 (n = 21 e 15). p pelo teste de Mann- Whitney. A Figura 4B é um gráfico que mostra a quantificação de células tumorais circulantes/ml de sangue por manchamento de HER2 de cytospins. A Figura 4C mostra uma imagem e um gráfico mostrando a porcentagem de micrometástase de P-Rb+ por seção de pulmão/animal (n = 4 e 6). A Figura 4D é uma imagem que mostra 100% de fotoconversão em ZR75.1-H2B-Dendra de fluorescência verde para fluorescência vermelha no dia 0, após a semeadura em Matrigel 3D. Na Figura 4E, células fotoconvertidas ZR75.1-H2B- Dendra foram semeadas em baixa (células individuais) ou alta densidade. O gráfico mostra a porcentagem de retenção de rótulo vermelho em células semeadas como células individuais ou em alta densidade ± dp. (n = 4). p pelo teste t de Student. A Figura 4F é como na Figura 4D, mas as células semeadas em alta densidade foram tratadas do dia 2 ao dia 8 com veículo (DMSO) ou LY4 (2 µM). O gráfico mostra que a porcentagem de colônias vivas foi medida ± dp. no dia 8 (n = 4). p pelo teste t de Student.
[0016] As Figuras 5A-5C demonstram que a inibição de PERK é super-regulada em células Her2+. A Figura 5A mostra que PERK (EIF2AK3) é super-regulada em uma subpopulação de pacientes com câncer de mama por HER2+. Análise de casos HER2+ com dados de câncer de mama TCGA (58 tumores) usando cBioPortal. A Figura 5B mostra imagens representativas de manchamento de carmim de uma glândula mamária normal FVB de montagem inteira em comparação com a montagem inteira de glândula mamária MMTV-neu tratada com veículo e LY4. A Figura 5C mostra a quantificação de estruturas histológicas (de ducto vazio normal a neoplasia intraepitelial mamária similar a DCIS), imagens superiores e ampliações mais altas na linha inferior) presentes em seções de glândulas mamárias coradas com H&E.
[0017] As Figuras 6A-6C mostram que o inibidor PERK LY4 causa a "normalização" da glândula mamária no modelo de câncer de mama MMTV-HER2+. A Figura 6A mostra imagens representativas de manchamento de carmim de glândulas mamárias de montagem inteira e seções de glândula mamária coradas com H&E de animais tratados com veículo e LY4. Barra de escala, 100 µm. A Figura 6B mostra a quantificação de estruturas histológicas (ducto vazio e.d., ducto ocluído o.d., hiperplasia ocluída o.h. e neoplasia intraepitelial mamária similar a DCIS M.I.N) presentes em seções de glândula mamária coradas com H&E (n = 50/animal, animais n = 13) encontradas em animais tratados com veículo e LY4 ± sem Significância estatística (p) calculada pelo teste de Mann-Whitney. A Figura 6C mostra IHC para o marcador luminal epitelial citoqueratina 8/18 (CK8/18) e o marcador mioepitelial actina do Músculo Liso ("SMA") em seções da glândula mamária. O gráfico mostra a pontuação das estruturas CK8/18+ e SMA+ por animal, n = 12. p pelo teste de Mann-Whitney. Barra de escala, 75 µm.
[0018] As Figuras 7A-7F mostram o efeito do tratamento com LY4 nos níveis de P-PERK, níveis de P-histona H3 e tamanho do tumor. A Figura 7A é um Western blot para os níveis de P-PERK em lisados de tumor MMTV-neu de animais tratados com veículo e LY4. A Figura 7B mostra os volumes do tumor de fêmeas tratadas com veículo (superior) e LY4 (inferior) (mm3). Cada linha representa um tumor. A Figura 7C mostra a redução percentual no tamanho do tumor em fêmeas tratadas com LY4 que apresentaram redução do tumor. Cada linha representa um tumor e um animal. A Figura 7D mostra IHC para P-histona H3 em seções de tumor da glândula mamária, imagens representativas e quantificação (gráfico à direita). p pelo teste de Mann-Whitney. Na Figura 7E, células ZR75.1 superexpressando HER2 foram semeadas em matrigel e após o estabelecimento do ácino (dia 10) as cavidades foram tratados com veículo (controle) ou LY4 (2 µM) durante 10 dias. O gráfico mostra a porcentagem de células positivas para caspase-3 clivadas por ácinos (n = 20) ± d.p. p por Teste t de Studen. Na Figura 7F, células MCF10A-HER2 foram semeadas em Matrigel e após o estabelecimento do ácino (dia 4) as cavidades foram tratadas com veículo (controle) ou LY4 (2 µM) por 10 dias. O gráfico mostra a porcentagem de células positivas para H3 de histona P por ácinos (n = 20) ± d.s. p pelo teste t de Student.
[0019] As Figuras 8A-8D mostram que a inibição de PERK prejudica o crescimento do tumor em fêmeas MMTV-HER2+. Na Figura 8A, fêmeas MMTV-neu (24 a 32 semanas de idade) apresentando tumores evidentes foram injetadas diariamente com veículo ou LY4 (50 mpk) por duas semanas. O gráfico mostra a variação percentual do tamanho do tumor em animais tratados com veículo e LY4 ± d. (n = 16). p pelo teste de Mann-Whitney. A Figura 8B é um gráfico que mostra o volume final do tumor (mm3). Os whiskers representam o mínimo e o máximo dos dados (n = 16). p pelo teste de Mann-Whitney. A Figura 8C mostra IHC representativo de manchamento TUNEL para medir os níveis de apoptose em seções de tumor. Barras de escala, 10 e 50 µm. Gráfico, porcentagem de células TUNEL positivas em seções de tumor tratadas com veículo e LY4 (n = 5). p pelo teste de Mann- Whitney. Na Figura D, as células 8D, HER2+ MCF10A-HER2 ou SKBR3 foram semeadas em Matrigel e após o estabelecimento do ácino (dia 4) as cavidades foram tratadas com veículo (controle) ou LY4 (2 µM) por 10 dias. O gráfico mostra a porcentagem de células positivas para caspase-3 clivadas por ácinos (n = 20) ± d.p. p pelo teste t de Student. Imagens confocais representativas de MCF10A- HER2 acini corados para caspase-3 clivada.
[0020] As Figuras 9A-9F mostram que o tratamento com LY4 diminui os níveis de fosfo-HER2 e as vias de sinalização a jusante. A Figura 9A mostra imagens representativas de IHC para P-HER2, P- PERK e P-EIF2α em uma seção de tumor de mama MMTV-HER2. Observe que a borda positiva para P-HER2 se sobrepõe aos manchamentos de P-PERK e P-EIF2α. Barra de escala, 100 µm. A Figura 9B mostra o agrupamento hierárquico do perfil de expressão gênica direcionada de alto rendimento (colunas) de células individuais (tumor de mama primário) (linhas) de fêmeas MMTV-HER2. A Figura 9C mostra manchamento representativo de P-HER2 e HER2 total IHC em tumores de mama tratados com veículo e LY4. O gráfico mostra a pontuação P-HER2 em tumores tratados com veículo e LY. Quantificação dos níveis de P-HER2 em seções de tumor, por intensidade de IHC e pontuação de área (n = 11) (veja a Figura 10A).
Barra de escala, 50 µm. p pelo teste de Mann-Whitney. Na Figura 9D, células MCF10A-HER2 foram privadas de alimentação durante a noite e tratadas com +/- LY4 (2 µM), após o que +/- EGF (100 ng/mL) foi adicionado durante 15 minutos antes da coleta. Os níveis de P-HER2, P-EGFR, P-AKT, P-S6 e P-ERK, bem como HER2 total e EGFR foram avaliados por Western blot. GAPDH e β-TUB foram usados como controles de carregamento. É mostrado um blot representativo de três. Análise densitométrica para P-HER2 (n = 3) ± dp. p pelo teste t de Student. Na Figura 9E, as células MCF10A-HER2 foram tratadas como na Figura 9D e o ensaio de biotinilação do receptor de superfície foi realizado. Os níveis de superfície de HER2 total e P-HER2 foram avaliados. A densitometria para P-HER2 é mostrada. Na Figura 9F, células MCF10A-HER2 foram tratadas como na Figura 9D e ensaio de biotinilação de receptor de superfície reversível foi realizado. Os níveis endocitados de HER2 total e P-HER2 foram avaliados. Um dos dois experimentos mostrados.
[0021] As Figuras 10A-10C mostram a quantificação dos níveis de P-HER2 em células MCF10A-HER2. A Figura 10A mostra o sistema de pontuação usado para a quantificação dos níveis de P-HER2 em seções de tumor da glândula mamária. A área positiva de IHC P-HER2 foi multiplicada por sua pontuação de intensidade de acordo com a pontuação estabelecida mostrada nessas imagens representativas. Barra de escala, 100 µm. Na Figura 10B, células MCF10A-HER2 foram mantidas em jejum durante a noite e tratadas com +/- LY4 (2 µM), após o que +/- EGF (100 ng/ml) foi adicionado por 20 minutos antes da coleta. Os níveis de P-HER2/Y1112 e P-HER2/Y877 foram avaliados por Western blot. GAPDH e HSP90 foram usados como controles de carregamento. A Figura 10C mostra a entrada para os extratos usados no ensaio de biotinilação de superfície.
[0022] As Figuras 11A-11E mostram que a inibição sequencial de
CDK4/6 seguida pela inibição de PERK aumenta o efeito antimetastático de LY4. A Figura 11A é uma ilustração esquemática de um experimento in vivo projetado para avaliar o tratamento sequencial de Abemaciclibe e LY4 em um modelo de camundongo MMTV- neu/HER2+. Camundongos fêmeas MMTV-neu/HER2+ (24 semanas de idade) foram tratados diariamente com o inibidor de CDK4/6 Abemaciclibe (50 mpk) por 4 semanas, seguido por +/- LY4 (50 mpk). A Figura 11B é uma série de IHC de fluorescência de seções tumorais para HER2, Ki67 (proliferação) e GADD34 (estresse de ER). Barras de escala, 100 µm. As setas indicam alta fluorescência. A Figura 11C é um gráfico que mostra o número de macrometástases (> 100 células) detectadas por manchamento H&E e quantificadas em 5 seções de pulmão/animal (n = 8). p pelo teste de Mann-Whitney. A Figura 11D é um gráfico que mostra o número de micrometástases (2-100 células) detectadas por manchamento IHC usando um anticorpo anti-HER2 e quantificado por seção de pulmão/animal ± d.d. (n = 8). p pelo teste de Matt-Whitney. A Figura 11E é um gráfico que mostra o número de células tumorais disseminadas solitárias detectadas por manchamento IHC para HER2, classificadas como Ki67+ ou Ki67- e quantificadas por seção pulmonar ± dp. (n = 8). p pelo teste de Matt-Whitney.
[0023] As Figuras 12A-12G mostram propostas de monoterapias ou terapias de combinação que incluem o uso de LY4 e experimentos que mostram que o tratamento de células de melanoma com o inibidor de CDK4/6 Abemaciclibe em combinação com LY4 afeta diferencialmente a viabilidade celular in vitro em cultura 2D e 3D. A Figura 12A é uma ilustração esquemática do fundamento lógico para a combinação de Abemaciclibe e LY4. A Figura 12B é um gráfico de barras que mostra os resultados de um tratamento in vitro de células de melanoma mutante Braf (WM35) com 0 nM, 10 nM ou 50 nM de Abemaciclibe por 1 semana seguido por 48 horas de tratamento com 2 µM de LY4. A Figura 12C inclui imagens de células coradas com DAPI após pré-tratamento com Abemaciclibe por uma semana, seguido por tratamento com 2 µM de LY4. 5.000 células foram semeadas em matrigel. Nas Figuras As células de melanoma 12D-12E, WM35 foram pré-tratadas com Abemaciclibe durante 5 semanas, seguido de tratamento com LY4 em meio completo e Abemaciclibe. As células foram coradas com azul Tripano para identificar células viáveis. A Figura 12D é um gráfico que mostra células sensíveis ao Abemaciclibe. A Figura 12E é um gráfico que mostra células resistentes ao Abemaciclibe. A Figura 12F mostram imagens de células coradas com DAPI após pré-tratamento com Abemaciclibe por 5 semanas e co-tratamento com 2 µM de LY4 e Abemaciclibe. 1.000 células foram semeadas em matrigel. A Figura 12G sugere que quando a parada do crescimento é induzida com Abemaciclibe, as células super-regulam um alvo PERK (GADD34), o que pode explicar por que as células são sensíveis a LY4. As células de melanoma WM35 virgens ou resistentes (R) ao Abemaciclibe foram tratadas em cultura com o veículo (-) ou 150 e 300 nM de Abemaciclibe durante 24 horas. As células foram então lisadas e sondadas via western blot para a expressão de GADD34. A expressão da tubulina foi usada como controle de carregamento. Observe que nas células naïve de Abemaciclibe, GADD34 é super-regulada, sugerindo ativação de PERK. As células resistentes parecem mostrar níveis mais elevados de GADD34 que não mudam ou diminuem após o tratamento adicional com Abemaciclibe.
[0024] As Figuras 13A-13C demonstram o efeito de BMP7-F9 na relação de atividade de ERK/p38 e vários mRNAs associados a genes de assinatura de latência. A Figura 13A mostra que o tratamento com BMP7-F9 a 2 ng/ml, 5 ng/ml e 10 ng/ml (segunda, terceira e quarta barras cinza, respectivamente: o controle é a primeira barra preta)
reduz a relação de atividade de ERK/p38 sobre o controle, conforme determinado por Western blot em células HEp3 HNSCC. O efeito na relação de atividade de ERK/p38 é observado após 2-6 e 24 horas (do segundo ao quarto grupo de colunas). Nos primeiros 30 minutos, a atividade de ERK é estimulada por BMP7 (primeiro conjunto de colunas). A Figura 13B mostra que o tratamento com BMP7-F9 induz mRNAs DEC2, p53 e p27 (10 ng/ml BMP7-F9, 24 horas), que codificam genes de assinatura de latência. A Figura 13C mostra que o tratamento com BMP7-F9 das mesmas células induz o acúmulo nuclear de NR2F1, um fator de transcrição potente que induz latência, conforme determinado por imunofluorescência (10 ng/ml, 24 horas). As setas indicam fluorescência de NR2F1. Diferenças nas Figura 13A e Figura 13B, p < 0,05 conforme calculado usando o teste t de Student. Esses dados suportam a hipótese de que BMP7-F9 é um forte indutor de genes de latência encontrados super-regulados em DCCs espontaneamente latentes ou aqueles induzidos por reprogramação ou sinalização de TGFß2 na medula óssea.
[0025] As Figuras 14A-14E mostram como BMP7-F9 in vitro e in vivo induz a parada do crescimento de células T-HEp3. A Figura 14A mostra que o tratamento com BMP7-F9 de células T-HEp3 inibe sua proliferação in vitro por 48 horas, conforme determinado pelo ensaio azul de título de célula (RFU, unidades de fluorescência relativa). A Figura 14B é uma ilustração esquemática do procedimento experimental in vivo usado nas Figuras 14C-14D. As células T-HEp3 foram pré-tratadas por 24 horas com BMP7-F9 in vitro e então inoculadas em membranas corioalantóicas de embrião de galinha ("CAM" s) (Figura 14C), onde foram tratadas diariamente in vivo com veículo ou BMP7-F9 (50 ng/ml) antes da coleta dos tumores e quantificação do número de células HEp3 HNSCC (Figura 14D) e níveis de P-H3 (Figura 14E). Setas na Figura 14E indicam fluorescência P-H3 e DAPI sobreposta. Estes dados suportam a hipótese de que os marcadores de latência identificados na Figura 13B se correlacionam com a supressão de crescimento in vitro e in vivo em um experimento de curto prazo no sistema CAM.
[0026] As Figuras 15A-15C mostram a avaliação do tratamento com BMP7-F9 em um modelo de doença de camundongo. A Figura 15A é uma ilustração esquemática de um procedimento experimental in vivo usado para avaliar o efeito de BMP7-F9 no início da metástase. Tumores HEp3-GFP HNSCC foram cultivados até atingirem aproximadamente 300 mm3 e então tratados no ambiente neoadjuvante com 50 µg/kg de BMP7-F9 até os tumores terem aproximadamente 600 mm3. Os tumores foram removidos por meio de cirurgia. 1-2 dias após a cirurgia, o tratamento adjuvante com BMP7- F9 foi continuado por mais 3, 4 ou 6 semanas. Os animais foram então sacrificados e a carga de DCC no pulmão foi avaliada usando microscopia de fluorescência. A Figura 15B mostra que BMP7 limita o desenvolvimento de recorrências locais e distantes após a cirurgia do tumor. Os camundongos NSG foram tratados seguindo o protocolo da Figura 15A por 3 e 6 semanas. Nesses momentos, a porcentagem de recorrência local e incidência de DCC foi pontuada. Na Figura 15C, os camundongos foram tratados como na Figura 15A, exceto que o tratamento adjuvante tenha sido por 4 semanas. O número de células positivas para GFP em pulmões dissociados foi classificado após o tratamento. Esta é uma medida da carga de DCC nos pulmões que é significativamente diminuída pelo tratamento com BMP7-F9. Observe que a mediana da carga de DCC cai um log e que BMP-7 aparentemente cura de DCCs 3 de 7 animais.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0027] São descritos no presente documento métodos de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo. Um aspecto da descrição se refere a um método de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo. Este método envolve o contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com uma proteína derivada da proteína morfogênica óssea 7 (BMP7). O contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com uma proteína derivada da proteína morfogênica óssea 7 (BMP7) induz ou mantém a latência nas DCCs contatadas do indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo.
[0028] Quando no presente documento usado, a frase "câncer residual mínimo" inclui uma situação ou condição em que, por critérios radiográficos e histológicos padrão, não há evidência de câncer em um indivíduo, mas onde o indivíduo de fato tem células cancerosas residuais (ou seja, DCCs) em o sangue (como CTCs) ou medula óssea ou nódulos linfáticos (como DTCs). O câncer residual mínimo pode ocorrer após o tratamento do câncer por quimioterapia, cirurgia e/ou radioterapia. Os métodos de detecção radiográfica e histológica padrão podem incluir, por exemplo, testes de imagem (raios X, ultrassom, MRI); testes de sangue ou imunoquímicos para marcadores tumorais conhecidos ou marcadores tumorais circulantes, como PSA; testar biópsias ou espécimes citológicos para marcadores tumorais conhecidos para avaliar, por exemplo, o número de células tumorais presentes ou a raridade relativa de tais células.
[0029] É bem conhecido na técnica que as células tumorais podem se disseminar precocemente de tumores primários como CTCs e DTCs. De fato, as DTCs foram identificados em indivíduos sem evidência de doença pós-cirurgia de tumor. Em casos raros em que o histórico de câncer não excluiu a doação de transplante, os receptores desenvolveram metástases derivadas de um doador, mesmo que um doador estivesse livre da doença por até 30 anos (MacKie et al., "Fatal Melanoma Transferred in a Donated Kidney 16 Years after Melanoma
Surgery, "N. Engl. J. Med. 348: 567-568 (2003), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[0030] A filogenética do tumor e o sequenciamento do genoma total de metástases em pacientes individuais sugeriram transmissão de tumor primário para metástase e metástase para metástase, o que fornece evidências de que um modelo de crescimento contínuo/linear não leva em conta recaídas tardias (mais de 10 anos) em indivíduos pacientes (Gundem et al., "The Evolutionary History of Lethal Metastatic Prostate Cancer", Nature 520: 353-357 (2015) e Naxerova et al., "Using Tumor Phylogenetics to Identify the Roots of Metastasis in Humans", Nature Reviews Clinical Oncology 12: 258-272 (2015), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade).
[0031] A análise de CTC de célula única também mostrou uma ligação de linhagem genética entre CTCs e tumores primários (Ni et al., "Reproducible Copy Number Variation Patterns Among Single Circulating Tumor Cells of Lung Cancer Patients," PNAS 110(52):21083-88; Heitzer et al., "Complex Tumor Genomes Inferred from Single Circulating Tumor Cells by Array-CGH and Next- Generation Sequencing," Cancer. Res. 73:2965-75 (2013); e Lohr et al., "Whole-Exome Sequencing of Circulating Tumor Cells Provides a Window into Metastatic Prostate Cancer," Nature Biotech. 32:479-484 (2014), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade).
[0032] Além disso, em humanos, as CTCs/DTCs não se correlacionam com o estágio ou tamanho do câncer primário (Krishnamurthy et al., "Detection of Minimal Residual Disease in Blood and Bone Marrow in Early Stage Breast Cancer," Cancer 116(14):3330-3337 (2010), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Em vez disso, pensa-se que CTCs e
DTCs retêm a capacidade de formar metástases/doença recorrente. Em particular, a detecção de CTCs e DTCs demonstrou ser preditiva de metástases e recidiva em cânceres de mama e de próstata (Braun et al., "A Pooled Analysis of Bone Marrow Micrometastasis in Breast Cancer," NEJM 353:793-802 (2005); Hayes et al., "Circulating Tumor Cells at Each Follow-up Time Point During Therapy of Metastatic Breast Cancer Patients Predict Progression-Free and Overall Survival," Clin. Cancer Res. 12(14):4218-4224 (2006); e de Bono et al., "Circulating Tumor Cells Predict Survival Benefit from Treatment in Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer," Clin. Cancer Res. 14:6302-6309 (2008), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade).
[0033] Pensa-se que as metástases surgem de DCCs proliferativos, mas também latentes, que sofreram reativação. Dado que os pacientes podem desenvolver metástases anos após a ressecção do tumor, acredita-se que as DCCs latentes podem ser responsáveis pela principal entidade responsável pela recidiva tardia nos cânceres. Quando no presente documento usado, o termo "latência" refere-se a uma parada mitótica e de crescimento temporária, definida como latência celular, onde mecanismos intrínsecos e/ou extrínsecos conduzem grupos solitários ou pequenos de DCCs para entrar em quiescência (uma parada reversível do crescimento). Uma segunda categoria de lesões latentes é definida por latência angiogênica, onde a massa tumoral é mantida constante por um equilíbrio entre células em divisão e células que morrem devido à vascularização insuficiente. Uma terceira categoria é a latência imunomediada, em que o sistema imunológico mantém uma massa tumoral em proliferação constante por meio de uma atividade citotóxica persistente que corta persistentemente a população de células cancerosas em crescimento (ver, por exemplo, Sosa et al.,
"Mecanismos de Latência de Células Câncer Disseminadas : An Awakening Field, "Nat. Rev. Cancer 14 (9): 611-622 (2014), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). As células latentes podem surgir de tumores primários estabelecidos, tumores secundários e/ou lesões pré-invasivas.
[0034] Em uma modalidade dos métodos no presente documento descritos, as DCCs contatadas são células cancerosas latentes, o que significa que as células cancerosas estão experimentando uma parada mitótica/de crescimento temporária ou um comportamento do tipo senescente.
[0035] DCCs podem ser detectadas em aspirados de medula óssea realizando uma seleção negativa eliminando células de linhagem hematopoiética e, em seguida, corando positivamente para EpCAM ou CK8/18. Em combinação, as células podem ser coradas para marcadores de latência para determinar se estes estão em um estado proliferativo ou latente. Este último pode ser feito pós-fixação. Para realizar a análise do genoma completo ou do transcriptoma completo, DCCs positivas de EpCAM da medula óssea são isolados vivos e processados para todo o genoma ou análise do transcriptoma (Gužvić et al., "Combined Genome and Transcriptome Analysis of Single Disseminated Cancer Cells from Bone Marrow of Prostate Cancer Patient Reveals Unexpected Transcriptomes, "Cancer Res. 74 (24): 7383-94 (2014), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[0036] Os métodos no presente documento descritos podem envolver ainda a detecção da presença de DCCs no indivíduo antes do referido contato. Conforme mostrado na Tabela 1 abaixo, DCCs latentes podem ser identificadas, porque elas são fenotipicamente distinguíveis de outros tipos de células (Sosa et al., "Mechanisms of Disseminated Cancer Cell Dormancy: An Awakening Field", Nat. Rev.
Cancer 14 (9) : 611-622 (2014), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Tabela 1. Marcadores de DCC
Câncer Fenótipo de DCC Latente Fenótipo de DCC Ativo
TGFβR3 ↑ P-FAK↑ BMPR2 ↑ EDG2 ↑ P-ERK ↓ P-Src ↑ P-p38 ↑ Mama P-ERK ↑ GRP78 ↑ P-p38 ↓ POSTN ↓ NR2F1 ↓ receptores TSP ↑ NR2F1 ↑ Carcinoma de TGFβR3 ↑ P-FAK↑ Células BMPR2 ↑ P-Src ↑ Escamosas de P-ERK ↓ P-ERK ↑ Cabeça e P-p38 ↑ P-p38 ↓ Pescoço GRP78 ↑ NR2F1 ↓ (HNSCC) NR2F1 ↑ TGFβR3 ↑ P-FAK↑ BMPR2 ↑ P-Src ↑ P-ERK ↓ Prostata P-ERK ↑ P-p38 ↑ P-p38 ↓ GRP78 ↑ NR2F1 ↓ NR2F1 ↑ Glioblastoma, POSTN ↓ osteossarcoma e Não Determinado receptores TSP ↑ lipossarcoma ARHI ↑ Ovariano Não Determinado genes ATG ↑ IFNR ↑ Pancreático Não Determinado TNFR ↑
[0037] As DTCs foram identificadas na medula óssea de 13-72% dos pacientes com câncer de próstata antes da cirurgia e de 20-57% dos pacientes sem evidência de doença maior que 5 anos após a cirurgia (Morgan et al., "Disseminated Tumor Cells in Prostate Cancer Patients after Radical Prostatectomy and without Evidence of Disease Predicts Biochemical Recurrence," Clin. Cancer Res. 15:677-683 (2009) and Weckermann et al., "Perioperative Activation of Disseminated Tumor Cells in Bone Marrow of Patients with Prostate Cancer," J. Clin. Oncol. 27(10):1549-56 (2009), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade). A detecção de CDT é um prognóstico de recidiva em pacientes com latência clínica.
[0038] Quando no presente documento usada, a frase "latência clínica" refere-se ao tempo livre de doença clínica prolongada (por exemplo, mais de 5 anos) entre a remoção de um tumor primário e a recorrência da doença. A latência clínica é comum no câncer de próstata, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer renal, câncer de tireoide, linfoma de células B e melanoma (Lam et al., "The Role of the Microenvironment – Dormant Prostate Disseminated Tumor Cells in the Bone Marrow," Drug Discov. Today Technol. 11:41-47 (2014); Gelao et al., "Tumour Dormancy and Clinical Implications in Breast Cancer," Ecancermedicalscience 7:320 (2013); Ellis et al., "Detection and Isolation of Prostate Cancer Cells from Peripheral Blood and Bone Marrow," Urology 61:277-281 (2003); Morgan et al., "Disseminated Tumor Cells in Prostate Cancer Patients after Radical Prostatectomy and without Evidence of Disease Predicts Biochemical Recurrence," Clin. Cancer Res. 15:677-683 (2009); e Pfitzenmaier et al., "Telomerase Activity in Disseminated Prostate Cancer Cells," BJU Int. 97:1309-1313 (2006), que são incorporados por referência em sua totalidade), e residir em órgãos distantes, incluindo osso, nódulos linfáticos, fígado e pulmão, onde podem permanecer latentes por um período de tempo prolongado (por exemplo, mais de 10 anos) até, em alguns pacientes, podem desenvolver-se metástases clínicas.
[0039] Em algumas modalidades de realização dos métodos no presente documento descritos, o indivíduo foi diagnosticado com CTCs.
[0040] Em algumas modalidades de realização de métodos no presente documento descritos, o indivíduo foi diagnosticado com DTCs e/ou um câncer não metastático.
[0041] Quando no presente documento usado, um "indivíduo" é, por exemplo, um paciente, tal como um paciente com câncer, e abrange qualquer animal, mas de preferência um mamífero. Em uma modalidade, o indivíduo é um indivíduo humano. Indivíduos humanos adequados incluem, sem limitação, crianças, adultos e indivíduos idosos que foram diagnosticados com células cancerosas disseminadas e/ou um câncer não metastático.
[0042] Em outras modalidades, o indivíduo pode ser bovino, ovino, porcino, felino, equino, murino, canino, lapino, etc.
[0043] Ao realizar os métodos no presente documento descritos, as DCCs em um indivíduo são contatadas para induzir ou manter a latência das DCCs. Isso significa o estabelecimento de um estado não proliferativo sustentado em uma DCC ou a continuação de um estado não proliferativo em uma DCC.
[0044] Em uma modalidade, o câncer residual mínimo é tratado em um indivíduo que foi diagnosticado com câncer. Por exemplo, e sem limitação, o indivíduo foi diagnosticado com um ou mais de câncer de mama, mieloma múltiplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cérebro, câncer cervical, linfoma de células de revestimento, leucemia, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, melanoma ureal e cutâneo, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, glioblastoma, neuroblastoma e câncer colorretal.
[0045] Outros cânceres também podem ser passíveis de tratamento com os métodos no presente documento descritos.
[0046] Em uma modalidade, o câncer residual mínimo relacionado ou associado ao câncer de mama é tratado em um indivíduo. O câncer de mama pode ser selecionado de um ou mais dentre câncer de mama invasivo, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma lobular in situ (LCIS) e câncer de mama inflamatório.
[0047] Uma variedade de fatores moleculares pode ser usada para categorizar molecularmente os cânceres de mama, incluindo receptores de hormônio e status do receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2). Os grupos HER2 e similares são os principais subtipos moleculares identificados entre os cânceres de mama negativos para receptores hormonais (Schnitt, "Classification and Prognosis of Invasive Breast Cancer: From Morphology to Molecular Taxonomy", Modern Pathology 23: S60-S64 (2010), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Em uma modalidade, o câncer de mama é o câncer de mama por HER2+.
[0048] Em algumas modalidades dos métodos no presente documento descritos, o indivíduo foi submetido à ressecção cirúrgica para remover um tumor. Por exemplo, o indivíduo pode ter sido submetido a um ou mais dentre mastectomia, prostatectomia, remoção de lesão de pele, ressecção do intestino delgado, gastrectomia, toracotomia, adrenalectomia, apendicectomia, colectomia, ooforectomia, tireoidectomia, histerectomia, glossectomia, polipectomia do cólon e ressecção colorretal.
[0049] Nos métodos no presente documento descritos, as células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo são colocadas em contato com uma proteína derivada da proteína morfogênica óssea 7 (BMP7). BMP7 é um membro da superfamília TGFβ, que é secretado pelos osteoblastos do estroma da medula óssea e pode influenciar o microambiente DCC/DTC. A BMP7 desempenha um papel fundamental na transformação das células mesenquimais em osso e cartilagem e demonstrou induzir reversivelmente a senescência em células-tronco do câncer de próstata (Kobayashi et al., "Bone Morphogenetic Protein 7 in Dormancy and Metastasis of Prostate Cancer Stem-Like Cells in Bone," J. Exp. Med. 208(13):2641-55 (2011), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). A Pro-BMP7 é um intermediário entre o pré-BMP7 e a BMP7 madura gerada por meio do processamento proteolítico da pré- proteína, que gera subunidades do homodímero maduro.
[0050] A proteína BMP7 humana é uma molécula de sinalização secretada da superfamília TGF-beta e foi originalmente identificada por sua capacidade de induzir a formação óssea, mas mais tarde tornou- se reconhecida como uma citocina multifuncional que media o crescimento e a diferenciação de muitos tipos de células diferentes. A proteína BMP7 humana é expressa em células como uma proteína precursora de 292 aminoácidos e a BMP7 madura biologicamente ativa é gerada por remoção proteolítica do peptídeo de sinal e pró- peptídeo. A sequência de aminoácidos da proteína BMP7 humana tipo selvagem contendo o peptídeo de sinal (os primeiros 29 aminoácidos), o pró-domínio e o peptídeo maduro (em negrito) é indicada como SEQ ID Nº: 1, como segue:
MHVRSLRAAA PHSFVALWAP LFLLRSALAD FSLDNEVHSS FIHRRLRSQE RREMQREILS ILGLPHRPRP HLQGKHNSAP MFMLDLYNAM AVEEGGGPGG QGFSYPYKAV FSTQGPPLAS LQDSHFLTDA DMVMSFVNLV EHDKEFFHPR YHHREFRFDL SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY IRERFDNETF RISVYQVLQE HLGRESDLFL LDSRTLWASE EGWLVFDITA TSNHWVVNPR HNLGLQLSVE TLDGQSINPK LAGLIGRHGP QNKQPFMVAF FKATEVHFRS IRSTGSKQRS QNRSKTPKNQ EALRMANVAE NSSSDQRQAC KKHELYVSFR DLGWQDWIIA PEGYAAYYCE GECAFPLNSY MNATNHAIVQ TLVHFINPET VPKPCCAPTQ LNAISVLYFD DSSNVILKKY RNMVVRACGC H
[0051] Será entendido por alguém versado na técnica que o peptídeo de sinal pode ser removido por clivagem proteolítica resultando em um pró-domínio/peptídeo maduro intacto que é designado como pró-BMP7.
[0052] A BMP7 madura humana tipo selvagem é um dímero de duas proteínas homodiméricas glicosiladas de 139 aminoácidos ligadas por dissulfeto de cerca de 35 kDa. Cada proteína homodimérica tem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 2:
STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE GYAAYYCEGE CAFPLNSYMN ATNHAIVQTL VHFINPETVP KPCCAPTQLN AISVLYFDDS SNVILKKYRN MVVRACGCH
[0053] As variantes da proteína BMP7 humana incluem variantes da BMP7 humana madura da SEQ ID Nº: 2, com alterações de aminoácidos específicas indicadas na sequência de consenso como mostrado na SEQ ID Nº: 3:
STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS SSXQRQXCKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPX GYAAXYCEGE CAFPLNSYMN ATNHAXXQXL XHXXNPETVP KPCCAPTQLX AISXLYFDDX SNVILKKXRN MXVXACGCH
[0054] Variantes particulares da proteína BMP7 humana madura da presente descrição têm atividade específica aumentada,
características de solubilidade melhoradas, biodisponibilidade melhorada, ligação diminuída a inibidores circulantes endógenos e/ou atividade de EBF reduzida em comparação com a proteína BMP7 humana madura tipo selvagem.
[0055] Variantes adequadas da proteína BMP7 humana são selecionadas a partir do grupo que consiste em F93V/N110G; Y65G/I86L/T89A/N110G; Y65G/I86L/N110G/Y128F; Y65G/I86L/N110G/Y128W; Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W (BMP7- F9); Y65G/T89A/N110G/Y128F; Y65G/I86L/N110G; e Y65G/V114M (veja a Tabela 2 abaixo). Tabela 2. Variantes Exemplares de BMP7 Humana Variante de SEQ ID Sequência de Aminoácido BMP7 Nº: F93V/N110G STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 4
SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE GYAAYYCEGE CAFPLNSYMN ATNHAIVQTL VHVINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS
SNVILKKYRN MVVRACGCH Y65G/I86L/ STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 5 T89A/N110G SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE
GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHALVQAL VHFINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS
SNVILKKYRN MVVRACGCH Y65G/I86L/ STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 6 N110G/Y128F SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE
GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHALVQTL VHFINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS
SNVILKKFRN MVVRACGCH Y65G/I86L/ STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 7 N110G/Y128W SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE
GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHALVQTL VHFINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS SNVILKKWRN MVVRACGCH
Variante de SEQ ID Sequência de Aminoácido BMP7 Nº: Y65G/I86L/ STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 8 F93V/N110G/ SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE Y128W GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHALVQTL (BMP7-F9) VHVINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS
SNVILKKWRN MVVRACGCH Y65G/T89A/ STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 9 N110G/Y128F SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE
GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHAIVQAL VHFINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS
SNVILKKFRN MVVRACGCH Y65G/I86L/ STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 10 N110G SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE
GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHALVQTL VHFINPETVP KPCCAPTQLG AISVLYFDDS
SNVILKKYRN MVVRACGCH Y65G/V114M STGSKQRSQN RSKTPKNQEA LRMANVAENS 11
SSDQRQACKK HELYVSFRDL GWQDWIIAPE GYAAGYCEGE CAFPLNSYMN ATNHAIVQTL VHFINPETVP KPCCAPTQLN AISMLYFDDS SNVILKKYRN MVVRACGCH
[0056] Em uma modalidade, variantes de BMP7 são selecionadas a partir do grupo que consiste em Y65G/I86L/N110G/Y128W e Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W.
[0057] Em uma modalidade, o derivado de BMP7 é uma variante de BMP7 projetada de pró-BMP7. A variante projetada de pró-BMP7 pode compreender substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes ao domínio da proteína madura BMP7. A variante projetada de pró-BMP7 pode ser processada em uma proteína derivada de BMP7 madura. Variantes adequadas de pró- BMP7 que contêm o pró-domínio fundido ao terminal N da variante de proteína BMP7 humana madura são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15 e SEQ ID Nº: 16, conforme ilustrado na Tabela 3. Tabela 3. Variantes Exemplares de Pró-BMP7 humana Pro- Variante de Sequência de Aminoácido BMP7
SEQ ID DFSLDNEVHS SFIHRRLRSQ ERREMQREIL SILGLPHRPR PHLQGKHNSA NO:12 PMFMLDLYNA MAVEEGGGPG GQGFSYPYKA VFSTQGPPLA
SLQDSHFLTD ADMVMSFVNL VEHDKEFFHP RYHHREFRFD LSKIPEGEAV TAAEFRIYKD YIRERFDNET FRISVYQVLQ EHLGRESDLF LLDSRTLWAS EEGWLVFDIT ATSNHWVVNP RHNLGLQLSV ETLDGQSINP KLAGLIGRHG PQNKQPFMVA FFKATEVHFR SIRSTGSKQR SQNRSKTPKN QEALRMANVA ENSSSDQRQA CKKHELYVSF RDLGWQDWII APEGYAAYYC EGECAFPLNS YMNATNHAIV QTLVHVINPE TVPKPCCAPT QLGAISVLYF DDSSNVILKK YRNMVVRACG CH
SEQ ID DFSLDNEVHS SFIHRRLRSQ ERREMQREIL SILGLPHRPR PHLQGKHNSA NO:13 PMFMLDLYNA MAVEEGGGPG GQGFSYPYKA VFSTQGPPLA
SLQDSHFLTD ADMVMSFVNL VEHDKEFFHP RYHHREFRFD LSKIPEGEAV TAAEFRIYKD YIRERFDNET FRISVYQVLQ EHLGRESDLF LLDSRTLWAS EEGWLVFDIT ATSNHWVVNP RHNLGLQLSV ETLDGQSINP KLAGLIGRHG PQNKQPFMVA FFKATEVHFR SIRSTGSKQR SQNRSKTPKN QEALRMANVA ENSSSDQRQA CKKHELYVSF RDLGWQDWII APEGYAAGYC EGECAFPLNS YMNATNHALV QALVHFINPE TVPKPCCAPT QLGAISVLYF DDSSNVILKK YRNMVVRACG CH
SEQ ID DFSLDNEVHS SFIHRRLRSQ ERREMQREIL SILGLPHRPR PHLQGKHNSA NO:14 PMFMLDLYNA MAVEEGGGPG GQGFSYPYKA VFSTQGPPLA
SLQDSHFLTD ADMVMSFVNL VEHDKEFFHP RYHHREFRFD LSKIPEGEAV TAAEFRIYKD YIRERFDNET FRISVYQVLQ EHLGRESDLF LLDSRTLWAS EEGWLVFDIT ATSNHWVVNP RHNLGLQLSV ETLDGQSINP KLAGLIGRHG PQNKQPFMVA FFKATEVHFR SIRSTGSKQR SQNRSKTPKN QEALRMANVA ENSSSDQRQA CKKHELYVSF RDLGWQDWII APEGYAAGYC EGECAFPLNS YMNATNHALV QTLVHFINPE TVPKPCCAPT QLGAISVLYF DDSSNVILKK FRNMVVRACG CH
SEQ ID DFSLDNEVHS SFIHRRLRSQ ERREMQREIL SILGLPHRPR PHLQGKHNSA NO:15 PMFMLDLYNA MAVEEGGGPG GQGFSYPYKA VFSTQGPPLA
SLQDSHFLTD ADMVMSFVNL VEHDKEFFHP RYHHREFRFD LSKIPEGEAV TAAEFRIYKD YIRERFDNET FRISVYQVLQ EHLGRESDLF LLDSRTLWAS
Pro- Variante de Sequência de Aminoácido BMP7
EEGWLVFDIT ATSNHWVVNP RHNLGLQLSV ETLDGQSINP KLAGLIGRHG PQNKQPFMVA FFKATEVHFR SIRSTGSKQR SQNRSKTPKN QEALRMANVA ENSSSDQRQA CKKHELYVSF RDLGWQDWII APEGYAAGYC EGECAFPLNS YMNATNHALV QTLVHFINPE TVPKPCCAPT QLGAISVLYF DDSSNVILKK WRNMVVRACG CH
SEQ ID DFSLDNEVHS SFIHRRLRSQ ERREMQREIL SILGLPHRPR PHLQGKHNSA Nº:16 PMFMLDLYNA MAVEEGGGPG GQGFSYPYKA VFSTQGPPLA SLQDSHFLTD
ADMVMSFVNL VEHDKEFFHP RYHHREFRFD LSKIPEGEAV TAAEFRIYKD YIRERFDNET FRISVYQVLQ EHLGRESDLF LLDSRTLWAS EEGWLVFDIT ATSNHWVVNP RHNLGLQLSV ETLDGQSINP KLAGLIGRHG PQNKQPFMVA FFKATEVHFR SIRSTGSKQR SQNRSKTPKN QEALRMANVA ENSSSDQRQA CKKHELYVSF RDLGWQDWII APEGYAAGYC EGECAFPLNS YMNATNHALV QTLVHVINPE TVPKPCCAPT QLGAISVLYF DDSSNVILKK WRNMVVRACG CH
[0058] Proteínas derivadas de BMP7 adequadas para uso com os métodos no presente documento descritos incluem variantes de pré- BMP7 humana (isto é, SEQ ID Nº: 1).
[0059] Em uma modalidade, a proteína derivada de BMP7 é uma proteína BMP7 madura com bioatividade aumentada (por exemplo, até mais de 50 vezes ou mais bioativa) e propriedades biofísicas (por exemplo, solubilidade e estabilidade realçadas) quando comparada a uma proteína BMP7 tipo selvagem madura.
[0060] Em outra modalidade, o derivado de BMP7 é BMP7-F9 (SEQ ID Nº: 8).
[0061] A referência no presente documento a uma proteína BMP7 tipo selvagem ou variante da mesma, incluindo por referência a uma SEQ ID Nº., refere-se a um homodímero em que cada subunidade monomérica tem a sequência identificada. Por exemplo, a referência a BMP7-F9 (SEQ ID Nº: 8) refere-se a um homodímero em que cada subunidade monomérica tem a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 8 e as subunidades estão ligadas por ligação (ões) dissulfeto.
[0062] Para os ensaios funcionais no presente documento descritos, o tratamento ou administração de uma proteína pró-BMP7 particular ou variante desta, refere-se ao tratamento ou administração de homodímeros da BMP7 madura particular, ou seja, do tipo selvagem ou de uma variante desta, que geralmente estão em um complexo não covalente com pró-domínio humano tipo selvagem.
[0063] De acordo com os métodos no presente documento descritos, o contato pode ser realizado pela administração da proteína derivada de BMP7 ao indivíduo.
[0064] O efeito de BMP7 em um indivíduo pode depender do Receptor 2 de BMP (BMPR2), cuja expressão se correlaciona inversamente com recorrência e metástase óssea em pacientes com câncer de próstata (Kobayashi et al., "Bone Morphogenetic Protein 7 in Dormancy and Metastasis of Prostate Cancer Stem-Like Cells in Bone, "J. Exp. Med. 208 (13): 2641-55 (2011), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Assim, em uma modalidade, as DCCs contatadas em um indivíduo são positivas para o receptor de proteína morfogênica óssea (BMPR+).
[0065] Os métodos no presente documento descritos podem ainda envolver a administração ao indivíduo de um agente quimioterapêutico, um agente imunoterapêutico, um agente epigenético ou radiação ionizante.
[0066] Quando no presente documento usado, o termo "agente quimioterapêutico" refere-se a um composto sintético, biológico ou semissintético que não é uma enzima e que mata células cancerosas ou inibe o crescimento de células cancerosas, embora tenha menos efeito em células não cancerosas. Qualquer agente quimioterapêutico adequado pode ser usado.
[0067] Os agentes quimioterápicos adequados incluem, sem limitação, uma antraciclina, um taxano, um inibidor da cinase, um anticorpo, uma fluoropirimidina e um fármaco de platina. Antraciclinas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, mitoxantrona e idarrubicina. Taxanos exemplares incluem, mas não estão limitados a, docetaxel e paclitaxel. Inibidores de cinase exemplares incluem, mas não estão limitados a, lapatinibe, mesilato de imatinibe e genefitinibe. Anticorpos exemplares incluem, mas não estão limitados a, alentuzumabe, gentuzumabe ozogamicina, rituximabe, trastuzumabe e ibritumomabe tiuxetano. As fluoropirimidinas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, 5- fluoruracila, capecitabina, tegafur, tegafur-uracila, floxuridina, 5- fluorodeoxiuridina e S-1. Fármacos de platina exemplares incluem, mas não estão limitados a, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina e nedaplatina.
[0068] Os agentes quimioterapêuticos adequados adicionais incluem, sem limitação, agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, clorambucila, tiotepa, hexametilmelamina, bussulfano, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, decarbazina, estramustina, estreptozocina e temozolomida), vinca alcaloides (por exemplo, vinblastina, vincristina e vinorelbina), podofilotoxina (por exemplo, etoposídeo e teniposídeo), antibióticos (por exemplo, bleomicina, dactinomicina, mitomicina e valrubicrina) e análogos da camptotecina (por exemplo, irinotecano ou topotecano).
[0069] Em algumas modalidades, o agente quimioterápico é um agente quimioterápico anti-HER2 selecionado a partir de trastuzumabe (Herceptin®) e lapatinibe (Tykerb®). O trastuzumabe é um anticorpo monoclonal que tem como alvo o receptor HER2/neu nas células cancerosas. O lapatinibe é um inibidor da tirosina cinase que tem como alvo o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e o HER2.
[0070] Quando no presente documento usado, o termo "agente imunoterapêutico" refere-se a um agente que é capaz de induzir ou realçar uma resposta imune em um indivíduo. No contexto do câncer, os agentes imunoterapêuticos estimulam o sistema imunológico para atingir de forma mais eficaz as células cancerosas. Os agentes imunoterapêuticos adequados podem ser selecionados a partir de um inibidor do ponto de checagem imunológico, um interferon e uma vacina contra o tumor.
[0071] Os inibidores de pontos de controle imunológicos são compostos que inibem o envolvimento de pontos de controle imunológicos. Agentes moduladores de ponto de checagem imune exemplares incluem inibidores de PD-1 (por exemplo, pembrolizumabe e nivolumabe), inibidores de PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe) e inibidores de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumabe).
[0072] Os interferons ("IFNs") são uma família de citocinas que protegem contra doenças por efeitos diretos nas células alvo e ativando respostas imunológicas. Os IFNs podem ser produzidos e agir sobre as células tumorais e as células do sistema imunológico. Os IFNs do tipo I compreendem proteínas IFNα, IFNβ, IFNε, IFNκ e IFNω. Os IFNs tipo I são conhecidos por mediar os efeitos antineoplásicos contra várias doenças malignas (Moschos et al., Interferons in the Treatment of Solid Tumors, "Cancer Treat. Res. 126: 207–241 (2005), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[0073] Quando no presente documento usado, o termo "vacina contra tumor" se refere a uma composição que estimula uma resposta imune em um indivíduo contra um tumor ou célula cancerosa. As vacinas tumorais são normalmente compostas por uma fonte de material ou células associadas ao câncer (antígeno) que podem ser autólogas (de si mesmas) ou alogênicas (de outras pessoas) para o indivíduo, junto com outros componentes (por exemplo, adjuvantes)
para estimular e aumentar ainda mais a resposta imune contra o antígeno. As vacinas de tumor podem resultar na estimulação do sistema imunológico do indivíduo a produzir anticorpos para um ou vários antígenos específicos e/ou produzir células T exterminadoras para atacar as células cancerosas que possuem esses antígenos.
[0074] Quando no presente documento usado, o termo "agente epigenético" refere-se a um agente que altera o estado epigenético (por exemplo, estado de metilação) do DNA de uma célula durante ou após o contato ou administração de tal agente.
[0075] Agentes epigenéticos adequados podem ser selecionados a partir de, por exemplo, um inibidor de histona desacetilase ("HDAC"), 5-azacitidina, ácido retinoico, trióxido de arsênio, inibidor do Realçador de Subunidade do Complexo 2 Repressivo Polycomb de Zeste 2 ("EZH2"), Inibidor de bromodomínio ("BRD") e seus derivados.
[0076] Inibidores de HDAC exemplares incluem, mas não estão limitados a, tricostatina A, trapoxina B, benzamidas, fenilbutirato, ácido valproico, vorinostate, belinostate, LAQ824, panobinostate, entinostate, CI994 e mocetinostate.
[0077] Inibidores de EZH2 exemplares incluem, mas não estão limitados a, 3-deazaneplanocina A (DZNep), EPZ005687, GSK126, EI1, UNC1999 e EPZ-6438 (Kim et al., "Targeting EZH2 in Cancer," Nat. Med. 22(2):128-134 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[0078] Inibidores de bromodomínio exemplares incluem, sem limitação, JQ1, I-BET151/762, PF-1 e RVX-208 (Wadhwa et al., "Bromodomain Inhibitor Review: Bromodomain and Extra-terminal Family Protein Inhibitors as a Potential New Therapy in Central Nervous System Tumors," Cureus 8(5):e620 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[0079] Agentes epigenéticos exemplares adicionais incluem inibidores de DNA metil transferase (DNMT) incluindo, mas não se limitando a, azacitidina e decitabina.
[0080] O microambiente DCC/DTC desempenha um papel crítico no realce da latência. Subfamília de Receptores Nucleares 2 Grupo F Membro 1 (NR2F1) é um receptor de hormônio nuclear e regulador de transcrição que é um nó-chave em uma rede de fatores de transcrição que constitui uma assinatura de latência de células tumorais. Quando aplicada a perfis de expressão gênica de pacientes com câncer de mama com receptor de estrogênio positivo (ER+), esta assinatura demonstrou prever períodos mais longos sem metástases (Kim et al., "Dormancy Signatures and Metastasis in Estrogen Receptor Positive and Negative Breast Cancer," PloS One 7:e35569 (2012), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Esta assinatura de latência também foi encontrada em DTCs latentes em pacientes com câncer de próstata que permaneceram assintomáticos por 7-18 anos (Sosa et al., "NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy via SOX9- and RARbeta-Driven Quiescence Programmes," Nat. Commun. 6:6170 (2015) and Chery et al., "Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways," Oncotarget 5:9939-51 (2014), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade), destacando sua relevância para a doença humana.
[0081] Foi demonstrado que NR2F1 super-regula e induz latência de células tumorais residuais locais e distantes após cirurgia de tumor em um modelo de xenoenxerto derivado de paciente (PDX) de células de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (HNSCC) (Sosa, "Dormancy Programs as Emerging Antimetastasis Therapeutic Alternatives," Mol. Cell. Oncol. 3(1):e1029062 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). A plasticidade da expressão de NR2F1 sugere que alterações no epigenoma de células tumorais residuais podem ser controladas por sinais externos e internos e ditar o destino das DCCs. Foi demonstrado que NR2F1 limita a reprogramação induzida de células- tronco pluripotentes (iPS), provavelmente pela modulação da reprogramação da cromatina (Onder et al., "Chromatin Modifying Enzymes as Modulators of Reprogramming," Nature 483(7391):598- 602 (2012), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). NR2F1 também é fundamental para manter uma cromatina globalmente repressiva em células tumorais latentes, permitindo simultaneamente um estado de cromatina ativa nos promotores de genes de latência específicos, incluindo seu próprio promotor (Sosa et al., "NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy via SOX9- and RARbeta-Driven Quiescence Programmes," Nat. Commun. 6:6170 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), que enfatiza a existência de um programa epigenético orquestrado modulado por NR2F1 e pistas microambientais que levam à latência de células tumorais. Em uma modalidade, as DTCs são NR2F1+.
[0082] DCCs demonstraram expressar altos níveis de ativação da via PERK (Bragado et al., "Microenvironments Dictating Tumor Cell Dormancy," Recent Results Cancer Res. 195:25-39 (2012); Sosa et al., "Regulation of Tumor Cell Dormancy by Tissue Microenvironments and Autophagy," Adv. Exp. Med. Biol. 734:73-89 (2013); Goswami et al., "The Phosphoinositide 3-Kinase/Akt1/Par-4 Axis: A Cancer-Selective Therapeutic Target," Cancer Res. 66(6):2889-92 (2006); e Schewe et al., "ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells in vivo," PNAS 105(30):10519-24 (2008), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade), que é um mediador do ISR. A sinalização de ISR por meio da fosforilação de PERK e EIF2α resulta em uma diminuição na translação geral, bem como aumentos na translação específica do gene, estresse oxidativo e produção de ROS, degradação de proteínas, degradação de RNA, autofagia e biossíntese de lipídeos, o que pode ajudar na sobrevivência das células tumorais.
[0083] Outro aspecto se refere a um método de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo, cujo método envolve o contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com um inibidor de retículo endoplasmático cinase similar ao RNA de proteína cinase (PERK) selecionado de LY2, LY3 e LY4, em que o referido contato erradica DCCs no indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo.
[0084] Em uma modalidade, as DCCs são fosfo-PERK ativos. Consequentemente, o método pode envolver ainda o contato de DCCs no indivíduo com um inibidor de PERK, um inibidor de MEK, um inibidor de CDK4/6 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0085] De acordo com uma modalidade dos métodos no presente documento descritos, o contato pode ser realizado pela administração de um inibidor de PERK ao indivíduo.
[0086] Em uma modalidade, o inibidor de PERK é um composto de fórmula (I) onde R é selecionado a partir do grupo que consiste em e ; X é CH ou N; R1 é hidrogênio ou halogênio (por exemplo, fluoro); e R2 é C1 a C3 alquila; ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[0087] Em uma outra modalidade, o inibidor de PERK é um composto de fórmula (Ia) onde R é selecionado a partir do grupo que consiste em e ; X é CH ou N; R1 é hidrogênio ou halogênio (por exemplo, fluoro); e R2 é C1 a C3 alquila; ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[0088] Quando o inibidor é um composto de fórmula (I) ou fórmula (Ia), R pode ser ou .
[0089] Quando no presente documento usado, o termo "alquila" significa um grupo de hidrocarboneto alifático que pode ser linear ou ramificado com cerca de 1 a cerca de 6 átomos de carbono ou 1 a cerca de 3 átomos de carbono na cadeia (ou o número de carbonos designado por "Cn-Cn", Onde n é a faixa numérica de átomos de carbono). Ramificado significa que um ou mais grupos alquila inferior, como metila, etila ou propila, estão ligados a uma cadeia alquila linear. Grupos alquila exemplares incluem metila, etila, n-propila e i-propila.
[0090] O termo "halogênio" significa flúor, cloro, bromo ou iodo. Em uma modalidade, o halogênio é flúor.
[0091] O termo "composto (s)" e expressões equivalentes significam compostos no presente documento descritos, cuja expressão inclui os pró-fármacos, os sais farmaceuticamente aceitáveis, os óxidos e os solvatos, por exemplo, hidratos, onde o contexto assim o permitir.
[0092] Os compostos no presente documento descritos podem conter um ou mais centros assimétricos e podem, assim, dar origem a enantiômeros, diastereômeros e outras formas estereoisoméricas. Cada centro quiral pode ser definido em termos de estereoquímica absoluta, como (R)- ou (S)-. A presente invenção pretende incluir todos esses isômeros possíveis, bem como suas misturas, incluindo formas racêmicas e opticamente puras. Os isômeros opticamente ativos (R) e (S), (-) e (+), ou (D) e (L) podem ser preparados usando sintons quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando técnicas convencionais. Todas as formas tautoméricas também devem ser incluídas.
[0093] A recitação de "um composto" se destina a incluir sais, solvatos, óxidos e complexos de inclusão desse composto, bem como qualquer forma estereoisomérica, ou uma mistura, de qualquer uma dessas formas desse composto em qualquer relação. Assim, de acordo com algumas modalidades, um composto quando no presente documento descrito, incluindo no contexto de composições farmacêuticas, métodos de tratamento e compostos per se, é fornecido como a forma de sal.
[0094] O termo "solvato" refere-se a um composto no estado sólido, onde moléculas de um solvente adequado são incorporadas na estrutura cristalina. Um solvente adequado para administração terapêutica é fisiologicamente tolerável na dosagem administrada. Exemplos de solventes adequados para administração terapêutica são etanol e água. Quando a água é o solvente, o solvato é referido como um hidrato. Em geral, os solvatos são formados dissolvendo o composto no solvente apropriado e isolando o solvato por resfriamento ou usando um antissolvente. O solvato é tipicamente seco ou azeotropado em condições ambientais.
[0095] Os complexos de inclusão são descritos em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. 1: 176-177 (1995), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade. Os complexos de inclusão mais comumente usados são aqueles com ciclodextrinas, e todos os complexos de ciclodextrina, naturais e sintéticos, são especificamente abrangidos pela presente invenção.
[0096] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais preparados a partir de ácidos ou bases não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo ácidos e bases inorgânicos e ácidos e bases orgânicos.
[0097] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que é,
dentro do escopo do julgamento médico sensato, adequado para uso em contato com células de humanos e animais inferiores sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica e similares, e são proporcionais a um relação benefício/risco razoável.
[0098] Os inibidores de PERK adequados podem ser selecionados a partir de LY2, LY3, LY4 e suas combinações (veja a Tabela 4 abaixo). O inibidor de PERK pode ser um sal farmaceuticamente aceitável de LY2, LY3 e/ou LY4. Tabela 4. Inibidores de PERK exemplares Composto Nome Químico Estrutura LY2 3-amino-6-[4-[[(2R)-2-(3,5- difluorofenil)-2-hidróxi- acetil]amino]-2-metil-fenil]-N- metil-pirazina-2-carboxamida LI3 (2R)-N-[4-(4-amino-7-metil- pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)-3- metil-fenil]-2-(3-fluorofenil)-2- hidróxi-acetamida LI4 2-amino-5-[4-[[(2R)-2-(3,5- difluorofenil)-2-hidróxi- acetil]amino]-2-metil-fenil]-N- isopropil-piridina-3- carboxamida
[0099] Em algumas modalidades, o contato é realizado com um inibidor de PERK que não inibe EIF2AK1, EIF2AK2 ou EIF2AK4.
[00100] Em uma modalidade, o inibidor de PERK não inibe AXL. De acordo com esta modalidade, o inibidor de PERK é selecionado a partir de LY3 e LY4.
[00101] Em outra modalidade, o inibidor de PERK não inibe Flt3, MNK2 ou NTRK. De acordo com esta modalidade, o inibidor de PERK é LY4.
[00102] Em uma modalidade, o contato é realizado pela administração de um inibidor de MEK ao indivíduo. Inibidores de MEK exemplares são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, PD184352, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119/BAY 869766 (see, por exemplo, Iverson et al., "RDEA119/BAY 869766: A Potent, Selective, Allosteric Inhibitor of MEK1/2 for the Treatment of Cancer," Cancer Res. 69(17):6839-47 (2009), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade).
[00103] Em outra modalidade, o contato é realizado pela administração de um inibidor de CDK4/6 ao indivíduo. Inibidores de CDK4/6 exemplares são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, Abemaciclibe (LY2835219), palbociclibe (PD0332991) e ribociclibe (LEE011).
[00104] Em uma modalidade, o método pode envolver ainda a seleção de um indivíduo sem evidência de doença antes do referido contato. Por exemplo, o indivíduo pode estar em remissão do câncer antes do referido contato.
[00105] Ao realizar os métodos no presente documento descritos, o câncer residual mínimo é tratado em um indivíduo. Tal tratamento pode incluir, sem limitação, a administração a um indivíduo em necessidade de tratamento para câncer residual mínimo de um ou mais compostos eficazes para tratar o indivíduo para a condição (ou seja, câncer ou câncer residual mínimo).
[00106] Em uma modalidade, os métodos de tratamento da presente descrição são realizados sob condições eficazes para induzir latência em células tumorais disseminadas ("DTCs") e/ou para induzir a morte de DTC latente.
[00107] Na realização dos métodos de tratamento da presente descrição, a administração de compostos a um indivíduo pode envolver a administração de composições farmacêuticas contendo o (s) composto (s) (isto é, uma proteína derivada de BMP7 e um inibidor de PERK da presente descrição) em quantidades terapeuticamente eficazes, o que significa uma quantidade de composto eficaz no tratamento das condições e/ou distúrbios indicados no indivíduo. Tais quantidades geralmente variam de acordo com uma série de fatores bem dentro do alcance de pessoas ordinariamente versadas na técnica. Estes incluem, sem limitação, o indivíduo particular, bem como a idade, peso, altura, condição física geral e histórico médico do indivíduo, o composto particular usado, bem como o veículo no qual é formulado e a via de administração selecionada para isso; a duração ou duração do tratamento; e a natureza e gravidade da condição a ser tratada.
[00108] A administração envolve tipicamente a administração de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, o que significa formas de dosagem de compostos no presente documento descritos e incluem, por exemplo, comprimidos, drageas, pós, elixires, xaropes, preparações líquidas, incluindo suspensões, sprays, comprimidos inalantes, pastilhas, emulsões, soluções, grânulos, cápsulas e supositórios, bem como preparações líquidas para injeções, incluindo preparações de lipossomas. Técnicas e formulações geralmente podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Última edição, que é no presente documento incorporada por referência em sua totalidade.
[00109] Ao realizar os métodos de tratamento da presente descrição, o fármaco (isto é, uma proteína derivada de BMP7 e um inibidor de PERK da presente descrição) pode estar contido, em qualquer quantidade apropriada, em qualquer substância veículo adequada. O fármaco pode estar presente em uma quantidade de até 99% em peso do peso total da composição. A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é adequada para a via de administração oral, parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular), retal, cutânea, nasal, vaginal, inalante, pele (adesivo) ou ocular. Assim, a composição pode estar na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, emplastros, poções, dispositivos de distribuição osmótica, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, sprays ou aerossóis.
[00110] As composições farmacêuticas de acordo com a presente descrição podem ser formuladas para liberar o fármaco ativo substancialmente imediatamente após a administração ou em qualquer tempo ou período de tempo predeterminado após a administração.
[00111] As formulações de liberação controlada incluem (i) formulações que criam uma concentração substancialmente constante do(s) fármaco(s) dentro do corpo ao longo de um período de tempo prolongado; (ii) formulações que após um intervalo de tempo predeterminado criam uma concentração substancialmente constante do(s) fármaco(s) dentro do corpo durante um período de tempo prolongado; (iii) formulações que sustentam a ação do(s) fármaco(s) durante um período de tempo predeterminado, mantendo um nível de fármaco relativamente constante e eficaz no corpo com minimização concomitante de efeitos colaterais indesejáveis associados a flutuações no nível plasmático da substância ativa do fármaco; (iv) formulações que localizam a ação do(s) fármaco(s) por, por exemplo, colocação espacial de uma composição de liberação controlada adjacente a ou na(s) célula(s) doente(s), tecido(s) ou órgão(s); e (v) formulações que visam a ação do(s) fármaco(s) usando veículos ou derivados químicos para administrar o fármaco a um determinado tipo de célula alvo.
[00112] A administração de fármacos na forma de uma formulação de liberação controlada pode ser preferida nos casos em que o fármaco tem (i) um índice terapêutico estreito (ou seja, a diferença entre a concentração plasmática que leva a efeitos colaterais prejudiciais ou reações tóxicas e a concentração plasmática que leva a um efeito terapêutico é pequeno; em geral, o índice terapêutico (TI) é definido como a relação entre a dose letal mediana (LD50) e a dose efetiva mediana (ED50); (ii) uma janela de absorção estreita no trato gastrointestinal; ou (iii) uma meia-vida biológica muito curta de modo que a dosagem frequente durante o dia seja necessária para manter o nível plasmático a um nível terapêutico.
[00113] Qualquer uma de uma série de estratégias pode ser seguida para obter liberação controlada em que a taxa de liberação supere a taxa de metabolismo da droga em questão. A liberação controlada pode ser obtida por seleção apropriada de vários parâmetros de formulação e ingredientes, incluindo, por exemplo, vários tipos de composições e revestimentos de liberação controlada. Assim, o fármaco é formulado com excipientes apropriados em uma composição farmacêutica que, após administração, libera o fármaco de uma maneira controlada (comprimidos de unidades únicas ou múltiplas ou composições de cápsulas, soluções de óleo, suspensões, emulsões, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, adesivos e lipossomas).
[00114] Assim, a administração de acordo com os métodos da presente descrição pode ser realizada por via oral, tópica, transdérmica, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por instilação intranasal, por instilação intracavitária ou intravesical, intraocular, intra-arterial, intralesional ou por aplicação às membranas mucosas. Os compostos podem ser administrados sozinhos ou com veículos farmacêuticos adequados e podem estar na forma sólida ou líquida, tais como comprimidos, cápsulas, pós, soluções, suspensões ou emulsões.
[00115] O fármaco (isto é, uma proteína derivada de BMP7 e um inibidor de PERK da presente descrição) pode ser administrada oralmente, por exemplo, com um diluente inerte, ou com um veículo comestível assimilável, ou pode ser encerrado em cápsulas de invólucro duro ou mole, ou pode ser prensado em comprimidos, ou pode ser incorporado diretamente com o alimento da dieta. Para administração terapêutica oral, o fármaco pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes e similares. Essas composições e preparações devem conter pelo menos 0,001% de composto ativo. A percentagem do composto nestas composições pode, é claro, variar e pode estar convenientemente entre cerca de 0,01% a cerca de 10% do peso da unidade. A quantidade de composto activo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que se obtenha uma dosagem adequada. Em uma modalidade, as composições são preparadas de modo que uma unidade de dosagem oral contenha entre cerca de 1 μg e 1 g de composto ativo.
[00116] Os comprimidos, cápsulas e similares também podem conter um aglutinante, como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; um agente desintegrante, como amido de milho, amido de batata, ácido algínico; um lubrificante como o estearato de magnésio; e um edulcorante como sacarose, lactose ou sacarina. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo graxo.
[00117] Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope pode conter, além do ingrediente ativo, sacarose como agente edulcorante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e um aromatizante como cereja ou laranja.
[00118] O agente terapêutico também pode ser administrado por via parentérica. As soluções ou suspensões podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e suas misturas em óleos. Óleos ilustrativos são aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja ou óleo mineral. Em geral, água, solução salina, dextrose aquosa e solução de açúcar relacionada, e glicóis, tais como propilenoglicol, hialuronano e seus derivados, carboximetilcelulose e outros derivados de polissacarídeo solúvel ou polietilenoglicol, são veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de micro-organismos se não forem produzidos assepticamente.
[00119] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista fácil seringabilidade. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser protegido contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), suas misturas adequadas e óleos vegetais.
[00120] O agente terapêutico também pode ser administrado diretamente às vias respiratórias na forma de um aerossol. Para uso como aerossóis, o agente terapêutico em solução ou suspensão pode ser embalado em um recipiente de aerossol pressurizado juntamente com propulsores adequados, por exemplo, propulsores de hidrocarbonetos como propano, butano ou isobutano com adjuvantes convencionais. O agente terapêutico também pode ser administrado em uma forma não pressurizada, como em um nebulizador ou atomizador.
[00121] Em uma modalidade, a administração pode aumentar a quantidade de DCCs latentes detectáveis em um indivíduo em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais.
[00122] Em outra modalidade, a administração pode diminuir a quantidade de DCCs detectáveis em um indivíduo em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais.
[00123] No contexto da presente descrição, "tratamento" significa a manutenção de nenhuma evidência de doença sintomática (por exemplo, câncer) em um indivíduo.
[00124] Em uma modalidade, o termo "tratando" ou "tratamento" designa, em particular, a eliminação do câncer residual mínimo em um indivíduo. O termo tratamento inclui a indução de latência em DCCs. O termo tratamento também inclui a eliminação de DCCs latentes no indivíduo. O termo tratamento também inclui uma diminuição na quantidade ou número de DCCs latentes detectáveis em um indivíduo.
[00125] Outro aspecto da descrição se refere a um método de tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo. Este método envolve o contato de células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com um inibidor de retículo endoplasmático similar ao RNA de proteína cinase (PERK) selecionado de LY2, LY3 e LY4, onde o referido contato erradica DCCs no indivíduo para tratar o câncer residual mínimo em o indivíduo.
[00126] Conforme descrito acima, os métodos da presente descrição são adequados para o tratamento de câncer residual mínimo em um indivíduo que foi diagnosticado com qualquer um ou mais de câncer de mama, mieloma múltiplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cérebro, cervical câncer, linfoma de células de revestimento, leucemia, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, melanoma, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, glioblastoma, neuroblastoma, câncer colorretal e outros tipos de câncer.
[00127] O câncer pode ser um câncer de mama selecionado de câncer de mama invasivo, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma lobular in situ (LCIS) e câncer de mama inflamatório.
[00128] Em uma modalidade, o câncer de mama é um câncer de mama por HER2+.
[00129] Em outra modalidade, o indivíduo foi diagnosticado com células tumorais disseminadas e/ou um câncer não metastático.
[00130] Conforme descrito acima, os métodos da presente descrição podem envolver ainda a administração ao indivíduo de um agente quimioterápico, um agente imunoterapêutico, um agente epigenético ou radiação ionizante.
[00131] Quando um agente quimioterápico é administrado ao indivíduo, o agente quimioterápico pode ser um agente quimioterápico anti-HER2 selecionado a partir de trastuzumabe (Herceptin®) e lapatinibe (Tykerb®). Em outra modalidade, o agente quimioterápico pode ser selecionado a partir de uma antraciclina, um taxano, um inibidor de cinase, um anticorpo, uma fluoropirimidina e um fármaco de platina.
[00132] Quando um agente imunoterapêutico é administrado ao indivíduo, o agente imunoterapêutico é selecionado a partir de um inibidor do ponto de checagem imunológico, um interferon ou uma vacina contra tumor.
[00133] Quando um agente epigenético é administrado ao indivíduo, o agente epigenético pode ser selecionado a partir de um inibidor de histona desacetilase (HDAC), inibidor de 5-azacitidina, ácido retinoico, trióxido de arsênio, inibidor do Realçador de Subunidade do Complexo 2 Repressivo Polycomb de Zeste 2 ("EZH2"), inibidor de bromodomínio (BRD) e seus derivados.
[00134] O contato pode ser realizado administrando o inibidor PERK ao indivíduo. Os inibidores de PERK adequados são descritos em detalhes acima e incluem, sem limitação, LY2, LY3 e LY4.
[00135] Em uma modalidade, o método envolve ainda a detecção da presença de DTCs no indivíduo antes do referido contato. Conforme descrito em mais detalhes acima, as DTCs podem ser NR2F1+, fosfo-PERK ativo e/ou BMPR+.
[00136] O método pode envolver ainda o contato de DCCs/DTCs no indivíduo com uma proteína derivada de BMP7. Em uma modalidade, o contato de DCCs/DTCs no indivíduo com uma proteína derivada de BMP7 é realizado pela administração da proteína derivada de BMP7 ao indivíduo. Proteínas derivadas de BMP7 adequadas são descritas acima. Em uma modalidade, a proteína derivada de BMP7 é BMP7-F9.
[00137] Em uma modalidade, o inibidor de PERK não inibe EIF2AK1, EIF2AK2 ou EIF2AK4.
[00138] Conforme descrito acima, o indivíduo pode ser um mamífero, de preferência um humano.
[00139] Em uma modalidade, o método pode envolver ainda a seleção de um indivíduo sem evidência de doença antes do referido contato. Por exemplo, o indivíduo pode estar em remissão do câncer antes do referido contato.
[00140] Ainda outro aspecto da descrição se refere a um método de tratamento de câncer em estágio avançado em um indivíduo. Este método envolver contatar células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com um inibidor de retículo endoplasmático cinase similar ao RNA de proteína cinase (PERK) selecionado de LY2, LY3 e LY4, em que o referido contato erradica DTCs no indivíduo para tratar câncer residual mínimo no indivíduo.
[00141] Quando no presente documento usado, o termo "câncer em estágio avançado" refere-se ao câncer em estágio II, câncer em estágio III e/ou câncer em estágio IV, ou a qualquer câncer que tenha metastizado. Será apreciado que a natureza de "estágio avançado" dos estados de doença do câncer pode ser determinada por um médico.
[00142] Conforme descrito em detalhes acima, o indivíduo pode ter sido diagnosticado com câncer de mama, mieloma múltiplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cérebro, câncer cervical, linfoma de células de revestimento, leucemia, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, melanoma, cânceres de pele, cânceres de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, glioblastoma, neuroblastoma ou câncer colorretal.
[00143] Em uma modalidade, o câncer é câncer de mama selecionado de câncer de mama invasivo, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma lobular in situ (LCIS) e câncer de mama inflamatório. O câncer de mama pode ser um câncer de mama por HER2+.
[00144] O método pode envolver ainda a administração ao indivíduo de um agente quimioterapêutico, um agente imunoterapêutico, um agente epigenético ou radiação ionizante. Em uma modalidade, o agente quimioterápico é um agente quimioterápico anti-HER2 selecionado a partir de trastuzumabe (Herceptin®) e lapatinibe (Tykerb®). Em outra modalidade, o agente quimioterápico é selecionado a partir de uma antraciclina, um taxano, um inibidor de cinase, um anticorpo, uma fluoropirimidina e um fármaco de platina. O agente imunoterapêutico pode ser selecionado a partir de um inibidor de ponto de controle imunológico, um interferon ou uma vacina contra tumor. O agente epigenético pode ser selecionado a partir de um inibidor de histona desacetilase (HDAC), 5-azacitidina, ácido retinoico, trióxido de arsênio, inibidor do Realçador de Subunidade do Complexo 2 Repressivo Polycomb de Zeste 2 (EZH2), inibidor do bromodomínio (BRD) e seus derivados.
[00145] Em uma modalidade, o contato é realizado pela administração do inibidor de PERK ao indivíduo.
[00146] O método pode ainda envolver a detecção da presença de DCCs/DTCs no indivíduo antes do referido contato.
[00147] Conforme descrito acima, as DTCs podem ser NR2F1+ ou fosfo-PERK ativos.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Materiais e Métodos para os Exemplos 2-6
[00148] Reagentes, cultura de células e tratamentos: o EGF foi obtido da PeproTech (Rocky Hill, NJ) e usado a 100 ng/ml. Thapsigargina era da Sigma (St. Louis, MO) e usada a 2 nM. A linhagem celular ZR75.1-H2B-Dendra2 foi gerada por transfecção estável do plasmídeo H2B-Dendra2 (Gurskaya et al., "Engineering of a Monomeric Green-to-Red Photoactivatable Fluorescent Protein Induced by Blue Light," Nat. Biotechnol. 24:461-465 (2006), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Para culturas 3D, as células MCF10A-HER2, SKBR3 e ZR75.1-H2B- Dendra2 foram semeadas em Matrigel com fator de crescimento reduzido (Corning, Corning, NY) e cultivadas como descrito precedentemente (Avivar-Valderas et al., "Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK," Oncogene 32(41):4932-40 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Ao se referir a "baixa densidade", 3.500 células/8 cavidades foram semeadas e para "alta densidade" 20.000 células/8 cavidades. Os tratamentos com veículo (DMSO) ou LY4 (2 µM) foram substituídos a cada 24 horas para culturas 2D e a cada 48 horas para culturas 3D.
[00149] Camundongos, crescimento de tumor e processamento de tecido: A cepa de camundongo FVB/N-Tg (MMTVneu) foi obtida de Jackson Laboratories (Sacramento, CA). Estes camundongos expressam a forma neu não ativada (HER2) sob o controle da transcrição do promotor/realçador do vírus do tumor mamário de camundongo. Antes de serem usadas em qualquer experimento, as fêmeas passaram por uma fase de gravidez e pelo menos duas semanas sem lactação após o desmame. Fêmeas entre 24-32 semanas de idade foram injetadas intraperitonealmente com veículo (90% de óleo de milho, 10% de etanol) ou LY4 (50 mpk) diariamente, por duas semanas. Para o tratamento de combinação, fêmeas com 24- 32 semanas de idade foram tratadas diariamente por gavagem oral com Abemaciclibe (50 mpk) por 4 semanas antes de iniciar o tratamento descrito precedentemente com LY4. Os volumes do tumor foram medidos usando a fórmula (Dxd2)/2, onde D é o maior e d é o menor diâmetro. Para contagem de CTC, os animais foram anestesiados e o sangue total foi extraído por punção cardíaca. Glândulas mamárias, pulmões e tumores foram coletados e fixados em formalina tamponada a 10% durante a noite antes da inclusão em parafina. A medula óssea dos dois membros inferiores foi lavada com uma agulha 26 G e posteriormente processada por centrifugação em gradiente de densidade em Ficoll. Para CTC, bem como para detecção de DTC na medula óssea, os tecidos foram esgotados de células hematopoiéticas maduras por separação de contas magnéticas marcadas com anticorpo anti-camundongo (Miltenyi Biotec, San Diego, CA) antes da fixação em formalina por 20 minutos a 4°C.
[00150] Manchamento de montagem total da glândula mamária: As glândulas mamárias fixadas em formalina tamponada a 10% foram incubadas em corante Carmine Alum (Carmim 0,2%, sulfato de potássio de alumínio 0,5%) (Sigma, St. Louis, MO) durante 2 dias. Em seguida, elas foram desidratadas e transferidas para uma solução de salicilato de metila antes da imagem usando um estereomicroscópio.
[00151] IHC e IF: IHC e IF de seções embebidas em parafina foram realizadas conforme descrito precedentemente (Avivar-Valderas et al., "Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK," Oncogene 32(41):4932-40 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Resumidamente, as lâminas foram desparafinadas e reidratadas em série. A recuperação do antígeno induzida por calor foi realizada em tampão citrato (10 mM, pH 6), tampão EDTA (1 mM, pH 8) ou Tris/EDTA (pH 9). As lâminas foram ainda permeabilizadas em 0,1% TritonTM-X100, bloqueadas e incubadas com anticorpo primário durante a noite a 4°C em diluição de 1: 50-1: 200. Para IHC, uma etapa adicional de extinção de peroxidase endógena e avidina/biotina foi realizada antes da incubação do anticorpo primário. Os anticorpos primários usados foram anticitoqueratina 8/18 (Progen, Heidelberg, Germany), actina-Cy3 do músculo liso (Sigma, St. Louis, MO), P- PERK (T980) (Tenkerian et al., "mTORC2 Balances AKT Activation and eIF2alpha Serine 51 Phosphorylation to Promote Survival Under Stress," Mol. Cancer Res. 13:1377-1388 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), P-EIF2A,
Cleaved Caspase 3, P-H3(S10), P-HER2(Y1221/1222) (Cell signaling, Danvers, MA), P-Rb(S249/T252) (Santa Cruz, Dallas, TX), HER2 (Abcam, Cambridge, MA), HER2 (Millipore, Darmstadt, Germany), Ki67 (eBioscience and Abcam), cytokeratin cocktail (C11 and ck7, Abcam; AE1 and AE3, Millipore), and GADD34 (Santa Cruz). Em seguida, as lâminas foram incubadas em anticorpos secundários (Life Technologies, Norwalk, CT) e montadas. Para IHC, as seções foram processadas usando o kit VectaStain ABC Elite (Vector Laboratories, Bulingame, CA) e o kit DAB Substrate para marcação de peroxidase (Vector Laboratories) e montadas em meio VectaMount (Vector laboratories). Para IF, as seções foram montadas em meio aquoso ProLong Gold Antifade (Thermo Fisher, Waltham, MA).
[00152] No caso de imunocitofluorescência, cytospins de células fixas (100.000 -200.000 células/cytospin foram preparadas por citocentrifugação a 500 rpm por 3 minutos em lâminas poli-prep, e o protocolo de manchamento foi realizado conforme explicado abaixo a partir da permeabilização. Na manchamento de culturas 3D, ácinos foram fixados em PFA 4% por 20 minutos a 4°C, permeabilizados com TritonTM-X100 0,5% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente, lavados em PBS-glicina e, em seguida, bloqueados com 10% normal soro de cabra por uma hora a 37°C, antes de realizar a manchamento por imunofluorescência.
[00153] A pontuação para os níveis de P-HER2 é explicada na Figura 10A. Para a pontuação de CK8/18 e SMA em dutos da glândula mamária, 20 campos de baixa ampliação foram avaliados por animal para a expressão de CK8/18 como negativo (0), baixo (1) ou alto (2) e o mesmo para SMA e a soma das duas pontuações foi considerada como pontuação final (de 0 a 4).
[00154] Microscopia: as imagens foram capturadas usando um microscópio Nikon Eclipse TS100, um microscópio multifotônico Leica
DM5500 ou confocal Leica SP5.
[00155] Detecção de morte celular in situ TUNEL: Os níveis de apoptose foram avaliados usando o kit de detecção de morte celular in situ, AP (Roche, Basel, Switzerland). Seções de parafina de tumores foram desparafinadas, reidratadas e permeabilizadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,2% de TRITONTM-X100 por 8 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas e bloqueadas em soro de cabra normal 20% por uma hora a 37°C. A mistura de reação TUNEL foi então adicionada e deixada ir durante uma hora a 37°C. A reacção foi parada incubando com Tampão I (cloreto de sódio 0,3 M, citrato de sódio 30 mM). A seguir, as lâminas foram incubadas com anticorpo antifluoresceína-AP por 30 minutos a 37°C. Após três lavagens em solução salina tamponada com Tris (TBS), as lâminas foram incubadas em substrato de fosfatase alcalina em 0,1% TWEENTM-20 por 20 min em temperatura ambiente. Finalmente, as lâminas foram montadas usando meio de montagem aquoso. A porcentagem de células TUNEL positivas foi calculada usando o software Image J (NIH).
[00156] Análise de imunoblot: As células foram lisadas em tampão RIPA e a proteína analisada por imunoblotting, conforme descrito precedentemente (Ranganathan et al., "Functional Coupling of p38- Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells," Cancer Res. 66: 1702-1711 (2006), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). As membranas foram transferidas usando os seguintes anticorpos adicionais: P-PERK (T982) (Tenkerian et al., "mTORC2 Balances AKT Activation and eIF2alpha Serine 51 Phosphorylation to Promote Survival Under Stress," Mol. Cancer Res. 13:1377-1388 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), PERK (Santa Cruz, Dallas, TX), P-EGFR(Y1148), EGFR, P-AKT(S473), P-S6 (S235/236) (Cell signaling, Danvers, MA), GAPDH (Millipore, Darmstadt, Germany) e β-Tubulina (Abcam, Cambridge, MA). Para indução de estresse de ER, as células MCF10A-HER2 foram plaqueadas em placas de baixa adesão por 24 horas antes da coleta.
[00157] Ensaio de biotinilação de superfície celular e endocitose: Para biotinilação de superfície celular, o kit de isolamento de proteína de superfície celular Pierce foi usado seguindo as instruções do fabricante com pequenas alterações. Resumidamente, as células MCF10A-HER2 estavam privadas de soro e EGF e tratadas com +/- LY4 por 24 horas antes de serem estimuladas com +/- EGF (100 ng/ml) por 20′. Em seguida, as células foram lavadas com PBS gelada e as proteínas de superfície biotiniladas durante 30 minutos a 4°C. Após a extinção, as células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA. Os lisados de proteína foram incubados com contas de agarose NeutrAvidin e as proteínas ligadas foram liberadas por incubação com tampão de amostra SDS-PAGE contendo DTT (50 mM). Para ensaios de endocitose (Cihil et al., "The Cell-Based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins," J. Vis. Exp. e50867 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), as células foram tratadas de forma similar, mas antes do tratamento com as proteínas da superfície celular EGF foram biotiniladas. Após 20 minutos de incubação +/- EGF (100 ng/ml) a 37°C (para induzir endocitose), as células foram lavadas com PBS gelado e incubadas com tampão de separação (para remover a biotinilação da superfície celular: 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2, CaCl2 0,1 mM, glutationa 50 mM e NaOH 80 mM, pH 8,6) durante 30 minutos. Para controlar a eficiência de separação, as células foram removidas sem incubação a 37°C (t = 0). Os lisados celulares foram preparados e processados para isolamento de proteína biotinilada como descrito antes.
[00158] Análise da expressão gênica direcionada a uma célula única: Tumores primários de fêmeas MMTV-neu de 28-30 semanas de idade foram digeridos com colagenase em uma suspensão de célula única. Pulmões de fêmeas MMTV-neu de 15-30 semanas de idade foram digeridos em uma suspensão de célula única com colagenase e ressuspensos em tampão FACS. As células foram então coradas com anti-HER2-PE, anti-CD45-APC e DAPI e a população de células HER2+/CD45- classificada usando um classificador BDFACSAria. As células selecionadas foram ressuspensas em uma concentração de
312.500 células/ml no meio e 80 µl foram misturados com 20 µl de reagente de suspensão (C1 Fluidigm). Um pré-amplificador de célula única C1 IFC 10-17 µm foi usado para a separação de célula única. A pré-amplificação foi executada usando o kit Ambion Single Cell-to-CT qRT-PCR e ensaios com 20x TaqMan Gene expression FAM-MGB. O cDNA resultante foi ainda diluído em reagente de diluição de C1 DNA 1/3 e usado para análise de expressão gênica usando 96,96 IFCs (Fluidigm), controlador de sistema Juno e Biomark HD para qPCR de alto rendimento. TaqMan Fast Advanced Master Mix foi usado para as reações qPCR. A análise foi realizada usando ferramenta baseada na web Fluidigm Real-Time PCR Analysis Software e Clustergrammer (Fernandez et al., "Clustergrammer, A Web-Based Heatmap Visualization and Analysis Tool for High-Dimensional Biological Data", Sci. Data 4: 1- 12 (2017), que é no presente documento incorporada por referência em sua totalidade) para mapas de calor de agrupamento hierárquico.
[00159] Ensaios bioquímicos: Domínio catalítico EIF2AK3 (PERK) humano recombinante (aminoácidos 536-1116; Cat # PV5107), substrato GFP-eIF2α (Cat # PV4809) e anticorpo fosfo-eIF2α marcado com Térbio (Cat # PR8956B) foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA). O domínio catalítico HIS-SUMO-GCN2 (aminoácidos 584-1019) foi expresso e purificado a partir de E. coli. Os ensaios de cinase TR- FRET foram realizados na ausência ou presença de inibidores em um tampão de reação que consiste em substrato de HEPES 50 mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM, EGTA 1,0 mM e Brij-35 0,01% e GFP-eIF2α 100- 200 nM. Os ensaios de PERK continham 62,5 ng/ml de enzima e 1,5 µM de ATP (Km, app ~ 1,5 μM) e os ensaios de GCN2 continham enzima 3 nM e 90 µM de ATP (Km, app ~ 200 μM). Após a adição do composto teste, a reação foi iniciada pela adição da enzima e incubada em temperatura ambiente durante 45 minutos. A reação foi interrompida pela adição de EDTA a uma concentração final de 10 mM e o anticorpo fosfo-eIF2α marcado com Térbio foi adicionado a uma concentração final de 2 nM e incubado por 90 minutos. A fluorescência resultante foi monitorada em um leitor EnVison® Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA). As relações de TR-FRET e os valores de IC50 resultantes foram determinados a partir das curvas de inibição ajustadas. O perfil de especificidade bioquímica foi realizado em Cerep (Redmond, WA) e DiscoverX (San Diego, CA).
[00160] Ensaio de TR-FRET baseado em células: Resumidamente, células GripTite™ 293 (Invitrogen) que expressam GFP-eIF2α foram semeadas a 10.000 células por cavidade em placas de 384 cavidades e permitidas a anexar durante a noite. As células foram pré-tratadas com compostos teste durante 1 hora. Adicionou-se tunicamicina (1 µM) para induzir a atividade de PERK e as placas foram incubadas a 37°C durante 2 horas. O meio de cultura foi removido e as células foram lisadas em tampão consistindo em Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NP-40 1%, NaF 5 mM, inibidores de protease (Sigma Cat # P8340), Inibidores da fosfatase (Sigma Cat # P2850) e anticorpo anti-fosfo-eIF2 marcado com Térbio 2 nM (Invitrogen Cat #
PM4312I). Os lisados celulares foram incubados durante 2 horas no escuro em temperatura ambiente e a fluorescência foi monitorada em uma leitora EnVison® Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA). As relações de TR-FRET e os valores de IC50 resultantes foram determinados a partir das curvas de inibição ajustadas usando cavidades não induzidas (100% de inibição) e induzidas (0% de inibição) como controles.
[00161] Ensaio ATF4-luc: células 293 foram transduzidas com um lentivírus de expressão de ATF4-luc (SABiosciences, Frederick, MD) e selecionadas em meio de crescimento contendo 1 µg/ml de puromicina. Para determinar o efeito dos compostos na atividade de ATF4 induzida por estresse de ER, células 293-ATF4-luc foram semeadas em 15.000 células por cavidade em placas de 96 cavidades revestidas com poli-D-Lisina e permitidas unir durante a noite. As células foram, então, pré-tratadas com compostos de teste durante 30 minutos. Tunicamicina (2 µM) foi adicionada para induzir estresse de ER e as placas foram incubadas a 37°C por 6 horas. O meio de cultura foi, então, aspirado e as células foram lisadas em tampão de lise passivo (Promega Cat# E194A) em um agitador de placas por 5 minutos. A atividade da luciferase foi monitorada usando Luciferase Assay Reagent (Promega Cat# E1501) em uma Contadora Wallac 1420 Victor2™ Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA) e os valores de IC50 foram determinados a partir das curvas de inibição ajustadas resultantes usando cavidades não induzidas (100% de inibição) e induzidas (0% de inibição) como controles.
[00162] Ensaios de viabilidade celular: células Hela, HT-1080 e Bx- PC-3 foram monitoradas quanto ao crescimento em placas de 96 cavidades na ausência ou presença de inibidores de PERK por 48, 72 ou 96 horas, respectivamente. A viabilidade celular foi determinada usando reagente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) e os valores de IC50 foram determinados a partir das curvas de inibição ajustadas resultantes usando cavidades não tratadas (0% de inibição) e tratadas com 20 µM de estaurosporina (100% de inibição) como controles.
[00163] Análise estatística: Todos os pontos representam amostras biológicas independentes com barras de erro representando desvios padrão e a significância estatística foi determinada usando um teste de Mann-Whitney usando o software Graph Pad Prism. Exemplo 2 - HER2+ DTCs Quiescentes Exibem uma Resposta ao Estresse de ER
[00164] Foi demonstrado que a ativação da via PERK serve como um efetor crucial da interrupção do crescimento induzida por UPR e da sobrevivência ligada a um fenótipo latente (Brewer et al., "PERK Mediates Cell-Cycle Exit During the Mammalian Unfolded Protein Response," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12625-30 (2000); Ranganathan et al., "Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase in Tumor Cell Growth Arrest and Survival," Cancer Res. 68:3260-3268 (2008); e Ranganathan et al., "Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells," Cancer Res. 66:1702-1711 (2006), cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Em animais MMTV-HER2, uma alta porcentagem de camundongos desenvolve metástases para os pulmões, que podem ser iniciadas por DCCs precoces ou DCCs tardios (Guy et al., "Expression of the Neu Protooncogene in the Mammary Epithelium of Transgenic Mice Induces Metastatic Disease," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 89:10578-10582 (1992); Husemann et al., "Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer," Cancer Cell 13:58-68 (2008); Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016); Hosseini et al., "Early
Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer," Nature 540:552- 558 (2016), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade). DCCs latentes exibem perda de caderina-E e expressão de Twist1 (Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade) e DCCs negativos para E-caderina em modelos de câncer pancreático também mostraram ser quiescentes e exibiram a super-regulação de CHOP, um gene induzido por PERK (Pommier et al., "Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases," Science 360(6394):eaao4908 (2018), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Para avaliar se esta mesma correlação entre os níveis de ativação da via PERK e interrupção do ciclo celular está presente no modelo de metástase espontânea de MMTV-HER2, duas abordagens diferentes foram usadas – imageamento de alta resolução usando imunofluorescência (IF) e análise de expressão gênica de resolução de célula única de DCCs e metástases.
IF de seções de tecido pulmonar de MMTV-HER2 de animais portadores de grandes tumores e, portanto, portadores de DCCs latentes e proliferativas (Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Em seguida, os tecidos foram cocorados para detectar DCCs positivas para HER2, Ki67 (como um marcador de proliferação) e GADD34 (ou PPP1r15A). GADD34 é um gene de estresse indutível por PERK responsável pela mudança programada da repressão translacional (devido à fosforilação de eIF2α) para a expressão gênica induzida por estresse (Novoa et al., "Stress-Induced Gene Expression Requires Programmed Recovery from Translational
Repression," EMBO J. 22:1180-7 (2003), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). A análise de imagem mostrou que as lesões metastáticas de HER2+ ou DCCs com um índice proliferativo baixo (ki67baixo) apresentaram altos níveis de estresse por ER, como mostrado por altos níveis de expressão de GADD34 (Figura 1A, painéis superiores e gráfico). Por outro lado, DCCs ou lesões altamente proliferativas mostraram níveis muito baixos de manchamento de GADD34 (Figura 1A, painéis inferiores e gráfico). Os dois marcadores, Ki67 e GADD34, foram anticorrelacionados em 100% das células, apoiando que UPRalta, DCCs quiescentes e lesões metastáticas podem ser biomarcadas pela detecção de GADD34.
[00165] Em seguida, foi avaliado se estas correlações também seriam verdadeiras em lesões metastáticas da mama humana, testando 17 metástases de câncer de mama de diferentes subtipos e fontes (linfonodo, pulmão, fígado) (Tabela 5). As metástases de câncer de mama foram coradas para citoqueratinas para identificar as lesões metastáticas, Ki67 e GADD34. Lesões metastáticas humanas avançadas exibiram um padrão de manchamento mais heterogêneo para ambos os marcadores entre diferentes pacientes e entre diferentes áreas da mesma lesão do que no modelo de camundongo. No entanto, foi observada uma correlação oposta entre os níveis de proliferação (Ki67) e ativação de estresse por ER (GADD34), independentemente do tipo de metástase (Figura 1B). Esta análise valida os resultados nos modelos de camundongos e que GADD34 pode ajudar a identificar as células tumorais de UPRalta/quiescentes em sítios metastáticos.
Tabela 5. Amostras de Metástases de Câncer de Mama Humano de Status de HER2
Citoqueratinas Status de ER
Status de PR
Metástase Patologia
GADD34* Paciente
Amostra Nome
Ki67* 5 14850 - - + Carcinoma ductal Linfonodo + H L
4 14851 + - + Carcinoma ductal Linfonodo + L I
7 14852 - - + Carcinoma ductal Linfonodo + H L
8 14853 - - + Carcinoma ductal Linfonodo + H L
6 14854 + + + Carcinoma ductal Linfonodo + I L
1 14855 + + + Carcinoma ductal Linfonodo + L H
3 14856 + + + Carcinoma ductal Linfonodo + L H
9 14857 + + + Carcinoma ductal Linfonodo + H -
10 14858 - - + Carcinoma ductal Linfonodo + I -
2 14859 + - + Carcinoma ductal Linfonodo + L H
Invasivo mal Linfonodo 9876 parte D + + - + L I diferenciado
Ductal Liver 3603 parte B + + - moderadamente + H L diferenciado
879 parte C - - - Não declarado Liver + H -
Ductal Liver 1645 parte F - - + moderadamente + L H diferenciado
Ductal Liver 1415 parte B + + - moderadamente - I I diferenciado
Filodes malignos, Chest 8852 parte A N/A N/A N/A sarcomatoide de + L L wall alto grau
+, Adeno mal Lung 943 parte C - - + L H fraco diferenciado
*alto (H); baixo (L); intermediário (I)
[00166] Marcadores de proliferação, quiescência, latência e estresse por ER presentes em células metastáticas foram avaliados através da realização de análise de expressão gênica direcionada a uma única célula de DCCs, micrometástases e macrometástases alojadas nos pulmões de camundongos MMTV-HER2. Pulmões de fêmeas MMTV-HER2 foram processados em suspensões de células únicas e células HER2+/CD45- foram classificadas (Figura 2A). As células classificadas foram, então, processadas para separação de célula única, lise, RT e pré-amplificação usando a tecnologia C1 (Fluidigm) como mostrado na Figura 2A.
Este canal permitiu o isolamento e processamento, com alto grau de confiança (IF e confirmação molecular de da célula única HER2+) e qualidade, de 255 DCCs individuais e 90 células tumorais primárias e seus pools correspondentes.
Em seguida, qPCR de alto rendimento foi usada para analisar a expressão de genes de estresse por ER, genes do ciclo celular (ativadores e inibidores) e genes de latência (Kim et al., "Dormancy Signatures and Metastasis in Estrogen Receptor Positive and Negative Breast Cancer," PloS One 7:e35569 (2012), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade; B’chir et al., "The eIF2α/ATF4 Pathway is Essential for Stress-Induced Autophagy Gene Expression," Nucleic Acids Res. 41:7683-99 (2013); Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade) (Figura 2B). A expressão do gene de resolução de célula única de DCCs revelou a existência de uma população de células (Figura 1C, grupo 1, aproximadamente 19% dos DTCs) que mostram a super-regulação concomitante e forte de todos os genes de estresse por ER testados (incluindo o próprio PERK) (caixa que abrange Fam123b-Ddit3) com reguladores negativos da proliferação celular,
como Rb1 e TP53 e inibidores de CDK p21, p27, p16 e p15 (caixa que abrange Cdkn2a-Rb1) (Figura 1C). O enriquecimento na expressão de genes de latência como NR2F1, DEC2 (Bhlhe41), TWIST1, CDH5, STAT3 e COL4a5 também foi observado nessas células (Kim et al., "Dormancy Signatures and Metastasis in Estrogen Receptor Positive and Negative Breast Cancer," PloS One 7:e35569 (2012) and Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), cada um dos quais é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade) (caixa que abrange Nr2f1-Ccnd1). Outro grupo de DCCs, o grupo 2 (22%), também apresentou altos níveis de expressão gênica de estresse por ER junto com o p21. Grupo 3 (6%) mostrou menos dentre estresse por ER, inibidores do ciclo celular e genes de latência, sugerindo que estes podem representar células em trânsito para fora da latência ou em modo de ciclo lento.
No total, cerca de 40% das DCCs apresentaram um nível alto a intermediário de expressão gênica de estresse por ER, simultâneo com inibidores do ciclo celular ou genes de latência.
Isso está na faixa com a porcentagem de DCCs latentes detectadas em animais de MMTV-HER2 de progressão avançada usando detecção de fosfo-Histona H3 e fosfo-Rb (Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Ao todo, esses dados mostram que, mesmo em animais com metástases detectáveis, ~ 40% das DCCs exibem alta expressão de inibidores do ciclo celular.
É importante ressaltar que neste modelo, esta subpopulação de DCC latente exibe uma UPR não resolvida com expressão de ativação proeminente de genes da via de PERK.
Exemplo 3 - Inibição de PERK Erradica as DCCs Quiescentes na Medula Óssea e nos Pulmões e, Por Sua Vez, Suprime a Metástase Pulmonar
[00167] Os resultados dos exemplos acima levaram a uma avaliação dos efeitos dos inibidores seletivos de PERK no destino de DCC latente e na formação de metástases. LY2, LY3 e LY4 (inibidores da série LY) foram identificados como inibidores de PERK potentes e seletivos com propriedades similares a fármaco adequadas para apoiar estudos in vivo (Pytel et al., "PERK Is a Haploinsufficient Tumor Suppressor: Gene Dose Determines Tumor-Suppressive Versus Tumor Promoting Properties of PERK in Melanoma," PLoS Genet. 12:1-22 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Os inibidores da série LY foram testados em ensaios de cinase in vitro (usando eIF2α como substrato) e ensaios baseados em células observando a fosforilação de eIF2α e sua saída ATF4 a jusante (Tabela 6). Todos os três inibidores mostraram potência similar ou superior em comparação com GSK2656157 (Axten et al., "Discovery of GSK2656157: An Optimized PERK Inhibitor Selected for Preclinical Development," ACS Med. Chem. Lett. 4:964-968 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade); reduziu efetivamente os níveis de P-PERK (P-T980) e seu alvo a jusante ATF4 em células MCF10A que expressam HER2 (Figura 2C e Figura 3A); e tornou essas mesmas células sensíveis ao tratamento com dose baixa de tapsigargina, mostrando assim como esses inibidores de PERK afetam seletivamente a adaptação ao estresse por ER (Figura 2D).
[00168] Usando ensaios enzimáticos bioquímicos (Figura 2E), LY4 mostrou a especificidade mais alta não apresentando alvos de cinase secundários abaixo da concentração de 15 M, enquanto LY2, LY3 e GSK2656157 apresentaram vários alvos secundários abaixo de 5 M,
e mesmo em concentração de 1 M.
Usando o perfil de cinase DicoveRx scanMAXTM (Tabela 6), foi corroborado que LY4 exibiu maior seletividade em comparação com os outros inibidores, mesmo em uma concentração muito alta (20 M), na qual LY4 inibiu apenas 20 cinases em > 50% de um total de 456 em comparação com 80 por GSK2656157, ou 8 em comparação com 58 por > 60% de inibição.
Nenhum desses alvos secundários aconteceu de ser qualquer uma das outras cinases de eIF2α conhecidas, EIF2AK1 (também conhecida como HRI), EIF2AK2 (também conhecida como PKR) e EIF2AK4 (também conhecida como GCN2) (Tabela 7), indicando que a atividade medida em eIF2α foi altamente específica para a inibição de PERK.
Tabela 6. Valores de IC50 Enzimáticos e Baseados em Células e Seletividade de Cinase dos Diferentes Inibidores de PERK
IC50 da Enzima IC50 baseada na IC50 baseada na IC50 da Enzima # cinases inibidas > 50% e Composto PERKa Célula PERKb Célula ATF4-luc c GCN2d (µM) (µM) (µM) (µM) 0,2 µM 2,0 µM 20,0 µM
LY2 0,002 0,117 0,056 10,8 16 35 138
LY3 0,002 0,026 0,016 16,4 27 85 229
LY4 0,002 0,054 0,048 18,1 19 20 48
GSK2656157 f 0,008 0,036 0,021 >200 34 80 183 aEnsaio bioquímico de PERK usando eIF2a purificada como substrato. bEnsaio baseado em célula de fosforilação de eIF2a induzida por tunicamicina em células 293. cEnsaio baseado em células da atividade de ATF4-Luc induzida por tunicamicina em células 293. dEnsaio bioquímico de GCN2 usando eIF2a purificado como substrato. ePerfil de cinase DiscoveRx scanMAXTM baseado em dados de ligação usando o deslocamento de sondas de sítio ativo, 456 cinases testadas. fAtkins et al., "Characterization of a Novel PERK Kinase Inhibitor with Antitumor and Antiangiogenic Activity", Cancer Res. 73 (6): 1993-2002 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade.
Tabela 7. Comparação da Inibição in vitro de outras cinases eiF2α Símbolo LY4 GSK-2656157b Símboloa de do Gene KINOMEscan GENE 0,2 µM 2 µM 20 µM 0,2 µM 2 µM 20 µM Entrez EIF2AK1 EIF2AK1 0 0 35 8 77 95 PRKR EIF2AK2 0 0 0 20 45 67 GCN2(Kin.Dom.2,S808G) EIF2AK4 0 0 28 7 13 79 a Perfil de cinase DiscoveRx scanMAXTM baseado em dados de ligação usando deslocamento de sondas de sítio ativo, 456 cinases testadas. b Atkins et al., "Characterization of a Novel PERK Kinase Inhibitor with Antitumor and Antiangiogenic Activity", Cancer Res. 73 (6): 1993-2002 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade.
[00169] Camundongos fêmeas MMTV-HER2 uníparos de 24-32 semanas de idade foram tratados com veículo ou LY4 (50 mpk) i.p. diariamente, durante duas semanas. Glândulas mamárias, pulmões, pâncreas, medula óssea e tumores foram coletados para análises posteriores. LY4 foi bem tolerado, sem alterações significativas no peso corporal, o que está de acordo com estudos recentes que não mostraram efeito nos níveis de glicose no sangue ou na função do pâncreas (Pytel et al., "PERK Is a Haploinsufficient Tumor Suppressor: Gene Dose Determines Tumor-Suppressive Versus Tumor Promoting Properties of PERK in Melanoma," PLoS Genet. 12:1-22 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). O inibidor não teve um efeito significativo na homeostasia das células da medula óssea ou nos glóbulos brancos do sangue periférico, como mostrado por nenhum efeito nas contagens de células totais de fêmeas MMTV-HER2 (Figura 2F).
[00170] A inibição de PERK causou uma diminuição significativa nos níveis de P-PERK e P-eIF2α nos ductos da glândula mamária e no tecido pancreático (embora apenas parcial especialmente em ilhotas pancreáticas) (Figura 3B). Concluiu-se que a entrega sistêmica de LY4 inibe efetivamente a ativação de PERK e a fosforilação de eIF2α. A inibição de PERK não esgotou totalmente a atividade de PERK, o que pode permitir que camundongos controlem sua função pancreática e os níveis de glicose (Yu et al., "Type I Interferons Mediate Pancreatic Toxicities of PERK Inhibition," Proc. Natl. Acad. Sci. 112:15420-15425 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[00171] Uma alta porcentagem de animais MMTV-HER2 desenvolve metástases para os pulmões, que podem ser iniciadas no início da progressão (Guy et al., "Expression of the Neu Protooncogene in the Mammary Epithelium of Transgenic Mice Induces Metastatic Disease," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 89:10578- 10582 (1992); Husemann et al., "Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer", Cancer Cell 13:58-68 (2008); Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer", Nature 540:588-592 (2016), Hosseini et al., "Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer", Nature 540:552- 558 (2016); Linde et al., "Macrophages Orchestrate Breast Cancer Early Dissemination and Metastasis," Nat. Commun. 9:21 (2018), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade).
[00172] Assim, o efeito do inibidor LY4 PERK na doença metastática foi monitorado em animais com tumores pequenos e/ou grandes palpáveis. Todos os animais tratados com veículo apresentaram metástases detectáveis nas seções coradas com H&E. As lesões que exibiram >100 células foram categorizadas como macrometástases, uma vez que também são comumente positivas para marcadores de proliferação (Figura 1A). A quantificação de macrometástases por animal (5 seções pulmonares não consecutivas) revelou que, após apenas um tratamento de duas semanas, o LY4 reduziu o número e a incidência de macrometástases (Figura 3C) sem afetar a área dessas metástases (Figura 4A). Isso sugeriu que a inibição de PERK pode estar agindo nas etapas iniciais da metástase, em vez de diminuir as macrometástases estabelecidas.
Assim, foi avaliado em seguida se o tratamento com LY4 pode estar afetando a intravasamento de células tumorais do sítio primário ou a transição de DCC solitário para micrometástase (contendo 2-100 células). A detecção de células tumorais circulantes HER2+ (CTCs) diretamente em amostras de sangue não mostrou diferença significativa entre o veículo e os animais tratados com LY4 (Figura 4B), indicando que LY4 não está afetando grosseiramente o intravasamento de células tumorais.
Por outro lado, a detecção de micrometástases e DCCs únicas usando detecção de HER2 via IHC revelou uma diminuição significativa no número de micrometástases em fêmeas tratadas com LY4 (Figura 3D). Mais de 80% das DCCs únicas nos pulmões são negativos para P-Rb, indicando que eles estão principalmente fora do ciclo e latentes.
Esta medição reproduz medições de estudos precedentes (Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade). Significativamente, LY4 reduziu fortemente o número de DCCs únicas não proliferantes (negativas para P-Rb) que são comumente associadas a vasos sanguíneos em seções do pulmão, sem afetar o número de DTCs solitários positivas para P-Rb (Figura 3E) ou micrometástases (Figura 4C). É importante notar que LY4 diminuiu significativamente o número de DCCs encontrados na medula óssea (Figura 3F). Neste órgão, as metástases nunca se desenvolvem, porém, as DCCs são encontrados em alta incidência e estão latentes (Bragado et al., "TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling," Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013); Husemann et al., "Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer," Cancer Cell 13:58-68 (2008); e Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016), cada um dos quais é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade). Estes resultados argumentam que a inibição de PERK está seletivamente direcionada às DCCs latentes não proliferativas que exibem sinalização ativa de PERK e UPR.
[00173] Para testar ainda mais se o tratamento com LY4 poderia direcionar seletivamente a sobrevivência de DCCs humanas fora do ciclo, esta biologia foi modelada em culturas 3D. Células ZR75.1 HER2+ humanas expressando de forma estável uma proteína fluorescente fotocomutável (Dendra2) fundida para histona H2B foram usadas para realizar ensaios de retenção de marcador de longo prazo, devido à lenta renovação de nucleossomas contendo H2B em células quiescentes (Wilson et al., "Hematopoietic Stem Cells Reversibly Switch From Dormancy to Self-Renewal During Homeostasis and Repair," Cell 135:1118-1129 (2008), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Na exposição à luz de 405 nm por aproximadamente 1 minuto, a proteína H2B-DENDRA2 muda de fluorescência verde para vermelha tornando-se duplamente positiva para verde e vermelho; as células que retornam ao verde dividiram e diluíram as moléculas H2B-DENDRA2-RED enquanto as células quiescentes permanecem H2B-DENDRA2 GREEN and RED (Gurskaya et al., "Engineering of a Monomeric Green-to-Red Photoactivatable Fluorescent Protein Induced by Blue Light," Nat.
Biotechnol. 24:461-465 (2006), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). As células semeadas na matriz 3D Matrigel em alta densidade (clusters) para imitar macrometástases ou em baixa densidade (células únicas) para imitar DCCs únicas, foram fotoconvertidas (100%) (Figura 4D). Oito dias depois, apenas 35% das células de alta densidade eram positivas para H2B-DENDRA2-RED. Em contraste, 65% das células ZR75.1 HER2+ de baixa densidade eram positivas para H2B-DENDRA2-RED (Figura 4E), imitando o estado quiescente de DCCs solitárias (Bragado et al., "TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling," Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). O tratamento com o inibidor de PERK LY4 não teve efeito significativo sobre a viabilidade de ZR75.1 HER2 + semeado em alta densidade (Figura 4F). No entanto, erradicou as células ZR75.1 HER2+ únicas quiescentes, em paralelo com os resultados de DCCs in vivo (Figura 3G). Estes dados indicam que os sinais intrínsecos e/ou dependentes de ECM no contexto de células tumorais solitárias causam uma dependência na sinalização de PERK e que LY4 é de fato seletivamente direcionado a ciclos lentos ou DCCs não proliferativas que subsequentemente reativam para produzir metástases. Exemplo 4 - A Inibição de PERK Bloqueia a Progressão do Tumor Mamário Precoce e Tardia Conduzida por HER2
[00174] Tendo demonstrado que existe uma dependência de PERK em DCCs de UPRalta quiescentes, onde a latência é mais relevante, as lesões tumorais foram avaliadas em seguida. Descobriu-se que a progressão conduzida por HER2 é geneticamente dependente da PERK cinase no modelo MMTV-HER2 (Bobrovnikova-Marjon et al., "PERK-Dependent Regulation of Lipogenesis During Mouse Mammary
Gland Development and Adipocyte Differentiation," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 105:16314-16319 (2008), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade) e os tumores HER2+ mostraram ser sensíveis à proteotoxicidade e dependentes de ERAD (Singh et al., "HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive," Sci. Signal. 8:ra52 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Além disso, o banco de dados cBIO (Cerami et al., "The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data," Cancer Discovery 2:401- 404 (2012), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), a análise mostrou que ~14% dos tumores de mama humanos amplificados por HER2 exibem super-regulação de mRNA para PERK (Figura 5A). Assim, foi investigado se LY4 afetou a progressão do tumor de mama induzida por HER2 em lesões primárias, onde os diferentes estágios de progressão das glândulas mamárias hiperplásicas através de CDIS e câncer invasivo podem ser dissecados (Lu et al., "Mechanism of Inhibition of MMTV-neu and MMTV-wnt1 Induced Mammary Oncogenesis by RARalpha agonist AM580," Oncogene 29(25):3665-76 (2010); Muller et. al., "Single-Step Induction of Mammary Adenocarcinoma in Transgenic Mice Bearing the Activated c-neu Oncogene," Cell 54(1):105-115 (1988); Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016) ; Hosseini et al., "Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer," Nature 540:552- 558 (2016), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade).
[00175] A análise das glândulas mamárias de fêmeas uníparas com 24 semanas de idade mostrou que os animais MMTV-HER2 tratados com veículo exibiam ductos com ramificação densa secundária e terciária (Figura 6A, painéis esquerdos), e a análise histológica mostrou lesões hiperplásicas mamárias frequentes (Figura 6A, painéis direitos, setas pretas). Em contraste, os animais tratados com LY4 mostraram uma arquitetura glandular "normalizada" com ramificação menos densa, similar à árvore mamária de camundongos FVB normais não transgênicos (Figura 3B). Os animais tratados com LY4 também mostraram um aumento dramático no número de ductos ocos da glândula mamária do lúmen, constituindo mais de 60% das estruturas em comparação com cerca de 20% nas fêmeas de controle (Figura 6B e Figura 5C). O número de hiperplasias ocluídas e lesões similares a DCIS também foi reduzido para menos da metade do que em animais tratados com veículo. Lesões hiperplásicas em animais HER2+ controle mostraram vários graus de diferenciação luminal conforme avaliado pelos níveis desiguais de expressão de citoqueratina 8/18 (Figura 6C, painel superior). As células mioepiteliais (detectadas como actina de músculo liso, SMA, positivas), de outra forma igualmente espaçadas em ductos animais FVB normais, foram distribuídas de forma desigual nas hiperplasias tratadas com veículo nos camundongos MMTV-HER2. Em contraste, os animais MMTV-HER2 tratados com LY4 apresentaram expressão aumentada de citoqueratina 8/18 na camada luminal, frequentemente circundando um lúmen vazio e uma camada externa contínua de células mioepiteliais (Figura 6C, painel inferior e gráfico). Esses dados indicam que o tratamento com LY4 leva a uma "normalização" das lesões iniciais do câncer por meio de um mecanismo que parece restaurar os programas de diferenciação.
[00176] Os animais foram tratados assim que exibiram tumores, variando de 30 a 200 mm3 de volume (dois tumores eram >200 mm3) durante duas semanas com LY4 (Figura 7A). No grupo de tratamento com veículo, os tumores cresceram de forma constante (Figura 8A),
atingindo até 10 vezes o seu volume original em duas semanas (Figura 7B, gráfico superior). Em contraste, os tumores tratados com LY4 mostraram uma taxa de crescimento reduzida (Figura 8A), com alguns tumores permanecendo em citostase completa (definida como duplicação do volume do tumor apenas uma vez no período de duas semanas, 43% nos tratados com LY4 vs 7% em controles) (Figura 7B, gráfico inferior) e alguns tumores (25%) mostrando regressão no tratamento de janela de duas semanas (Figura 7C). Isso levou a uma diminuição significativa no volume médio final do tumor (Figura 8B). Embora os níveis de proliferação (P-histona H3 IHC) não fossem diferentes entre os tumores tratados com veículo e LY4 (Figura 7D), o manchamento de TUNEL de seções de tumor mostrou um aumento significativo nos níveis de fragmentação de DNA presente em animais tratados com LY4 (Figura 8C). Assim, em lesões mais primárias, o tratamento com LY4 induziu a apoptose de tumores HER2+ estabelecidos, argumentando a favor das funções promotoras de aptidão dependente do contexto de PERK durante a progressão.
[00177] O tratamento com LY4 de células cancerosas humanas com superexpressão de HER2 (MCF10A-HER2 ou ZR75.1) ou culturas de ácinos 3D amplificadas com HER2 (SKBR3) (Figura 8D e Figura 7E) em Matrigel mostraram que um tratamento de 10 dias com veículo ou LY4 (2 µM) aumentou significativamente os níveis de apoptose (caspase-3 clivada) nestes organoides, especialmente na massa celular interna que é privada de contato com a ECM (Figura 8D). Como in vivo, não foi observada uma mudança significativa nos níveis de proliferação detectados pelos níveis de fosfo-histona H3 (Figura 7F). Concluiu-se que as lesões iniciais de MMTV-HER2+ requerem PERK para alterações induzidas por HER2 na organização epitelial ductal. Em células cancerosas humanas HER2+ e tumores de camundongo, HER2 é dependente de PERK para a sobrevivência.
Exemplo 5 - A Sinalização de PERK é Necessária para a Fosforilação, Localização e ativação de AKT e ERK de HER2 Ideais
[00178] Uma vez que os tumores HER2+ são sensíveis à proteotoxicidade (Singh et al., "HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive," Sci. Signal. 8:ra52 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), se os inibidores de PERK podem afetar a atividade de HER2 ideal devido ao aumento da carga de proteína do cliente do ER foi avaliado. A detecção de fosforilação de HER2 nos resíduos Y1221/1222 em tumores mostrou que a área positiva para P- HER2 relatada por outros (DiGiovanna et al., "Active Signaling by Neu in Transgenic Mice," Oncogene 17:1877-1884 (1998), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade) se sobrepôs ao manchamento para P-PERK e P-eIF2α (Figura 9A). Este achado indicou que a ativação das vias PERK e HER2 colocalizam. Da mesma forma, o perfil de expressão gênica direcionada a uma célula única de células tumorais primárias também mostrou uma população de células tumorais primárias (cerca de 25%) com altos níveis de expressão de genes de estresse de ER (Figura 9B), que podem corresponder àquelas que mostram a ativação de P-HER2. É importante ressaltar que quando os níveis de P-HER2 foram marcados nos tumores, levando em consideração tanto a área quanto a intensidade da manchamento (Figura 10A), verificou-se que os tumores tratados com LY4 mostraram níveis significativamente mais baixos de P-HER2 do que os animais controle (Figura 9C). HER2 sinaliza como um homodímero ou heterodímero com EGFR e HER3 (Moasser MM, "The Oncogene HER2: Its Signaling and Transforming Functions and its Role in Human Cancer Pathogenesis," Oncogene 26(45):6469-87 (2007) and Negro et al., "Essential Roles of
Her2/erbB2 in Cardiac Development and Function," Recent Prog.
Horm.
Res. 59:1-12 (2014), cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). O tratamento in vitro de células MCF10A-HER2 que foram submetidas à fome e tratadas com EGF (100 ng/ml, 15 minutos) na presença ou ausência de LY4 (2 µM) revelou que o inibidor PERK diminuiu os níveis basais e induzidos por EGF de P-EGFR e P-HER2, juntamente com a subregulação dos níveis de P-AKT, P-S6 e P-ERK1/2 da via de sobrevivência (Figura 9D e gráfico e Figura 10B). Nenhum efeito óbvio foi observado sob essas condições nos níveis totais de HER2 ou heterodimerização com EGFR conforme determinado por estudos de biotinilação de superfície e coimunoprecipitação.
Uma vez que LY4 não tem um efeito inibidor direto no sítio ativo de qualquer um dos membros da família HER, AKT ou cinases S6 (Tabela 8), este efeito deve ser devido a um efeito indireto da inibição de PERK na sinalização de HER2. Em contraste com outros membros da família HER, HER2 é conhecido por permanecer na membrana plasmática após a ligação do ligante e dimerização (Hommelgaard et al., "Association with Membrane Protrusions Makes ErbB2 an Internalization-Resistant Receptor," Mol Biol Cell. 15(4):1557-67 (2004); Bertelsen et al., "The Mysterious Ways of ErbB2/HER2 Trafficking," Membranes (Basel) 4:424-446 (2014), cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Para testar se LY4 pode estar perturbando o mecanismo de ativação dos receptores HER2, ensaios de biotinilação de superfície foram realizados para medir a presença do receptor na superfície celular e biotinilação reversível de superfície para medir a endocitose do receptor (Cihil et al., "The Cell-Based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins," J.
Vis.
Exp. e50867 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Os dados mostraram que o tratamento com LY4 diminuiu a quantidade de P- HER2 e HER2 total na superfície celular (Figura 9E e Figura 10C), enquanto aumenta concomitantemente o fosfo-HER2 endocitado e HER2 total (Figura 9F). Esses dados, juntamente com os de Singh et al., "HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER- Associated Degradation to Survive," Sci. Signal. 8:ra52 (2015) (que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), sugere que a sinalização de PERK e a função UPR adequada são necessárias para manter a sinalização a jusante de HER2 adequada, afetando a localização e ativação ideais do receptor. Tabela 8. Atividade Inibidora Direta de LY4 na Via de Sinalização da Família HER Símbolo do LY4 GSK-2656157 Símbolo do
GENE Gene Entrez 0,2 µM 2 µM 20 µM 0,2 µM 2 µM 20 µM KINOMEscan AKT1 AKT1 0 5 0 14 32 0 AKT2 AKT2 0 0 0 0 4 8 AKT3 AKT3 0 0 13 24 3 0 EGFR EGFR 30 23 16 18 16 50 ERBB2 ERBB2 0 0 0 57 64 97 ERBB3 ERBB3 0 0 0 40 22 53 ERBB4 ERBB4 0 0 4 0 0 0 ERK1 MAPK3 2 18 0 0 17 0 ERK2 MAPK1 0 0 1 0 0 0 ERK3 MAPK6 0 32 3 0 16 0 ERK4 MAPK4 0 0 0 0 35 0 ERK5 MAPK7 0 0 4 4 23 12
Símbolo do LY4 GSK-2656157 Símbolo do
GENE Gene Entrez 0,2 µM 2 µM 20 µM 0,2 µM 2 µM 20 µM KINOMEscan ERK8 MAPK15 0 0 0 0 3 6 S6K1 RPS6KB1 31 0 24 0 30 56 SRC SRC 0 1 11 10 45 69 SYK SYK 0 0 0 0 12 23 CSK CSK 31 0 14 0 33 64 PIK3CA PIK3CA 9 0 8 0 8 0 PIK3CB PIK3CB 0 0 12 0 0 0 PIK3CG PIK3CG 24 0 26 36 47 50 PIK3C2B PIK3C2B 40 39 94 0 9 22 PYK2 PTK2B 0 0 6 0 0 3 1 Perfil de cinase DiscoveRx scanMAXTM baseado em dados de ligação usando deslocamento de sondas de sítio ativo, 456 cinases testadas. Exemplo 6 - Combinação Sequencial de um Inibidor de CDK Seguida por Inibição de PERK Realça o Efeito Antimetastático de LY4
[00179] Os efeitos da inibição farmacológica de PERK nas lesões primárias foram estabelecidos e, mais importante, também foi estabelecido que LY4 pode inibir a metástase por meio da erradicação de DCCs latentes. Com essas informações, foi avaliado se os fármacos clinicamente disponíveis, que imitariam a latência, poderiam ser usados para tornar as células cancerosas induzidas por latência UPRalta e sensíveis a LY4. Esta justificativa foi apoiada pela descoberta de que DCCs UPRalta expressaram níveis mais elevados de inibidores de CDK (Figura 1C). Assim, foi questionado a seguir se o aumento do alça de DCCs quiescentes acima dos 50% basais por meio de pré-tratamento dos animais com um inibidor de CDK4/6, Abemaciclibe (50 mpk, 4 semanas) (Figura 11A) aumentaria ainda mais o efeito antimetastático de LY4. Na verdade, o pré-tratamento de fêmeas MMTV-HER2 com Abemaciclibe sozinho resultou em um aumento notável nas células GADD34+ em seções de tumor primário (Figura 11B), que de outra forma mostram níveis muito baixos e localizados de manchamento de GADD34 (controle). A medição em tumores primários serviu como um biomarcador substituto da UPR associada à quiescência causada pelo Abemaciclibe. Como esperado, o tratamento com LY4 eliminou a expressão de GADD34 no tumor primário de animais tratados (Figura 11B). O tratamento sequencial de camundongos com Abemaciclibe (fase de indução similar à latência) seguido por LY4 (fase de erradicação de DCC latente) resultou na mesma diminuição na carga de macrometástases observada com o tratamento único LY4 (Figura 11C). No entanto, a combinação eliminou quase completamente a presença de micrometástases (Figura 11D) e, como visto com o agente único, diminuiu muito o número de células cancerosas disseminadas isoladas quiescentes (Figura 11E). Juntos, esses resultados apóiam o fundamento lógico da combinação sequencial de um agente citostático, como um inibidor de CDK, seguido por LY4 como uma estratégia terapêutica promissora para prevenir metástases, direcionando DCCs quiescentes que reativam e semeiam essas lesões. Exemplo 7 - Discussão dos Exemplos 2-6
[00180] Vários estudos em modelos de câncer de mama por HER2+ concluíram que a tumorigênese do câncer de mama por HER2+ depende da sinalização de PERK para sobrevivência e adaptação (Bobrovnikova-Marjon et al., "PERK Promotes Cancer Cell Proliferation and Tumor Growth by Limiting Oxidative DNA Damage," Oncogene 29(27):3881-95 (2010); Singh et al., "HER2-mTOR Signaling-Driven
Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive," Sci.
Signal. 8:ra52 (2015); Avivar-Valderas et al., "PERK Integrates Autophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment," Mol.
Cell.
Biol. 31:3616-3629 (2011); e Avivar-Valderas et al., "Regulation of Autophagy During ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK," Oncogene 32(41):4932-40 (2013), cada um dos quais é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade). Curiosamente, também foi descoberto que células tumorais quiescentes, que existem nas margens da cirurgia e também como células cancerosas disseminadas latentes em órgãos-alvo (Bragado et al., "TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling," Nat.
Cell.
Biol. 15:1351- 1361 (2013); Chéry et al., "Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways," Oncotarget 5(20):9939-51 (2014); Sosa et al., "Mechanisms of Disseminated Cancer Cell Dormancy: An Awakening Field," Nat.
Rev.
Cancer 14:611-622 (2014); e Sosa et al., "NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy Via SOX9- and RARbeta- Driven Quiescence Programmes," Nat.
Commun. 6:6170 (2015), cada um dos quais são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade), sinalização ERK ativada para a sobrevivência, juntamente com outras vias de estresse de ER (Adomako et al., "Identification of Markers that Functionally Define a Quiescent Multiple Myeloma Cell Sub-Population Surviving Bortezomib Treatment," BMC Cancer 15:444 (2015); Ranganathan et al., "Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase in Tumor Cell Growth Arrest and Survival," Cancer Res. 68:3260-3268 (2008); Ranganathan et al., "Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP and Activation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic
Reticulum Kinase to Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells," Cancer Res. 66:1702-1711 (2006); Schewe et al., "ATF6alpha-Rheb- mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells In Vivo," Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 105:10519-10524(2008); Schewe et al., "Inhibition of eIF2alpha Dephosphorylation Maximizes Bortezomib Efficiency and Eliminates Quiescent Multiple Myeloma Cells Surviving Proteasome Inhibitor Therapy," Cancer Res. 69:1545-1552 (2009); e Chéry et al., "Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways," Oncotarget 5(20):9939-51 (2014), cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Recentemente, Pommier et al., "Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune-Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases," Science 360(6394):eaao4908 (2018) (que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade) validou este trabalho, mostrando que DCCs pancreáticas alojadas em fígados (e outros modelos) ativam UPR durante a quiescência. Este nível de reprodutibilidade em diferentes tipos de câncer e modelos sugere um alto nível de relevância biológica para esta biologia.
[00181] Os exemplos neste documento demonstram que o inibidor PERK LY4 pode direcionar seletivamente a dependência de HER2 em DCCs e em lesões primárias. Um achado importante a discutir é o efeito inibidor do LY4 na metástase. No modelo MMTV-HER2, como em pacientes, a metástase pode ser assíncrona com o tumor primário e às vezes se desenvolver até mesmo com lesões primárias ocultas, com algumas metástases iniciando mais cedo do que a detecção aberta do tumor (Husemann et al., "Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer," Cancer Cell 13:58-68 (2008); Pavlidis et al., "Cancer of Unknown Primary (CUP)," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 54:243-250 (2005); Harper et al., "Mechanism of Early Dissemination and
Metastasis in Her2+ Mammary Cancer," Nature 540:588-592 (2016); e Hosseini et al., "Early Dissemination Seeds Metastasis in Breast Cancer," Nature 540:552-558 (2016), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade). O tratamento com LY4 reduziu todas as metástases, aquelas iniciadas precocemente (antes que os tumores evidentes fossem óbvios) ou aquelas metástases que eram coincidentes com o crescimento do tumor primário evidente (Figura 8). Isso é importante porque argumenta que o efeito na metástase não foi simplesmente devido à redução da carga de tumor primário causada por LY4. Surpreendentemente, a carga metastática foi reduzida pelo tratamento com LY4 eliminando grupos solitários ou pequenos não proliferativos de DTCs negativas para P-Rb.
A imagem e o qPCR multiplex de célula única revelaram que essas DCCs mostraram com maior frequência a super-regulação de GADD34 (proteína) e um conjunto maior de genes de estresse de ER, incluindo o próprio PERK, ao mesmo tempo que exibia um fenótipo quiescente, revelado pela super-regulação de vários reguladores negativos da proliferação celular.
Deve-se levar em consideração que parte do programa de estresse de ER induzido por PERK envolve a regulação da transcrição e outra parte é a translação preferencial de genes contendo ORF a montante, como ATF4 e GADD34 (Young et al., "Upstream Open Reading Frames Differentially Regulate Gene Specific Translation in the Integrated Stress Response," J.
Biol.
Chem. 291:16927-16935 (2016), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Da mesma forma, a parada G1 induzida por UPR mostrou ser causada pela inibição da translação da ciclina D1 (Brewer et al., "Mammalian Unfolded Protein Response Inhibits Cyclin D1 Translation and Cell-Cycle Progression," Proc.
Natl.
Acad.
Sci. 96:8505-8510 (1999), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Experimentos de organogênese 3D usando linhagens de células cancerosas humanas HER2+ confirmaram a morte seletiva por LY4 de células cancerosas individuais quiescentes. Esses dados argumentam que as DCCs quiescentes são mais propensas a contar com a sinalização de PERK para a sobrevivência. Da mesma forma, uma subpopulação de células metastáticas humanas de pacientes com câncer de mama também mostrou uma correlação negativa entre GADD34 e Ki67, validando a associação encontrada em camundongos. Esses dados sugerem que junto com NR2F1 (Borgen et al., "NR2F1 Stratifies Dormant Disseminated Tumor Cells in Breast Cancer Patients," Breast Cancer Research 20:120 (2018), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), GADD34 sozinho ou em combinação com NR2F1 pode servir como um conjunto de biomarcadores robustos para DCCs latentes/UPRalta e, assim, guiar a seleção do paciente para o tratamento.
[00182] Descobrir um alvo e um fármaco que pode erradicar DCCs latentes é altamente significativo porque DCCs latentes, são conhecidas por evadir terapias antiproliferativas por meio de mecanismos ativos e passivos (Aguirre-Ghiso et al., "Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer," Nat. Med. 19:276-277 (2013); Naumov et al., "Ineffectiveness of Doxorubicin Treatment on Solitary Dormant Mammary Carcinoma Cells or Late-Developing Metastases," Breast Cancer Res. Treat. 82(3):199-206 (2003); Oshimori et al., "TGF- Beta Promotes Heterogeneity and Drug Resistance in Squamous Cell Carcinoma," Cell 160:963-976 (2015); e Fluegen et al., "Phenotypic Heterogeneity of Disseminated Tumour Cells is Preset by Primary Tumour Hypoxic Microenvironments," Nat. Cell Biol. 19(2):120-132 (2017), cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). A erradicação de DCCs na medula óssea, onde essas células também estão comumente latentes
(Bragado et al., "TGF-Beta2 Dictates Disseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII and P38Alpha/Beta Signalling," Nat. Cell. Biol. 15:1351-1361 (2013); Chéry et al., "Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals Tumor Cell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways," Oncotarget 5(20):9939-51 (2014); Ghajar et al., "The Perivascular Niche Regulates Breast Tumour Dormancy," Nat. Cell Biol. 15:807-817 (2013); e Husemann et al., "Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer," Cancer Cell 13:58-68 (2008), que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade), fortalece ainda mais a noção de inibição de PERK como uma terapia de DCC antilatente (Aguirre-Ghiso et al., "Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer," Nat. Med. 19:276-277 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade) que pode ser usada na rotina adjuvante para eliminar a doença residual mínima latente (Aguirre-Ghiso et al., "Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer," Nat. Med. 19:276-277 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[00183] Os mecanismos exatos pelos quais a inibição da PERK cinase bloqueia o crescimento do tumor não são claros. É possível que a adaptação reduzida ao estresse imposto pela proteotoxicidade (Singh et al., "HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive," Sci. Signal. 8:ra52 (2015), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade) seja um mecanismo. Os resultados no presente documento descritos demonstram que LY4 reduziu os níveis de fosfo- HER2 in vivo e LY4 diminuiu a abundância do receptor ativo na membrana por meio de endocitose aumentada. Não foram observadas alterações na degradação da proteína HER2. Em relação a como o PERK controla exatamente a localização da membrana HER2 ou endocitose, é possível que a internalização do receptor permita uma desfosforilação melhor ou mais rápida do receptor ou diminua as chances de o receptor ser ativado, resultando em diminuição da sinalização a jusante. Foi demonstrado que a endocitose do receptor pode reduzir a saída de sinalização de muitos receptores localizados na membrana plasmática, reduzindo fisicamente a concentração de receptores da superfície celular (Sorkin and Zastrow, "Endocytosis and Signaling: Intertwining Molecular Networks," Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10:609-22 (2009), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade).
[00184] Os resultados no presente documento apresentados demonstram ainda que, nas lesões iniciais, LY4 induziu um fenótipo de diferenciação. No entanto, em tumores estabelecidos, LY4 levou os tumores à estase ou regressão como um único agente. Isso argumenta que, no início, a desregulação da sinalização de PERK em lesões iniciais de HER2+ está mais ligada à perda de programas de diferenciação, por meio de mecanismos ainda não determinados. Então, como a biologia do tumor muda para se tornar altamente proliferativa, a dependência de PERK ainda é altamente dependente para esses tumores HER2+. Isso pode estar relacionado ao modo como as funções do HER2 mudam durante a progressão; nos estágios iniciais, ele desregula principalmente um programa de morfogênese que leva à resistência e disseminação do anoikis, enquanto mais tarde está principalmente envolvido em programas proliferativos e de sobrevivência.
[00185] Os resultados no presente documento descritos também apontam para o valor da combinação de terapias antiproliferativas padrão com LY4 que eliminariam as células quiescentes restantes. Essa abordagem foi testada usando a combinação do inibidor de CDK4/6 Abemaciclibe seguido por LY4, que revelou um efeito antimetastático melhorado. De forma encorajadora, as doses de LY4 usadas não afetaram significativamente os níveis de glicose, medula óssea ou contagens de células do sangue periférico, consumo e alimentação de camundongos sem tumor ou com câncer. Isso argumenta que as doses usadas, embora bloqueiem severamente o crescimento do tumor e metástases através da erradicação da DCC latente, não afetaram a função normal do órgão do hospedeiro. Uma vez que DCCs latentes/UPRalta também foram encontradas para regular negativamente a expressão de superfície MHC-I (Pommier et al., "Unresolved Endoplasmic Reticulum Stress Engenders Immune- Resistant, Latent Pancreatic Cancer Metastases", Science 360(6394):eaao4908 (2018) (que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade), LY4 também pode ajudar a resposta imune adaptativa direcionar DCCs e talvez tumores estabelecidos também. O trabalho atual está abordando essa possibilidade. Os resultados no presente documento descritos abrem a porta para o uso de terapias de sobrevivência de DCC antilatente como uma nova maneira de direcionar a doença metastática. Isso permitiria direcionar a heterogeneidade fenotípica completa da doença disseminada que pode incluir DCCs proliferativas, de ciclo lento e latentes (Aguirre-Ghiso et al., "Metastasis Awakening: Targeting Dormant Cancer," Nat. Med. 19:276-277 (2013), que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade). Exemplo 8 - Combinação do Inibidor de CDK4/6 Abemaciclibe e do Inibidor de PERK LY4 em uma Linhagem Celular de Melanoma
[00186] Uma vez que os inibidores de CDK4/6 mostraram induzir a parada do ciclo celular e LY4 induz a morte celular em DTCs paralisadas do ciclo celular (Figura 12A), foi investigado a seguir se a combinação de um inibidor de CDK4/6 e LY4 reduziria a viabilidade celular em uma linhagem celular in vitro. O inibidor de CDK 4/6
Abemaciclibe demonstrou inibir o crescimento de células de melanoma WM35 em culturas de células in vitro 2D e 3D. O tratamento agudo in vitro (48 horas) com 2 µM de LY4 após uma semana de pré-tratamento com 50 nM de Abemaciclibe (2D) diminui a viabilidade de células Braf- mutantes de melanoma WM35, em comparação com o tratamento de células com 2 µM de LY4 sozinho (Figura 12B). Em culturas 3D in vitro, a adição de 2 µM de LY4 após um pré-tratamento de uma semana com Abemaciclibe teve um efeito aditivo na diminuição da viabilidade celular (Figura 12C). Os resultados demonstrados na Figura 12C sugerem que o pré-tratamento com Abemaciclibe pode induzir parada do crescimento e alguma morte celular em cultura de células 3D. A adição de LY4 então parece aumentar esse efeito sobre a morte celular. Isso é consistente com a noção de que as células presas com Abemaciclibe podem regular positivamente uma resposta ao estresse de ER, conforme mostrado pela super-regulação de GADD34 (Figura 12G) e, em seguida, tornar-se sensíveis a LY4.
[00187] Em células de melanoma, um fenótipo resistente ao Abemaciclibe surge após 4-5 semanas de tratamento contínuo. O co- tratamento de células com LY4 e Abemaciclibe diminui o número de células resistentes ao Abemaciclibe viáveis em cultura de células 2D, mas não mostra um aumento como esperado da realização desses experimentos em culturas 2D. No entanto, nas células resistentes ao Abemaciclibe, LY4 tem um efeito aditivo na diminuição da viabilidade em cultura de células 3D após tratamento persistente com Abemaciclibe (Figuras 12D-12E). Estes dados argumentam que as células resistentes ao inibidor de CDK4/6 de melanoma permanecem dependentes da resposta ao estresse de ER mediada por PERK para sobreviver. Em culturas 3D in vitro, a adição de LY4 após 5 semanas de pré-tratamento com Abemaciclibe teve um efeito aditivo na diminuição da viabilidade celular (Figura 12F), conforme medido por apoptose de células que absorvem DAPI. Embora as células resistentes cresçam, bem como as células controle em culturas 2D, o pré-tratamento com Abemaciclibe parece induzir a morte celular em cultura 3D (Figura 12F). Exemplo 9 - BMP7-F9 Induz e Mantém a Latência de DTCs (HNSCC)
[00188] BMP7-F9 reduz a relação de atividade de ERK/p38 e induz vários mRNAs na assinatura de latência (FIGs. 13A-13C). A Figura 13A mostra que o tratamento com BMP7-F9 a 2 ng/ml, 5 ng/ml e 10 ng/ml (segunda, terceira e quarta barras cinza, respectivamente; o controle é a primeira barra preta) reduz a relação de atividade de ERK/p38 sobre o controle, conforme determinado por Western blot em células HEp3 HNSCC. O efeito na relação de atividade de ERK/p38 é observado após 2-6 e 24 horas (do segundo ao quarto grupo de colunas). Nos primeiros 30 minutos, a atividade de ERK é estimulada por BMP7 (primeiro conjunto de colunas). A Figura 13B mostra que o tratamento com BMP7-F9 induz mRNAs DEC2, p53 e p27 (10 ng/ml BMP7-F9, 24 horas), que codificam genes de assinatura de latência. A Figura 13C mostra que o tratamento com BMP7-F9 das mesmas células induz o acúmulo nuclear de NR2F1, um fator de transcrição potente que induz latência, conforme determinado por imunofluorescência (10 ng/ml, 24 horas). Diferenças na Figura 13A e Figura 13B, p <0,05 conforme calculado usando o teste t de Student.
[00189] BMP7-F9 in vitro e in vivo induz a interrupção do crescimento de células T-HEp3 (FIGs. 14A-14E). A Figura 14A mostra que o tratamento com BMP7-F9 de células T-HEp3 inibe sua proliferação in vitro por 48 horas, conforme determinado pelo ensaio de título de célula azul (RFU, unidades de fluorescência relativa). A Figura 14B é uma ilustração esquemática do procedimento experimental in vivo usado nas Figuras 14C-14D. As células T-HEp3 foram pré-tratadas por 24 horas com BMP7-F9 in vitro e, em seguida, inoculadas em membranas corioalantóicas de embrião de galinha (CAMs) (Figura 14C), onde foram tratadas diariamente in vivo com veículo ou BMP7-F9 (50 ng/ml) antes da coleta dos tumores e quantificação do número de células HEp3 HNSCC/tumor (Figura 14D) e níveis de P-H3 (Figura 14E).
[00190] Os camundongos NSG foram tratados seguindo o protocolo da Figura 15A por 3 e 6 semanas. Nesses momentos, a porcentagem de recorrência local e incidência de DTC foi pontuada. Resultados tabulados correspondentes à Figura 15B mostram que BMP7 limita a incidência de recorrências locais (Tabela 9) e a incidência de DTC nos pulmões (Tabela 10) após a cirurgia do tumor são mostradas abaixo (Tabela 11). Tabela 9. Efeito de BMP7-F9 na Configuração de Adjuvante nas Recorrências Locais nas Margens da Cirurgia Tratamento (apenas +recorrência Incidência de n tratamento adjuvante) local recorrência local (%) 3 semanas controle 11 4 36,4 BMP7 11 1 9,1 6 semanas controle 8 2 25,0 BMP7 7 0 0,0 Tabela 10. Efeito de BMP7-F9 na incidência de DCC nos pulmões Tratamento (apenas +DCCs nos incidência de n tratamento adjuvante) pulmões DCC (%) 3 semanas controle 11 9 81,8 BMP7 10 5 50,0 6 semanas controle 8 6 75,0 BMP7 7 3 42,9
Tabela 11. Número Médio de Células Tumorais GFP+/Vimentina+/Pulmão nas Mesmas Experiências Representadas nas Figuras 15A-15B e Tabelas 9 e 10 Número Mediano de Tratamento (apenas n células tumorais faixa valor p tratamento adjuvante) GFP+/Vimentina+/pulmão 3 semanas controle 11 2,2E+04 0-1,14E+0,6 0,2294 BMP7 10 0,62E+04 0-333333 6 semanas controle 8 25,2E+04 0-1,05E+06 0,2859 BMP7 7 0 0-6,8E+06
[00191] Tumores HEp3-GFP HNSCC foram cultivados até atingirem aproximadamente 300 mm3 e então tratados no ambiente neoadjuvante com 50 µg/kg de BMP7-F9 até os tumores terem aproximadamente 600 mm3. Os tumores foram removidos por meio de cirurgia. 1-2 dias após a cirurgia, o tratamento adjuvante com BMP7- F9 foi continuado por mais 4 semanas. Os animais foram então sacrificados e a carga de DCC no pulmão foi avaliada usando microscopia de fluorescência. Observou-se que BMP7 limita o desenvolvimento de recorrências locais e distantes após a cirurgia do tumor. Os camundongos NSG foram tratados seguindo o protocolo da Figura 15A por 4 semanas. Nesses momentos, a porcentagem de recorrência local e incidência de DCC foi pontuada. O número de células positivas para GFP em pulmões dissociados foi classificado após o tratamento. Esta é uma medida da carga de DCC nos pulmões que é significativamente diminuída pelo tratamento com BMP7-F9. Observe que a mediana da carga de DCC cai um log e que BMP-7 aparentemente cura de DCCs 3 de 7 animais.
[00192] O efeito de BMP7-F9 na rotina neoadjuvante + adjuvante nas recorrências locais nas margens da cirurgia (Tabela 12) e na incidência de DCC nos pulmões (Tabela 13) é mostrado abaixo.
Os resultados são tabulados a partir dos resultados na Figura 15C, onde os camundongos foram tratados como na Figura 15A, exceto que o tratamento adjuvante foi por 4 semanas.
O número de células positivas para GFP em pulmões dissociados foi classificado após o tratamento.
Os resultados mostram que o BMP7 limita a incidência de recorrências locais (Tabela 12) e a incidência de DCC nos pulmões (Tabela 13) após cirurgia do tumor com um tratamento neoadjuvante e adjuvante.
A Tabela 14 mostra uma medida da carga de DCC nos pulmões, que é significativamente diminuída pelo tratamento com BMP7-F9. Observe que a mediana da carga de DCC cai um log e que BMP-7 aparentemente cura de DCCs 3 de 7 animais.
Tabela 12. Efeito de BMP7-F9 na Nonfiguração Neoadjuvante + Adjuvante nas Recorrências Locais nas Margens da Cirurgia
Tratamento (tratamento n + recorrência local % neoadjuvante e adjuvante)
4 semanas controle 8 5 62,5
BMP7 7 3 42,9
Tabela 13. Incidência de DCC nos Pulmões
Tratamento (tratamento +DCCs nos n % neoadjuvante e adjuvante) pulmões
4 semanas controle 8 8 100
BMP7 7 4 57,1
Tabela 14. Número médio de células tumorais GFP +/Vimentina +/pulmão de camundongos relatado nas tabelas 12 e 13. Número Mediano de Tratamento (tratamento n células tumorais Faixa p valor neoadjuvante e adjuvante) GFP+/Vimentina+/pulmão 4 semanas controle 8 5,4E+04 0,02-3,2E+05 0,046 BMP7 7 0,02E+04 0-2,4E+04
[00193] Embora modalidades preferidas tenham sido representadas e descritas em detalhes neste documento, será evidente para aqueles versados na técnica relevante que várias modificações, adições, substituições e similares podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção e, portanto, são consideradas estar dentro do escopo da invenção conforme definido nas reivindicações que se seguem.

Claims (47)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento do câncer residual mínimo em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: contatar células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com uma proteína derivada de proteína morfogênica óssea 7 ("BMP7"), em que o referido contato induz ou mantém a latência nas DTCs contatadas do indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com câncer de mama, mieloma múltiplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cérebro, câncer cervical, linfoma de células de revestimento, leucemia, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, melanoma, câncer de pele, cânceres de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, glioblastoma, neuroblastoma ou câncer colorretal.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama selecionado dentre câncer de mama invasivo, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma lobular in situ (LCIS) e câncer de mama inflamatório.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama HER2+.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com células tumorais disseminadas e/ou um câncer não metastático.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado de BMP7 é BMP7-F9.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: administrar ao indivíduo um agente quimioterápico, um agente imunoterapêutico, um agente epigenético ou radiação ionizante.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que um agente quimioterápico é administrado ao indivíduo, e em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico anti-HER2 selecionado dentre trastuzumabe (Herceptin®) e lapatinibe (Tykerb®).
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que um agente quimioterápico é administrado ao indivíduo, e em que o agente quimioterápico é selecionado dentre uma antraciclina, um taxano, um inibidor de cinase, um anticorpo, uma fluoropirimidina e um fármaco de platina.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que um agente imunoterapêutico é administrado ao indivíduo, e em que o agente imunoterapêutico é selecionado dentre um inibidor do ponto de checagem imune, um interferon ou uma vacina contra tumor.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que um agente epigenético é administrado ao indivíduo, e em que o agente epigenético é selecionado dentre um inibidor de histona desacetilase (HDAC), 5-azacitidina, ácido retinoico, trióxido arsênico, inibidor do Realçador Da Subunidade do Complexo 2 Repressivo Polycomb de Zeste 2 (EZH2), inibidor do bromodomínio (BRD) e seus derivados.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado pela administração da proteína do derivado de BMP7 ao indivíduo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:
detectar a presença de DCCs no indivíduo antes do referido contato.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as DCCs são NR2F1+.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que as DCCs são positivas para o receptor de proteína morfogênica óssea ("BMPR+").
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que as DCCs são fosfo-PERK ativas.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: contatar as DCCs no indivíduo com um inibidor de retículo endoplasmático cinase semelhante ao RNA de proteína cinase (PERK), um inibidor de MEK, um inibidor de CDK4/6 ou qualquer combinação dos mesmos.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado pela administração de um inibidor de PERK ao indivíduo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado com um inibidor de PERK selecionado dentre LY2, LY3, LY4 e suas combinações.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado com um inibidor de PERK que não inibe EIF2AK1, EIF2AK2 ou EIF2AK4.
21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado pela administração de um inibidor de MEK ao indivíduo.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o inibidor de MEK é selecionado dentre PD184352, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119/BAY 869766.
23. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado pela administração de um inibidor de CDK4/6 ao indivíduo.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CDK4/6 é selecionado dentre abemaciclibe (LY2835219), palbociclibe (PD0332991) e ribociclibe (LEE011).
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: selecionar um indivíduo em remissão de câncer antes do referido contato.
27. Método de tratamento do câncer residual mínimo em um indivíduo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: contatar células cancerosas disseminadas (DCCs) em um indivíduo com um inibidor do retículo endoplasmático cinase semelhante ao RNA de proteína cinase (PERK) selecionado dentre LY2, LY3 e LY4, em que o referido contato erradica DTCs no indivíduo para tratar o câncer residual mínimo no indivíduo.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com câncer de mama, mieloma múltiplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cérebro, câncer cervical, linfoma de células de revestimento, leucemia, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, melanoma, cânceres de pele, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, glioblastoma, neuroblastoma ou câncer colorretal.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama selecionado dentre câncer de mama invasivo, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma lobular in situ (LCIS) e câncer de mama inflamatório.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama HER2+.
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com células tumorais disseminadas e/ou câncer não metastático.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: administrar ao indivíduo um agente quimioterápico, um agente imunoterapêutico, um agente epigenético ou radiação ionizante.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que um agente quimioterápico é administrado ao indivíduo, e em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico anti-HER2 selecionado dentre trastuzumabe (Herceptin®) e lapatinibe (Tykerb®).
34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que um agente quimioterápico é administrado ao indivíduo, e em que o agente quimioterápico é selecionado dentre uma antraciclina, um taxano, um inibidor de cinase, um anticorpo, uma fluoropirimidina e um fármaco de platina.
35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que um agente imunoterapêutico é administrado ao indivíduo, e em que o agente imunoterapêutico é selecionado a partir de um inibidor do ponto de checagem imune, um interferon ou uma vacina contra tumor.
36. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que um agente epigenético é administrado ao indivíduo, e em que o agente epigenético é selecionado dentre um inibidor de histona desacetilase (HDAC), 5-azacitidina, ácido retinoico, trióxido de arsênico, inibidor do Realçador Da Subunidade do Complexo 2 Repressivo Polycomb de Zeste 2 (EZH2), inibidor do bromodomínio ("BRD") e seus derivados.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado pela administração do inibidor de PERK ao indivíduo.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: detectar a presença de DCCs no indivíduo antes do referido contato.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que as DCCs são NR2F1+.
40. Método, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que as DCCs são fosfo-PERK ativas.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, caracterizado pelo fato de que as DCCs são positivas para o receptor de proteína morfogênica óssea ("BMPR+").
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: contatar DCCs no indivíduo com uma proteína derivada da proteína morfogênica óssea 7 (BMP7).
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o referido contato de DCCs no indivíduo com uma proteína derivada de BMP7 é realizado pela administração da proteína derivada de BMP7 ao indivíduo.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que a proteína derivada de BMP7 é BMP7- F9.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 44, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PERK não inibe EIF2AK1, EIF2AK2 ou EIF2AK4.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 45, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: selecionar um indivíduo em remissão de câncer antes do referido contato.
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