TWI546383B - 用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法 - Google Patents

Description

用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法

本發明為一種米組織之製備方法，尤指一種米癒傷組織之製備方法，該癒傷組織可用於皮膚保健材料。

隨著農產品開放政策、國人飲食習慣改變等因素，台灣境內水稻面臨產量過剩的問題，各界均欲發展水稻的副產物以增加水稻的附加價值。已知水稻的胚及糠的萃取物、米糠油、米發酵產物具有對皮膚保溼、抗氧化、抑制黑色素的合成以及促進細胞增殖的作用，但水稻的癒傷組織(callus)是否有益於皮膚保健尚未得知。植物的癒傷組織等同於動物的幹細胞，為植物體局部受傷後，在傷口表面新形成的組織，該癒傷組織恢復了細胞分裂的能力，加速增生而能將傷口癒合。在植物組織培養的過程中，癒傷組織特別指的是培養過程中新形成、無分化結構的薄壁細胞團塊。業界尚未知悉如何備製一可用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，包括植物培養基的種類、生長調節劑的種類與濃度、以及培養環境，例如溫度等。

本發明之目的在於提供一可用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，以增加水稻的附加價值。

本創作所提供的一種用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，包括（A）在培養盤內裝填培養基，將去殼之米種子置於培養基表面，培養基為N6培養基或MS培養基，培養基中添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxy acetic acid，於本文其他段落簡稱為2,4-D）生長調節劑；（B）米種子發芽後，切除其根部；（C）當癒傷組織之大小約為米種子初始大小的2-3倍大時，將癒傷組織移至液態之N6培養基中懸浮培養；（D）懸浮培養7天後膜分離過濾，取分子量在11000以下者。

基於本發明所提供的製備方法，所製得之米癒傷組織萃取物具有抑制黑色素合成、促進皮膚纖維母細胞及角質細胞增生的效果，並可應用於皮膚保健材料，達到增加米附加價值的目的。

以下藉由一系列的實驗說明本發明的各項條件及其對於皮膚保健之功效。本實施例中的米種子選用成熟的台農67號米種子，經烘箱乾燥後於4℃冰箱保存。製備癒傷組織之前將米種子去殼及表面殺菌，表面殺菌的方法為用10%次氯酸鈉超音波震盪10分鐘，接者以無菌水超音波震盪兩次，每次10分鐘。選用的培養基為Murashige and Skoog(MS)及Chu(N6)培養基，添加30 g/L的蔗糖，以1N HCl _(aq)或1N NaOH _(aq)將酸鹼值調整為5.7。選用的培養容器為直徑10公分、高度1.5公分的圓形平盤。選用的植物生長調節劑為2,4-D。

本實施例所提供的一種用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，包括下列步驟：

固態培養（A）：在調好酸鹼值的N6或MS培養基中添加2 mg/L的2,4-D及7-9 g/L的洋菜，在培養容器內倒入8-10 mL該培養基，再以鋁箔紙封口，進行高溫殺菌。待培養基回到室溫，培樣基中的洋菜使之凝固成為固態培養基，將4-6粒經過去殼及表面殺菌之米種子置於固態培養基表面，置於25-30℃、避光的培養室中；

切根處理（B）：大約一週後，培養的米種子會發芽並長出根部及癒傷組織，將發芽的米種子移至光亮處切除其根部，以增加、誘導癒傷組織生成，本實施例中，每7-14天替換新的固態培養基；

懸浮培養（C）：當癒傷組織之大小約為米種子初始大小的2-3倍大時，將癒傷組織取出移至液態之N6培養基中懸浮培養。該液態之N6培養基與上述的N6固態培養基雷同，其主要差異在於液態之N6培養基並無添加洋菜，N6培養基中同樣添加2 mg/L的2,4-D。癒傷組織及N6液態培養基以一三角錐瓶盛裝，放置於搖盤上以90-100 rpm搖晃培養，培養溫度為25-30℃。液態培養的時間約為1-7週。本實施例中，每7-14天替換新的液態N6培養基。

第1圖A-L表現米種子經切根處理前後誘導癒傷組織生成的連續過程，空心箭號指出切根的位置，實心箭號指出癒傷組織。第2A、2B圖分別顯示在25℃培養9週，以N6或MS培養基進行固態培養的癒傷組織均會持續增生，因此其截面積會持續擴張。第3A、3B圖顯示在30℃培養9週亦有相似的結果。

為了尋找最佳生長調節劑的濃度，另做實驗重複步驟(A)-(C)，惟僅使用N6培養基，且其中2,4-D生長調節劑的濃度為0.5、1、1.5、2 mg/L，請見第4-5圖，不論培養溫度為25℃或30℃，上述四種濃度的生長調節劑皆可誘導癒傷組織(箭號所指)生成，誘導效果隨著濃度增加而增加，以2 mg/L的誘導效果為最佳，且能有效抑制根、莖生長。

為了佐證經由上述(A)-(C)步驟所製備的米癒傷組織對皮膚具有保健功效，可進一步萃取該米癒傷組織的有效成分並執行下述實驗。萃取步驟為(D)將經不同懸浮培養週數的癒傷組織自液態之N6培養基中取出，在由液態氮形成的低溫環境下進行研磨，研磨後的粉末放入15 mL離心管內，並加入體積為粉末體積約兩倍的無菌水，過程中該離心管置放在冰上，以保持低溫環境，之後以超音波震盪儀(MISONIX, NO C2618)震盪1分鐘使癒傷組織破碎，再以離心機(Hettich, Universal 32R)於4°C、4500 rpm離心15分鐘，共離心兩次。離心後將上清液以針筒過濾器(Sartorius Stedim Biotech)進行膜分離，藉此過濾並收集分子量約介於200-1000的活性物質，例如胜□，最後以零下20°C冷凍保存，執行下述實驗之前，將萃取物回溫並調配至適當的濃度。前述膜分離也可改為透析或其他可依分子量大小區分活性物質的方法，對不同分子量的物質進行區分。

(一)抑制酪胺酸□活性實驗：酪胺酸□是合成黑色素的關鍵□，酪胺酸□的活性降低可減少黑色素合成。實驗方法參考Lee等人於1999年發表的Biological screening of 100 plant extracts for cosmetic use (I): inhibitory activities of tyrosinase and DOPA auto-oxidation一文，取100 μL的待測物溶液置入96孔培養盤(costar 3599, Sigma-Aldrich Co. LLC.)中，於37℃環境下避光靜置15分鐘，之後以酵素免疫分析儀器(Enzyme-linked immunosorbent assay reader, ELISA reader)測定波長為492 nm的吸光值。抑制酪胺酸□計算公式如下:

抑制酪胺酸□(%)=[1–((a–b)/(c–d))]×100

其中a為樣品吸光值，b為樣品空白吸光值，c為控制組吸光值，d為控制組空白吸光值。

樣品吸光值(a)的待測物為米癒傷組織的萃取物分別以10、100 mg/mL的濃度溶於磷酸緩衝溶液(phosphate buffered saline, 下稱PBS)，待測物置入96孔培養盤中，再依序加入40 μL的1.5 mM左旋酪胺酸和20 μL的1500 units/mL酪胺酸□。樣品空白吸光值(b)的待測物同樣包括含有10、100 mg/mL米癒傷組織萃取物的磷酸緩衝溶液，但後續不加入上述左旋酪胺酸及酪胺酸□。控制組吸光值(c)的待測物包含PBS，而無米癒傷組織的萃取物，後續加入上述左旋酪胺酸及酪胺酸□。控制組空白吸光值(d)的待測物僅為PBS，且後續不加入上述左旋酪胺酸及酪胺酸□。

請見第6圖，未經懸浮培養的米癒傷組織萃取物已有約14%抑制酪胺酸□的效果，經懸浮培養一週後的米癒傷組織萃取物則有更好的抑制效果，且100 mg/mL的效果更優於10 mg/mL。但懸浮培養三週以上的米癒傷組織萃取物的抑制效果反而有衰退現象。

(二)人類角質細胞增殖實驗：選用人類正常角質細胞HaCaT cell，將之培養於直徑10公分的培養盤中，當細胞生長至培養盤的8-9分滿後，除去盤內的培養液，以2-3 mL的PBS沖洗，再加入2 mL胰蛋白□螯合劑(trypsin-EDTA)使細胞剝離盤壁，爾後置於37℃培養箱內10分鐘，再加入4 mL含有10 % 胎牛血清（Fetal Bovine Serum，簡稱FBS）的DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）以終止胰蛋白□螯合劑的作用並將細胞輕輕打散，以10 ⁵的細胞量培養於24孔培養盤(GeneDireX, Inc.)後，在37℃、5 %二氧化碳含量的環境中培養24小時，再分別加入含有0、5、10、15、20 μg/mL米癒傷組織萃取物的PBS溶液，再以台盼藍染色測定法(trypan blue dye exclusion assay)分析細胞存活率。台盼藍染劑會經由破裂細胞膜滲入死亡的細胞中，而將其染成藍色，活細胞則不會被台盼藍染劑染上色。

請見第7圖，所繪示者為角質細胞增殖率對癒傷組織萃取物濃度的關係圖，其中各結果以未加入米癒傷組織萃取物(0 μg/mL)的待側物數據為基準（100％）。實驗結果顯示，濃度為10μg/mL且經懸浮培養一週的米癒傷組織萃取物的角質細胞增殖效果較佳，其增殖效果較未經懸浮培養的對照組高出150 %以上。

(三)人類纖維母細胞增殖實驗：選用人類纖維母細胞CCD-966SK，將之培養於直徑10公分的培養盤中，當細胞生長至培養盤的8-9分滿後，除去盤內的培養液，以2-3 mL的PBS沖洗，再加入2 mL稀釋至0.5倍的胰蛋白□螯合劑(trypsin-EDTA)使細胞剝離盤壁，爾後置於37℃培養箱內3-5分鐘，後續實驗步驟與上述角質細胞增殖實驗大致雷同。

請見第8圖，所繪示者為纖維母細胞增殖率對癒傷組織萃取物濃度的關係圖，其中各結果以未加入米癒傷組織萃取物(0 μg/mL)的待測物數據為基準（100％）。實驗結果同樣顯示，以濃度為10μg/mL且經懸浮培養一週的米癒傷組織萃取物的效果較佳，人類纖維母細胞的增殖效果較未經懸浮培養的對照組高出180％以上。

由以上實驗可推知，經由本發明所提出之米癒傷組織之製備方法，可萃取出具有抑制酪胺酸脢、提高人類角質細胞及纖維母細胞增殖能力的萃取物，該萃取物可用於皮膚保健材料，藉此，增加水稻的附加價值。

最後，必須再次說明的是，本發明於前揭實施例中所揭露的構成單元僅為舉例說明，並非用來限制本案之範圍，其他等效的替代或變化，亦應為本案之申請專利範圍所涵蓋。

無

第1圖為米種子於製備方法的步驟（A）、（B）時的照片；

第2A圖為在25℃使用N6培養基時，癒傷組織截面積對培養時間的關係圖；

第2B圖為在25℃使用MS培養基時，癒傷組織截面積對培養時間的關係圖；

第3A圖為在30℃使用N6培養基時，癒傷組織截面積對培養時間的關係圖；

第3B圖為在30℃使用MS培養基時，癒傷組織截面積對培養時間的關係圖；

第4圖為在25℃使用不同濃度之生長調節劑製備癒傷組織的照片；

第5圖為在30℃使用不同濃度之生長調節劑製備癒傷組織的照片；

第6圖為癒傷組織萃取物抑制酪胺酸□活性實驗中，酪胺酸□抑制率對懸浮培養時間的關係圖；

第7圖為癒傷組織萃取物促進人類角質細胞增殖活性實驗中，角質細胞增殖率對癒傷組織萃取物濃度的關係圖；

第8圖為癒傷組織萃取物促進人類纖維母細胞增殖活性實驗中，纖維母細胞增殖率對癒傷組織萃取物濃度的關係圖。

無

Claims (5)

1. 一種用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，包括：(A)在培養容器內裝填培養基，將去殼之米種子置於培養基表面，培養基為N6培養基或MS培養基，培養基中添加生長調節劑；(B)米種子發芽並長出根部及癒傷組織後，切除其根部；(C)當米種子的癒傷組織之大小約為米種子初始大小的2-3倍大時，將癒傷組織移至液態之N6培養基中懸浮培養約一週，N6培養基中添加生長調節劑；(D)將癒傷組織自液態之N6培養基中取出，在低溫環境下進行研磨、水萃、離心後取上清液，將該上清液進行膜分離或透析而收集分子量介於200-1000的活性物質；其中，該生長調節劑為2,4-二氯苯氧乙酸，該活性物質為胜肽。
2. 如請求項1所述用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，在步驟(A)、(C)中，添加在培養基內的生長調節劑的濃度為0.5-2mg/L。
3. 如請求項1所述用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，在步驟(A)中，培養基更添加30g/L的蔗糖及7-9g/L的洋菜。
4. 如請求項1所述用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，其中步驟(A)、(C)是在25-30℃環境下進行。
5. 如請求項1所述用於皮膚保健材料的米癒傷組織之製備方法，其中步驟(A)是在避光環境下進行。