TWI538701B - 用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊及其應用 - Google Patents
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Description
本發明提供一種蛋白質奈米磁性殼核膠囊，特別係一種用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
藥物載體係將藥物傳遞至人體的病灶，以達到治療的效果。為了藥物的安全性及有效性，藥物載體系統被廣泛地應用於改善藥物釋放、吸收、分布與代謝上。近年來，隨著生物技術的進步，蛋白質及基因藥物的使用越來越多，但蛋白質藥物的傳輸容易被胃酸破壞，造成藥效不佳；另一方面，抗癌藥物毒性高，藥物傳輸過程常造成正常細胞的毒害，而引發嚴重的副作用；再者，慢性疾病的頻繁用藥，需要長效劑型以減少服藥的頻率，上述相關問體係為藥物載體開發的重要考量要點。
在目前藥物載體的技術中，奈米傳遞系統目前廣泛被應用在醫藥及生技產業中，以有機材料所製得之核殼奈米結構被應用來攜帶藥物之載體，該些有機的核殼奈米結構，例如是由雙脂肪層所構成之微脂體(liposome)或由兩性高分子所構成之微胞(micelle)，然而，該些有機的核殼奈米結構具有結構不穩定、製程繁雜及不易控制等問題。此外，這些技術因使用高分子聚合物作為原料，並使用多種小分子的介面活性劑來穩定介面，因此該些材料還存有對人體造成毒性之問題。
現行使用的抗癌藥物常因對正常細胞的毒性，而在臨床使用上受到很大的限制。因此，急需開發方便使用且侵入性低的藥物載體，能增加患者使用藥物的便利性，並增加藥物對人體的可用率，使藥物達到最佳的效果，同時還能減少副作用的產生，以改善患者對藥物的不適。
有鑑於此，本發明揭露一種藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，本發明之殼核膠囊係利用單一雙性蛋白質(amphiphilic protein)與奈米氧化鐵進行單一乳化步驟，即可形成奈米級中空結構，其中該雙性蛋白質作用為穩定劑與界面活性劑，故能形成具有高包覆藥物效率的藥物載體，更佳地是，親水性藥物分子及疏水性藥物分子可同時存在於本發明的蛋白質奈米磁性殼核膠囊內。此種利用單一乳化步驟的殼核膠囊的合成省略傳統多次以上的乳化步驟方式，且需要多種介面活性劑來穩定介面。本發明僅需利用蛋白質與奈米氧化鐵的單一乳化步驟即可形成，除了具有更好的生物相容性，藥物載體更具多功能性。
本發明提供用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，係包含：複數個雙性蛋白質(amphiphilic protein)、複數個奈米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性蛋白質具有一親水端與一疏水端；其中該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包含一水相核層，包含該親水性藥物；以及一油相殼層，包含該複數個奈米氧化鐵及疏水性藥物，而該油相殼層包覆該水相核層，且一部份雙性蛋白質介於該油相殼層與水相核層之間，另一部份雙性蛋白質圍繞於該油相殼層；其中該雙性蛋白質與該奈米氧化鐵的比例為1：0.8至1：16.7之間。
在本發明之一實施例中，其中該一部份雙性蛋白質的親水端界定形成該水相核層，且該一部份雙性蛋白質的疏水端與另一部份雙性蛋白質的疏水端界定形成該油相殼層。
在本發明之一實施例中，其中於該油相殼層中該等雙性蛋白質的疏水端與該奈米氧化鐵緊密交纏。
在本發明之一實施例中，其中該雙性蛋白質係為胎牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)或乳鐵蛋白(Lactoferrin)。
在本發明之一實施例中，其中該蛋白質奈米磁性殼核膠囊具有磁操控特性。
本發明更提供一種用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊的單乳化步驟之製造方法，係由以下步驟所組成：混合複數個雙性蛋白質與一親水性藥物以形成一水相核層溶液；分散複數個奈米氧化鐵於一
CHCl3溶液中，且加入一疏水性藥物於該CHCl3溶液中混合形成一油相殼層溶液；將該水相核層溶液及該油相殼層溶液混合進行乳化步驟，以形成一乳化液；以及把該乳化液中的CHCl3完全揮發後，以水清洗，得到該蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
本發明另提供一種藥物傳遞系統，係包含該蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
本發明又提供一種核磁共振顯影劑，係包含該蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
本發明再提供一種用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，係包含：複數個雙性蛋白質(amphiphilic protein)、複數個奈米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性蛋白質具有一親水端與一疏水端；其中一部份雙性蛋白質的親水端界定一第一空間，該一部份雙性蛋白質的疏水端與圍繞於該一部份的另一部份雙性蛋白質的疏水端共同界定一第二空間，該第二空間包覆該第一空間，其中該第一藥物活性成分容置於該第一空間，而該磁性奈米粒子容置於該第二空間；其中該第一空間形成一水相核層，該第二空間形成一油相殼層，且該油相殼層包覆該水相核層；該親水性藥物容置於該水相核層，該疏水性藥物容置於該油相殼層；其中該雙性蛋白質與該奈米氧化鐵的比例為1：0.8至1：16.7之間，且該雙性蛋白質係為胎牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)或乳鐵蛋白(Lactoferrin)。
本發明之用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊為中空球狀結構，具有水相核層及油相殼層結構，因此具有同時包覆親水性及疏水性藥物的能力。在疏水性的油相殼層中，藉由雙性蛋白質的疏水端和油相奈米氧化鐵交纏，在乳化過程中奈米氧化鐵協助油相殼層穩定，而該油相殼層除了可以增加結構完整性以有效地保護藥物之外，相較於傳統技術使用高分子載體，本發明的奈米載體因含有奈米氧化鐵而具有磁操控特性，可以藉由磁場刺激來進行熱療及載體的藥物釋放。
由於蛋白質受熱產生變性而引發載體團聚的效應，使本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊經加熱後可達到更好的藥物累積及目標治療效應，此外，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊更可經多次離心清洗後重新分散，
顯示其穩定性極佳。該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的油相殼層是由雙性蛋白質及奈米氧化鐵緊密交纏而構成，故該油相殼層除了有穩定該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的殼核結構之功能外，其所創造出殼層的強疏水性環境可以兼具避免水相核層中的親水性藥物的自然釋放及攜帶疏水性藥物兩種功能。其中，油相殼層也可以經由表面修飾來增加標靶能力或改變此載體的性質，提高細胞攝入該膠囊的效率或該膠囊進入病灶的精確性，對於藥物治療具有相當大的助益。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1‧‧‧蛋白質奈米磁性殼核膠囊
101‧‧‧油相殼層
102‧‧‧水相核層
103‧‧‧雙性蛋白質
104‧‧‧奈米氧化鐵
105‧‧‧疏水性藥物
106‧‧‧親水性藥物
第一圖係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的示意圖。
第二圖係顯示牛血清蛋白(BSA)的疏水片段可夾帶脂肪酸(Fatty Acids)、甲狀腺素(Thyroxine)、二氮平(Diazepam)及鈣(Calcium)。
第三圖係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的掃描式電子顯微鏡影像。
第四圖(a)至(d)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的穿透式電子顯微鏡影像；真空乾在後的中空結構的蛋白質奈米磁性殼核膠囊在穿透式電子顯微鏡中，(a)及(b)顯示油相殼層折疊部分對比較深，(c)及(d)顯示奈米氧化鐵和牛血清蛋白緻密交纏形成穩定油相殼層。
第五圖係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的掃描式電子顯微鏡影像。
第六圖係為(a)至(d)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的穿透式電子顯微鏡影像；真空乾在後的中空結構的蛋白質奈米磁性殼核膠囊在穿透式電子顯微鏡中，(a)及(b)顯示油相殼層折疊部分對比較深，(c)及(d)顯示利用控制乳鐵蛋白濃度可製備實心球狀結構。
第七圖(a)至(d)係為成中空球狀結構及實心球狀結構的比較圖；其中，
(a)係為中空球狀結構及實心球狀結構的粒徑分布圖；(b)係為中空球狀結構及實心球狀結構的親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)的包覆率數據圖；(c)係為中空球狀結構及實心球狀結構的藥物釋放率；(d)係為子宮頸癌Hela細胞株養在中空球狀結構的本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊兩小時以後的影像圖；量子點以白色箭頭表示。
第八圖係(a)至(c)顯示不同濃度的雙性蛋白質(牛血清蛋白)對之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的影響；其中，(a)係為牛血清蛋白的重量百分濃度<1%、(b)係為牛血清蛋白的重量百分濃度1%~4%及(c)係為牛血清蛋白的重量百分濃度>4%。
第九圖(a)至(e)係顯示調整胎牛血清蛋白的濃度及Fe3O4的濃度可以調整蛋白質奈米磁性殼核膠囊大小；(a)及(b)係為1wt% BSA、8.35wt% Fe3O4的條件下形成的蛋白質奈米磁性殼核膠囊之掃描式電子影像圖；(c)及(d)係為2wt% BSA、16.7wt% Fe3O4的條件下形成的蛋白質奈米磁性殼核膠囊之掃描式電子影像圖；(e)係為該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑分佈圖。
第十圖係為不同含鐵量之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑分布圖。
第十一圖(a)至(f)係顯示本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在不同溫度下蛋白質奈米磁性殼核膠囊型貌、表面電荷及水動力半徑(Hydrodynamic radius)；(a)至(d)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在高溫下會有團聚現象之掃描式電子影像圖；(a)及(c)為室溫環境下；(b)及(d)為加熱至60℃；(e)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在不同溫度下的電荷分布圖；(f)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在不同pH值下的粒徑分布圖。
第十二圖係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在不同pH值下之水合半徑分布圖。
第十三圖係為肺癌A549細胞株分別在不同濃度的本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的存活率之數據圖；控制組為不加蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
第十四圖係為子宮頸癌Hela細胞株分別培養在10mg/mL高濃度及3mg/mL低濃度的本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的影像圖；量子點以白色箭頭表示。
第十五圖(a)及(b)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊之磁敏感特性的曲線圖；(a)係為不同強度高週波磁場強度(16kA/m及8kA/m)刺激的藥物釋放曲線圖，(b)係為利用磁場的開關可達到調控藥物釋放速度的藥物釋放曲線圖。16kA/m-Doxo及8kA/m-Doxo分別表示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包覆親水性藥物(Doxorubicin)施加16kA/m或8kA/m磁場10分鐘；16kA/m-PTX分別表示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包覆疏水性藥物(Paclitaxol)施加16kA/m或8kA/m磁場10分鐘；DE-Doxo與DE-PTX表示未施加磁場的載體藥物釋放情形。
第十六圖(a)及(b)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊之動物試驗結果；(a)顯示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊可累積於小鼠腫瘤位置之影像圖，(b)顯示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊可經過30天的磁場治療可降低小鼠腫瘤生長之曲線圖。PD-VNs表示含有親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)之蛋白質奈米磁性殼核膠囊；PD-VNs-MFx3及PD-VNs-MFx1分別表示3次或1次磁場治療之含親水性藥物與疏水性藥物之蛋白質奈米磁性殼核膠囊；PD表示單純Doxorubicin與Paclitaxol；VNs+MF表示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊加磁場；PD-VNs表示含Doxorubicin與Paclitaxol之蛋白質奈米磁性殼核膠囊；Control為僅施打生理食鹽水的控制組。
本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊，該殼核膠囊利用單一雙性蛋白質(amphiphilic protein)與奈米氧化鐵進行單一乳化步驟，即可形成奈米級中空結構。藥物的包覆可在蛋白質奈米磁性殼核膠囊製程中直接進行，以提升藥物包覆率。除了可以同時包覆疏水性及親水性二種截然不同特性的藥物進行控制釋放之外，奈米氧化鐵更能應用核磁共振顯影及熱療方面；該蛋白質奈米磁性殼核膠囊也可經過簡單的修飾，使其具有標靶特定部位的功能。
本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊，其係藉由單一雙性蛋白質與奈米氧化鐵，經過生物性考量的揮發性溶劑的使用，即可以簡單的單
一乳化步驟形成一奈米中空結構。相較於習知技術要形成中空結構的技術，須經過多次以上的乳化步驟，先形成水/油結構，習知技術再經第二次乳化形成水/油/水的構造；而本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊，其核層與殼層都是雙性蛋白質，所以製備方法只需要經過一次乳化步驟即可形成水/油/水的中空結構，雙性蛋白質和奈米氧化鐵結合可以穩定油相殼層，並具有同時包覆親水性及疏水性藥物之能力。
本實施例以牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)為材料與油相奈米氧化鐵，較佳為磁性奈米鐵，來說明本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的製程和應用，其應用係以疏水性藥物紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和親水性藥物鹽酸多柔比星(Doxorubicin hydrochloride，DOX)為例。
蛋白質奈米磁性殼核膠囊的製備方法如下：
1.先配置BSA水溶液、DOX水溶液、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)溶液。
2.合成5nm油相氧化鐵(Fe3O4)，將Fe3O4去除乙醇後，分散於100L的CHCl3中，並加入PTX溶液，作為油相(oil phase)備用。
3.將BSA溶液和DOX溶液做為水相(water phase)，與步驟2油相(oil phase)溶液混合，利用能量超音波進行乳化30秒，待完全乳化後，置於通風操作台攪拌，於室溫將CHCl3完全揮發。
4.將產物用Milli-Q超純水、8000rpm離心清洗三次後，再用Milli-Q超純水溶。
經由上述條件所乳化形成的本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊1為中空結構，其結構如第一圖所示，其係由雙性蛋白質103，較佳實施例為牛血清蛋白(BSA)親水端圍繞形成水相核層102，油相殼層101包覆著水相核層102。其中，油相殼層101是由雙性蛋白質103及油相奈米氧化鐵104，較佳實施例為牛血清蛋白與油相奈米氧化鐵緊密交纏而構成，故該油相殼層101除了有穩定該蛋白質奈米磁性殼核膠囊1的殼核結構之功能外，其所創造出油相殼層的強疏水性環境可以兼具避免水相核層102中的親水性藥物106的自然釋放、及攜帶疏水性藥物105兩種功能。而油相奈米氧化鐵104使該蛋白質奈米磁性殼核膠囊1具有磁操控特性。
雙性蛋白質例如牛血清蛋白(BSA)序列具有親水性與疏水性的結構域，疏水結構域可以攜帶油相分子，例如：脂肪酸(Fatty acid)、甲狀腺素(Thyroxine)、二氮平(Diazepam)及鈣(Calcium)，如第二圖所示，油相氧化鐵會與這些位置結合，而親水端許多含OH官能基的胺基酸(amino acid)會朝向水溶液，因此牛血清蛋白可以存在於兩相之間。根據界面活性劑的HLB值(hydrophilic-lipophilic balance value，親水-疏水平衡值),BSA在特定濃度下具有穩定油/水(HLB值：8~16)和水/油(HLB值：3~8)界面的特性，能夠同時當作水/油及油/水的乳化劑使用，因此能自組裝形成水-油-水的中空結構。
發明人分別利用掃描式電子顯微鏡及穿透式電子顯微鏡分析本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊之結構，其結果如第三圖及第四圖所示，第三圖係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的掃描式電子顯微鏡影像，將本發明的蛋白質奈米磁性殼核膠囊用去離子水洗淨後，真空乾燥所拍攝的影像，由於蛋白質沒有鋼性性質，故乾燥後的蛋白質奈米磁性殼核膠囊會有明顯的塌陷或皺縮的形貌，因為油相含有氧化鐵不會蒸發，顯示蛋白質奈米磁性殼核膠囊內部確實為水相結構。第四圖(a)至(d)係為本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的穿透式電子顯微鏡影像，其更可以清楚觀察蛋白質奈米磁性殼核膠囊乾燥皺縮後的透視結構，對比較深的黑色顆粒為氧化鐵，在氧化鐵外有一層對比較淡的部分則是牛血清蛋白(第四圖(a)及(b))，氧化鐵和牛血清蛋緊密結合形成具有可撓性的油相殼層(第四圖(c)及(d))。
本實施例以乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)材料與油相奈米氧化鐵，較佳為磁性奈米鐵，來說明本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊和應用，其應用以疏水性藥物紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和親水性藥物鹽酸多柔比星(Doxorubicin hydrochloride)為例，其製備方法如同實施例1.1所述。
經由上述條件所乳化形成的本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊為中空結構，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊也會呈現出殼核結構，其中
殼係為乳鐵蛋白與氧化鐵所組成的複合物，如第五圖所示，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包覆親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)後，奈米結構依然保持於原來特性，其中空結構經乾燥後產生凹陷，此結構的形成機制也與實施例1.1的結果一致。
不過由於利用乳鐵蛋白製造的蛋白質奈米磁性殼核膠囊之粒徑大小與利用BSA製造的不同，在穿透式電子顯微鏡觀察下，如第六圖(a)至(d)所示，利用乳鐵蛋白製造的蛋白質奈米磁性殼核膠囊之粒徑大小約為160nm，真空乾燥後的中空結構的蛋白質奈米磁性殼核膠囊可精楚觀察到油相殼層折疊部分對比較深(第六圖(a)及(b))；本發明並可利用控制乳鐵蛋白的比例，降低乳鐵蛋白的濃度形成實心球狀結構(第六圖(c)至(d))。
本發明分析該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑，並以利用控制乳鐵蛋白的比例形成中空球狀結構及實心球狀結構作比較，其中0.5wt%-8wt%乳鐵蛋白搭配氧化鐵可行成中空球，0.1wt%-0.5wt%形成實心球。如第七圖(a)所示，其中該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的中空球狀結構的粒徑大小較大約為220nm，而本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的實心球狀結構的粒徑大小大約只有130nm，其粒徑會相較於穿透式電子顯微鏡下觀察較大，其原因為載體的水合半徑造成量測不同。在包藥測試下，如第七圖(b)所示，親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)皆可以包覆於該些結構當中，由於中空結構其具有親水核，因此可以包覆更多親水性藥物。在長時間藥物釋放測定下，如第七圖(c)所示，兩種結構的藥物釋放皆可以達到緩慢釋放的效果。此外，在子宮頸癌Hela細胞攝入實驗中，經培養兩個小時後，如第七圖(d)所示，可以發現中空球狀結構的蛋白質奈米磁性殼核膠囊可以大量的被癌細胞吞入，並分散在細胞質當中，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊量子點以白色箭頭標示，證實本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊具有標靶功能。
在上述製備方法中，在氧化鐵為0.017g/mL的情況下，分別調整雙性蛋白質的重量百分濃度為<1%、1%~4%及>4%測試該蛋白質奈
米磁性殼核膠囊是否形成。雙性蛋白質為牛血清蛋白測試結果陳列於表一及第八圖(a)至(c)、雙性蛋白質為乳鐵蛋白測試結果陳列於表二，皆顯示出當雙性蛋白質重量百分比在1%~4%時，會形成中空結構，且該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑大小低於200nm(第八圖(b))；而當雙性蛋白質濃度過低或過高時，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊不易形成(第八圖(a)及(c))。
本發明藉由調整Fe3O4的濃度、環境溫度、pH值改變蛋白質奈米磁性殼核膠囊大小，證實本發明蛋白質奈米磁性殼核膠囊大小可以人為控制，提供更為廣泛的應用。
本發明藉由在前述的範圍內調整胎牛血清蛋白及Fe3O4的濃度可改變本發明實施例1.1之蛋白質奈米磁性殼核膠囊大小：第九圖(a)及(d)係為利用動態光散射儀分析本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊之結構；第九圖(a)及(b)係為1wt% BSA、8.35wt% Fe3O4的條件下形成的蛋白質奈米磁性殼核膠囊；第九圖(c)及(d)係為2wt% BSA、16.7wt% Fe3O4的
條件下形成的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，證實隨著氧化鐵濃度的提升，合成蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑亦隨之增加，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑分佈圖如第九圖(e)所示。
本發明不同含鐵量的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，有不同的外觀，藉由調整本發明實施例1.1之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的氧化鐵濃度，可以改變載體的粒徑分布與大小，如第十圖所示，不同含鐵量之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的粒徑分布圖，含鐵量越高粒徑越大。
本發明實施例1.1之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在不同溫度下之形貌，如第十一圖(a)及(c)所示，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊在室溫下為分散狀態；如第十一圖(b)及(d)所示，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊加熱樣品至60℃為團聚狀態，故該蛋白質奈米磁性殼核膠囊隨溫度升高會有團聚現象產生。同時，本發明利用表面電位(zeta potential)檢測該蛋白質/氧化鐵奈米磁性殼膠在不同溫度下之電荷變化，如第十一圖(e)所示，增加該蛋白質奈米磁性殼核膠囊之環境溫度，會造成電性減少而產生團聚效應；本發明利用動態光散射(dynamic light scattering)量測不同溫度下該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的水動力半徑(Hydrodynamic radius)變化，亦證實本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊經加熱後產生蛋白質變性，而引發該蛋白質奈米磁性殼核膠囊載體團聚的效應，以達到更好的藥物累積及目標治療效應。
本發明實施例1.1之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在不同pH值下之水合半徑，如表三及第十二圖所示，會隨pH值下降而逐漸增加，且該些水合半徑皆能維持本發明蛋白質奈米磁性殼核膠囊原來的結構；證實本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊在較酸的環境下亦可維持原結構特徵。
本發明利用肺癌A549細胞株進行實施例1.1之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的生物相容性試驗，肺癌A549細胞株分別在不同濃度蛋白質奈米磁性殼核膠囊的培養下，如第十三圖所示，其存活率與不加蛋白質奈米磁性殼核膠囊的控制組比較幾乎沒有差異，證實本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的生物相容性極佳。
此外，本發明利用子宮頸癌Hela細胞株分別在含有10mg/mL高濃度及3mg/mL低濃度實施例1.1之蛋白質奈米磁性殼核膠囊的培養基培養下，如第十四圖所示，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊量子點以白色箭頭標示，細胞透過核體內區隔(endosomal compartments)的方式，可以攝取不經過任何修飾的蛋白質奈米磁性殼核膠囊；且高濃度的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，或細胞培養時間越久，將增加該蛋白質奈米磁性殼核膠囊在細胞的累積量。因此，本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊除具有極佳的生物相容性外。
本發明為檢測該蛋白質奈米磁性殼核膠囊的磁敏感特性，分別以不同強度高週波磁場強度(16kA/m及8kA/m)刺激後，如第十五圖(a)所示，16kA/m-Doxo表示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包覆親水性藥物(Doxorubicin)施加16kA/m磁場10分鐘，而16kA/m-PTX表示該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包覆疏水性藥物(Paclitaxol)施加16kA/m磁場10分鐘，經由磁場刺激後，藥物皆能夠達到快速釋放的目的，第十五圖(a)圖中DE-Doxo與DE-PTX表示未施加磁場的載體藥物釋放情形，其釋放相對緩慢。第十五圖(b)則表示蛋白質奈米磁性殼核膠囊包覆親水性藥物(Doxorubicin)或疏水性藥物(Paclitaxol)，在開-關磁場下的藥物釋放情形，可以發現藥物可以隨磁場快速釋放。
本發明利用磁場的開關可達到調控藥物釋放速度的目的，未給予磁場時，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊可將藥物良好包覆於核內，當磁場一開啟，藥物迅速且精準的大量釋放。
本發明將實施例1.1的蛋白質奈米磁性殼核膠囊(PD-VNs)進行螢光分子cy5.5標定，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊(PD-VNs)已含有親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)；再將該蛋白質奈米磁性殼核膠囊利用尾靜脈注入裸鼠中，經過3次磁場治療(PD-VNs-MFx3)或1次磁場治療(PD-VNs-MFx1)。以用非侵入式活體分子影像系統(Caliper IVIS system)作為觀測腫瘤、蛋白質奈米磁性殼核膠囊分佈，觀察動物整體的變化。並另以僅用單純親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)(PD)、含有親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)的蛋白質奈米磁性殼核膠囊(PD-VNs)及該蛋白質奈米磁性殼核膠囊(不含藥)加磁場(VNs+MF)作為對照組，以及僅施打生理食鹽水的控制組(control)。本實施例是方法為每隻實驗老鼠之體重及腫瘤大小將固定一位成員觀察測量，每週觀察紀錄3次。由於腫瘤形成橢圓形狀，利用游標尺測量腫瘤直徑最長為a，直徑最長為b，故腫瘤體積的計算依下列公式=1/2ab2。
結果如第十六圖(b)所示，經過3次磁場治療(PD-VNs-MFx3)或1次磁場治療(PD-VNs-MFx1)，並持續觀察30天，其皆可達到抑制腫瘤生長的目的，以3次磁場治療為最佳；而僅用單純親水性藥物(Doxorubicin)與疏水性藥物(Paclitaxol)的PD，則因藥物被代謝掉，造成藥物毒殺性質不夠強，而顯示腫瘤持續生長。另外，該蛋白質奈米磁性殼核膠囊(不含藥)加磁場(VNs+MF)、或含Doxorubicin與Paclitaxol之蛋白質奈米磁性殼核膠囊(PD-VNs)且不外加磁場則有部分抑制效果；Control為僅施打生理食鹽水的控制組，無抑制效果。
另外，本發明將螢光染劑作為模擬藥物包覆於本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊內，再注射至小鼠體內，如第十六圖(a)所示，經由影像可觀察到該其可累積於小鼠腫瘤位置。
經由上述結果證實本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊具有良好的磁敏感特性，故有益於長時間的藥物控制。
綜上所述，本發明之蛋白質奈米磁性殼核膠囊僅由一般的雙性蛋白質所構成，其材料為雙性蛋白質，極具生物相容性；且氧化鐵媒介
更可為該蛋白質奈米磁性殼核膠囊具有藥物操控釋放及熱療的能力及核磁共振顯影劑的特性，再者，不須經過繁複的改質或聚合，不同以往需要交聯反應來增加結構在溶液中的穩定性；其製程十分簡單，利用單一雙性蛋白質即可同時穩定油/水及水/油的界面；藥物包覆也可於合成該蛋白質奈米磁性殼核膠囊時一併完成，不僅簡化製程，在包覆藥物的效率上也較高；且該蛋白質奈米磁性殼核膠囊可同時包覆親水及疏水兩種特性的藥物，應用性更為廣泛。
1‧‧‧蛋白質奈米磁性殼核膠囊
101‧‧‧油相殼層
102‧‧‧水相核層
103‧‧‧雙性蛋白質
104‧‧‧奈米氧化鐵
105‧‧‧疏水性藥物
106‧‧‧親水性藥物
Claims (8)
- 一種用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，係包含：複數個雙性蛋白質(amphiphilic protein)、複數個奈米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性蛋白質具有一親水端與一疏水端；其中該蛋白質奈米磁性殼核膠囊包含一水相核層，包含該親水性藥物；以及一油相殼層，包含該複數個奈米氧化鐵及該疏水性藥物，而該油相殼層包覆該水相核層，且一部份雙性蛋白質介於該油相殼層與水相核層之間，另一部份雙性蛋白質圍繞於該油相殼層；其中該雙性蛋白質與該奈米氧化鐵的比例為1：0.8至1：16.7之間；以及其中該雙性蛋白質係為乳鐵蛋白(Lactoferrin)。
- 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質奈米磁性殼核膠囊，其中該一部份雙性蛋白質的親水端界定形成該水相核層，且該一部份雙性蛋白質的疏水端與另一部份雙性蛋白質的疏水端界定形成該油相殼層。
- 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質奈米磁性殼核膠囊，其中於該油相殼層中該等雙性蛋白質的疏水端與該奈米氧化鐵緊密交纏。
- 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質奈米磁性殼核膠囊，其中該等奈米氧化鐵賦予該蛋白質奈米磁性殼核膠囊具有磁操控特性。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊的單乳化步驟之製造方法，係由以下步驟所組成：混合複數個雙性蛋白質與一親水性藥物以形成一水相核層溶液； 分散複數個奈米氧化鐵於一CHCl3溶液中，且加入一疏水性藥物於該CHCl3溶液中混合形成一油相殼層溶液；將該水相核層溶液及該油相殼層溶液混合進行乳化步驟，以形成一乳化液；以及把該乳化液中的CHCl3完全揮發後，以水清洗，得到該蛋白質奈米磁性殼核膠囊，其中該雙性蛋白質係為乳鐵蛋白(Lactoferrin)。
- 一種藥物傳遞系統，係包含如申請專利範圍第1項所述之蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
- 一種核磁共振顯影劑，係包含如申請專利範圍第1項所述之蛋白質奈米磁性殼核膠囊。
- 一種用於藥物傳遞的蛋白質奈米磁性殼核膠囊，係包含：複數個雙性蛋白質(amphiphilic protein)、複數個奈米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性蛋白質具有一親水端與一疏水端；其中一部份雙性蛋白質的親水端界定一第一空間，該一部份雙性蛋白質的疏水端與圍繞於該一部份的另一部份雙性蛋白質的疏水端共同界定一第二空間，該第二空間包覆該第一空間，其中該第一藥物活性成分容置於該第一空間，而該磁性奈米粒子容置於該第二空間；其中該第一空間形成一水相核層，該第二空間形成一油相殼層，且該油相殼層包覆該水相核層；該親水性藥物容置於該水相核層，該疏水性藥物容置於該油相殼層；其中該雙性蛋白質與該奈米氧化鐵的比例為1：0.8至1：16.7之間；以及 其中該雙性蛋白質係為乳鐵蛋白(Lactoferrin)。
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