TWI522047B - 一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途 - Google Patents

Description

一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途

本發明係關於一種香蕉皮萃取物的用途，特別係該香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途。

近年來，台灣蝦類養殖蓬勃發展，蝦類不僅可以作為食物來源，亦可以外銷為國家帶來豐富的經濟效益。由於蝦類養殖快速發展，而限於土地價格高，養殖業者須採用高密度養殖，以降低成本。

高密度的養殖方式易造成養殖環境惡化，疾病叢生，使得水產動物間易相互傳染疾病，因此蝦類存活率通常只有50%，又，每到冬季寒流來襲時，溫度急速下降，蝦類生長於低溫緊迫的環境下，死亡率亦隨之提升。為了降低蝦類死亡率，養殖業者常添加抗生素於飼料中，以提升蝦類對抗細菌病毒之能力，然而抗生素的濫用，不僅是導致食用者吃蝦過敏的原因，亦會引發病菌產生抗藥性。

生活中，許多蔬果皆含有天然抗氧化劑，可有助於免疫力的提升。其中特別係香蕉，由於臺灣有香蕉王國之美稱，四季皆盛產香蕉，且香蕉果皮亦含有多酚物質及蕉皮素等活性成分，具有抗氧化及抑制真菌細菌生長繁殖之功效，但一般人通常僅食用香蕉的果肉，而丟棄香蕉皮，殊不知香蕉皮中富含活性成分。

有鑑於此，基於「蝦體內抗生素危害人體健康」及「香蕉皮 浪費」的問題，因此極須提供一種香蕉皮萃取物用於提升蝦類免疫力之用途，以解決上述問題。

本發明之主要目的係提供一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係可以減少抗生素的使用，增強淡水大蝦免疫能力，降低淡水大蝦死亡率者。

本發明之再一目的係提供一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係收取丟棄的香蕉皮，充分再利用香蕉皮者。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係將該香蕉皮萃取物投予一蝦體，以增強該蝦體之免疫力，其中，該香蕉皮萃取物之製備方法係包含：提供一香蕉皮；將該香蕉皮以重量體積比為1：5~1：10之比例與水混合，並於90℃下進行萃取5分鐘，以獲得一香蕉皮萃取液；及將該香蕉皮萃取液進行濃縮，以獲得該香蕉皮萃取物。

本發明之一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該香蕉皮萃取物較佳係注射至該蝦體的頭胸部腹面血竇。

本發明之一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該蝦體較佳係為4~5個月大。

本發明之一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該注射之劑量較佳係為每克之蝦體重注射1~6μg之該香蕉皮萃取物。

本發明之一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該香蕉皮萃取物較佳係與一飼料混合以形成一混合物， 並以該混合物餵飼該蝦體每日2次，每天餵飼量為該蝦體重的2~3%。

本發明之一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該混合物較佳係為每公斤飼料加入1~6克之該香蕉皮萃取物。

本發明之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係透過香蕉皮所富含之活性成分，促進淡水大蝦免疫功能，提高淡水大蝦對疾病及低溫緊迫之抵抗力，是以達到減少抗生素用量之功效。

本發明之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係使丟棄的香蕉皮可回收再被利用，達到減少香蕉皮所造成的垃圾量之功效。

第1圖：係本試驗第A1~A4組淡水大蝦酚氧化酵素活性長條圖。

第2圖：係本試驗第B1~B4組淡水大蝦酚氧化酵素活性長條圖。

第3圖：係本試驗第A1~A4組淡水大蝦吞噬活性長條圖。

第4圖：係本試驗第B1~B4組淡水大蝦吞噬活性長條圖。

第5圖：係本試驗第A1~A4組淡水大蝦清除活性長條圖。

第6圖：係本試驗第B1~B4組淡水大蝦清除活性長條圖。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明所述「蝦類」係指養殖蝦類，包含但不限於，白蝦(Litopenaeusvannamei)、草蝦(Penaeusmonodon)、斑節蝦(Marsupenaeusjaponicus)、中國草蝦(Fenneropenaeuschinensis)、印度對蝦(F.indicus)、沙蝦(Metapenaeusensis)、紅尾蝦(F.penicillatus)及淡 水大蝦(Macrobrachiumrosenbergii)。

本發明較佳實施例之香蕉皮萃取物係可以經由以下方式製備獲得，但不以此為限。本較佳實施例香蕉皮萃取物之製備方式，係包含：提供一香蕉皮，並以水萃取該香蕉皮，獲得一香蕉皮萃取液，續濃縮該香蕉皮萃取液，即可以獲得本較佳實施例之香蕉皮萃取物。

詳言而之，以水萃取該香蕉皮前，較佳係可以先於50℃下乾燥該香蕉皮(含水量小於10%)，以獲得一乾燥香蕉皮，並將該乾燥香蕉皮粉碎(以100mesh紗網過濾)，獲得一粉碎香蕉皮，以增加其後續萃取效率。

續將該粉碎香蕉皮以重量體積比為1：5~1：10之比例與水混合，並於90℃下加熱萃取5分鐘，以獲得該香蕉皮萃取液。上述萃取亦可以重複數次，使該香蕉皮所富含之活性成分可以完整釋出於水中，此為本領域所屬具有通常知識者所廣泛應用，在此不加以贅述。

本較佳實施例之香蕉皮萃取液係可以經由真空過濾(GF-75濾紙)，並以4000 xg於4℃下進行離心10分鐘，重複3次，續於-40℃~-50℃下冷凍乾燥離心後所得的上清液，以獲得一含水量小於15%的香蕉皮萃取物，此為本領域所屬具有通常知識者慣用手段，係為本領域所屬具有通常知識者可以理解，在此不再贅述。

本較佳實施例中，係取用100克之粉碎香蕉皮，以1公升水於90℃下加熱萃取5分鐘，再經過濾、離心及冷凍乾燥後，係可以獲得約20克之該香蕉皮萃取物。

本較佳實施例香蕉皮萃取物可以提升蝦類免疫力，係將一有效劑量之該香蕉皮萃取物投予一蝦體，使該蝦體充分獲取該香蕉皮萃取物所含活性成分，以提升該蝦體之抗氧化力及免疫細胞活性，降低該蝦體死亡率。

其中，上述香蕉皮萃取物係可以利用注射方式投予該蝦體，較佳係將該香蕉皮萃取物注射至該蝦體的頭胸部之腹面血竇，該腹面血竇係接近心臟，且為該蝦體之血淋巴集中處，是以該香蕉皮萃取物之活性成分係可以經由該蝦體之血淋巴流向各組織，由於注射方式較為麻煩，因此於該蝦體之生命週期內僅注射一次，以了解注射後可持續的有效時程，其中，該有效劑量係為每克之蝦體重注射1~6μg之該香蕉皮萃取物為佳。又由於當該蝦體過小時，不易抽取較多量的血淋巴，因此該蝦體較佳係為4~5個月大以上，且該蝦體體重約為40.0±1.0g。

然而為了產業應用方便，上述香蕉皮萃取物亦可以採餵飼方式投予該蝦體，該蝦體體重為17~20g，餵飼方式可以應用於較小的蝦體，不會受蝦體重量大小所限制；其中，較佳係可以將該香蕉皮萃取物與如第1表所示之一蝦飼料混合以形成一混合物，並以該混合物餵飼該蝦體每天2次，每天餵飼量為該蝦體重的2~3%，混合比例係以每公斤飼料加入1~6克之該香蕉皮萃取物為佳。該蝦體係可以經由攝食，消化並吸收該香蕉皮萃取物之活性成分。

為證實本較佳實施例之香蕉皮萃取物可以有效提升蝦類免疫力，係將該香蕉皮萃取物投予一養殖蝦類，並利用該養殖蝦類進行以下試驗：

(A)酚氧化酵素(phenoloxidase，簡稱PO)活性分析

本試驗之養殖蝦類係選用從屏東養殖場取得的淡水大蝦(M.rosenbergii)，試驗前，先將淡水大蝦置於實驗室養殖兩週，使其適應試驗養殖環境(淡水環境，鹽度為0；水溫為27±1℃；pH值為7.2~7.6)，在適應期間係以如第1表所示之該蝦飼料餵飼，一日兩次。選擇在蛻殼階段的淡水大蝦進行試驗，因蛻殼階段蝦體外殼硬，使得注射操作方便且不易傷害蝦體，有利於注射的進行，然而因各蛻殼階段之生理因子表現會有所差異，因此使用同一蛻殼階段的蝦體進行試驗，可降低各蝦體間之差異，增加試驗的準確性，控制組與各試驗組之數量均為6隻，注射及餵飼方式間之各該組淡水大蝦重量均無顯著差異。

於養殖兩週後，係以如第2表記載之劑量，將本較佳實施例之香蕉皮萃取物注射於各組淡水大蝦頭胸部腹面血竇一次，空白對照組係為注射未含該香蕉皮萃取物的生理食鹽水(如第2表所示)，並於投予該香蕉皮萃取物之第1、3及6天後，取各該組淡水大蝦進行後續試驗。

本試驗係依先前文獻(Comparative Biochemistry and Physiology 1996；113C：61-66；Nature；1956；177：79-81)所述，使用分光計(Hitachi U-2000)紀錄來自左旋多巴(L-DOPA)的多巴色素(dopachrome)，以測量PO活性。詳而言之，首先以一包含有0.9ml抗凝血劑(30mM檸檬酸三鈉、0.34M氯化鈉及10mM EDTA，pH7.55，再利用葡萄糖調整滲透壓至780mOsm/kg)的滅菌針筒(1ml，25號針頭)從各該組淡水大蝦的腹面血竇抽取0.1ml血淋巴樣品，以獲得一9：1稀釋血淋巴樣品。將該9：1稀釋血淋巴樣品於4℃下以300 xg離心20分鐘，去除上清液後，將沉澱物重新懸浮於1ml二甲砷酸鹽-檸檬酸(cacodylate-citrate)緩衝溶液(10mM二甲砷酸鈉、0.45M氯化鈉、0.10M檸檬酸三鈉；pH7.0)中。再次離心後，取沉澱物重新懸浮於200ml二甲砷酸鹽(cacodylate)緩衝溶液(0.01M二甲砷酸鈉、0.45M氯化鈉、0.01M氯化鈣及0.26M氯化鎂；pH7.0)中，以獲得一血球細胞液。取100ml之該血球細胞液與50ml的1mg/ml胰蛋白酶(trypsin)混合，並於25~26℃下靜置10分鐘，經作用10分鐘後，再加入50μl之3mg/ml左旋多巴(配製於二甲砷酸鹽緩衝溶液)，5分鐘後續加入800ml二甲砷酸鹽緩衝溶液，以獲得各組PO活性檢測樣品。以分光計於490nm測量該PO活性檢測樣品，所測得之吸光值係以每50ml血淋巴之多巴色素的形成表示之，代表各該組淡水大蝦之PO活性，其分析結果如第1圖所示。本試驗控制組係作為PO活性分析之背景值，其係包含100ml之該血球細胞液、50ml二甲砷酸鹽及50μl左旋多巴。

請參照第1圖所示，第A4組於第1天的PO活性，明顯高於第A1~A3組(第A1~A3與A4組之統計差異分別以b及a表示)。第3及6天後，第A2~A4組相較於第A1組的PO活性皆有顯著提升(第A2~A4與A1組之統計差異分別以a及b表示)。

此外，為證實本較佳實施例之香蕉皮萃取物亦可以利用餵飼方式投予該蝦體，另將如第3表所記載之不同劑量之該香蕉皮萃取物與該蝦飼料混合，以形成各組混合物，並利用纖維素(Sigma，購自友和貿易股份有限公司)補足第B1~B3組混合物之重量，使第B1~B3組混合物中組成比例與第B4組一致，並餵飼淡水大蝦每天2次，每天餵飼量為蝦體重的2~3%，空白對照組係為餵飼未含該香蕉皮萃取物的蝦飼料，並以6g纖維素取代(如第3表所示)，該香蕉皮萃取物係以如第3表記載之劑量餵飼各組淡水大蝦，於2、4、8、16及32天後，取各該組淡水大蝦進行相關試驗。

請參照第2圖所示，第B4組於各時間點下之PO活性皆明顯高於第B1組，其中特別係於第4及8天，第B1組與第B4組間有更高的顯著性差異(第B1與B4組之統計差異分別以c及a表示)。

(B)吞噬比率分析

本試驗係依先前文獻(Asian Journal of Food and Agro-Industry 2011；4(01)：31-46)所述，計算血球細胞吞噬比率。簡言之，各組淡水大蝦經注射如第2表記載之該香蕉皮萃取物劑量，並分別在注射後第1、3及6天的時間採樣，採樣方式為先以20μl乳酸鏈球菌懸浮液進行注射，使各該組淡水大蝦感染菌量為2×10⁶ CFU/shrimp，並將各該組淡 水大蝦放置於28℃水中3小時，後續自其腹面血竇抽取200μl血淋巴，續與200μl抗凝血劑混合，以獲得一1：1稀釋血淋巴樣品。將該1：1稀釋血淋巴樣品平分成兩等份，各為200μl，一份供吞噬比率分析使用，剩餘部份另供後續清除活性試驗使用。取200μl之該1：1稀釋血淋巴樣品置於4℃，並以200μl的0.1%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定30分鐘後，並於4℃下以700 xg進行離心3分鐘，去除上清液後，再將沉澱物重新懸浮於0.4ml生理食鹽水，以獲得一懸浮液。使50μl之該懸浮液分散於一玻片，並將該玻片置於細胞離心機(cytospin centrifuge，Model Cytospin 3，購自Shandon，England)，以113 xg離心3分鐘。待該玻片乾燥後，施以快速染色(BaSO Liu Stain，購自BaSO Diagnostic INC.Taiwan)，並將染色完成之血球細胞置於光學顯微鏡下觀察，計算各該組之血球細胞吞噬比率，其計算方式為吞噬率(phagocytosis rate，簡稱PR)=(吞噬血球細胞數/總血球細胞數)×100，分析結果如第3圖。

請參照第3圖所示，第A4組之吞噬率於第1~6天之吞噬比率皆顯著高於第A1組(第A1與A4組之統計差異分別以b及a表示)。於第3及6天，第A2及A3組相較於第A1組的吞噬率皆有明顯上升趨勢(第A2及A3組與第A1組之統計差異分別以a及b表示)。

本試驗另以如第3表記載之該香蕉皮萃取物劑量透過餵飼方式投予至各組淡水大蝦，每天2次，並分別在餵飼後第2、4、8、16及32天的時間進行與上述相同的採樣方式，得各該組淡水大蝦的血球細胞吞噬率，其分析結果如第4圖。

請參照第4圖所示，第B4組於各時間點，相較於第B1組均有顯著差異(於第2、8、16及32天，第B1與B4組之統計差異分別以b及a表示；於第4天，第B1與B4組之統計差異則以c及a表示)。

(C)清除活性分析

本試驗係依先前文獻(Asian Journal of Food and Agro-Industry 2011；4(01)：31-46)所述，計算清除乳酸鏈球菌效率。清除活性樣品處理方式如下，取50μl各該組經注射方式投予該香蕉皮萃取物之淡水大蝦的1：1稀釋血淋巴樣品塗抹於TSA盤上，並於28℃下培養12小時後計算菌落數，進一步換算出各該組之清除活性，其換算公式為清除乳酸鏈球菌百分比(%)=〔試驗組(CFU)/控制組(CFU)〕×100，分析結果如第5圖。

請參照第5圖所示，第A2~A4組於第3及6天時的清除活性皆明顯高於第A1組(第A2~A4與A1組之統計差異分別以a及b表示)。

本試驗另以如同上述清除活性樣品的處理方式，取50μl各該組經餵飼方式投予該香蕉皮萃取物之淡水大蝦的1：1稀釋血淋巴樣品，進行相同的後續處理，得各該組之清除活性，其分析結果如第6圖。

請參照第6圖所示，第B2~B4組於第2、8、16及32天時的清除活性皆顯著高於第B1組(第B2~B4與B1組之統計差異分別以a及b表示)。

綜合上述試驗結果，本較佳實施例之香蕉皮萃取物對養殖蝦類確實具有提升其免疫反應之效果。

為證實即使養殖蝦類感染乳酸鏈球菌，經投予本較佳實施例之香蕉皮萃取物可有效降低養殖蝦類之死亡率，遂進一步進行攻擊試驗。

(D)攻擊試驗

本試驗係經由注射如第2表所示之該香蕉皮萃取物劑量至各組淡水大蝦6天後，以乳酸鏈球菌懸浮液進行攻擊試驗，菌量為2×10⁵ CFU/shrimp，並觀察感染乳酸鏈球菌後之第12、24、48、72、96及144個小時，各該組淡水大蝦之存活率(如第4表所示)，控制組則未受乳酸鏈球菌感染。

攻擊試驗結果如第4表所示，第A1~A4組之最終存活率分別為30.0±0.0%、50.0±5.8%、56.7±6.7%及63.3±3.3%，其中以第A4組最終存活率為最高，且特別係於第72小時後，第A2~A4組存活率皆顯著地高於第A1組。

本試驗另將如第3表所示之該香蕉皮萃取物劑量以餵飼方式投予至各組淡水大蝦32天後，以乳酸鏈球菌懸浮液進行攻擊試驗，菌量為2×10⁵ CFU/shrimp，並觀察感染乳酸鏈球菌後之第12、24、48、72、96 及144個小時，各該組淡水大蝦之存活率(如第5表所示)，控制組則未受乳酸鏈球菌感染。

攻擊試驗結果如第5表所示，第B1~B4組之最終存活率分別為16.7±0.0%、50.0±5.8%、56.7±6.7%及66.67±3.3%，其中以第B4組最終存活率為最高，且同樣地於第72小時後，第B2~B4組存活率皆顯著地 高於第B1組。

因此，上述試驗結果顯示本較佳實施例之香蕉皮萃取物有助於養殖蝦類免疫力的提升，是以增強其對抗乳酸鏈球菌攻擊之能力。

為證實經給予本較佳實施例之香蕉皮萃取物的養殖蝦類，於低溫環境下有較佳的生存能力，遂進一步進行低溫緊迫試驗。

(E)低溫緊迫試驗

本試驗係經由注射如第2表所示之該香蕉皮萃取物劑量至各組淡水大蝦6天後，將各該組淡水大蝦移至14℃之低溫環境，並觀察紀錄第12、24、48、72、96小時，各該組淡水大蝦之存活率(如第6表所示)，控制組仍飼養於28℃之環境下。

低溫緊迫試驗結果如第6表所示，第A1~A4組之最終存活率分別為0.0±0.0%、3.3±3.3%、30.0±5.8%及46.7±6.7%，其中最終存活率以第A4組為最高，且於第96小時，第A3及A4組之存活率明顯高於第 A1及A2組。

本試驗另將如第3表所示之該香蕉皮萃取物劑量以餵飼方式投予至各組淡水大蝦32天後，將各該組淡水大蝦移至14℃之低溫環境，並觀察紀錄第12、24、48、72、96小時，各該組淡水大蝦之存活率(如第7表所示)，控制組仍飼養於28℃之環境下。

低溫緊迫試驗結果如第7表所示，第B1~B4組之最終存活率分別為13.3±0.0%、56.7±5.8%、63.3±5.8%及63.3±3.3%，其中於第96小時，第B2~B4組之存活率明顯高於第B1組。

根據上述結果顯示，經投予本較佳實施例之香蕉皮萃取物劑量相較於空白對照組能確實提升養殖蝦類免疫力，其中分別係以注射6μg/g及餵飼6g/kg之香蕉皮萃取物劑量為最佳，能幫助養殖蝦類生存於低溫環境，抵抗細菌，是以減少養殖蝦類的死亡率。

綜合上述，本發明之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係透過香蕉皮所富含之活性成分，促進淡水大蝦免疫功能，提高淡水大蝦對疾病及低溫緊迫之抵抗力，是以達到減少抗生素用量之功效。

再者，本發明之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係使丟棄的香蕉皮可回收再被利用，達到減少香蕉皮所造成的垃圾量之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (6)

1. 一種香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，係將該香蕉皮萃取物投予一蝦體，以增強該蝦體之免疫力，其中，該香蕉皮萃取物之製備方法係包含：提供一香蕉皮；將該香蕉皮以重量體積比為1：5~1：10之比例與水混合，並於90℃下進行萃取5分鐘，以獲得一香蕉皮萃取液；及將該香蕉皮萃取液進行濃縮，以獲得該香蕉皮萃取物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該香蕉皮萃取物係注射至該蝦體的頭胸部腹面血竇。
3. 如申請專利範圍第2項所述之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該蝦體係為4~5個月大。
4. 如申請專利範圍第2項所述之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該注射之劑量係為每克之蝦體重注射1~6μg之該香蕉皮萃取物。
5. 如申請專利範圍第1項所述之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該香蕉皮萃取物係與一飼料混合以形成一混合物，並以該混合物餵飼該蝦體每日2次，每天餵飼量為該蝦體重的2~3%。
6. 如申請專利範圍第5項所述之香蕉皮萃取物用於製備提升淡水大蝦免疫力藥物之用途，其中，該混合物係為每公斤飼料加入1~6克之該香蕉皮萃取物。