TWI511736B - Peach Extract and Its Use and Extraction - Google Patents
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Description
本發明係關於一種植物萃取物及其應用,尤指一種由月桃地下莖萃取而得之月桃萃取物具有抗氧化、抗糖化及抗糖尿病之功效。
隨著文明科技之進步,現代的飲食習慣普遍過度精緻化,餐餐高熱量、高油脂及高鹽份的飲食,這種現象對於社會大眾來說已經是稀鬆平常,而各種文明病也跟著群雄病起。因此,慢性疾病的威脅逐漸成為社會關切之焦點,例如高血壓、高血脂、心臟病、糖尿病等。本是老年人專利的慢性疾病,目前也常好發於年輕人身上。根據衛生署統計,糖尿病至今是國人十大死因之第四位,可見糖尿病致命的嚴重性。糖尿病為新陳代謝異常之相關疾病,主要由於胰島素利用率不佳或胰島素分泌不足,所造成的慢性高血糖。許多研究也指出,糖化終產物(advanced glycation end products,AGEs)生成之機制與糖尿病併發症有極大之相關性,糖尿病患者中,當血液在高濃度葡萄糖狀況下,血液中葡萄糖(glucose)之羰基會與含胺基物質(蛋白質、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸)之胺基結合,進行糖化反應,又稱為梅納反應(Maillard reaction),而此反應的最終產物就是
糖化終產物(AGEs)。
薑科(Zingiberaceae
)植物為一種被廣泛利用的香料,使用於多種食物與飲料中作為調味品,亦被作為傳統中藥,其成分已被報導具有諸多生理活性。然而現有技術仍未清楚薑科(Zingiberaceae
)之月桃屬(Alpina
)之月桃(Alpina zerumbet
)是否具有抗糖尿病之生理活性。
鑒於現有技術仍未清楚薑科之月桃屬之月桃(Alpina zerumbet
)是否具有抗糖尿病之生理活性,故本發明之目的在於提供一種月桃萃取物的製備方法,其中月桃萃取物具有抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之功效。
為達上述目的,本發明提供一種月桃(Alpina zerumbet
)萃取物之製備方法,其包括:齊備一月桃地下莖;以一低級醇類溶液萃取該月桃地下莖,以獲得一月桃醇類萃取物;以及,將一低級烷類溶液萃取該月桃醇類萃取物,以獲得一第一月桃粗萃物以及一第一水層萃取物。
依據本發明,「低級醇類」係指具有1個至5個碳原子之醇類,更佳為1個至3個碳原子的醇類,其包括,但不限於甲醇、乙醇、丙醇及異丙醇。
依據本發明,「低級烷類」係指一飽和直鏈或含支鏈的單價烴基,具有1個至10個碳原子,其中烷基可是選擇性的經一個或多個選自下述的取代基彼
此互不相關地取代的。烷基包括,但不限於甲基、乙基、n-丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二-丁基、第三-丁基、戊基,異戊基、新戊基、第三-戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基、辛基及類似物。
較佳的,所述之方法更包括以一低級醇類溶液萃取該月桃地下莖以獲得一月桃醇類萃取物後,將該月桃醇類萃取物經減壓濃縮,以獲得一經減壓濃縮的月桃醇類萃取物,並將該經減壓濃縮的月桃醇類萃取物低級烷類溶液萃取,以獲得第一月桃粗萃物以及第一水層萃取物。
較佳的,所述之低級醇類溶液係含水之甲醇溶液或乙醇溶液,其中以總體積為基礎,甲醇或乙醇之體積濃度係大於1 v/v%至100 v/v%。
較佳的,所述之低級烷類溶液係含水之正己烷溶液,且水與正己烷之體積比係介於1:1至1:10,且第一月桃粗萃物係月桃正己烷萃取物。
較佳的,所述之方法更包括:以酯類溶液萃取該第一水層萃取物,以獲得一第二月桃粗萃物以及一第二水層萃取物;以及,將該第二月桃粗萃物經減壓濃縮後,再以管柱層析分離純化該第二月桃粗萃物,以獲得月桃萃取物,其月桃萃取物包括查耳酮類化合物或綠原酸,其中查耳酮類化合物係選自於下列者所構成之群組:2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)或4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮(4'-hydroxy-2',6'-dimethoxychalcone)
以及其組合。
較佳的,所述之酯類溶液係含水之乙酸乙酯溶液,且水與乙酸乙酯之體積比係介於1:1至1:10、第二月桃萃取物係月桃乙酸乙酯萃取物。
較佳的,所述之管柱層析包括依序以葡聚糖凝膠色層管柱層析分離該第二月桃萃取物,其中葡聚糖凝膠色層管柱係395×30 mm o.d.,並以濃度範圍為大於0%至100%乙醇當移動相,將沖堤液以試管收集,經高效能液相層析分析滯留時間及純度判斷以獲得月桃區分物F1至F9,再將該月桃區分物F1至F9以液相層析分析逆相碳(reversed-phase column,RP-column)C18玻璃管柱(360×24 mm o.d.),移動相為濃度70%至95%之甲醇溶液,流速為每分鐘0.9毫升(mL/min),依一定體積之甲醇溶液體積以試管進行收集,進一步分離後,再以高效能液相層析分析滯留時間及純度,其中月桃區分物F3-1、F3-2係以逆相碳18分離管柱(150×4.6 mm i.d.)、F8-1係以BioBasic-18管柱(150×2.1 mm i.d.)分析,以獲得月桃萃取物之物質並做結構鑑定。
較佳的,所述之方法更包含將第二水層萃取物歷經減壓濃縮並去除溶劑,以獲得第三月桃粗萃物。
本發明更提供一種如前述之方法所製得之第一月桃粗萃物、第二月桃粗萃物或第三月桃粗萃物用於抗氧化之用途。
依據本發明,「抗氧化」如此處所指係抵抗
氧化作用之過程,其如本發明所例示者,抗氧化可透過總酚類含量(total phenolics content)、類黃酮含量(flavonoids content)、DPPH自由基清除率(DPPH free-radical scavenging activity)、總抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity)及抑制亞麻油酸過氧化能力(inhibition of linoleic acid peroxidation activity)予以測定而得。
依據本發明,「抗糖化」如此處所指係抑制糖(尤其是血糖)或其降解物質之羰基與含胺基物質(蛋白質、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸)之胺基結合而產生變性的現象,其如本發明所例示者,抗糖化可透過丙酮醛(methylglyoxal,MG)清除率以及抑制進階糖化終產物(advanced glycosylation end-products,AGES)之活性予以測定而得。
依據本發明,「抗糖尿病」如本發明所例示者,抗糖尿病可透過藉由地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(Hep G2)於糖尿病模式,並以所述之查耳酮類組合物予以抑制磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)之核糖核苷酸(mRNA)表現及葡萄糖產生量測定而得。
本發明更提供一種如前述之方法所製得之月桃萃取物,其中月桃萃取物包括查耳酮類化合物或綠原酸,其中查耳酮類化合物係選自於下列者所構成之群組:2',4',6'-三甲氧基查耳酮或4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮以及其組合。
本發明更提供一種前述之月桃萃取物用於製備抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之醫藥組合物之用途。
本發明更提供一種用於抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之醫藥品,其包括如前述之月桃萃取物或其藥學上可接受之鹽類以及其藥學上可接受之賦形劑,且該醫藥組合物可之用途。
本發明更提供一種查耳酮類化合物用於製備抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之醫藥品之用途,其中該查耳酮類化合物係具有下列化學式:
其中R1、R2、R3及R1’分別為氫(H)、氫氧基(hydroxyl group)、甲氧基(methoxy group)、C1
至C6
之烷基(alkyl group)、C1
至C6
之烷氧基(alkoxyl group)、C2
至C6
之烯基(alkenyl group)、C2
至C6
之烯氧基(alkenyloxy group)、C2
至C6
之炔基(alkynyl group)、C2
至C6
之炔氧基(alkynyloxy group),胺基(amine group)、單或雙取代胺基(mono-or di-substituted amino group)或環狀C1
至C5
之烷胺基(alkylamino group)。
較佳的,所述之查耳酮類化合物係2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)、4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮(4'-hydroxy-2',6'-dimethoxychalcone)、2,2',4'-三羥基查
耳酮(2,2',4'-trihydroxychalcone)、2,2',5'-三羥基查耳酮(2,2',5'-trihydroxychalcone)或2',3',4'-三羥基查耳酮(2',3',4'-trihydroxychalcone)。
本發明所揭一種月桃萃取物包括查耳酮類化合物及綠原酸,其中查耳酮類化合物係2',4',6'-三甲氧基查耳酮、4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮,該查耳酮類化合物及綠原酸具有抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之功效,因此,可作為用於製造抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之醫藥組成物之有效成份。
圖1是本發明之萃取方法流程圖。
圖2是本發明以不同溶劑所得之萃取物(月桃水層萃取物、月桃正己烷萃取物、月桃乙酸乙酯萃取物)對於DPPH自由基清除率之直條圖。
圖3是本發明以不同溶劑所得之萃取物萃取物(月桃水層萃取物、月桃正己烷萃取物、月桃乙酸乙酯萃取物)抑制亞麻油酸過氧化能力之直條圖。
圖4是本發明之各月桃乙酸乙酯區分物於反應時間為2小時之清除丙酮醛之百分比之直條圖。
圖5A是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之高效能液相層析圖。
圖5B是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F-3-2(AZ-EtOAc F3-2)之高效能液相層析圖。
圖5C是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物
F8-1(AZ-EtOAc F8-1)之高效能液相層析圖。
圖6A是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)於正離子模式之液相層析質譜層析圖。
圖6B是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之液相層析質譜圖。
圖7A是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)於正離子模式之液相層析質譜層析圖。
圖7B是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之液相層析質譜圖。
圖8A是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)於負離子模式之液相層析質譜層析圖。
圖8B是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)之液相層析質譜圖。
圖9A是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之氫一維光譜圖。
圖9B是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之碳一維光譜圖。
圖9C是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之二維化学位移相關譜圖。
圖9D是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之二維相關異核單量子相關圖。
圖9E是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物
F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之異核多鍵相關圖。
圖10A是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之氫一維光譜圖。
圖10B是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之碳一維光譜圖。
圖10C是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之二維化学位移相關譜圖。
圖10D是本發明之實施例3之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之二維相關異核單量子相關圖。
圖10E是本發明之月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之異核多鍵相關圖。
圖11A是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於糖尿病模式之2,2',4'-三羥基基查耳酮及2,2',5'-三羥基查耳酮對於人類肝癌細胞之細胞存活率直條圖。
圖11B是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於糖尿病模式之2',3',4'-三羥基基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮對於人類肝癌細胞之細胞存活率直條圖。
圖12A是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於糖尿病模式之2,2',4'-三羥基查耳酮及2,2',5'-三羥基查耳酮對於磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶核糖核苷酸(mRNA)之表現直條圖。
圖12B是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素
誘發人類肝癌細胞(HepG2)於糖尿病模式之2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮對於磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶核糖核苷酸(mRNA)之表現直條圖。
圖13A是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於糖尿病模式之2,2',4'-三羥基查耳酮及2,2',5'-三羥基查耳酮對於葡萄糖產生量之直條圖。
圖13B是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於糖尿病模式之2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮對於葡萄糖產生量之直條圖。
圖14A是本發明之實施例4之以胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於低胰島素敏感性模式之2,2',4'-三羥基查耳酮及2,2',5'-三羥基查耳酮對於人類肝癌細胞之細胞存活率直條圖。
圖14B是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於低胰島素敏感性模式之2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮對於人類肝癌細胞之細胞存活率直條圖。
圖15A是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於低胰島素敏感性模式之2,2',4'-三羥基查耳酮及2,2',5'-三羥基查耳酮對於葡萄糖產生量之直條圖。
圖15B是本發明之實施例4之以地塞米松或胰島素誘發人類肝癌細胞(HepG2)於低胰島素敏感性模式之
2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三羥基查耳酮對於葡萄糖產生量之直條圖。
本發明將由下列的實施例做為進一步說明,這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者,可以做些許之改良與修飾,但不脫離本發明之範疇。
如圖1所示,本發明所述之月桃(Alpina zerumbet
)萃取物之製備方法,其包括:齊備一月桃地下莖;以95%乙醇(低級醇類溶液)萃取該月桃地下莖,並經減壓濃縮以獲得一月桃乙醇萃取物;將含水之正己烷溶液(低級烷類溶液)且水與正己烷之體積比為1:1之條件萃取該月桃乙醇萃取物,以獲一月桃正己烷萃取物(第一月桃粗萃物)以及一月桃正己烷水層萃取物(第一水層萃取物);將含水之乙酸乙酯溶液(酯類溶液)且水與乙酸乙酯之體積比為1:1之條件萃取該月桃正己烷水層萃取物(第一水層萃取物),以獲一月桃乙酸乙酯萃取物(第二月桃粗萃物)以及一月桃乙酸乙酯水層萃取物(第二水層萃取物);以及,以管柱層析分離純化該月桃乙酸乙酯萃取物(第二月桃粗萃物),以獲得月桃萃取物,其月桃萃取物包括查耳酮類化合物及綠原酸,其中查耳酮類化合物係2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)或4'-羥基
-2',6'-二甲氧基查耳酮(4'-hydroxy-2',6'-dimethoxychalcone)。
本發明所述之具有化學式I(即2',4',6'-三甲氧基查耳酮)或式Ⅱ(4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮)結構之查耳酮類化合物是以前述之方法所製得;方法的詳細說明如下:係以乙醇溶液萃取月桃地下莖,並經減壓濃縮以獲得一月桃乙醇萃取物;再以正己烷水溶液萃取該月桃乙醇萃取物,以獲得一月桃正己烷萃取物以及一月桃正己烷水層萃取物;以及,再將乙酸乙酯水溶液萃取該月桃正己烷水層萃取物以獲得月桃乙酸乙酯萃取物。
該月桃乙酸乙酯萃取物進一步經由葡聚糖凝膠LH-20色層分析(Sephadex LH-20 chromatography)玻璃管柱中(395×30 mm o.d.),並以濃度為95%乙醇當移動相,將沖堤液以試管收集,經高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)之RP-18管柱分析後,依高效能液相層析圖判定為9個月桃乙酸乙酯區分物(AZ-EtOAC F1至F9);將月桃乙酸乙酯區分物F-3(AZ-EtOAc F-3)、月桃乙酸乙酯區分物F-4(AZ-EtOAc F-4)分別進一步以製備型液相層析之逆相碳18分離管柱進行分離(reversed-phase C18 column,360×24 mm o.d.;25-40 μm分子大小),其中移動相為濃度70%之甲醇溶液,流速0.9 mL/min,即可於由月桃乙酸
乙酯區分物F-3(AZ-EtOAc F-3)獲得2',4',6'-三甲氧基查耳酮(即式I)、由月桃乙酸乙酯區分物F-4(AZ-EtOAc F-4)獲得4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮(即式Ⅱ)。
製備例1製備月桃地下莖樣品
清水將新鮮的月桃地下莖洗淨,去除表面附著的沙土,接著利用切碎機切片後置於低溫低濕乾燥機內,溫度設定為38℃,乾燥完成之月桃利用高速粉碎機磨成粉末,真空密封於真空袋中,保存於-18℃冷凍庫備用。
製備例2製備月桃醇類萃取物
秤取由製備例1所製得之月桃地下莖粉末,置入1公升(L)血清瓶中,加入濃度為95%乙醇,於室溫下搖擺震盪進行萃取,萃取時間共48小時並分成5個時間點,分別為第6、12、24、36以及第48小時,並於每個時間點更換乙醇以及進行下個時間點之萃取;將收集的萃取液以濾紙抽氣過濾,以分別獲得濾液;再將收集之濾液於35℃下以減壓濃縮機(rotary vacuum evaporator,型號為N-1100,購自於日本Rikakikai公司)減壓濃縮至乾,以獲得月桃乙醇萃取物。
製備例3製備月桃正己烷萃取物
將200 mL的蒸餾水加入製備例2所獲得之月桃乙醇萃取物,並以超音波震盪機震盪後加入200 mL正己烷以進行分層萃取,以獲得一月桃正己烷水層萃取物;反覆加入200 mL正己烷萃取步驟共3次,而後將正己烷萃取液利用減壓濃縮機濃縮至無溶劑殘
留,以獲得月桃正己烷萃取物;再將所得之正己烷萃取物,倒入50 mL離心管內進行冷凍乾燥並計算其萃取率,以獲得月桃正己烷萃取物粉末,並將該冷凍乾燥的月桃正己烷萃取物粉末儲存在-18℃備用。
製備例4製備月桃乙酸乙酯萃取物
將200 mL乙酸乙酯加入製備例3所得之月桃正己烷水層萃取物以進行分層萃取,再反覆利用200 mL乙酸乙酯萃取步驟3次,而後將收集到的乙酸乙酯萃取液減壓濃縮至無溶劑殘留,再將所得之月桃乙酸乙酯萃取物,倒入50 mL離心管內進行冷凍乾燥並計算其萃取率,以獲得月桃乙酸乙酯萃取物粉末,並將該月桃乙酸乙酯萃取物粉末儲存在-18℃備用。
製備例5製備月桃水層萃取物
將製備例4所得之月桃乙酸乙酯水層萃取物歷經減壓濃縮並去除多餘的有機溶劑及水,再倒入50 mL離心管內進行冷凍乾燥並計算其萃取率,以獲得月桃水層萃取物粉末,並將該月桃水層萃取物粉末儲存在-18℃備用。
如表一所示,其中以正己烷萃取月桃所得之正己烷萃取物之萃取率為5.65%,具有最高萃取率;月桃乙酸乙酯萃取物及月桃水層萃取物之萃取率則分
別為1.76%與2.40%。
製備例6分離月桃乙酸乙酯萃取物
將製備例4所得之0.8 g月桃乙酸乙酯粉末,溶於濃度為95%、3 mL乙醇中,經超音波震盪充分溶解後,以0.45微米(μm)濾膜過濾,以獲得一濾液,並將該濾液緩慢加入於葡聚糖凝膠LH-20色層分析(Sephadex LH-20 chromatography)玻璃管柱中(395×30 mm o.d.),並以濃度為95%乙醇當移動相,將沖堤液以試管收集,經高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)之RP-18玻璃管柱分析後,依高效能液相層析圖之滯留時間及純度判定為9個月桃乙酸乙酯區分物(AZ-EtOAC F1至F9),收集後的沖堤液經減壓濃縮以獲得各區分物粉末,並計算各區分物粉末的回收率。
製備例7純化月桃乙酸乙酯區分物
將200毫克(mg)由製備例6所得之各區分物粉末溶於濃度為80%甲醇溶液中,利用超音波充分震
盪溶解並進行離心,接著將濾液緩慢加入製備型RP-18 HPLC玻璃管柱中(360×24 mm o.d.),移動相為濃度70%之甲醇溶液,流速為每分鐘0.9毫升(mL/min),以試管收集經分離後之樣品並利用高效能液相層析分析,根據高效能液相層析圖以滯留時間及純度判斷試管所收集之化合物,並將所獲得之化合物經減壓濃縮至粉末,儲存在-18℃備用;其中由月桃乙酸乙酯區分物F-3(AZ-EtOAc F-3)經分離可獲得月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)、由月桃乙酸乙酯區分物F-4(AZ-EtOAc F-4)經分離可獲得月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2),以及由月桃乙酸乙酯區分物F-8(AZ-EtOAc F-8)經分離可獲得月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)。
製備例8以高效能液相層析分析各區分物
將製備例7所獲得之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F-3-1)、月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F-3-2)使用的管柱為逆相碳18分離管柱(reversed-phase C18 column,150×4.6 mm i.d.;3 μm分子大小,購自美國Phenomenex公司);月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)使用的管柱為Thermo BioBasic-18 column,150×2.1 mm i.d.;5 μm分子大小(購自美國Thermo公司),移動相(A)為0.15%醋酸水、移動相(B)為LC grade甲醇,流速0.55 mL/min,注射體積10微升(μL),偵測波長280奈米(nm),移動相沖堤梯度如表3所示。
製備例9以液相層析電灑游離串聯質譜(liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS)鑑定各區分物
將製備例8所得月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)、月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)及月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)分別以濃度為99.9%甲醇配製成濃度為每毫升50微克(μg/mL),並利用液相層析電灑游離串聯質譜(liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS)進行分析。以逆相碳18管柱(Thermo BioBasic-18,150×2.1 mm i.d.;5 μm particle size,購自Thermo公司)進行分析,樣品注射量為10 μL。高效能液相層析條件如表3。高效能液相層析電灑游離串聯質譜(HPLC-ESIMS)的分析條件為:鞘氣流速率(sheath gas flow rate):40 arb、輔助氣流速率(aux gas flow rate):20 arb,毛細管溫度(capillary temperature):250℃、毛細管電壓(capillary voltage):36 V(正離子模式)及-37 V(負離子模式)、管透鏡(tube lens):75 V(正離子模式)及-121 V(負離子模式),所使
用的程式軟體為Xcalibur 2.06,分別採用正及負離子模式進行分析。
製備例10以核磁共振光譜儀(nuclear magnetic resonance,NMR)鑑定各區分物
將製備例8所得之月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)及月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)溶於氘代甲醇(CD3
OD溶劑,購自於Sigma公司)、2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)溶於氘代氯仿(CDCl3
溶劑,購自於Sigma公司)中,以核磁共振光譜儀(型號為AVANCE Ⅲ 500 MHz,購自Bruker公司),並收集包括氫(1
H)一維單脈衝及二維化学位移相關譜(chemical shift correlation spectroscopy,COSY)、碳(13
C)一維單脈衝及無畸變極化轉移增強(distortionless enhancement by polarization transfer,DEPT)、以及與1
H-13
C二維相關異核單量子相關(heteronuclear singular quantum correlation,HSQC)及異核多鍵相關(heteronuclear multiple-bond correlation,HMBC)等光譜。
製備例11於誘導糖尿病模式測試之細胞毒性試驗
秤取3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT](購自於美國Sigma公司)粉末溶於無菌之磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered
saline,PBS)使其濃度為每毫升5毫克(mg/ml),再以0.22μm之濾膜過濾,分裝到微量離心管(eppendorf)並儲存於4℃冰箱中備用。
將200 μL人類肝癌細胞株Hep G2以每毫升2×105
細胞數(cells/mL)之細胞密度置於96孔盤中,並將96孔盤置於37℃、5%二氧化碳(CO2
)培養箱中培養。待12小時後,將細胞培養液更換成濃度5微莫耳濃度(μM)、10 μM、25 μM、50 μM、100 μM之2,2',4'-三羥基查耳酮(2,2',4'-trihydroxychalcone)、2,2',5'-三羥基查耳酮(2,2',5'-trihydroxychalcone)、2',3',4'-三羥基查耳酮(2',3',4'-trihydroxychalcone)(以上購自於美國INDOFINE公司)、2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)化合物之樣品、0.1% DMSO或10奈莫耳濃度(nM)胰島素(insulin)(作為對照組),並同時加入地塞米松(dexamethasone)誘導劑(作為誘導組),繼續培養4小時;之後移去上清液,於96孔盤加入200 μL之MTT溶液(5 mg/ml),於培養箱避光反應4小時後,去除上清液並每孔加入200 μL二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)以溶解紫色結晶,搖晃均勻溶解後以酵素免疫分析儀(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)於波長570 nm下測定吸光值。
存活率之計算:cell viability(% of control)=(OD570
sample/OD570
control)×100%
製備例12於低胰島素敏感性模式測試之
細胞毒性試驗
將200 μl人類肝癌細胞Hep G2以2×105
cells/mL置於96孔盤中,置於37℃、5% CO2
培養箱中培養。待12小時後,更換成1 μM胰島素,繼續培養24小時後移去上清液,更換成5 μM、10 μM、25 μM、50 μM之2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮、2',4',6'-三甲氧基查耳酮化合物之樣品,繼續培養4小時後,移除上清液,加入200 μL之MTT溶液(5 mg/ml),於培養箱避光反應4小時,去除上清液後每孔加入200 μL二甲基亞碸以溶解紫色結晶,搖晃均勻溶解後以酵素免疫分析儀於波長570 nm下測定吸光值。
存活率之計算:cell viability(% of control)=(OD570
sample/OD570
control)×100%
實施例1分析月桃正己烷、乙酸乙酯及水層萃取物之總酚、類黃酮含量及抗氧化能力
月桃正己烷、乙酸乙酯及水層萃取物之抗氧化能力分別測定各萃取物之總酚類含量、類黃酮含量、DPPH自由基清除率、總抗氧化能力及抑制亞麻油酸過氧化能力。
就各萃取物之總酚類含量,各取20 μL月桃正己烷、乙酸乙酯及水層萃取物濃度分別為50 ppm、100 ppm、250 ppm、500 ppm及1000 ppm之樣品或濃度為0 ppm、10 ppm、2 5ppm、50 ppm及100 ppm之標準品於96孔盤中,再加入100 μL之福林試劑
(Folin-ciocalteu’s reagent)反應3分鐘,之後再加入80 μL且濃度為7.5 w/v%之碳酸鈉(Na2
CO3
)並混合均勻;放置30分鐘後,以酵素免疫分析儀偵測波長760 nm之吸光值,並以沒食子酸(gallic acid)作為標準曲線,以計算求得樣品之沒食子酸當量含量。
就各萃取物之類黃酮含量,將月桃正己烷、乙酸乙酯及水層萃取物分別溶於甲醇溶液中,且濃度分別為50 ppm、100 ppm、250 ppm、500 ppm及1000 ppm作為樣品,並以檞黃酮(quercetin)作為標準品,且濃度分別為0Vppm、10 ppm、25 ppm、50 ppm、100 ppm與150 ppm,試藥為10 w/v %硝酸鋁[Al(NO3
)3
]、0.1 mL之1 M醋酸鉀(CH3
COOK);實驗流程:將0.5 mL樣品或標準品、1.5 mL去離子水、0.1 mL之10 w/v %硝酸鋁以及0.1 mL之1 M醋酸鉀混合均勻後於室溫下靜置40分鐘,以分光光度計於415 nm測定吸光值,並對照檞黃酮之標準曲線以計算樣品中類黃酮(flavonoids)當量含量。
由表4可得知,月桃正乙酸乙酯萃取物及月桃正己烷萃取物的類黃酮含量較佳,且與月桃水層萃取物相比具有顯著差異。在總酚含量測定結果發現,月
桃正乙酸乙酯萃取物具最高的總酚含量(210.19 mg GAE/g),其次為月桃水層萃取物。
就各萃取物之DPPH自由基清除率,將月桃正己烷、乙酸乙酯及水層萃取物分別溶於甲醇溶液中,且濃度分別為50 ppm、100 ppm、250 ppm、500 ppm及1000 ppm,並以檞黃酮(quercetin)作為標準品,且濃度分別為0 ppm、10 ppm、25 ppm、50 ppm、100 ppm,試藥為含有0.1 mM之1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)之甲醇溶液;實驗流程:取30 μL樣品與150 μL新鮮配製之0.1 mM DPPH混勻靜置50分鐘,再以酵素免疫分析儀於波長517 nm測定吸光值,由公式計算其捕捉DPPH自由基能力。
計算公式:捕捉DPPH自由基能力(%)=[1-(A517
nm,sample/A517
nm,blank)]×100%
如圖2所示,月桃乙酸乙酯萃取物具較顯著之清除率,其中月桃乙酸乙酯萃取物於濃度為100 ppm時,具有高達83%的DPPH自由基清除率,而濃度為250 ppm時,DPPH自由基清除率為90%,並與抗氧化物檞黃酮濃度為100 ppm之DPPH自由基清除率(89%)相當。且於表2可得知,月桃乙酸乙酯萃取物之DPPH自由基清除率隨著酚類化合物含量較多而增加其清除效果;月桃正己烷萃取物及月桃水層萃取物於濃度500 ppm時,DPPH自由基清除率與濃度為100 ppm的檞黃
酮相當;且樣品月桃乙酸乙酯萃取物、月桃正己烷萃取物及月桃水層萃取物於濃度為25 ppm至250 ppm之DPPH自由基清除率皆呈現劑量效應(dose-dependent response)。並經計算後,可分別求出月桃乙酸乙酯萃取物、月桃正己烷萃取物及月桃水層萃取物之50%抑制濃度(inhibitory concentration at 50%,IC50
)分別為59.87 μg/mL、105.15 μg/mL及178.53 μg/mL。
就各萃取物之總抗氧化能力,首先配置7 mM 2,2'-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid),ABTS]及2.54 mM過硫酸鉀(potassium peroxodisulfate,K2
S2
O8
)溶於去離子水中,混合均勻後於室溫下避光反應16小時,使其產生ABTS陽離子自由基(ABTS.+
)。實驗當日以乙醇稀釋ABTS.+
以產生ABTS.+
混合溶液,使其於波長734 nm下吸光值為0.7±0.05。以Trolox作為標準品並以乙醇溶液配製成濃度為0 ppm、1 ppm、2.5 ppm、5 ppm及10 ppm之Trolox乙醇標準溶液;另外將月桃正己烷、乙酸乙酯及水層萃取物分別與乙醇配製成濃度為50 ppm、100 ppm、250 ppm、500 ppm及1000 ppm之樣品。實驗流程:將200 μL ABTS.+
混合溶液分別與2 μL樣品或0 ppm至10 ppm之Trolox乙醇標準溶液,反應7分鐘後以分光光度計於734 nm下測定並進行總抗氧化能力計算,對照Trolox標準曲線,計算樣品的總抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity,TEAC)。
就各萃取物之抑制亞麻油酸過氧化能力,首先將30 μM之氯化鐵(ferric chloride)及200 μM抗壞血酸(L-ascorbic acid)加入於50 mM、pH7.4之Tris緩衝液(Tris buffer)中,以作為促氧化液。將100 mg之亞油酸(linoleic acid)及1g Tween 20,再加入20 mL、50mM之Tris緩衝液(pH 7.4)於冰浴中以超音波震盪混勻形成基質乳化液。取0.1 mL濃度為25 ppm、50 ppm、100 ppm、250 ppm溶於甲醇之樣品於試管中,加入前述0.5 mL促氧化液及0.5 mL基質乳化液,在37℃乾浴中反應5分鐘或30分鐘,反應時間完畢後加入0.01 mL、4%二丁基羥基甲苯終止反應並迅速冷卻,以分別獲得各反應液。分別取0.1 mL反應液與2.4 mL甲醇混勻,並以等量去離子水作為控制組,於234 nm下測其吸光值,並分別與標準品二丁基羥基甲苯(濃度為5 ppm、10 ppm、25 ppm、50 ppm及100 ppm)比較其抑制能力
如圖3所示,月桃水層萃取物及月桃正己烷萃取物分別於濃度為250 ppm及100 ppm時,抑制亞麻油酸過氧化能力皆為50%以上。月桃乙酸乙酯萃取物於濃度為25 ppm至100 ppm之抑制亞麻油酸過氧化能力並無顯著性差異,且抑制亞麻油酸過氧化能力皆高達70%以上,而在濃度為250 ppm時,其抑制亞麻油酸過氧化能力與濃度為100 ppm之二丁基羥基甲苯相當(88%)。
表5不同溶劑萃取月桃萃取物之總抗氧化能力、DPPH自由基清除率及抑制亞麻油酸過氧化能力之IC50
比較
由表5可得知,各樣品抑制亞麻油酸過氧化能力之結果與DPPH自由基清除率之結果相似,其中月桃乙酸乙酯萃取物抑制亞麻油酸過氧化能力效果最佳(13.51 μg/mL),其次為月桃正己烷萃取物(104.69 μg/mL),效果較差者為月桃水層萃取物(240.73 μg/mL)。
比較表4及表5可得知,月桃正乙酸乙酯萃取物不僅具有高抗氧化能力,亦含有較高的類黃酮及酚類物質,因此可推測月桃正乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力以及在類黃酮與酚類物質之含量上,具有極大的相關性。
實施例2測量月桃乙酸乙酯區分物之抗糖化活性
月桃乙酸乙酯區分物之抗糖化活性分別可由丙酮醛清除率以及抑制進階糖化終產物之活性進行測量。
就測量丙酮醛之清除率而言,丙酮醛為一種高活性、易揮發且易與其他物質反應的小分子化合物,在紫外光/可見光波長下無吸收光值,無法以一般高效能液相層析儀偵測。但鄰苯二胺(o
-phenylenediamine,o
-PDA)與丙酮醛進行縮合反應而形成衍生物2-甲基喹喔啉(2-methylquinoxaline,2-MG)
為穩定的化合物,可以於313 nm下利用高效能液相層析進行分析,因此以相似結構的5-甲基喹喔啉(5-methylquinoxaline,5-MQ)作為內標準品進行2-甲基喹喔啉之定量。
首先配製濃度為200 ppm磷酸鉀緩衝溶液(pH 7.4含0.06% NaN3
)、將由製備6所製得之月桃乙酸乙酯區分物分別配製成濃度為300 ppm之樣品以及濃度為0.5 mM的丙酮醛;分別取4 mL樣品(控制組為4 mL 200 ppm磷酸鉀緩衝溶液)並與1 mL丙酮醛混合,於37℃下水浴並以60 rpm震盪反應0小時或2小時(0小時作為對照組),以獲得一混合溶液,儲存於-20℃備用。接著進行下列反應:
(1)o
-PDA衍生化反應
取250 μL、0.15 mM鄰苯二胺分別與前述兩時間點(0小時或2小時)之250 μL反應溶液混合,並於37℃下水浴15分鐘進行衍生化反應(使丙酮醛衍生為2-甲基喹喔啉)以分別獲得衍生化反應溶液,空白組為磷酸緩衝溶液。
(2)高效能液相層析-紫外光(HPLC-UV)分析
分別取等量的衍生化反應溶液於微量離心管並離心3分鐘,取上清進行高效能液相層析分析,所使用的管柱為逆相C18分離管柱(Luna C18 column,150×4.6 mm i.d.;3 μm),移動相(A)為100%乙腈(acetonitrile)、移動相(B)為0.5%醋酸水溶液,流速0.8
mL/min,注射體積10 μL,偵測波長313 nm,移動相沖堤梯度如表6,並依據高效能液相層析圖之面積計算丙酮醛清除百分比。
計算公式:{1-[Sample(2-MQ/5-MQ)2hr
/Blank(2-MQ/5-MQ)0hr
]}×100%
如表7及圖4所示,樣品月桃乙酸乙酯區分物F-3(AZ-EtOAc F-3)清除糖化反應中期產物丙酮醛之能力最佳,其清除率為75.80%,其次為月桃乙酸乙酯區分物F-4(AZ-EtOAc F-4)、月桃乙酸乙酯區分物F-7(AZ-EtOAc F-7)、月桃乙酸乙酯區分物F-8(AZ-EtOAc F-8)及月桃乙酸乙酯區分物F-9(AZ-EtOAc F-9)效果較
佳,丙酮醛清除率皆超過50%,推測可能是由於其酚類化合物含量較高所造成較高之丙酮醛清除率。
就抑制進階糖化終產物之活性而言,首先以200 mM、pH 7.4磷酸鉀緩衝溶液配製濃度60 mg/mL牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)及1.5 M果糖(D-fructose),並將由製備6所製得之各月桃乙酸乙酯區分物分別溶於甲醇後,再將該等溶於甲醇之0.2 mL樣品、0.2 mL牛血清蛋白及0.2 mL果糖混合,以分別形成各混合液;再將該等混合液並於螢光測定儀之激發光為360 nm、散射光為460 nm測定其螢光強度(將所測得之數值設定為原點),再將該等混合液置於50℃下反應24小時後,再以與前述相同波長之激發光(360 nm)、散射光(460 nm)測定螢光強度(將所測得之數值設定為終點),並以甲醇作為控制組、3 mM甲脒肼(aminoguanidine,AG)作為正對照組。
計算公式:抑制率(%)=〔(控制組吸光值差值-樣品組吸光值差值)/控制組吸光值差值〕×100%
月桃乙酸乙酯區分物之濃度範圍為250 ppm至3000 ppm;由表8可得知,月桃乙酸乙酯區分物F-8(AZ-EtOAc F-8)抑制糖化終產物之IC50
為200.1 μg/mL,其抑制效果與甲脒肼之IC50
206.34 μg/mL相當,因此月桃乙酸乙酯區分物F-8(AZ-EtOAc F-8)抑制進階糖化終產物之活性為最佳,其次為月桃乙酸乙酯區分物F-7(AZ-EtOAc F-7)以及月桃乙酸乙酯區分物F-9(AZ-EtOAc F-9)。推測抗糖化能力可能主要來自於區分物中的多酚類化合物,尤其是類黃酮類物質。
實施例3分離純化並鑑定月桃乙酸乙酯區分物
將實施例2所述之具有較佳丙酮醛清除率之月桃乙酸乙酯區分物F-3(AZ-EtOAc F-3)、月桃乙酸乙酯區分物F-4(AZ-EtOAc F-4)及具有較佳抑制糖化終產物活性之月桃乙酸乙酯區分物F-8(AZ-EtOAc F-8)以製備例8所述之方法進行分離,以獲得月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)、月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)及月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)。
如圖5A至圖5C所示,月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)於UV-280 nm之高效能液相層析圖之滯留時間為22.27分鐘、月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)於UV-280 nm之高效能液相層析圖滯留時間為20.17分鐘,而月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)之滯留時間為0.98分鐘。
經製備例9所述之方法以液相層析質譜儀分析月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)、月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)及月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)。如圖6A至圖6B所示,月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之[M+H]+
為299.14 m/z及[2M+Na]+
為618.76 m/z;如圖7A至圖7B所示,月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之[M+H]+
為285.24 m/z及[2M+Na]+
為591.01 m/z;如圖8A至圖8B所示,月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)之[M-H]-
為352.97m/z及[2M-H]-
為706.79 m/z,綜合上述結果,可得知月桃乙酸乙酯分離物F3-1、F3-2、F8-1為單一的化合物。
經由比對以綠原酸(chlorogenic acid)作為標準品之液相層析圖及圖譜([M-H]-
為352.94 m/z及[2M-H]-
為706.74 m/z)可得知月桃乙酸乙酯分離物F8-1(AZ-EtOAc F8-1)為綠原酸,其分子式為C16
H18
O9
(式Ⅲ),分子量為354.31,外觀為白色或淡黃色。
以製備例10所述之方法以核磁共振光譜儀分析月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)。如圖
9A至圖9E所示,可利用以上圖譜確定氫的位置、氫與氫之位置對應關係及確定其碳數,再推知碳氫異核單量子相關及碳氫異核多量子相關,如表9所示,以推測出每個氫所對應的碳與周圍的關係,藉由這些圖譜推測月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之分子構型為2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)化合物,其分子式為C18
H18
O4
(式I),分子量298.34,化學名為(E)-3-phenyl-1-(2,4,6-trimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one,外觀為淡黃色。
s
係為單峰(singlet);d
係為二重峰
(doublet);m
係為多重峰(multiplet)。
以製備例10所述之方法以核磁共振光譜儀分析月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)。如圖10A至圖10E所示,可利用以上圖譜確定氫的位置、氫與氫之位置對應關係及確定其碳數,再推知碳氫異核單量子相關及碳氫異核多量子相關,如表10所示,以推測出每個氫所對應的碳與周圍的關係。
s
係為單峰(singlet);d
係為二重峰(doublet);m
係為多重峰(multiplet)。
對照月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)的核磁共振光譜圖(圖9A、圖9B)可發現月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)與月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)極為相似,主要不同處在於月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之4"C上所接的為-OH,而月桃乙酸乙酯分離物F3-1 AZ-EtOAc F3-1
之4"C上所接的為-OCH3
,推測出此兩化合物結構之分子量應相差14,並可藉由圖6B及圖7B證實其分子量確實相差14,但由圖9B與圖10B之可得知月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)之空間相異碳數為13,而月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之空間相異碳數應為12,但在月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)之碳一維光譜發現空間相異碳數為11,並在圖9B之130 ppm位置出現4個波峰(peak),分別為4'(131.77 ppm)、3'5'(130.20 ppm)、2(130.05 ppm)、2'6'(129.62 ppm),而在圖10B之130 ppm位置只出現3個波峰,且發現其高度有異,因此對其3個波峰進行積分,發現在3'5'的積分值為3.09應有3個碳,故證實圖10B中確實具有12個碳,其中3個波峰所代表的分別為4'(131.70 ppm)、2 3'5'(130.20 ppm)、2'6'(129.60 ppm),因此推測出月桃乙酸乙酯分離物F3-2(AZ-EtOAc F3-2)分子構型為4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮(4'-hydroxy-2',6'-dimethoxychalcone)化合物,其分子式為C17
H16
O4
(式Ⅱ),分子量284,化學名為(E)-1-(4-hydroxy-2,6-dimethoxyphenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one,外觀為淡黃色。
實施例4評估查耳酮類化合物用於抗糖尿病
經由實施例3證實月桃乙酸乙酯分離物F3-1(AZ-EtOAc F3-1)為2',4',6'-三甲氧基查耳酮,並挑選其結構相似的查耳酮(chalcone)類化合物:2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮及2',3',4'-三羥基查耳酮分別藉由地塞米松(Dex-CA)或胰島素誘發人類肝癌細胞(Hep G2)於糖尿病模式以評估查耳酮類化合物用於抗糖尿病之活性。
依據製備例11所述之方法,由圖11A至圖11B可得知與誘導組相比,2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮,皆不會造成人類肝癌細胞Hep G2死亡,其存活率皆高於99%。
由於磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)是調控糖質新生(glyconeogenesis)及甘油新生(glycerogenesis)的重要酵素,因此可藉由2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮抑制磷酸烯醇丙酮酸羧化
激酶核糖核苷酸(mRNA)表現之效果評估2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮抗糖尿病之活性。
如圖12A至圖12B所示,誘導劑地塞米松可成功誘導PEPCK1核糖核苷酸(mRNA)表現,且與控制組相比,上升了約70%;胰島素亦可顯著降低PEPCK1 mRNA之表現(約65%);2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮亦顯著降低PEPCK1 mRNA表現並具有劑量效應(dose-dependent response),且在所有樣品濃度為50 μM及100 μM時抑制PEPCK1 mRNA表現之效果與胰島素抑制PEPCK1 mRNA表現之效果相當。且各樣品與誘導組相比,可抑制超過50%之PEPCK1 mRNA表現,其中2',4',6'-三甲氧基查耳酮在濃度為5 μM至100 μM時可抑制PEPCK1 mRNA表現量之效果為34%至74%。
由於糖尿病患者因糖質新生速度的改變會增加肝臟葡萄糖輸出(hepatic glucose output,HGO),因此糖尿病患者會維持在高血糖(hyperglycemia)狀態。如圖13A至圖13B所示,誘導組與控制組相比,誘導組之葡萄糖產生量明顯的上升約70%;反觀胰島素之正對照組,其葡萄糖產生量明顯的下降了約70%而與控制組相當。2,2',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮濃度為50 μM及100 μM以及2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮濃度為25 μM至100 μM時,
皆可以顯著降低50%葡萄糖之產生量,且在所有樣品濃度為100 μM時,與胰島素之正對照組的處理組具有相似之效果。2',4',6'-三甲氧基查耳酮在濃度分別為5 μM、10 μM、25 μM、50 μM時,抑制葡萄糖產生量之效果為16%至71%並具有明顯的劑量效應,且可證實2',4',6'-三甲氧基查耳酮降低葡萄糖產生量主要係藉由促進細胞周邊葡萄糖的攝取、利用和抑制肝臟糖質新生所達到。
依據製備例12所述之方法,由圖14A至圖14B可得知與誘導組相比,2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮,皆不會造成人類肝癌細胞Hep G2死亡,其存活率皆高於99%。
由於高濃度胰島素誘導人類肝癌細胞Hep G2於胰島素敏感性下降時,會使葡萄糖利用率降低,而產生高血糖及葡萄糖耐受性不良之現象,因此可藉由2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三甲氧基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮於低胰島素敏感性模式下抑制葡萄糖產生量以評估2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮抗糖尿病之活性。
如圖15A至圖15B所示,2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮、2',3',4'-三羥基查耳酮及2',4',6'-三甲氧基查耳酮皆可以顯著降低50%以上的葡萄糖產生量,且2',4',6'-三甲氧基查耳酮濃度為50 μM
時可觀察到葡萄糖產生量下降到與控制組相當,並具劑量效應。並且發現樣品濃度於50 μM時,2',4',6'-三甲氧基查耳酮與2,2',4'-三羥基查耳酮、2,2',5'-三羥基查耳酮具有顯著性差異,顯示出2',4',6'-三甲氧基查耳酮具有最佳降低葡萄糖產生量之能力。實驗結果表示所添加的樣品可以增加細胞對葡萄糖之利用。文獻指出,如果能有效的控制血糖之恆定,將可以緩解糖尿病併發症的症狀,或預防併發症的發生。
Claims (11)
- 一種月桃(Alpina zerumbet )萃取物之製備方法,其包括:齊備一月桃地下莖;以一低級醇類溶液萃取該月桃地下莖,並經濃縮以獲得一月桃醇類萃取物;將一低級烷類溶液萃取該月桃醇類萃取物,以獲得一第一月桃粗萃物以及一第一水層萃取物;以及以酯類溶液萃取該第一水層萃取物,以獲得一第二月桃粗萃物以及一第二水層萃取物;其中酯類溶液係含水之乙酸乙酯溶液,且水與乙酸乙酯之體積比係介於1:1至1:10,且第二月桃粗萃物係月桃乙酸乙酯萃取物。
- 如請求項1所述之方法,其中該低級醇類溶液係含水之甲醇溶液或乙醇溶液,其中以總體積為基礎,甲醇或乙醇之體積濃度係大於1v/v%至100v/v%。
- 如請求項2所述之方法,其中低級醇類溶液之低級醇濃度係介於75v/v%至95v/v%之間。
- 如請求項3所述之方法,其中低級烷類溶液係含水之正己烷溶液,且水與正己烷之體積比係介於1:1至1:10,且第一月桃粗萃物係月桃正己烷萃取物。
- 如請求項1至4任一項所述之方法,其更包含:以管柱層析分離純化該第二月桃粗萃物,以獲得月桃萃取物,其月桃萃取物包括查耳酮類化合物及綠原酸,其中查耳酮類化合物係選自於下列者所構成之群組:2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)、4'-羥基-2',6'- 二甲氧基查耳酮(4'-hydroxy-2',6'-dimethoxychalcone)以及其組合。
- 如請求項5所述之方法,其更包含將第二水層萃取物歷經濃縮並去除溶劑,以獲得第三月桃粗萃物。
- 一種如請求項1、5、6任一項所述之方法所製得之第二月桃粗萃物或第三月桃粗萃物用於製備抗氧化之醫藥組合物之用途。
- 一種如請求項5或6所述之方法所製得之月桃萃取物,其中月桃萃取物包括查耳酮類化合物及綠原酸,其中查耳酮類化合物係2',4',6'-三甲氧基查耳酮或4'-羥基-2',6'-二甲氧基查耳酮。
- 一種如請求項8所述之月桃萃取物用於製備抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之醫藥品之用途。
- 一種用於抗氧化、抗糖化或抗糖尿病之醫藥品,其包括如請求項8所述之月桃萃取物或其藥學上可接受之鹽類以及其藥學上可接受之賦形劑。
- 一種如請求項5或6所述之方法所製得之查耳酮類化合物用於製備抗糖化或抗糖尿病之醫藥品之用途,;其中查耳酮類化合物係2',4',6'-三甲氧基查耳酮(2',4',6'-trimethoxychalcone)或2',3',4'-三羥基查耳酮(2',3',4'-trihydroxychalcone)。
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CA2507738A1 (en) * | 2004-06-10 | 2005-12-10 | Abgenomics Corporation | Modulation of peroxisome proliferator-activated receptors |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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Jamnian Chompoo et al., Advanced glycation end products inhibitors from Alpinia zerumbet rhizomes. Food Chemistry, 2011, 129(3), 709-175 * |
蘇柏榕,山月桃之抗癌活性研究,台北醫學大學 生藥學研究所,2007年碩士論文 * |
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