TWI510628B - 以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種快篩毒物之方法，特別是一種利用乳酸菌作為廢棄物毒性檢測菌種以快篩毒物之方法。
近年來，隨著廢棄物處理法規日漸嚴格，廢棄物所含生物毒性之檢測也隨之成為矚目焦點，以期望透過準確的檢測方式大幅降低生物毒性對人體造成之傷害。
習用生物毒性的檢測方法，多是利用生物活體[例如：鯉魚、米蝦或水蚤等]來檢測水樣或底泥等廢棄物之生物毒性。惟，因廢棄物中的污染物種類相當複雜，且魚類對於廢棄物中所含重金屬之毒害較不敏感，故不易於短時間內完全獲知底泥及水質可能含有之生物毒性。此外，利用生物活體檢測之過程不僅耗時且操作繁雜，更因此衍生生物活體購置或飼養等費用的支出，甚至還存在再現性不高等種種缺點。
據此，多方研究係逐漸利用細菌性生物取代以往之生物活體，從而透過細菌對生物毒性的高敏感度，作為檢測廢棄物生物毒性之測試對象，以成為早期生物毒性預警之依據。如中華民國公開第200927933號專利案，其係揭示一種金屬離子生物毒性分析之方法，利用菌體麵包酵母菌為指標微生物，以將一酵母菌進行培養並保持其活性；且製備一欲檢測生物毒性金屬之水溶液；將該酵母菌注入一配置有該欲檢測生物毒性金屬水溶液之培養皿中持續培養，藉以測得該欲檢測金屬之生物毒性相關數據，並透過劑量反應分析，獲知金屬離子之生物毒性。
然而，一般固體廢棄物多需經酸性液作用，使其酸鹼值達pH<4〔較佳是pH<3〕之後，方可溶出其中所含之重金屬，以致廢棄物生物毒性的檢測過程往往是處於酸性環境之下。但是，習知專利案所用之酵母菌對於酸的耐受性不佳，其酸鹼耐受性僅約略為pH=4~6.0左右，以致酵母菌無法直接適用於pH<3之酸性環境之下，故習知專利案若沒有經特殊處理程序，則貿然採用酵母菌作為檢測廢棄物生物毒性之指標微生物時，係往往容易使酵母菌在適用於酸性檢測環境之下即刻造成死亡，而終究無法以酵母菌的菌數變化檢測得廢棄物之重金屬含量；甚至，習知專利案所用之酵母菌多仰賴固態培養機制，而必須在長達48小時之後，方可測得酵母菌之生菌數作為判斷生物毒性之依據，以致習知用以檢測廢棄物生物毒性之過程過於冗長且不具時效性。
有鑑於此，確實有必要發展一種快篩廢棄物生物毒性之方法，以透過指標菌種對毒物的高敏感度及對檢測環境的耐受度，從而解決如上所述之各種問題。
本發明主要目的乃改善上述缺點，以提供一種以乳酸菌快篩廢棄物生物毒性之方法，其係能夠適用於酸性環境之下，以準確檢測得自廢棄物溶出之重金屬含量。
本發明次一目的係提供一種以乳酸菌快篩廢棄物生
物毒性之方法，係能夠於短時間內完成重金屬含量之檢測判定，以提升檢測廢棄物生物毒性之時效性。
為達到前述發明目的，本發明之以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，該酸性廢棄液是為pH>9之灰渣經酸化處理所產生，且該灰渣於酸化處理之前係與水混合，並調整灰渣及水之體積比為1：8，以使該灰渣中的兩性離子溶出，並於過濾後，再以酸性液調整該含有兩性離子之溶出液至pH<2，該以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，係包含：一培養步驟，將一乳酸菌培養於一培養液中，以製備成一乳酸菌液，取10ml之酸性廢棄液添加於10ml之培養液中，並在其中添加0.5ml之乳酸菌液，維持該乳酸菌菌數為108
以上，以成一待檢測液；及一檢測步驟，持續培養該乳酸菌液及待檢測液，且於持續培養過程中，分別計數並比較該乳酸菌液及待檢測液之生長菌數，以由該待檢測液之生長菌數相對該乳酸菌液之生長菌數的減少趨勢作為生物毒性快篩之依據。
其中，該乳酸菌係培養於MRS培養液中，並維持該乳酸菌之菌數為108
以上。且，於該檢測步驟中，該乳酸菌液及待檢測液係持續培養0~7小時，並以混濁度計數法測得該乳酸菌液及待檢測液於每小時之濁度變化，以各繪製成一對應乳酸菌生長之濁度曲線，並予以比較。
其中，該酸性廢棄液是為pH>9之灰渣經酸化處理所產生，且該灰渣於酸化處理之前係與水混合，並調整灰渣及水之體積比為1：8，以使該灰渣中的兩性離子溶出，並於過濾後，再以酸性液調整該含有兩性離子之溶出液至pH
<2。或者，該酸性廢棄液是為垃圾焚化處理後之固化物經重新酸處理，以溶出固化物中所含重金屬之溶出液。再者，該酸性廢棄液是為農、林、漁、牧或工業運作所排放之廢水，經酸性液調整為pH<3之水溶液。
此外，於該檢測步驟中計數乳酸菌生長菌數之方式是為細胞直接計數法、吸光度計數法、活細胞計數法、電子細胞計數法或細胞導電度偵測法。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本文所述之「廢棄物」是泛指所有農、林、漁、牧或工業運作所排放之廢水，以及垃圾焚化且經處理後之固化物〔例如：飛灰、底渣〕等等，特於此表明。
承上述，於下述文中是以〝酸性廢棄液〞代表前述之廢棄物經酸化處理且溶出欲檢測之重金屬者。例如：一般垃圾焚化處理後之固化物或農、林、漁、牧或工業運作所排放之廢水，皆可利用如硝酸、鹽酸等酸性液進行酸化。藉此，係可溶出該固化物中所含之重金屬；或者，直接調整廢水至pH<3而轉變為酸性廢水。
上述揭示之廢棄物酸化過程乃為熟習該技藝之人士所能理解，且為一般廢棄物的基本處理流程，並非本案之技術特徵所在，故不再詳述亦不需限制。
請參照第1圖所示，其係為本發明一較佳實施例，該
以乳酸菌快篩廢棄物生物毒性之方法係包含一培養步驟S1及一檢測步驟S2，藉此用以檢測廢棄物經處理後之酸性廢棄液中所含重金屬。
該培養步驟S1係將一乳酸菌培養於一培養液中，以製備成一乳酸菌液，並將該乳酸菌液添加於一酸性廢棄液中，且在混合有該乳酸菌液之酸性廢棄液中再另添加該培養液，並調整該酸性廢棄液、培養液及乳酸菌液之體積比為1：1：0.05，以成一待檢測液。其中，該培養液可以是任意供乳酸菌生長之成份，本實施例特別係將乳酸菌培養於MRS培養基〔此乃菌種培養的基本成份，不再贅述〕，並維持該乳酸菌菌數為108
以上為佳，藉以穩定乳酸菌之生長情形，並以足夠的乳酸菌量作後續檢測。
舉例而言，本實施例係選擇將垃圾焚化處理後之固化物重新進行酸處理，以溶出固化物中所含之重金屬，此富含重金屬之溶出液即為該酸性廢棄液；續之，以該酸性廢棄液、培養液及乳酸菌的添加體積比為1：1：0.05之原則，取約10ml之酸性廢棄液添加於10ml之培養液中，並在其中另添加0.5ml之乳酸菌液，持續培養0~7小時後，遂可於後續之檢測步驟S2中得知乳酸菌生長情況。
請續參照第1圖所示，該檢測步驟S2係持續培養該乳酸菌液及待檢測液，且於持續培養過程中，分別計數並比較該乳酸菌液及待檢測液之生長菌數，以由該待檢測液之生長菌數相對該乳酸菌液之生長菌數的減少趨勢作為生物毒性快篩之依據。其中，用以獲知乳酸菌生長菌數之方式可以是為細胞直接計數法〔如血球計數法〕、吸光度計
數法〔如混濁度計數法〕、活細胞計數法〔如直接計數法、菌落計數法〕、電子細胞計數法或細胞導電度偵測法等等。
舉例而言，經該培養步驟S1持續培養0~7小時後，係可透過混濁度計數法測得該乳酸菌液及待檢測液於每小時之濁度變化，以各繪製成一濁度曲線〔即代表乳酸菌的生長曲線〕，從而得知乳酸菌於正常情況，以及受該酸性廢棄液所含重金屬作用後之生長全菌數，並藉該乳酸菌液及待檢測液的二者濁度曲線相互比較，以完成快篩廢棄物生物毒性之檢測作業。承上所述，本實施例所述之混濁度計數法乃利用吸光度的變化所測得，亦可搭配一般簡易水中濁度偵測計，此乃熟習該技藝之人士可理解，容不在此詳述其濁度偵測計之檢測原理。
如此一來，當乳酸菌受該酸性廢棄液中所含重金屬作用之下，係容易造成乳酸菌代謝被抑制，從而產生乳酸菌生長遲緩甚至出現死亡等情形；又因乳酸菌對不同種類之重金屬皆具有不同耐受性，且對多數重金屬亦具有毒性抑制效應，以致乳酸菌的生長菌數是可作為判斷重金屬量及其種類之標準，更以此成為快篩生物毒性之依據。
此外，若欲處理之廢棄物是為如垃圾焚化產出之飛灰、底渣等pH>9之鹼性廢棄物時，較佳係先將體積比為1：8之灰渣及水混合，以靜置待灰渣中的兩性離子溶出，並經過濾後，再如前所述以硝酸或鹽酸等酸性液進行酸化，以將該含有兩性離子之溶出液調整至pH<2，以便於以本發明之方法快篩灰渣的生物毒性。
詳言之，由於透過強酸或強鹼之作用，方可溶出灰渣內所含之鉛、鋅等兩性離子，並使其中之氫氧化物相對沉澱；且，為了配合乳酸菌之耐酸特性，遂於過濾後，再以硝酸調整溶出液至pH<2，以使原本在pH=5之作用環境產生沉澱之鉛、鋅、銅再次溶出，以獲得欲檢測之酸性廢棄液。於此，便可接續該培養步驟S1及檢測步驟S2，以經上述流程檢測灰渣中所含重金屬量及其種類。
為了證明本發明之乳酸菌確實可作為廢棄物生物毒性之指標性微生物，並探討乳酸菌對不同種類重金屬之耐受情形，係進行如下所述之實驗。
其中，本實施例係以南部某焚化廠中的底渣和飛灰經上述處理並酸化後獲得之水液為檢測水樣，以下稱之〝酸性廢棄液A〔底渣溶出之水液〕〞及〝酸性廢棄液B〔飛灰溶出之水液〕〞。首先，係先利用感應耦合電漿原子發散光譜儀〔ICP〕及火焰原子吸收光譜儀〔AA〕檢測該酸性廢棄液A、B中的重金屬含量，以確保重金屬充分溶出，其重金屬含量分佈係詳如表1所示。
接著，係將該酸性廢棄液A、B分別添加於一培養液中，並在分別混合有該酸性廢棄液A或B之培養液中再添加乳酸菌，以於0~7小時內觀察其濁度變化，且以該培養液純培養之乳酸菌作為對照組〔如圖面所示之MRS〕，詳如第2a及2b圖所示。由結果可知，分別添加有該酸性廢棄液A或B之乳酸菌濁度皆比該培養液純培養之乳酸菌濁度來的低，且其曲線還呈現持平狀態，即是代表乳酸菌受到重金屬之作用時，便會在極短的時間內產生生物毒性抑制效應，迫使乳酸菌無法持續生長而受到明顯抑制。
承上所述，在同樣條件之下，以血球計數法計算其中乳酸菌的生長菌數，以印證濁度與菌數之間的關係。詳如第3a及3b圖所示，皆係證明乳酸菌的菌數量與濁度之間是具有相當的對數關係，故檢測培養後的液體濁度係可以相對得知乳酸菌的生長情形，並以此作為快篩廢棄物生物毒性之有效依據。
除此之外，更進一步探討乳酸菌對不同種類重金屬之耐受情形，並以濃度分別為10~100ppm之金屬溶液進行標準測試，藉此作為後續判定廢棄物生物毒性是否符合法規標準之依據，詳如第4至6圖所示。其中，第4至6圖所示之橫座標是為時間〔小時〕；縱座標是為濁度〔NTU〕。
請參閱第4圖所示，其係將乳酸菌分別培養於銅含量為10~100ppm之水溶液當中，以觀察0~7小時內之乳酸菌生長情形，並透過濁度偵測計紀錄每小時之溶液濁度值，且以該培養基純培養之乳酸菌作為對照組〔如圖面所示之MRS〕。由結果可知，當乳酸菌未受銅作用之下，其濁度值變化亦隨時間逐漸上升，即代表乳酸菌的生長情形良好；反之，當乳酸菌受銅作用濃度提升至30ppm以上時，其所測得之濁度值明顯降低，甚至在銅濃度達40ppm時，測得之濁度曲線還呈現持平狀態，即是代表乳酸菌在銅作用下明顯產生生長遲緩、抑制甚至死亡等現象。
換句話說，由此係可得知乳酸菌對銅的耐受度僅維持在銅濃度30ppm以下，故當測得之濁度曲線明顯低於對照組，甚至出現濁度曲線持平狀態時，則代表該酸性廢棄液中的銅含量大於40ppm以上，即說明該酸性廢棄液中的銅
含量遠高於法規標準之15ppm，而需重新再處理，以至測得之濁度曲線相近似於對照組方可。
請參閱第5及6圖所示，其係將乳酸菌分別培養於鉛含量為10~100ppm之水溶液，以及鋅含量為10~100ppm之水溶液當中，以觀察0~7小時內之乳酸菌生長情形，並透過濁度偵測計紀錄每小時之溶液濁度值，且以該培養基純培養之乳酸菌作為對照組〔如圖面所示之MRS〕。由結果可知，乳酸菌對鋅的耐受度明顯高於鉛，證實乳酸菌並不會受鋅作用而產生抑制效應〔如第6圖所示〕，即代表鋅對人體的傷害明顯較微弱，故現今環保法規亦不再對鋅含量加以管制。經此，本發明透過乳酸菌對鉛與鋅具有之較佳選擇性，便能判定影響乳酸菌生長之金屬不會為鋅。
請再參閱第5圖所示，當乳酸菌受鉛作用濃度提升至70ppm以上時，其所測得之濁度值明顯降低，甚至隨鉛濃度逐漸提升至100ppm時，所測得之濁度曲線還呈現持平狀態，即是代表乳酸菌在鉛作用下明顯產生生長遲緩、抑制甚至死亡等現象。換句話說，由此係可得知乳酸菌對鉛的耐受度僅維持在鉛濃度70ppm以下，故當測得之濁度曲線明顯低於對照組，甚至出現濁度曲線持平狀態時，則代表該酸性廢棄液中的鉛含量大於70ppm以上，即說明該酸性廢棄液中的鉛含量遠高於法規標準之5ppm，而需重新再處理，以至測得之濁度曲線相近似於對照組方可。
如此一來，當以乳酸菌檢測該酸性廢棄液中重金屬分佈情形時，係利用所測得之濁度曲線與上述對照組之濁度曲線進行比較，藉此推得該酸性廢棄液中的銅、鉛金屬含
量。以當所測得之濁度曲線相較對照組明顯降低時，係代表該酸性廢棄液中的銅含量高於法規之15ppm，且鉛含量高於法規之5ppm，甚至其中的銅與鋅加總含量更高達100ppm以上，以此判定該酸性廢棄液含有過量重金屬，而需對該酸性廢棄液進行再處理，以至所測得之濁度曲線近似對照組，方可將該酸性廢棄液予以放流。
綜上所述，本發明以乳酸菌快篩廢棄物生物毒性之方法之主要特徵在於：藉由乳酸菌可適應在pH<3之檢測環境中，而得以透過乳酸菌的生長情形，作為判定一般經酸溶之酸性廢棄液中所含重金屬量及其種類之依據，不僅可準確檢測廢棄物中重金屬含量，更可因乳酸菌對毒物的高敏感度及對檢測環境的高耐受度，從而達到提升檢測靈敏度及檢測效率等功效。此外，由於乳酸菌對不同種類之重金屬皆具有不同耐受性，且對多數重金屬亦具有毒性抑制效應，以致乳酸菌受該酸性廢棄液中所含重金屬作用之下，係容易造成乳酸菌代謝被抑制，而產生乳酸菌生長遲緩甚至出現死亡等情形，以此遂能快速完成重金屬之檢測判定，達到提升檢測廢棄物生物毒性時效性之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
〔本發明〕
S1‧‧‧培養步驟
S2‧‧‧檢測步驟
第1圖：本發明操作流程圖。
第2a圖：本發明以乳酸菌檢測底渣水液之濁度變化圖。
第2b圖：本發明以乳酸菌檢測飛灰水液之濁度變化圖。
第3a圖：本發明以乳酸菌檢測底渣水液之菌數變化圖。
第3b圖：本發明以乳酸菌檢測飛灰水液之菌數變化圖。
第4圖：本發明以乳酸菌檢測不同濃度銅之濁度變化圖。
第5圖：本發明以乳酸菌檢測不同濃度鉛之濁度變化圖。
第6圖：本發明以乳酸菌檢測不同濃度鋅之濁度變化圖。
S1．．．培養步驟
S2．．．檢測步驟
Claims (4)
- 一種以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，該酸性廢棄液是為pH>9之灰渣經酸化處理所產生，且該灰渣於酸化處理之前係與水混合，並調整灰渣及水之體積比為1：8，以使該灰渣中的兩性離子溶出，並於過濾後，再以酸性液調整該含有兩性離子之溶出液至pH<2，該以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，係包含：一培養步驟，將一乳酸菌培養於一培養液中，以製備成一乳酸菌液，取10ml之酸性廢棄液添加於10ml之培養液中，並在其中添加0.5 ml之乳酸菌液，維持該乳酸菌菌數為108 以上，以成一待檢測液；及一檢測步驟，持續培養該乳酸菌液及待檢測液，且於持續培養過程中，分別計數並比較該乳酸菌液及待檢測液之生長菌數，以由該待檢測液之生長菌數相對該乳酸菌液之生長菌數的減少趨勢作為生物毒性快篩之依據。
- 如申請專利範圍第1項所述之以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，於該檢測步驟中，該乳酸菌液及待檢測液係持續培養0~7小時，並以混濁度計數法測得該乳酸菌液及待檢測液於每小時之濁度變化，以各繪製成一對應乳酸菌生長之濁度曲線，並予以比較。
- 如申請專利範圍第1項所述之以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，於該檢測步驟中，該乳酸菌液及待檢測液係持續培養0~7小時，並以混濁度計數法測得 該乳酸菌液及待檢測液於每小時之濁度變化，以各繪製成一對應乳酸菌生長之濁度曲線，並予以比較。
- 如申請專利範圍第1、2或3項所述之以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法，其中，於該檢測步驟中計數乳酸菌生長菌數之方式是為細胞直接計數法、吸光度計數法、活細胞計數法、電子細胞計數法或細胞導電度偵測法。
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- 2012-04-09 TW TW101112456A patent/TWI510628B/zh active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Plata MR et al., Development of a novel biotoxicity screening assay for analytical use., Chemosphere. 2009 Aug;76(7):959-66 * |
| 吳南明等，廢棄物焚化底渣溶出水質生物毒性鑑定評估研究，2009環境汙染控制評估研討會 * |
| 唐幸絹，探討垃圾焚化灰渣之長期細胞毒性及其於評估灰渣水洗條件之應用，屏東科技大學碩士論文，中華民國98年5月8日 * |
Also Published As
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|---|---|
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