TWI504743B - 增強生物固碳之方法 - Google Patents

增強生物固碳之方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI504743B
TWI504743B TW102148965A TW102148965A TWI504743B TW I504743 B TWI504743 B TW I504743B TW 102148965 A TW102148965 A TW 102148965A TW 102148965 A TW102148965 A TW 102148965A TW I504743 B TWI504743 B TW I504743B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
clostridium
acid
group
microorganism
salt
Prior art date
Application number
TW102148965A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201441366A (zh
Inventor
Chang Chieh Chen
Hsin Tzu Kuo
Yi Te Chou
Chin Chen Hsu
shao wen Wu
Original Assignee
Green Cellulosity Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Green Cellulosity Corp filed Critical Green Cellulosity Corp
Publication of TW201441366A publication Critical patent/TW201441366A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI504743B publication Critical patent/TWI504743B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

增強生物固碳之方法
本發明涉及一種增強生物固碳的方法。
最近的氣候異常，包括颶風與乾旱已與全球變暖即全球溫度上升有關。全球變暖的一個主要原因是由於大氣中二氧化碳濃度的增加。事實上，據報導在過去200年裡大氣中CO2 濃度已從大約280ppm上升到368ppm。因此，開發能夠有效減少CO2 排放或從大氣中捕獲CO2 的方法是人們一直感興趣的。
利用有機體將CO2 轉化為有機化合物的方法通常被稱為二氧化碳生物固定。二氧化碳生物固定最突出的例子包括使用光合微生物，如微藻(microalgae)與藍藻(cyanobacteria)，其運用太陽能驅動碳固定途徑。
除了光合微生物以外，化學自營微生物(chemoautotrophic microorganisms)(一類通過無機化合物氧化而不是光合作用獲得其營養的微生物)代表了用於碳固定方法的一種潛在替代物。
化學自營微生物使用的一個主要的非光合二氧化碳固定途徑是Wood-Ljungdahl(WL)途徑(第1圖)。WL途徑通常為厭氧微生物所用，包括醋酸梭菌(Clostridium aceticum )、自產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum )、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans )、困難梭菌(Clostridium difficile )、將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )、熱乙酸莫爾氏菌(原熱乙酸梭菌，Moorella thermoacetica ，Clostridium thermoaceticum )、嗜熱自營甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum )、自營脫硫桿菌(Desulfobacterium autotrophicum )、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii )、嗜熱自營梭菌(Clostridium thermoautotrophicum )、蟻酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum )、大梭菌(Clostridium magnum )、甲醇醋酸桿菌(Acetobacterium carbinolicum )、凱伍醋酸桿菌(Acetobacterium kivui )與伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii )。
儘管一些產乙酸梭菌已被工程化用以生產大宗化學品(例如丁酸鹽、醋酸鹽、乙偶姻(acetoin)與丙酮)與生物燃料(例如丁醇與乙醇)，但仍然需要開發可增進厭氧有機體將CO2 代謝為有用化學物質及/或生物燃料能力的方法。
因此，本發明提供用於微生物醱酵包括CO2 的氣體基質的方法，所述方法包括：對微生物提供一氣體基質與一液體培養基，其中所述液體培養基包括乳酸及/或其鹽，並且其中所述氣體基質包括CO2 ，與使微生物產生選自酸與醇的至少一種產物。
本發明還提供一種增進微生物醱酵中碳捕獲效率的方法，包括：對微生物提供一氣體基質與一液體培養基，其中所述液體培養基包括乳酸及/或它們的鹽，且其中所述氣體基質包括選自CO與CO2 的至少一種碳源，與使微生物產生選自酸與醇的至少一種產物。
本發明其他的特徵與優點將在本說明書下文部分進行闡述，並且有些部分在說明書中是顯而易見的，或者可通過本發明的實踐來獲知。通過附屬的權利要求書中特別指出的要素與組合可以認識到或得到所述特徵與優點。
應當理解的是，以上一般說明與以下詳細說明都僅是示例性與說明性的，不是對所要求保護的本發明的限制。
附圖顯示了本發明公開的示例性實施例，將其納入並構成本說明書的一部分。
第1圖顯示了Wood-Ljungdahl(WL)途徑。
第2圖顯示了暴露於CO2 與H2 的混合氣體中的將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )BCRC 17797的生長曲線，(a)實驗組(培養基中含有2.5g/L的乳酸鈉)，(b)鈉離子對照組(培養基中含有1.52g/L的氯化鈉)，與(c)無添加劑對照組，如實施例部分所述。
第3圖顯示了培養基中存在2.5g/L乳酸鈉可誘導乳酸通透酶與Wood-Ljungdahl途徑中涉及的某些基因。如實施例部 分所述，其表現與無添加劑對照組相比有成倍的增加。
第4圖顯示了培養基中存在2.5g/L乳酸鈉可誘導乳酸通透酶與Wood-Ljungdahl途徑中涉及的某些基因。如實施例部分所述，其表現與鈉離子對照組相比有成倍的增加。
第5圖顯示了相對於無添加劑對照組，兩個實驗組(1g/L與2.5g/L的乳酸鈉)中某些基因的表現，如實施例部分所述。
第6圖顯示了培養96小時後，實驗組、無添加劑對照組(只有合成氣)與鈉離子對照組中醋酸的產量，如實施例部分所述。
第7圖顯示了培養96小時後，實驗組、無添加劑對照組(只有合成氣)與鈉離子對照組中乙醇的產量，如實施例部分所述。
第8圖顯示了培養90小時後，相對於無添加劑對照組，包含1g/L乳酸鈉的實驗組中某些基因的表現，如實施例部分所述。
下面將參考附圖詳細描述示例性實施例，以便本領域的普通技術人員可以理解。本發明的理念可以以各種形式來體現，而不限於本發明所闡述的示例性實施例。
本發明提供了用於微生物醱酵包括CO2 的氣體基質(gaseous substrate)的方法，所述方法包括：對微生物提供一氣體基質與一液體培養基，其中所述液體培養基包括乳酸及/或它們的鹽，並且其中所述氣體 基質包括CO2 ，與使微生物產生選自酸與醇的至少一種產物。
本發明還提供了一種提高微生物醱酵中碳捕獲效率的方法，包括：對微生物提供一氣體基質與一液體培養基，其中所述液體培養基包括乳酸及/或它們的鹽，並且其中所述氣體基質包括選自CO與CO2 的至少一種碳源，與使微生物產生選自酸與醇的至少一種產物。
在一些實施例中，所述微生物選自可通過Wood-Ljungdahl(WL)途徑將CO2 及/或CO轉化為選自酸與醇的至少一種產物的任何厭氧有機體。
在一些實施例中，所述微生物選自化學自營微生物。
在一些實施例中，所述微生物選自光合微生物，其經基因工程改造以便能夠通過Wood-Ljungdahl(WL)途徑將CO2 及/或CO轉化為選自酸與醇的至少一種產物。
在一些實施例中，所述微生物選自醋酸梭菌(Clostridium aceticum )、自產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum )、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans )、困難梭菌(Clostridium difficile )、將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )、熱乙酸莫爾氏菌(原熱乙酸梭菌，Moorella thermoacetica ，Clostridium thermoaceticum )、嗜熱自營甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum )、自營脫硫桿菌(Desulfobacterium autotrophicum )、斯蒂克蘭德 氏梭菌(Clostridium sticklandii )、嗜熱自營梭菌(Clostridium thermoautotrophicum )、蟻酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum )、大梭菌(Clostridium magnum )、甲醇醋酸桿菌(Acetobacterium carbinolicum )、凱伍醋酸杆菌(Acetobacterium kivui )與伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii )。
術語“包括CO2 的氣體基質”與類似術語應理解為包括其中二氧化碳(CO2 )可用於微生物生長及/或醱酵的任何氣體基質。類似地，術語“包括選自CO與CO2 的至少一種碳源的氣體基質”應理解為包括其中CO及/或CO2 可用於微生物生長及/或醱酵的任何氣體基質。
在一些實施例中，氣體基質可以是作為工業過程的副產物或從例如汽車排放廢氣等其他來源所獲得的包括CO2 及/或CO的廢氣。示例性工業過程包括但不限於：石油精煉過程、煤的氣化、電力生產、碳黑生產、氨生產、甲醇生產與焦炭生產。根據包括CO2 及/或CO的氣體基質組合物，在將其引入醱酵之前，可能需要從氣體基質中去除不需要的雜質，如塵埃顆粒。例如，可使用已知的方法過濾或清洗氣體基質。
在一些實施例中，所述氣體基質可進一步包括選自氫氣(H2 )與氮氣(N2 )的至少一種氣體。
在一些實施例中，所述氣體基質是包括CO2 、CO與H2 的合成氣體(“合成氣”)。合成氣可通過天然氣的蒸汽重整或者由各種有機材料例如生物質、有機廢棄物、煤、石油、塑膠或其它含碳材料的氣化而產生。
在一些實施例中，所述氣體基質可包括至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%體積的CO2 。在一些實施例中，所述氣體基質可包括20%至80%的CO2 。作為非限制性的例子，所述氣體基質可包括20%的CO2 與80%的H2 。
通常，CO2 及/或CO將以氣態形式提供給微生物。然而，在一些實施例中，可以提供液態形式的CO2 及/或CO。例如，將一液體用包含CO2 的氣體基質進行飽和，然後將該液體添加到生物反應器中。
在一些實施例中，可對微生物提供還原性化學物質及/或電極作為用於CO2 固定的電子源。
在一些實施例中，可對微生物提供至少一種電子源用於CO2 固定，其中所述至少一種電子源可選自氫(H2 )、還原性碳化合物(非限制性例子：CO、甲酸與甲醇)、硫化合物(非限制性例子：H2 S與S)與氮化合物(非限制性例子：NH3 )。
在一些實施例中，為了增進碳捕獲及/或CO2 固定的效率，對微生物提供包含乳酸及/或其鹽的液體培養基。
在一些實施例中，對微生物提供的液體培養基可包括0.5g/L至3g/L乳酸及/或其鹽。作為非限制性的例子，對微生物提供的液體培養基可包括，例如0.5g/L、1g/L、1.25g/L、1.5g/L、1.75g/L、2g/L、2.25g/L、2.5g/L、2.75g/L或3g/L乳酸及/或其鹽。
在一些實施例中，對微生物提供的液體培養基可包括足夠量的乳酸及/或其鹽以誘導Wood-Ljungdahl(WL)途 徑中所涉及的基因的表現。
例如，在某些實施例中，乳酸及/或其鹽存在的量可足以誘導至少一種基因的表現，所述基因選自Köpke M.et al.,Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas(2010)中所述的Wood-Ljungdahl途徑中涉及的CLJU_c37670、CLJU_c37570、CLJU_c37550、CLJU_c37580、CLJU_c06990、CLJU_c20040、CLJU_c08930、CLJU_c07020、CLJU_c37650、CLJU_c37640、CLJU_c37630、CLJU_c37610、CLJU_c37560與CLJU_c09110。
在某些實施例中，相對於在相同條件但不存在乳酸及/或其鹽的情況下培養的微生物而言，乳酸及/或其鹽存在的量可足以誘導Wood-Ljungdahl途徑中涉及的至少一種基因增加表現約1.5倍或以上。
在某些實施例中，相對於在相同條件但不存在乳酸及/或其鹽的情況下培養的微生物而言，乳酸及/或其鹽存在的量可足以誘導Wood-Ljungdahl途徑中涉及的至少一種基因增加表現約1.5倍或以上。作為非限制性的例子，相對於在相同條件但不存在乳酸及/或其鹽的情況下培養的微生物而言，乳酸及/或其鹽存在的量可足以誘導Wood-Ljungdahl途徑中涉及的至少一種基因增加表現約1.5倍至約10倍。
在一些實施例中，相對於在相同條件但不存在乳酸及/或其鹽的情況下培養的微生物而言，液體培養基中存在的乳酸及/或其鹽的量可足以誘導選自codH、codH β、codH δ、codH γ、coos1與metF的至少一種基因增加表現約1.5倍至約10 倍。作為非限制性的例子，相對於在相同條件但不存在乳酸及/或其鹽的情況下培養的微生物而言，液體培養基中存在的乳酸及/或其鹽的量可足以誘導選自codH、codH β、codH δ、codH γ、coos1與metF的至少一種基因增加表現約1.5倍至約8倍。
為了促進微生物生長及/或CO2 及/或CO固定，除了所述乳酸及/或其鹽外，還可以對液體培養基增補適於細菌生長的額外的營養物或成分。例如，用於培養微生物的培養基還可包括足以使微生物生長的維生素、鹽、提取物及/或礦物質。
在一些實施例中，用於CO2 及/或CO的固定方法是在發生所期望的醱酵(如從CO2 到酸)的條件下進行。可以考慮的反應條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基的氧化還原電位、攪拌速率(如果使用連續攪拌槽式反應器(continuous stirred tank reactor))、接種程度(inoculum level)、最大氣體基質濃度，以確保在液相中的CO2 或其它組分不受限制，並且使產物濃度最大化以避免產物抑制。
在一些實施例中，所述方法可以在任何適合的生物反應器中進行，基質可以在其中與一種或多種微生物接觸，例如，連續攪拌槽式反應器、固定化細胞反應器(immobilized cell reactor)、氣升式反應器(gas-lift reactor)、氣泡塔反應器(bubble column reactor)、膜反應器(membrane reactor)例如中空纖維膜生物反應器(hollow fiber membrane bioreactor)、或滴流床反應器(trickle bed reactor)、整體式生物反應器(monolith bioreactor)或環式反應器(loop reactor)。
在一些實施例中，本發明所述醱酵製程可生產的 產物包括但不限於醇及/或酸。示例性的酸包括但不限於甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙烯酸、脂肪酸；以及示例性的醇包括但不限於甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、丁醇與2,3-丁二醇。
在醱酵產物中，本發明使用的術語“酸”包括羧酸與相關的羧酸根陰離子。例如，術語“醋酸”包括單獨的游離醋酸、醋酸鹽以及游離醋酸與醋酸鹽的混合物。
術語“脂肪酸”包括帶有長脂肪鏈的羧酸。在一些實施例中，脂肪鏈可以是線形的或分支的，以及飽和的與不飽和的。在一些實施例中，脂肪鏈可包含例如4至12個碳原子，5至11個碳原子，或者8至10個碳原子。
醱酵方法中的選自酸與醇的至少一種產物可用任何已知方法回收。
作為非限制性的例子，可以通過如分餾或蒸發以及萃取醱酵的方法從醱酵液回收乙醇。
也作為非限制性的例子，可以使用包含活性炭過濾的吸附系統從醱酵液中回收醋酸鹽。在這種情況下，可以首先使用合適的分離單元從醱酵液中除去微生物。然後將無細胞、含醋酸鹽的培養基通過含有活性碳的管柱以吸附醋酸鹽。醋酸鹽以酸的形式(醋酸)而不是鹽(醋酸鹽)的形式更容易被活性炭吸附。因此，通過活性碳管柱之前，可將含醋酸鹽且無細胞的培養基的pH值降低到小於約3，以使大部分的醋酸鹽轉化為醋酸的形式。
進一步地，作為非限制性的例子，醱酵液中存在的丁酸可通過使用脂肪族胺萃取來回收與純化，如Alamine 336 (三辛/癸基胺；Alamine336®，Cognis,Cincinnati，OH，USA)，或其他非水溶性溶劑。
從說明書以及本發明所披露的實踐來考慮，本發明的其他實施例對本領域的技術人員而言是顯而易見的。說明書與實施例僅作為示範性例子，本發明真正的範圍與精神由後面的權利要求書限定。
實施例
實施例1
微生物
將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )BCRC 17797(DSM No.13528；BCRC No.17797)購自臺灣生物資源保存及研究中心(Taiwan)。已知該菌株是利用大氣中的如CO；CO2 與H2 的混合氣；或合成氣體(CO與H2 )等碳源通過Wood-Ljungdahl途徑(第1圖)生長與產生代謝物。見Köpke M.et al，Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas,Proc Natl Acad Sci USA,107(29),pp.13087-13092(2010)。
材料
經修改的PETC基礎培養基(Modified PETC Basal Medium)，包含(每升)：蛋白酶蛋白腖(10g)、酵母提取物(3g)與刃天青(resazurin)儲備液(0.5mL，0.1%，w/v)。見Cottera JL et al,Influence of process parameters on growth ofClostridium ljungdahlii andClostridium autoethanogenum on synthesis gas,Enzyme and Microbial Technology 44(5),pp. 281-299(2008)。
ATCC 1754鹽溶液，包含(每升)：NH4 Cl(20g)、KCl(2g)、MgSO4 ．7H2 O(4g)、NaCl(16g)、KH2 PO4 (2g)與CaCl2 (0.4g)。
維生素溶液，包含(每升)：生物素(2mg)，葉酸(2mg)，吡哆醇(10mg)，鹽酸硫胺素(5mg)，核黃素(5mg)，煙酸(5mg)，鈣D(+)泛酸(5mg)，維生素B12(5mg)，p-氨基水楊酸(5mg)與硫辛酸(thioctic)(5mg)。
微量元素溶液包含(每升)：氨三乙酸(2g)、MnCl2 ．4H2 O(1.3g)、FeSO4 ．7H2 O(0.4g)、CoCl2 ．6H2 O(0.2g)、ZnSO4 ．7H2 O(0.2g)、CuCl2 ．2H2 O(0.02g)、NiCl2 ．6H2 O(0.02g)、Na2 MoO4 ．2H2 O(0.02g)、Na2 SeO3 (0.02g)與Na2 WO4 ．2H2 O(0.025g)。
經修改的PETC培養基(mPETC)，pH6.8：對1升經修改的PETC基礎培養基(mPETC Basal Medium)中補以50ml ATCC 1754鹽溶液，10ml的維生素溶液與10ml的微量元素溶液以製備mPETC。然後將所製備的培養基分裝到血清瓶中，然後在121℃、15psi下高壓蒸氣滅菌15~20分鐘。
用於厭氧培養的氣密瓶：將200ml鉗口血清瓶(crimp-top serum bottle)用橡膠塞密封，橡膠塞進一步用鋁製鉗口蓋(aluminum crimp)固定就位以確保氣密封閉。
方法
將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )首先用含有10g/L果糖的mPETC培養基於37℃下在上述一個氣密瓶中厭氧培 養。當OD600 值達到1至1.5的範圍時，將培養基於3500rpm下離心210秒。將所得細胞沉澱物重懸於無果糖的mPETC，然後進一步在37℃下厭氧培養1小時以除去任何殘餘的糖基質。
將45ml mPETC培養基加入上述鉗口血清瓶中，然後用鋁箔覆蓋並於121℃、15psi下高壓滅菌15分鐘。冷卻後，將所述含培養基的瓶子轉移到厭氧培養室內，並向培養基添加50μl的半胱氨酸-HCl(50% w/v)以去除任何溶解氧。
對於實驗組，進一步將乳酸鈉溶液加入培養基中以獲得2.5g/L(約0.022M)的乳酸濃度。
對於鈉離子對照組，將氯化鈉溶液加入培養基中以獲得1.52g/L(約0.026M)的氯化鈉濃度。該對照組是設計來測試乳酸鈉中鈉離子的存在是否在二氧化碳固定中發揮作用。因此，該實驗組中加入相同莫耳量的鈉離子。
對於無添加劑對照組，向培養基中加入適量的水。
然後向每個含有45ml mPETC培養基的血清瓶接種5ml已去除殘糖的將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )培養物。在這個點上的採樣標記為t=0樣品。然後將瓶子用橡膠塞密封並進一步覆蓋鋁質鉗口蓋以確保氣密封閉。
先用注射針頭把含有80% N2 與20% CO2 的氣體混合物以10psi壓力吹掃氣密瓶內頂部的空間。同時用另一支注射針頭插入到橡膠塞使瓶子裡的氣體排出。暴露於混合氣體約30秒後，瓶子內獲得充填二氧化碳的厭氧條件。
然後，藉由使用注射針頭，進一步在20psi壓力下以另一種含80% H2 與20% CO2 的氣體混合物淨化瓶子內頂部的 空間以代替先前的氣體混合物。約30秒後，去除針頭，使瓶子內部的壓力積聚到約20psi。然後將瓶子移到37℃的培養箱並放置在提供振盪速度為100rpm的振盪器上。
每12小時，用針頭來釋放瓶子內積聚的氣體，並按上述相同方法向瓶子內的頂部空間進行淨化與更新，以在穩定的壓力條件下補充氣態碳源。
用帶有針頭的注射器來收集液體樣品。測定OD600 之後，將液體樣品於12,000rpm下離心10分鐘。將得到的細胞沉澱物儲存在700μl TRIzol溶液中用於後續的RNA萃取與基因表現分析。將上清液用Agilent 1100系列高效液相色譜儀(HPLC)與Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱進行分析。
結果
第2圖顯示了各組培養基中細菌生長指標OD600 的變化，(a)實驗組(包含2.5g/L乳酸鈉)，(b)鈉離子對照組(包含1.52g/L的氯化鈉)，(c)是無添加劑對照組。在所有的組別中，前70個小時內將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )BCRC 17797都快速生長，然後它們的生長率緩慢下來。
在t=144小時，OD600 值為：(a)含有乳酸鈉的實驗組達0.71，(b)鈉離子對照組達0.82，(c)無添加劑對照組達0.79。因此，觀察到的這三組的增長率並無顯著差異。
用HPLC分析t=144小時的培養基樣品，如表1所示，當提供CO2 作為碳源時，在mPETC中生長的將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )BCRC 17797能夠產生醋酸。
如表1所示，於t=144小時，實驗組中的醋酸濃度高於無添加劑對照組或鈉離子對照組。且無添加劑對照組於t=144小時的醋酸濃度與鈉離子對照組的醋酸濃度幾乎相同。
表1的資料進一步顯示了實驗組的乳酸濃度從2.92g/L(t=0)下降至2.25g/L(t=144)。這表明細菌消耗了少量的乳酸(即0.67g/L)。消耗的0.67g/L的乳酸可提供約0.022M的碳原子，且實驗組產生的6.39g/L醋酸包含約0.213M的碳原子。這表明至少0.191M(0.213減去0.022M)的碳原子來自氣體混合物中存在的CO2 。
如上表1所示，培養144小時後，無添加劑對照組產生約4.97g/L的醋酸，其含有約0.166M的碳原子，鈉離子對照組產生約4.91g/L的醋酸，其含有約0.164M的碳原子。因此，被實驗組轉化(固定)為醋酸的CO2 量(0.191M(即實驗組產生的醋酸中存在的碳原子減去可能從乳酸轉化而成的碳原子量))比無添加劑對照組(無添加劑對照組中產生的醋酸中存在0.166M碳原子)或鈉離子對照組(鈉離子對照組中產生的醋酸中存在0.164M碳原子)至少高出約15%。這顯示了實驗組培養基中存在的乳酸增強了將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )BCRC 17797的二氧化碳固定。
使用即時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)量化表2中列出的特定基因的表現。
如第3圖所示，相對於無添加劑對照組，實驗組的培養基中存在的乳酸誘導：(i)乳酸通透酶增加約11倍，表明該細菌對乳酸有反應；(ii)codH、codH β、codH δ與codH γ增加約4至8倍；(iii)cooS1增加約3倍；及(iv)metF增加約4倍。
如第4圖所示，相對於鈉離子對照組，實驗組的培養基中存在的乳酸誘導乳酸通透酶、codH、codH β、codH δ、codH γ與metF增加約3至6倍。這表明乳酸確實可誘導二氧化碳固定中涉及的基因的表現。
實施例2
重複實施例1所述的實驗方案，區別在於，除了具有無添加劑對照組外，設置了兩個實驗組，一個是培養基中有1g/L的乳酸，另一個是培養基中有2.5g/L的乳酸。
下表3顯示了培養96小時後，實驗組與無添加劑對照組中消耗的乳酸與產生的醋酸的量。
第5圖顯示了相對於無添加劑對照組，兩個實驗組中某些基因的表現。
實施例3
重複實施例1所述的實驗方案，區別在於，除了具有無添加劑對照組外，設置了三個實驗組(0.5g/L、1g/L與3g/L的乳酸鈉)及一個鈉離子對照組(含1.57g/L的氯化鈉)。
第6圖與第7圖顯示了培養96小時後，實驗組、無添加對照組(只有合成氣)與鈉離子對照組中分別產生的醋酸與乙醇的量。
第8圖顯示了培養90小時後，相對於無添加劑對照組，含1g/L乳酸鈉的實驗組中某些基因的表現。下表4顯示第8圖中所示的每個CLJU_c數字的酶代表的含義。
顯然本領域技術人員可以對本發明所公開的實施例進行各種修改與變型。要說明的是說明書與實施例僅是示例性的。

Claims (18)

  1. 一種用於微生物醱酵包括CO2 之氣體基質的方法，所述方法包括：對微生物提供一氣體基質與一液體培養基，其中所述液體培養基包括乳酸及/或其鹽，且其中所述氣體基質包括CO2 ，其中該乳酸及/或其鹽誘導與CO2 固定相關之基因的表現，以及使所述微生物產生選自酸與醇的至少一種產物，其中該微生物係選自可通過Wood-Ljungdahl(WL)途徑將CO2 及/或CO轉化為選自酸與醇的至少一種產物的厭氧有機體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述氣體基質進一步包括選自H2 、N2 與CO的至少一種氣體。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述氣體基質包括至少20%體積的CO2 。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述乳酸及/或其鹽是以0.5g/L至3g/L的濃度存在。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中相對於不存在乳酸及/或其鹽的條件下培養的微生物，所述乳酸及/或其鹽存在的量足以誘導選自codH、codHβ、codHδ、codHγ、coos1與metF的至少一種基因增加表現約1.5倍或以上。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述至少一種產物選自乙酸、丙酸、丁酸、丙烯酸與脂肪酸。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述至少一種產物選自乙醇、丙酮、丙醇、丁醇與2,3-丁二醇。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述微生物能 夠將CO2 及/或CO轉化為選自酸與醇的至少一種產物。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，所述微生物選自醋酸梭菌(Clostridium aceticum )、自產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum )、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans )、困難梭菌(Clostridium difficile )、將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )、熱乙酸莫爾氏菌(原熱乙酸梭菌，Moorella thermoacetica，Clostridium thermoaceticum )、嗜熱自營甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum )、自營脫硫桿菌(Desulfobacterium autotrophicum )、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii )、嗜熱自營梭菌(Clostridium thermoautotrophicum )、蟻酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum )、大梭菌(Clostridium magnum )、甲醇醋酸桿菌(Acetobacterium carbinolicum )、凱伍醋酸桿菌(Acetobacterium kivui )與伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii )。
  10. 一種提高微生物醱酵中碳捕獲效率的方法，包括：對微生物提供一氣體基質與一液體培養基，其中所述液體培養基包括乳酸及/或其鹽，且其中所述氣體基質包括選自CO與CO2 的至少一種碳源，且其中該乳酸及/或其鹽誘導與CO2 固定相關之基因的表現，以及使所述微生物產生選自酸與醇的至少一種產物，其中該微生物係選自可通過Wood-Ljungdahl(WL)途徑將CO2 及/或CO轉化為選自酸與醇的至少一種產物的厭氧有機體。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中所述氣體基質進一步包括選自H2 與N2 的至少一種氣體。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中所述氣體基質包括至少20%體積的CO2 。
  13. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中所述乳酸及/或其鹽是以0.5g/L至3g/L的濃度存在。
  14. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中相對於不存在乳酸及/或其鹽的條件下培養的微生物，所述乳酸及/或其鹽存在的量足以誘導選自codH、codH β、codH δ、codH γ、coos1與metF的至少一種基因增加表現約1.5倍或以上。
  15. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中所述至少一種產物選自乙酸、丙酸、丁酸、丙烯酸與脂肪酸。
  16. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中所述至少一種產物選自乙醇、丙酮、丙醇、丁醇與2,3-丁二醇。
  17. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中所述微生物能夠將CO2 及/或CO轉化為選自酸與醇的至少一種產物。
  18. 如申請專利範圍第10項所述的方法，所述微生物選自醋酸梭菌(Clostridium aceticum )、自產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum )、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans )、困難梭菌(Clostridium difficile )、將達梭菌(Clostridium ljungdahlii )、熱乙酸莫爾氏菌(原熱乙酸梭菌，Moorella thermoacetica，Clostridium thermoaceticum )，嗜熱自營甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum )，自營脫硫桿菌(Desulfobacterium autotrophicum )，斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii )、嗜熱自營梭菌(Clostridium thermoautotrophicum )、蟻酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum )、大梭菌(Clostridium magnum )、甲醇醋酸桿菌(Acetobacterium carbinolicum )、凱伍醋酸桿菌(Acetobacterium kivui )與伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii )。
TW102148965A 2013-01-04 2013-12-30 增強生物固碳之方法 TWI504743B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361749010P 2013-01-04 2013-01-04
US14/140,627 US20140193871A1 (en) 2013-01-04 2013-12-26 Method for enhancing carbon biofixation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201441366A TW201441366A (zh) 2014-11-01
TWI504743B true TWI504743B (zh) 2015-10-21

Family

ID=49920071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102148965A TWI504743B (zh) 2013-01-04 2013-12-30 增強生物固碳之方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20140193871A1 (zh)
EP (1) EP2752494B1 (zh)
TW (1) TWI504743B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201112231D0 (en) * 2011-07-15 2011-08-31 Verdant Bioproducts Ltd Micro-organism
CA2977593A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 White Dog Labs, Inc. Mixotrophic fermentation method for making acetone, isopropanol, butyric acid and other bioproducts, and mixtures thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136577A (en) * 1992-10-30 2000-10-24 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of ethanol from waste gases with Clostridium ljungdahlii
JP4665066B1 (ja) * 2010-02-15 2011-04-06 住友商事株式会社 ブタノールの新規な生産方法
EP2631298A1 (en) * 2012-02-22 2013-08-28 Evonik Industries AG Biotechnological method for producing butanol and butyric acid

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Köpke M. et al. "2,3-butanediol production by acetogenic bacteria, an alternative route to chemical synthesis, using industrial waste gas." Appl Environ Microbiol. 2011, 77(15):5467-75. *
Köpke M. et al. "Fermentative production of ethanol from carbon monoxide." Curr Opin Biotechnol. 2011, 22(3):320-5. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20140193871A1 (en) 2014-07-10
EP2752494A1 (en) 2014-07-09
TW201441366A (zh) 2014-11-01
EP2752494B1 (en) 2020-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8222013B2 (en) Bacteria and methods of use thereof
US8293509B2 (en) Alcohol production process
US8119378B2 (en) Microbial alcohol production process
US7972824B2 (en) Microbial fermentation of gaseous substrates to produce alcohols
JP5618995B2 (ja) 嫌気的微生物発酵によるブタンジオールの製造
US9765366B2 (en) Biotechnological method for producing butanol and butyric acid
KR101417235B1 (ko) 최적화된 발효 배지
AU2012396327A1 (en) A fermentation process
TWI595091B (zh) 用於在經選擇基質培養微生物的方法
TWI504743B (zh) 增強生物固碳之方法
CN103911401B (zh) 加强生物固碳的方法
US8551746B2 (en) Method for controlling undesirable byproducts formation caused by contaminating organisms in the production of ethanol from syngas
US8852918B2 (en) Bacteria and methods of use thereof
CN107779477B (zh) 一种食气厌氧菌利用合成气发酵产醇的培养体系和培养方法
CN107779476B (zh) 一种利用合成气低温发酵生产己醇的方法
AU2008321615B2 (en) Novel bacteria and methods of use thereof