TWI501762B - 阿達帕林治療癌症的新穎用途 - Google Patents

Description

阿達帕林治療癌症的新穎用途 相關申請的交互參考

本專利申請案主張於2013年1月31日申請的美國臨時申請案第61/758,927號的優先權。

本發明是關於6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸或其功能性衍生物於治療癌症，特別是治療非小細胞肺癌(NSCLC)的新穎用途。

高程度的表皮生長因數受體(EGFR)可見於許多人類腫瘤中，特別是肺或頭與頸的鱗狀細胞瘤。組成性活化突變EGFR也被報導於膠質瘤、乳房腫瘤及肺腫瘤。此顯示EGFR活化可能導致該等腫瘤的增生且EGFR的抑制劑可使用作為抗腫瘤劑。

非小細胞肺癌(NSCLC(Non-small-cell lung carcinoma))為肺癌的最常見形式，其於肺癌患者中占約75%¹ 。於顯著比例的患者中，其由EGFR激酶功能域的突變所引起。於活性環中的取代L858R或於展成殘基746-759的區域中3至8個殘基的刪除，於激酶功能域之N-突出中自β3 股延伸至αC螺旋，為最常觀察到的突變。雖然患有此形式肺的患者可成功地以市售藥物如艾瑞莎(Iressa®)或吉非替尼(Gefitinib)與特羅凱(Tarceva®)或埃羅替尼(Erlotinib)治療，但多數患者於治療的數個月內對於該等治療發展出抗藥性³ 。該等患者之半數中，該抗性是由激酶功能域的閘管理者的第二突變T790M所引起。有迫切需要來開發用於抑制L858R+T790M及刪除+T790M突變EGFR以治療該等患者的標靶藥物⁴ 。L858R激酶功能域已顯示相較於野生型具有較大活性⁵ 。此歸功於突變能將酵素鎖定於組成性活性構形。然而，最近研究已推論突變有助於受體的二聚物化⁶ 。艾瑞莎(Iressa®)或吉非替尼(Gefitinib)與特羅凱(Tarceva®)或埃羅替尼(Erlotinib)二者皆為ATP競爭抑制劑且對於L858R突變相較於野生型顯示選擇性^6,7 。此可理解為突變酵素的ATP Km值較高於野生型⁸ 。已有建議對於帶有第二突變T790M患者的藥物抗性的出現，係起因於雙突變酵素的ATP Km值已回復至野生型的程度⁸ 。

阿達帕林(或nsl-8)為類視色素化合物，原始經FDA核准用於治療痤瘡與角化症。Nsl-8的化學式為C₂₈ H₂₈ O₃ 且對應的IUPAC命名為6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸(CAS註冊編號：106685-40-9)。阿達帕林(或nsl-8)的化學結構如下所示：

本發明之主要目的是提供6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸(CAS註冊編號：106685-40-9)(或阿達帕林或nsl-8)或其醫藥可接受鹽或其衍生物於治療癌症的用途，以及包含阿達帕林或其醫藥可接受鹽或其衍生物作為活性成分之用於治療癌症的醫藥組成物。

本發明的另一目的是提供於個體治療癌症的方法，包含對有需要該治療的個體投藥阿達帕林或其醫藥可接受鹽或其衍生物。

本發明的再一目的是提供於個體中殺死癌細胞的方法，包含對有需要治療的個體投藥阿達帕林或其醫藥可接受鹽或其衍生物。

本發明的再一目的是提供阿達帕林或其醫藥可接受鹽或其衍生物用於製造治療癌症的藥物的用途。

本發明一態樣中，本發明的個體為哺乳動物。

本發明的另一態樣中，該哺乳動物為人類。

本發明的另一態樣中，阿達帕林或其醫藥可接受鹽或其衍生物投藥至人類的每日劑量是由老鼠的每日劑量約 40毫克/公斤體重換算得到。

本發明的再一態樣中，需要該治療的個體處於或曾經接受吉非替尼(Gefitinib)或埃羅替尼(Erlotinib)的治療。

本發明的再一態樣中，需要治療的個體已發展出對吉非替尼(Gefitinib)或埃羅替尼(Erlotinib)的抗藥性。

本發明的一態樣中，癌症為EGFR相關腫瘤。

本發明的另一態樣中，癌症是相關於升高程度的EGFR。

本發明的再一態樣中，該EGFR相關癌症是選自肺癌、乳癌、頭頸癌、胰臟癌、大腸癌及膠質癌。

本發明的進一步態樣中，該EGFR相關癌症為非小細胞肺癌。

圖1顯示nsl-1至nsl-10的酵素性分析IC₅₀ 結果。

圖2顯示在四種不同非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株中測量nsl-8的IC₅₀ 的2D細胞基礎分析。

圖3顯示在四種不同非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株中測量nsl-8的IC₅₀ 的3D細胞基礎分析。

圖4顯示群組1a與1b動物中經植入A549腫瘤的生長。 由方型表示的測試藥物nsl-8相對於由三角表示的載劑對照組作圖。數據呈示為平均值(means)+/-標準差(SEM)。

圖5顯示群組1a與1b的帶有A549動物的動物體重變 化。由方型表示的測試藥物nsl-8相對於由三角表示的載劑對照組作圖。數據呈示為平均值(means)+/-標準差(SEM)。

圖6顯示於第69日對群組1a與1b動物活體內所測量之主要腫瘤體積(A549模式)。藥物nsl-8(群組1b)相對於載劑對照組(群組group 1a)作圖。數據皆呈示為平均值(means)+/-標準差(SEM)。

圖7顯示於群組2a、2b與2c動物中nsl-8對於經植入A549腫瘤的生長的效果。

圖8顯示於群組3a、3b與c動物中nsl-8對於經植入HCC827腫瘤的生長的效果。

圖9顯示nsl-8對於帶有A549腫瘤小鼠的體重的效果。

圖10顯示nsl-8對於帶有HCC827腫瘤小鼠的體重的效果。

圖11顯示nsl-8對於帶有A549腫瘤小鼠的紅血球計數的效果。

圖12顯示nsl-8對於帶有HCC827腫瘤小鼠的紅血球計數的效果。

圖13顯示nsl-8對於帶有A549腫瘤小鼠所測定的BUN、ALY與AST的效果。

圖14顯示nsl-8對於帶有HCC827腫瘤小鼠所測定的BUN、ALY與AST的效果。

圖15顯示將特羅凱或埃羅替尼(a)或nsl-8(b)藉由ADDock對接至野生型EGFR激酶功能域2ity的活性位點。

圖16顯示將特羅凱或埃羅替尼(a)或nsl-8(b)藉由 ADDock對接至帶有雙突變L858R+T790M的野生型EGFR激酶功能域4i22的活性位點。

本發明的醫藥組成物

本專利申請案的發明人嘗試研究數個已知藥物資料庫以發現可能經由與其激酶功能域結合而抑制EGFR的藥物先導分子(lead)且因此引起對於某些腫瘤的生長停止，特別是NSCLC的生長停止。已經由酵素性與某些2D與3D細胞增生分析進行試驗性研究理論尋求的藥物先導分子。令人意外的nsl-8(或阿達帕林)顯示與野生型EGFR激酶功能域結合的活性。再者，所尋求的藥物先導分子nsl-8(或阿達帕林)的抗腫瘤藥效已使用數個活體內小鼠異種移植(xenograft)模式進行評估。

本發明的醫藥組成物是經由包括6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸(或阿達帕林或nsl-8)或其功能性衍生物做為活性成分而提供。

可調配於本發明的醫藥組成物的6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸的功能性衍生物包含鹽、酯、醯胺等。適當衍生物的選擇可由此項技術領域中具有通常知識者根據實施的必要而完成。

藉由此項技術領域中具有通常知識者所習知的技術與方法，本發明的醫藥組成物可調配為適當的劑量形式，如溶液、懸浮劑、錠劑、可分散錠劑、丸劑、膠囊、粉 劑、持續釋放調配物或酏劑用於經口投藥，或呈無菌溶液或懸浮物用於非腸道投藥。

本發明的醫藥組成物可包括活性成分與醫藥可接受載體。較佳地，該醫藥可接受載體是非毒性且可根據此項技術領域的傳統技術與方法選擇。本發明的醫藥組成物中的活性成分的濃度取決於需要該等治療的個體的生理條件，如年齡、性別、體重、健康條件、疾病嚴重度、投藥途徑及其他條件，以及適當的治療方針與投藥量可由有經驗的臨床人員決定。

包括對需要該治療的個體投藥該醫藥組成物的治療癌症的方法

本發明所提供治療癌症的方法包括對有需要該治療的個體投藥6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸。

治療癌症的方法包括對個體投藥治療有效量的本發明的醫藥組成物。

該治療有效量可根據如個體的年齡、性別、體重、投藥途徑、疾病嚴重度與其他條件的條件而加以變化。所給出活性成分的量將由此項技術領域者根據各種條件而變化且無疑慮地可循常規方式測定。

本發明的需要該治療的個體包括涵蓋哺乳動物的動物界的所有成員。本發明的需要該等治療的哺乳動物包含人類，以及適合本發明的需要該等治療的人類是處於及/或已經接受吉非替尼或埃羅替尼的治療。較佳地，本發明的需 要該等治療的個體已發展出對於吉非替尼或埃羅替尼的抗藥性。

本發明的治療癌症的方法進一步包括同時、分別或依序對個體投藥另一抗腫瘤劑。

關於「治療有效量」意指相對於未投藥活性成分所獲得的回應，誘發緩解、降低腫瘤負擔、及/或預防腫瘤擴散或腫瘤生長的活性成分的量。用語「治療」或「療法」為此項技術領域所習知，且意指獲得有利的或所期望的結果。有利的或所期望的結果可包含，但不限於，緩和或紓緩一或多種症狀或狀況、消除腫瘤、腫瘤狀態的安定化或不惡化、預防腫瘤的移轉、延遲或減緩腫瘤進展、舒緩或緩和腫瘤階段、消除腫瘤的復發、以及部份或全部的緩解腫瘤，包含延長的存活，相較於未接受治療所預期的存活。

6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸(或nsl-8)用於製造用以治療癌症的藥劑的用途

本發明進一步提供6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸用於製造用以治療癌症的藥劑的用途。

本發明藥劑可調配為適當用於此項技術領域者所選擇的投藥途徑的劑量形式。

本發明的藥劑可製造用以治療與EGFR異常程度相關的癌症，且適當地為EGFR的升高程度。

與EGFR異常成度相關的癌症是選自肺癌、乳癌、頭頸癌、胰臟癌、大腸癌或膠質癌。

進一步地，提供用於治療癌症的本發明的藥劑與另一種抗腫瘤藥劑的組合。另一種抗腫瘤藥劑可為此項技術領域者已知是當用以治療癌症的任何藥劑，且較佳為吉非替尼或埃羅替尼。

本發明的範疇可參考下述實施例而被理解，但該等實施例不意圖限制本發明為該等具體例。揭示於本文的具體例只提供示例方式，以及本發明應由隨附的申請專利範圍與其均等物的全部範疇所限制。

實施例 使用ADDock的主要研究：

有兩個藥物資料庫藉由ADDock⁹ 進行研究。對於各藥物添加氫原子。對接盒內鑒定所有結晶水或輔因數分子於2ity¹⁰ ，野生型EGFR激酶功能域的結構藉由X-射線結晶法測定，於對接之前移除。對於各藥物分子藉由ADDock對接至2ity的活性位點被認為由下列步驟組成：(i)選擇末端原子作為錨定子，(ii)根據所選定的錨定子計數完整分子的拓撲，(iii)根據對於配體所計算的拓撲向量定義對接參數以及對接盒，以及(iv)使用基因演算法搜尋最佳參數以及然後評分對接配體與蛋白質標的之間的交互作用。ADDock使用折線潛力函數以評分對接配體與蛋白質邊地之間的交互作用以及計算參予氫鍵交互作用的距離與幾何學。由對於指定給各原子的正常電荷計算靜電交互作用以及藉由距離依賴性介電常數的等級。進一步地，ADDock藉由改變於配體對稱性所鑒定的所 有末端原子以選擇錨定子。換言之，一系列的構型根據所選擇的主要錨定子於起始時自動產生，然後由所產生的所有主要錨定子(構型)所計算的最低對接能量測定最佳的錨定子。藉由ADDock選擇10個對接與結果最佳的藥物分子且實驗性測試其等與EGFR激酶功能域的結合活性。再者，該10個對接與置頂至野生型EGFR激酶功能域2ity的藥物也藉由ADDock對接至帶有雙重突變(L858R+T790M)的野生型EGFR激酶功能域4i22¹¹ ，用於估算於其等之間與野生型與突變的DGFR功能域之間的結合的任何差異。

用於篩選藥物的酵素分析：

除了Tarceva®或由LC Laboratories購得的埃羅替尼，所有經篩選的藥物是購自西格瑪奧德里奇。呈示GST-融合蛋白質的表現於Sf9昆蟲細胞的重組野生型人類EGFR激酶功能域使用於酵素分析。重組蛋白質藉由GSH-親和性管柱純化以及蛋白質的純度藉由SDS-PAGE/考馬西染色檢測以及同一性藉由質量質譜法確定。使用放射性蛋白質激酶分析用以測量EGFR蛋白質激酶的激酶活性。所有分析皆於購自PerkinElmer(Boston,MA,USA)的96-孔FlashPlates^TM 盤中以50微升的反應體積進行。50微升分析反應物含有70mM HEPES-NaOH pH 7.5、3mM MgCl₂ 、3mM MnCl₂ 、3M Na-正釩酸、1.2mM DTT、50μg/ml PEG20000、ATP(對應於由野生型EGFR激酶所測定的表觀ATP-K_m )、[-³³ P]-ATP(每孔接近5 x 10⁵ cpm)、20ng EGFR激酶以及受質(各種量)。反 應混合物於30℃培養60分鐘。反應利用50微升的2%(v/v)H₃ PO₄ 中止且將盤抽吸並以200微升的0.9%(w/v)NaCl清洗二次。利用微孔盤閃爍計數器測定³³ P_i 的併入。所有該等分析是利用BeckmanCoulter/SAGIAN^TM Core System進行。

各分析盤中第1欄(n=8)中計數的中值定義為「低對照」。此值反應在缺乏蛋白質激酶但受質存在的情況下放射活性對各盤的非特異性結合。各分析盤(n=8)的第7欄中計數的中值取作「高對照」，亦即缺乏任何抑制劑的全活性。高對照與低對照之間的差異取作100%活性。來自特定盤的低對照值由高對照值以及由對應盤的所有80個「化合物值」相減。特定盤的各孔的殘餘活性(呈%)使用下述式計算：殘餘活性(%)=100×[(化合物的cpm-低對照)/(高對照-低對照)]對於各濃度的殘餘活性以及藥物IC₅₀ 值使用GraphPad Prism軟體計算。IC₅₀ 測定的符合模式為以參數「頂」固定於100%以及「底」固定於0%的「S字型回應」(Sigmoidal response)(可變斜率)。所使用的符合方法為最小平方符合。

藉由ADDock對於10個所選擇的藥物nsl-1至nsl-10至野生型EGFR激酶功能域2ity所提供的對接能量分別為-76.2、-109、-94.1、-89.8、-79.5、-82.1、-90.6、-99.7、-94.3及-92.4kcal/mol。經由酵素分析對於10個所選擇的藥物(nsl-l至nsl-10)藉由ADDock所測定的IC₅₀ 列於表1。有10個濃度使用於測定各藥物的IC₅₀ 以及對於所測試各藥物的結果呈現於圖1。明顯地，以所測定的IC₅₀ 為0.515μM(圖 1)，只有藥物nsl-8被認為與野生型EGFR激酶功能域的結合中為活化。應注意對於藥物nsl-8藉由ADDock所提供的對接能量於所研究的所有10個藥物中分級為第二最佳。

我們也使用ADDock研究Tarceva®或埃羅替尼對接至野生型2ity與帶有二的點突變L858R+T790M的突變EGFR激酶功能域二者的活性位點。如示於圖15a及15b，在nsl-8與Tarceva®或埃羅替尼之間的野生型EGFR激酶功能域的活性位點殘基的結合有顯著差異。當Tarceva®或埃羅替尼的乙炔基苯基深入對接至催化性口袋，喹唑啉與藥物的二個2-甲氧基乙氧基分別對接至口袋的頸區域與環區域(圖15a)。應注意藉由ADDock計算對接構型之間的根-平均-平方(rms)誤差以及X-射線所測定的結構為0.08Å。然而，如圖15b所示，當nsl-8的萘相關甲氧基-苯基對接於區域的外頸時，nsl-8的金剛烷基對接至催化性口袋的上方疏水性裂口。藉由ADDock對於nsl-8與Tarceva®或埃羅替尼至野生型酵素2ity的活性位點所獲得的對接能量分別為-99.7與-119kcal/mol。此顯示nsl-8與野生型EGFR激酶功能域地結合模式與Tarceva®或埃羅替尼與野生型酵素的結合為相當不同。此對於對接nsl-8與Tarceva®或埃羅替尼二者致突變EGFR激酶功能域4i22的活性位點也是如此。藉由ADDock對於nsl-8與Tarceva®或埃羅替尼至突變激酶功能域4i22的活性位點所獲得的對接能量分別為-115及-118kcal/mol。明顯地，藉由Tarceva®或埃羅替尼所顯示至突變酵素(圖16a)或野生型酵素(圖15a)的對接結果沒有顯著差異。然而，在nsl-8對 接至突變酵素(圖16b)與野生型酵素(圖15b)之間分別有明確的差異。在nsl-8的金剛烷基對於突變酵素(圖16b)與野生型酵素(圖15b)呈現對接至不同的疏水性裂口。此顯示nsl-8與突變EGFR功能域的結合模式也和Tarceva®或埃羅替尼與突變酵素的結合模式相當不同。此將暗示nsl-8可能有用於治療利用Tarceva®或埃羅替尼治療後已經發展出藥物抗藥性的患者。

對於所研究的藥物先導分子的2D細胞增生：

使用4個NSCLC細胞株(A549(具有k-ras基因突變的人類腺癌肺泡基底表皮細胞)、H1299(具有p53突變的人 類非小細胞肺癌細胞株)、H460(具有k-ras基因突變的人類非小細胞肺癌細胞株)以及HCC827(具有由E746至A750刪除的EGFR突變的人類NSCLC細胞))使nsl-8進行2D細胞增生分析以及結果示於表2。對於各藥物使用8個濃度測定其IC₅₀ 。活性對濃度的對應作圖示於圖2。應注意Tarceva®或埃羅替尼，一個FDA於2004核准的NSCLC藥物包含於分析中用於比較。Tarceva®或埃羅替尼顯示HCC827生長的部份抑制低至最低濃度，顯示該化合物具有低於3.0nM的IC₅₀ 。除此細胞株外，對於Tarceva®或埃羅替尼所測定的所有其他IC₅₀ 皆大於10μM(表2)此也與已經公開的其他先前技術文獻相符^12,13 。放線菌素D為化療藥物，單純使用作為所有試驗的品質管控。

於2D細胞增生分析中，細胞培養於含有10% FCS與盤尼西林/鏈黴素的DMEM中。對於該等分析，將細胞接種於150μL培養基的96-孔盤且在添加化合物之前於37℃培養一夜。化合物製備為最終分析濃度的16倍濃縮的預稀釋物。細胞接種一日後，對細胞添加10μL的預稀釋化合物(1：16稀釋)。以0.1% DMSO或1% DMSO(對於nsl-8的最頂二濃度)與1.0E-05M星型孢菌素(Staurosporine)分別處理細胞作為高對照(100%存活率)與低對照(0%存活率)。化合物對於細胞存活率的影響的測定如下述進行：5000個細胞(A549與and HCC827)或2500個細胞(H1299與H460)接種於96-孔盤的內壁於150μL完全培養基中。隔日，將化合物添加至培養基達最終濃度後於37℃根據培養基在5%或10% CO₂ 培養 72小時。後續添加10μL的阿爾瑪藍試劑(Alamar Blue reagent)且於37℃在5% CO₂ 中培養5小時後使用螢光計於590nm測定螢光。

將原始資料轉換為相對於高對照(對於藥物nsl-8的最頂二濃度的溶劑0.1% DMSO或1% DMSO)與低對照(1.0E-05M星型孢菌素)的細胞存活率百分比，其分別設定為100%與0%。使用GraphPad Prism軟體利用可變斜率S字型回應符合模式，使用0%細胞生長作為底下限且以100%細胞生長作為頂上限計算IC₅₀ 。如圖2與表2所測試的的四種NSCLC細胞株，對於nsl-8所測定的IC₅₀ 由2至11μM變化，顯示該藥物有效於延緩該等四種NSCLC細胞株各者的生長。

對於所研究的藥物先導分子的3D細胞增生：

藥物nsl-8進一步進行3D細胞增生以評估其抑制NSCLC腫瘤生長的潛力。使用於2D增生分析的相同四種 NSCLC細胞株生長於軟瓊脂且在瓊脂固化後添加藥物。然後將經添加藥物的細胞培養數日直到在溶劑對照中形成菌落。後續地，添加細胞存活率試劑的阿瑪爾藍且測定對應的螢光釋放作為於軟瓊脂中菌落生長的定量。製備14種濃度用於測定各化合物的IC₅₀ 且結果示於表3。

對於各細胞株，製備數個96孔培養盤。倒入100μL的軟瓊脂底層(完全培養基中0.6%濃度)且使其固化。然後添加50μL的含有對應細胞與細胞數的軟瓊脂頂層(0.4%最終濃度)，固化且將該96孔盤於37℃在10% CO₂ 中培養一夜。隔日，以所顯示的最終濃度將藥物添加至盤的內壁。後續地，分析物於細胞培養箱中培養所顯示的時期。最後，使用阿瑪爾藍展現分析物且於37℃培養3至5小時後測定螢光強度(激發：560nm，發散：590nm)。作為低對照，細胞以1.0E-05M星型孢菌素(6倍值fold values)處理。作為高對照，細胞以0.1% DMSO(溶劑對照，6倍值)處理。原始資料使用2D細胞增生分所揭示的相同步驟處理。於四種NSCLC細胞株各者對於NSL-8所測定的IC₅₀ 總結於表3。該等四種細胞株中對於NSL-8所測定的IC₅₀ 由0.99 to 13Mm變化，再次顯示該藥物有效於抑制四種NSCLC細胞株的生長。

對於所研究的藥物先導分子的小鼠異種移植模式：

所研究的藥物先導分子nsl-8的抗腫瘤藥效使用活體內皮下異種移植A549與HCC827肺癌腫瘤模式進行研究。如表4所詳述者，由各含有8只雌性BALB/c裸小鼠(A549：群組1a與1b)或10只雌性SCID小鼠(A549：群組2a與2b，HCC827：群組3a與3b)所組成之用於nsl-8治療的研究，加上5只雌性SCID小鼠(A549：群組2c,HCC827：群組3c)用於Tarceva®或埃羅替尼治療的研究。所有試驗使用5至6周齡的雌性BALB/c裸小鼠(接近重量：16-20g)(A549)或雌性SCID小鼠(接近重量：16-20g)(A549與HCC827)進行。小鼠於恒溫與恒濕條件下維持於個別飼養籠(IVC，最多每籠4只小鼠)。對於群組1a與1b的動物測定三次動物體重(週一、週三與週五)或對於群組2a-2c與3a-3c的動物測定二次動物體重(週一與週四)。每日監控動物行為。

於第0日，分別將100μL PBS中的2×10⁶ A549 或2×10⁶ HCC827腫瘤細胞植入至所有對應BALB/c裸鼠與SCID小鼠的左腹側皮下空間。接著，藉由卡尺測量測定腫瘤尺寸。腫瘤尺寸根據公式W² xLg/2(Lg=長度與W=腫瘤的垂直寬度，L>W)計算。於第48日或第30日，在平均腫瘤體積達接近100mm³ 時，根據腫瘤尺寸將對應之帶有腫瘤的動物隨機分為2群組，8只動物(A549模式：群組1a與1b)或10只動物(A549模式：群組2a與2b)。於第24日或第28日，在平均腫瘤體積達接近100mm³ 時，根據腫瘤尺寸將對應之帶有腫瘤的動物隨機分為2群組，10只動物(HCC827模式：群組3a與3b)。對於各者指定具有5只動物的第三群組(2c與3c)保留用於Tarceva®或埃羅替尼的治療。使用下述公式計算腫瘤生長抑制(TGI)的百分比：%TGI=[1-(T/C)]×100%其中T與C分別表示治療群組與對照群組的平均腫瘤體積。

於同一日，開始以藥物nsl-8、Tarceva®或埃羅替尼的治療，以及載劑對照(詳細內容參照表4)。如表4所示，除了群組1a與1b中的動物利用腹腔注射(i.p.)途徑治療外，其他群組的所有動物皆利用經口投藥(o.p.)途徑治療。為了製備每日nsl-8劑量溶液用於治療群組1a與1b，秤重158.4mg的nsl-8且溶解於19.5ml的DMSO得到最終濃度為每毫升DMSO為8.123mg藥物。將溶液以每管650μl的量分取置數個15ml無菌離心管後，於使用前儲存於-80℃。為了製造用於注射群組1a或1b動物的每日劑量溶液，自-80℃冷凍櫃取出分取液且於冰上溶解後與5.85ml的0.5% w/v甲基纖維 素(Sigma；M0512-110g；Lot# 079K0054V)於PBS pH 7.4(PAA；H21-002；Lot-# H00212-1920)中混合，亦即製備10% nsl-8 DMSO母液於甲基纖維素懸浮物中。如表4所示，載劑對照群組1a、2a與3a的動物分別每日一次於第48至66日經由腹腔注射途徑接受49.24毫升/公斤的載劑且經由經口投藥途徑每日一次於第1日至第14日接受74.36毫升/公斤的載劑。群組1b的動物每日一次於第48至66日經由腹腔注射途徑接受40毫升/公斤的nsl-8劑量溶液，而群組2b與3b的動物則分別於第1至第14日(群組2b)與第1至第14日(群組3b)經由經口投藥途徑接受每日一次70毫升/公斤的nsl-8劑量溶液(表4)。再者，群組2c與3c的動物每日一次於第1至第14日經由經口投藥途徑接受20毫克/公斤的Tarceva®或埃羅替尼(表4)。

群組1a與1b(A549模式)於第69日結束，而群組2a至2c(A549模式)與3a至3c(HCC827模式)於第15日結束。於屍體解剖時，動物藉由頸椎脫臼法犧牲。測定主要腫瘤重量與體積。腫瘤體積與重量使用描述性資料分析(平均值、標準差、中值)進行分析。藥效資料的統計分析使用未配對t-test進行。所有資料分析使用自GraphPad軟體公司(美國，加州，聖地牙哥)取得的GraphPad Prism 5進行。

也在試驗終點收集群組2a至2c與3a至3c動物小鼠血漿用於評估在載劑、nsl-8或Tarceva®或埃羅替尼治療後，其對應的腎臟與肝臟是否功能正常。測定血液尿素氮(BUN)的血清程度用以評估腎臟功能而使用Ektachem DT系統(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics)測定丙胺酸胺基轉移酶(ALT)與天冬胺酸胺基轉移酶(AST)的血清程度用以評估肝臟功能。也收集EDTA處理抗凝血血液樣品藉由使用Hematology Analyzer(Sysmex,XT-1800i)用於製造完全週邊血計數。

對於群組1a與1b(A549模式)動物以藥物nsl-8的治療開始於第48日且終止於第69日。於第48至第69日的完整治療期間，動物未連續地利用nsl-8治療。替代地，由於於治療動物中觀察到明顯的體重損失，為避免造成治療受到質疑的動物倫理理由，於第48至第52日以及第62日至第66日的治療之間有中斷(圖4)。事實上，如圖5所示，自第48至至第52日利用nsl-8治療後於動物中觀察到16%體重損 失。然而，在中斷治療數日後，動物能由該等體重損失回復(圖5)。再治療動物的體重損失回復後，自第62至至第66日恢復第二治療週期(圖5)。此第二治療週期再次造成體重損失(圖5)。然而，由於在某些動物中腫瘤潰瘍的存在，在第69日終止研究群組1a與1b。應注意利用載劑治療的動物中的體重損失也在治療的最終階段觀察到(圖5)。我們推測該等損失可能因所製備載劑中10%DMSO的存在所引起。然而，如圖4與圖6所示，餘地69日完成研究後觀察到腫瘤尺寸的顯著減少(P=0.0838)或可注意的抗腫瘤藥效。如圖6所示，經由腹腔注射途徑以40毫克/公斤的nsl-8治療，相較於載劑群組者，於腫瘤尺寸引起約50%減少。如果於全治療期間沒有因道德理由所強迫的中斷，nsl-8的抗腫瘤藥效應更為顯著。

為了進一步研究活體內藥物nsl-8的抗腫瘤藥效，分別經由經口投藥途徑以劑量70毫克/公斤對群組2b與3b的20只SCID小鼠投藥。符合藉由經口投藥途徑分別以20毫克/公斤的劑量對群組2c與3c的10只SCID小鼠投藥，於此研究中本發明也採用Tarceva®或埃羅替尼作為對照。對此研究，製備於DMSO的0.161ml的nsl-8母液與1.339ml的0.9% w/v的生理鹽水混合以使製備用於餵食動物的最終劑量溶液的體積為1.5ml且含有10% DMSO。因此，使用於治療群組2a至2b與3a至3b動物的投藥途徑與載劑相當不同於使用於群組1a至1b動物者。如圖7所示，於利用每日餵食70毫克/公斤的nsl-8群組2b動物中A549植入腫瘤的生長，於14試驗日期間以增加比例由7.1至19.1%逐漸抑制。 相反地，藉由餵食20毫克/公斤Tarceva®或埃羅替尼的群組2c動物顯示A549植入腫瘤的生長沒有抑制(圖7)。此符合表2所示的藉由添加Tarceva®或埃羅替尼的A549細胞株的生長幾乎無受到抑制。然而，如表2與圖8所示，Tarceva®或埃羅替尼非常有效於抑制HCC8274細胞株生長或以每日20毫克/公斤的劑量餵食的帶有HCC827腫瘤的動物的生長。如圖8所示，於利用每日餵食70毫克/公斤的nsl-8群組3b動物中HCC827植入腫瘤的生長，於全試驗日期間以增加比例由16.6至28.7%逐漸抑制。因此，活體內的試驗(圖7與圖8二者)進一步證實nsl-8於治療A549與HCC827植入腫瘤二者的藥效。

也監控全試驗期間群組2a至2c與3a至3c動物的體重變化且分別呈示於圖9與圖10以及表7及表8。全試驗期間以每日70毫克/公斤餵食nsl-8的群組2b與3b動物的體重有輕微降低。於完整的試驗中觀察到群組2b或3b動物的體重的2.0或3.8%減低(圖9與圖10以及表7及表8)。此並未違反道德理由，雖然顯示於圖5的每日經注射40毫克/公斤nsl-8的群組1b動物的結果相反。

由以nsl-8與Tarceva®或埃羅替尼治療的A549異種移植小鼠所收集的周邊血液樣品的全血計數示於圖11。明顯地，白血球細胞、紅血球細胞或血小板相對於A549模式的載劑、nsl-8以及Tarceva®或埃羅替尼的治療群組未發現顯著差異。然而，由HCC827異種移植小鼠收集的周邊血液樣品的全血計數有明顯差異。如圖12所示，對於nsl-8治療動物可見到中性球與淋巴求的計數增加以及紅血球細胞計數的降低。對於相同模式的Tarceva®或埃羅替尼治療動物也有紅血球細胞計數的降低(圖12)。然而，在相同模式的載劑與藥物治療的所有群組的總白血球細胞與血小板計數沒有顯著差異(圖12)。在完整試驗中，也測定BUN、ALT與AST的血清程度，如圖13所示，在A549模式的所有治療群組中，BUN、ALT與AST的血清程度沒有顯著差異。類似地，在HCC827模式的所有治療群組中，BUN、ALT與AST的血清程度也沒有顯著差異(圖14)。因此，該等資料將顯示於全試驗期間每 日以70毫克/公斤餵食的動物中沒有明顯的毒性效果。

我們也發現藉由ADDock的Tarceva®或埃羅替尼對接至野生型2ity或雙突變酵素4i22的結果之間沒有顯著差異。藥物基本上對接至ATP通常是結合的中央催化性洞(圖15a與16a)。然而，藉由ADDock的nsl-8對接至野生型2ity(圖15b)或雙突變酵素4i22(圖16b)的結果之間有明顯差異。然而，藉由ADDcok對接nsl-8至野生型2ity(圖15)或雙突變酵素4i22(圖16b)的結果之間有明顯差異。再者，藉由ADDcok對接nsl-8至野生型2ity或雙突變酵素4i22的結果與Tarceva®或埃羅替尼者為相當不同。本文所研究的藥物先導分子nsl-8可能有用於治療經以Tarceva®或埃羅替尼治療而已發展出藥物抗藥性的患者。此為nsl-8與野生型或突變EGFR激酶功能域(圖15b與圖16b)的結合模式與Tarceva®或埃羅替尼(圖15a圖16a)的結合模式為相當不同的事實所支援。

根據活體內腫瘤生長的監控以及屍體解的觀察，於A549腫瘤模式中可見到經由腹腔注射途徑以40毫克/公斤的nsl8投藥具有P=0.0838的顯著抗腫瘤藥效。此藥效進一步於A549與HCC827腫瘤模式中經由經口投藥途徑以70毫克/公斤投藥nsl-8的活體試驗中第二次獲得確認。在第一次A549腫瘤模式研究中經由腹腔注射途徑藉由注射40毫克/公斤的nsl8觀察到腫瘤尺寸的50%縮減，而再HCC827與第二A549腫瘤模式研究中經由經口投藥界由餵食70毫克/公斤的nsl-8也觀察到腫瘤尺寸的28.7或19.1%的縮減。根據所監控的體重、所測定的血球計數以及所測定的BUN、ALT及AST 的血清濃度，經由經口投藥以70毫克/公斤的nsl-8每日劑量持續14日對於所治療的動物沒有觀察到明顯的毒性效果。然而，當動物利用經由腹腔注射途徑以40毫克/公斤治療時，觀察到體重的顯著降低。由於在nsl-8與載劑測試動物中接觀察到體重減低，我們猜測該等減低可由使用於製備劑型溶液的10%DMSO所引起。已知EGFR標靶於治療乳癌^14,15 、頭頸癌^16,17 、胰臟癌¹⁸ 、大腸癌^19,20 及膠質癌^21-23 。因此，對於治療NSCLC有效的nsl-8或阿達帕林，於本文經由對於二種小鼠異種移植模式的研究確認也有效於治療前述癌症。

揭示於本文的所有參考文獻，包含但不限於專利與公開文獻，其全文皆以參考方式併入本文。

雖然上述說明書伴隨所提供的說明用實施例，教示本發明的主旨，但此項技術領域者應瞭解本發明的實施涵蓋如同下述申請專利範圍與其均等物的範疇內的所有有用的變化、適用及/或修改。

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Claims (10)

1. 一種6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸或其醫藥可接受鹽的用途，其中該用途是用於製造一種治療需要該治療的個體的癌症的藥劑，其中該癌症是肺癌或非小細胞肺癌。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該需要該治療的個體是哺乳動物。
3. 如申請專利範圍第2項所述的用途，其中該哺乳動物是人類。
4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該癌症是肺癌。
5. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該癌症是非小細胞肺癌。
6. 如申請專利範圍第5項所述的用途，其中該需要該治療的個體是處於或曾經接受吉非替尼(Gefitinib)或埃羅替尼(Erlotinib)的治療。
7. 如申請專利範圍第5項所述的用途，其中該需要該治療的個體已發展出對於吉非替尼或埃羅替尼的抗藥性。
8. 如申請專利範圍第5項所述的用途，其中該6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸或其醫藥可接受鹽投藥至該個體的每日劑量是由老鼠的每日劑量約40毫克/公斤體重換算得到。
9. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該藥劑呈溶液形式經由腹腔注射途徑投藥該個體。
10. 如申請專利範圍第9項所述的用途，其中該溶液是經由將6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸溶解於有機溶劑，以及將6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸的有機溶液與水性溶液混合而製備。