TWI481712B - 從菇類栽培後基質製造木質分解酵素及其用於去除有機毒化物之用途 - Google Patents

Description

從菇類栽培後基質製造木質分解酵素及其用於去除有機毒化物之用途

本發明係關於利用白腐真菌(white rot fungi)之栽培後基質(一般俗稱“太空包”)生產及純化木質分解酵素之改良方法，特別是關於製造漆化酵素之方法。本發明亦關於經由本發明之方法所製得之木質分解酵素用於去除有機毒化物的用途。

人類為了追求更舒適便利的生活，大量合成及使用化學物質，其中有一群特殊的有機化學污染物稱為新興污染物(emerging contaminants)。此類污染物共同特質為法規上未規範或規範不全，傳統都市汙水處理廠無法處理且對人體健康與生態潛在危害性既深且遠，包括廢水排放之有機污染物、工業用化學物質、藥品和個人保健用品及內分泌干擾物質。其中內分泌干擾物質係指外因性干擾生物體內分泌之化學物質，國際通用名稱為環境荷爾蒙。生活中舉凡蔬菜、水果、魚貝類、清潔劑、殺蟲劑、化妝品等用品及環境介質如空氣、土壤及水體，都可能含有環境荷爾蒙物質的殘留。人類長期暴露於環境荷爾蒙物質下，可能已無意間成了環境荷爾蒙的受害者，環境荷爾蒙的影響已引起國際上歐美日等國的重視。

其中壬基酚(nonylphenol)、鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters)及雙酚A(bisphenol-A)此三類物質，於科學上皆有證據顯示具有影響動物生理功能內分泌之作用(Keith與Telliard,1979;Environmental Science Technology 13:416-423,1979)。彼等在低濃度下具類似天然荷爾蒙的作用，可直接刺激或抑制生物的內分泌系統，進而阻礙生殖、發育等機能，甚至有引發惡性腫瘤與生物絕種的危害。國內學者也證實鄰苯二甲酸酯類及壬基酚對懷孕期胚胎或成長初期的影響(Chen等人,Environment International 34:79-85,2008)。由於環境水體中此類有機污染物殘留日益嚴重(Yuan等人,Chemosphere 49:1295-1299,2002)，如何開發產品以降低其毒性，進而減低對人類及生態的危害為一急需考慮解決問題。

白腐真菌含有胞外木質素分解酵素系統，該酵素系統包括漆氧化酵素(laccase)、木質素過氧化酵素(LiP)和錳離子過氧化酵素(MnP)等三類酵素，能對木材進行脫色作用，並產生白色斑點，而被命名為白腐真菌。木質素分解酵素系統具有低受質特異性、高效的分解作用、低耗能的反應進行及高適用性的特點，已被應用在許多難分解的芳香類化合物如多環芳香族碳氫化合物、DDT、氯酚化合物、染料等污染物的去除(Paszczynski與Crawford,Biotechnology Progress 11:368-379,1995;Schultz等人,Applied and Environmental Microbiology 67:4377-4381,2001；Lee等人,Enzyme Microbiology Technology 35:417-423,2004)。其特殊的降解機制在飼料工業、化學工業、煤炭化學和環境保護方面展現無限的應用前景，引起學術界和工業界的廣泛關注(Mendonca等人,Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology 35:1323-1330,2008)。

上述三種酵素中又以漆氧化酵素為主，漆氧化酶主要存在於白腐真菌中，為分解木質素時所分泌的酵素，為含銅的氧化還原酶，也是單電子氧化還原酶，受質特異性低，能對包括酚類化合物在內的多種芳香族碳氫化合物進行氧化性聚合和聚解，亦能對氯酚(chlorophenol)進行脫氯作用(等人,Soil Biology and Biochemistry 36,909-916,2004)。漆氧化酶作用機制是以本身的銅離子為電子接受者，接受來自還原受質的電子後，將電子由受質傳遞到氧分子上產生水，使受質氧化成帶有不穩定的正價自由基，且伴隨著氧氣的消耗，漆氧化酶作用的受質也可以藉由電子傳遞介質的存在而增加應用範圍，之後再進行重整後，產生烷基-芳香基的解離和支鏈及芳香環的裂解而降解木質素，因自由基的反應是屬於高度非特異性及無立體選擇性，使白腐真菌與降解物之間並無一一對應關係，對汙染物的降解則呈現廣譜特性。

白腐真菌中靈芝類生物分佈於世界各地，目前在台灣已被發現約有12種，其中又以赤芝(Ganoderma lucidum )最為常見。我國幾千年來即使用靈芝作為的藥材，其具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗過敏、預防高血壓及預防老化藥效。台灣人工栽培的靈芝技術可分為兩種方式，一種是於發酵槽中接菌進行液體培養，可以大量生產，且生產週期短。另一種是以太空包接菌進行固態培養，此種生產方式可以得到靈芝的子實體，但是生長期較長。估計全球靈芝產品的年產值超過25億美元，台灣年產量約1萬2千公噸。靈芝太空包栽培時，接種菌絲體至填充木屑及適當營養源之太空包。台灣近年來以大規模太空包栽植，提高靈芝產量，供應市場需求，而產生許多採收後培養基質，根據統計產生1kg的子實體會產生5kg的太空包廢棄物(Lau等人,Chemosphere 52,1539-1546,2003)。

此外近年來台灣栽培食用菇之生產量、種類及需求量不斷擴增，消費量有顯著增加趨勢。其中杏鮑菇(Pleurotus eryngii )屬食用菇的一種，營養成分含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質及人無法製造的胺基酸，其風味、質地及烹煮特性深受消費者喜愛，被譽為蠔菇類的極品。杏鮑菇為蠔菇屬的一種白腐真菌，具有強大分解木質纖維素的能力(Victor等人,European Journal of Biochemistry 268:4787-4793,2001)。目前國內菇類栽培主要以太空包或聚丙烯塑膠瓶方式為主，年產量達2000公噸以上。依據台中縣環保局資料顯示2006年鮮菇類生產量為115,000公噸，每年平均有1億3,255萬個太空包進行菇類生產，每包以乾重300-400公克計，採收後約產生39,765至53,020公噸以上之培養基質。

由於大部分菇類屬於白腐真菌，研究已發現太空包採收菇體後，其內容物仍含有豐富有機質及植物營養成分，且其萃出液含有多量木質素分解酵素(Ball與Jackson,Bioresource Technology 54,311-314,1995)。然而利用靈芝及杏鮑菇等白腐真菌生產木質素分解酵素，去除有機毒化物，經調查顯示國內外有關此技術之研發並不多。若能開發利用靈芝及杏鮑菇等採收後培養基質於工業大量生產此酵素，來源更為充足，成本更為低廉，且可作資源回收再利用，並達到節能減碳之目的。

目前關於從菇類栽培後基質製造木質素分解酵素，以及其應用於去除環境汙染物之研究並不多見。經查全世界申請靈芝相關專利的數量已超過1,000件，中國是申請最積極的國家計有947件，我國科學家亦已研發出173項專利。其中國內與靈芝培養有關之專利係關於靈芝的生物體培養裝置及生物體培養方法(公開號碼為200300449)，以及2009年12月2月登錄之面膜改良(公告號碼為098203845)等。然而歸納這些專利可發現，彼等多屬靈芝液態及固態之培養方法、多醣體及靈芝酸之萃取方法，以及作為保健食品、化妝品、食品或飲料等應用。有關杏鮑菇相關專利之申請，我國科學家僅有19項，中國亦僅有24項，多為杏鮑菇培養方法、多醣體萃取方法，及作為化妝品、食品或飲料等應用。並無涉及從靈芝及杏鮑菇栽培基質製造木質素分解酵素的方法，以及其萃取得之木質素分解酵素應用於去除環境汙染物。

因此，本發明經由一系列研究建立，以白腐真菌(例如靈芝及杏鮑菇)之栽培後基質生產木質素分解酵素的最佳條件與酵素純化過程，並利用所萃取出的特有木質素分解酵素去除壬基酚、鄰苯二甲酸酯類、雙酚A等有機毒化物質，以減少環境污染並促進資源回收再利用，進而完成本發明。

於一方面，本發明係關於一種自白腐真菌之栽培後基質生產及純化木質分解酵素之方法，其包含下列步驟：將經白腐真菌子實體採收後之栽培後基質(組成包含木屑、米糠與麥糠)存放於4℃下以維持酵素活性；於4-20℃下以基質和緩衝液比例為1:5至1:25的醋酸鈉-醋酸緩衝液(0.2M,pH 5)進行酵素萃取三小時至一天；及以8000rpm離心15分鐘，取上清液而得到酵素萃取液。

本發明所使用的“栽培後基質”意指，菇類以太空包或聚丙烯塑膠瓶培養，在供食用之子實體採收後所殘留下來的基質部分。

於本發明之一項具體態樣，其中該栽培後基質於4℃下之萃取前存放期不超過兩個月，最好是不超過1個月。於本發明之另一項具體態樣，本發明之純化方法進一步包括將酵素萃取液加入50-100%硫酸銨(ammonium sulfate)進行鹽析；將鹽析後的產物移入透析膜(12-14kDa)進行透析(0.01M磷酸鹽緩衝液pH 7.0)；及回收與濃縮得酵素蛋白質等步驟。

於本發明之一項具體態樣，該栽培後基質係來自靈芝栽培後基質，於再一項具體態樣，該栽培後基質係來自赤芝(Ganoderma lucidum )之栽培後基質。於本發明之一項具體態樣，該栽培後基質係來自靈芝類之太空包培養。

於另一項具體態樣，該栽培後基質係來自杏鮑菇(Pleurotus eryngii )之栽培後基質。於本發明之再一項具體態樣，該栽培後基質係來自杏鮑菇之太空包培養。於本發明之再一項具體態樣，該栽培後基質係來自杏鮑菇之太空包培養。

於另一方面，本發明係關於一種用於分解環境荷爾蒙之組成物，其包含經由本發明方法所製得之酵素萃取液、磷酸鹽緩衝液(0.2M,pH 5.0)、triton X-100(1%)及2,2^‘ -Azino-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS,0.5mM)。於一項具體態樣，該環境荷爾蒙為壬基酚(nonylphenol)。於另一項具體態樣，該環境荷爾蒙為鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters)。於又一項具體態樣，該環境荷爾蒙為雙酚A(bisphenol-A)。

術語“環境荷爾蒙”用於本文意指會外因性地干擾生物體內分泌之化學物質，例如壬基酚、鄰苯二甲酸酯類、雙酚A等。其中壬基酚所帶來的危害逐漸被重視是因為其化學結構似生物雌激素(17β-estradiol)，具有干擾生物賀爾蒙的能力。前人研究也證實壬基酚可藉由與人類雌激素受器結合，進而刺激乳癌細胞的增生。壬基酚為無色透明液體、強疏水性、低水溶性等特性，於環境中之累積量相當高。壬基酚為台灣環保署列管的第一類毒化物質，然而2008年台灣環境品質文教基金會調查報告公佈仍顯示市售洗碗精、洗衣精、浴廁清潔劑有三分之一產品含過量的壬基酚聚乙氧基醇類。其中洗碗精可能因碗盤未洗淨而隨食物進入人體。

鄰苯二甲酸酯類為一種增塑劑，具有芳香氣味的無色液體，高分子量、低揮發性、難溶於水，易溶於多數的有機溶劑中。台灣在食衣住行上大量使用塑膠類製品，而塑膠的塑化劑添加鄰苯二甲酸酯類比率很高，許多塑膠袋、免洗餐具、雨衣、玩具，甚至於化妝品都含有此類化合物。在高溫或使用時間增加的情況下，這些塑膠製品就會釋出此類有害物質，溫度愈高其有害物質溶出量更明顯增加。其中鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)及鄰苯二甲酸二丁酯為台灣環保署公告的第四類毒性化學物質。

雙酚A主要用於生產聚碳酸酯塑化產品，包括嬰兒奶瓶、兒童玩具、可重複使用的杯子水壺、可微波的食品容器、電機設備、運動頭盔、汽車零件、眼鏡鏡片等。此類化合物進入人體的途經包括嬰兒用的奶瓶、罐頭食品的內附膜、牙齒的填充劑或是其他電子、電機產品的阻燃劑等。其中較擔憂的是嬰兒用的奶瓶，嬰兒對化學物質及環境荷爾蒙最敏感，造成的影響往往相當深遠和嚴重。國內環保署於2009年4月新增公告為第四類毒性化學物質。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。除非另有規定，本發明所涉及的科學和技術所用詞彙和一般普通技能所使用的詞彙為相同的，若是有所衝突的情況下，本發明將會給予名詞新的定義。

根據本發明所呈現的各種實施例，下述各種儀器、裝置、方法和其相關結果者，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。此外，在此所提出和披露的某些理論，但無論他們是對還是錯，只要該創作是根據本發明所實施的，而不需考慮任何特定的理論或行動的計畫，都應被限制在本發明的範圍之內。

實施例

於本發明所載述之實驗中所使用之靈芝赤芝(Ganoderma lucidum )及杏鮑菇(Pleurotus ostreatus )太空包，係回收自台中縣新社鄉某菇類農場，其中成分為木屑、米糠、麥糠等。

Murugesan等人(Enzyme Microbial Technology 40,1662-1672,2007)發現漆氧化酶為靈芝脫色主要作用酵素，因此於本發明實施例所述之研究中，係以漆氧化酵素為主進行酵素活性分析。漆氧化酶分析方法如下：以甘胺酸(100mM，pH 3)：ABTS(4mM)：酵素上清液為1：1：2的比例混合，反應5分鐘。接著使用光電比色計，在波長405nm下測試吸光值的變化。酵素活性以U表示，表示每毫升中，受質經酵素催化後每分鐘μmole產物生成量。漆氧化酶活性染即利用前述的漆氧化酶分析試劑，將膠片滴滿4mM ABTS，數秒後開始呈色，以掃描機保存影像後，在室溫下，放入考瑪斯藍(coomassie blue)緩慢震盪(60rpm)30分鐘進行蛋白質染色，最後放入退染液中緩慢震盪，更換退染液數次直至背景透明即可，隨即以清水浸潤過之玻璃紙進行封片，陰乾後護貝保存。

結果分析：(1)殘留量(%)：(剩餘濃度/原始濃度)×100%，去除效率(%)：[(原始濃度-剩餘濃度)/原始濃度]×100%；(2)酵素活性計算，計算公式：△A=εIC，C=△A/εI，U=C/t=(△A/εI)/t。△A：單位時間內吸光值變化量，C：濃度，ε：吸光常數，t：反應時間，I：吸光直徑，U：酵素活性。註：液體培養方面以U/L表示每升培養基所含的酵素活性，固態培養方面則以U/g呈現，表示每克基質所含酵素活性。

數據統計分析：以軟體SPSS的成對T-test分析數據間的差異性。*P<0.05為有顯著差異。

實施例一：建立由菇類栽培後基質最佳生產木質素分解酵素的產量條件

為研究採收後之菇類栽培後基質中的酵素活性是否會因太空包的存放時間(新鮮度)而有所影響，遂將剛採收之菇類太空包存放 於4℃下，於固定分析時間點取出，偵測其中漆氧化酵素活性。由圖1之結果顯示，存放時間越長漆氧化酵素活性表現量也隨之減少，約為每個月減少1U/g，存放九個月時，漆氧化酵素活性表現量只剩0.4U/g，試驗應在固定的時間內完成，以減少其他因素對實驗結果造成影響。

為測試出最佳的酵素萃取條件，首先決定最佳的酵素萃取緩衝液，培養後基質與緩衝液之固液比例，作用之溫度與pH值以及酵素萃取震盪時間。

測試不同萃取的震盪時間為3小時、1天、4天於4℃下，對於太空包中漆氧化酵素的表現量影響。不同萃取時間對於靈芝栽培後基質中漆氧化酵素的表現量如圖2A所示，漆氧化酵素在震盪三小時的表現量和震盪一天結果並無顯著差異，而經四天震盪後漆氧化酵素的表現量有些微的下降。杏鮑菇栽培後基質中漆氧化酵素的表現量，分別在不同時間萃取酵素的表現量結果顯示並無顯著性差異(圖2B)，因此設定較佳的酵素萃取時間為震盪三小時。

利用不同緩衝液：磷酸鹽緩衝液pH 7、磷酸鹽緩衝液pH 5.8、醋酸鈉-醋酸緩衝液pH 5、及醋酸鈉-醋酸緩衝液pH 4.5，於4℃下萃取基質中的酵素，並測試對漆氧化酵素(laccase)活性之影響，而選擇出最佳用於萃取酵素之緩衝液。由圖2之結果顯示，利用不同緩衝液包括醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)、醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 4.5)、磷酸鹽緩衝液(pH5.8)、磷酸鹽緩衝液(pH 7)，4℃下萃取基質，對漆氧化酵素(laccase)活性之影響。靈芝栽培後基質如圖2(A)所示，震盪萃取三小時後，結果顯示醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)> 醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 4.5)>磷酸鹽緩衝液(pH5.8)>磷酸鹽緩衝液(pH 7)。杏鮑菇栽培後基質如圖2(B)所示，震盪萃取三小時後，結果顯示醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)>醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 4.5)>磷酸鹽緩衝液(pH5.8)>磷酸鹽緩衝液(pH 7)，顯示醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)萃取之酵素活性最高，而以醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)作為菇類栽培基質最佳萃取酵素之緩衝液。

利用不同基質與緩衝液比例，於4℃下萃取基質中的酵素，測試對漆氧化酵素(laccase)活性之影響。將靈芝及杏鮑菇基質和緩衝液比例調整為1：5、1：10、1：25的量，經震盪萃取後，測試其漆氧化酵素活性的表現量。經震盪萃取後測試其漆氧化酵素活性的表現量如圖3所示，亦顯示以1：5靈芝及杏鮑菇基質與緩衝液比例為最佳條件。

將太空包內容物利用不同萃取條件，包括不同的緩衝液、pH值，分別置於4、20、30℃條件下，於固定分析時間點取出，分析其中漆氧化酵素活性，選擇酵素最適作用之溫度。杏鮑菇及靈芝栽培基質在不同溫度4、20、30℃條件下經萃取後，對於漆氧化酵素活性表現量之影響列示於圖4。結果顯示靈芝以醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)緩衝液萃取為例，在4℃、20℃時漆氧化酵素值分別為0.7U/g和0.57U/g，而30℃高溫下緩衝溶液萃取之酵素活性則下降至0.3U/g，而選擇4℃作為酵素萃取的最適溫度。杏鮑菇以醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)緩衝液萃取，亦得到相同結果。

綜合上述之結果，於菇類栽培後基質之最適反應條件中，萃取時間以震盪三小時萃取漆氧化酵素最佳，緩衝液則使用醋酸鈉- 醋酸緩衝液(pH 5)作為實驗菇類栽培基質最佳萃取酵素之緩衝液。最適溫度以低溫4℃為萃取時為最佳溫度，杏鮑菇栽培基質酵素活性大於靈芝菇類栽培基質。存放溫度顯示在4℃有良好的酵素活性維持，且隨著溫度越高漆氧化酵素活性反而會越低。

關於粗酵素萃取液之進一步純化，係將以離心、過濾去除菌絲的培養液進行鹽析：緩慢的加入事先烘乾並磨細的硫酸銨(ammonium sulfate)，利用硫酸銨與水分子的作用力大於水分子與蛋白質的作用力，使蛋白質的水合程度降低，使蛋白質沉降出來。25℃下飽和度先加硫酸銨到50%的飽和度，以防局部硫酸銨濃度過高造成蛋白質沉澱，一邊緩慢加入並攪拌。蛋白質會在不同的飽和度沉降出來，若有混濁或沉澱表示蛋白質析出，將混合液離心取沉澱物(Beckman JA-18，8000rpm，4℃，15min)，上清液繼續加入硫酸銨至100%的飽和度，將此培養液分裝於離心管中，取沉澱物。

鹽析後的產物須將鹽分去除，因此需進行透析步驟。將沉澱物以乾淨的刮勺移入透析膜(12-14kDa，先以沸水煮過，去除膜上之抗真菌粉末，淨泡水中冰於4℃保存)，透析膜內勿有空氣，進行透析：0.01M磷酸鹽緩衝液pH 7.0中，4℃，緩慢攪拌，透析2小時後，置換緩衝液，再進行第二次長時間過夜透析。透析結束後，收集樣品蛋白質，保留少許以待測漆氧化酵素的活性、蛋白質濃度定量，其餘樣品置於-20℃冷凍庫中保存。靈芝及杏鮑菇栽培後基質之酵素純化結果如下表一所示，經純化後可有效提升漆氧化酵素之活性。

實施例二：調製具有較佳酵素活性之組成物

菇類粗萃液經純化後，由於酵素是具有活性的分子，可能隨時失去活性，因此於本實施例藉由研究出適合得自栽培後基質之酵素的各種最佳環境與條件，以使酵素能保持在最安定的狀態。其中酵素的緩衝液是最關鍵的因素，此外可在緩衝液中常加入一些物質，以增加酵素安定或保持活性，及控制緩衝液在不同溫度。

將菇類粗萃液經純化後定量添加不同的緩衝液包括：甘胺酸緩衝液(Glycine buffer,pH 3)、磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffer,pH 5.8)、磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffer,pH 7)、醋酸鈉-醋酸緩衝液(acetic acid buffer pH 4.5)及醋酸鈉-醋酸緩衝液(pH 5)，於4、20及30℃下偵測漆氧化酵素活性變化。如圖5(A)所示，於4℃下以磷酸鹽緩衝液，pH為5.8之緩衝液中酵素活性為42.5U/L，其次為甘胺酸緩衝液pH 3，酵素活性降至35.8U/L，醋酸鈉-醋酸緩衝液pH 4.5為33.2U/L，而以醋酸鈉-醋酸緩衝液pH 5與磷酸鹽緩衝液pH 7效果較差，分別為28.7U/L及25.4U/L。結果顯示，靈芝栽培後基質酵素萃取液產生的漆氧化酵素，比較適合在偏酸的環境下進行作用，而以磷酸鹽緩衝液，pH為5.8為酵素活性穩定的最佳緩衝液。

在酵素純化液中依上述結果，最佳緩衝液為磷酸鹽緩衝液pH 5.8，分別與添加物質包括triton X-100、tween 80、EDTA、β-巰基乙醇，進行反應偵測酵素活性。如圖5(B)所示，添加介面活性劑以triton X-100較能維持良好的酵素活性，而加入抗氧化劑β-巰基乙醇，其漆氧化酵素明顯被抑制。因此以Triton X-100作為日後酵素安定的添加物，使酵素保持在最安定的狀態。

為研究加入不同添加物對壬基酚去除的影響，遂於不同菇類栽培後基質酵素萃取液中加入CuSO₄ (1mM)、MnSO₄ (0.5mM)、酒石酸(tartaric acid)(20mM)、ABTS(0.5mM)、1-羥基苯並三唑(1-hydroxybenzotriazole,HBT)(0.5mM)及remazol brilliant blue R(0.01mM)對2mg/L壬基酚去除效率如表二所示。靈芝添加CuSO₄ 、MnSO₄ 、酒石酸、ABTS、1-羥基苯並三唑及remazol brilliant blue R，反應1天壬基酚去除率分別為86.3%、88.3%、93.7%、99.0%、91.5%及92.4%。而杏鮑菇添加靈芝添加CuSO₄ 、MnSO₄ 、酒石酸、ABTS、1-羥基苯並三唑及remazol brilliant blue R，反應1天壬基酚去除率分別為88.8%、90.4%、95.8%、99.3%、93.9%及95.5%。結果顯示菇類基質酵素去除壬基酚效率為杏鮑菇>靈芝，添加六種添加物與未添加之控制組比較，對壬基酚去除皆有促進作用，而在六種添加物中以ABTS最能有效去除壬基酚。

實施例三：菇類栽培後基質之木質素分解酵素清除環境荷爾蒙之功效

依實施例二中所述的結果，加入於最佳條件獲得之酵素溶液，分別加入2mg/L之壬基酚(nonylphenol,NP)，鄰苯二甲酸酯類包括鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)，及雙酚-A(bisphenol-A,BPA)，於30℃振盪反應，於固定分析時間點取出樣品分析三類化合物濃度。該三種毒化物之分析方法如下所述。

壬基酚 ：取樣加入鹽酸及二氯甲烷，於超音波震盪器震盪10分鐘，重覆添加正己烷萃取二次，以GC-MSD分析。使用DB-5 MS毛矽管管柱，分析條件起始溫度80℃停留1分，升溫速率30℃/min至200℃停留兩分，升溫速率10℃/min至300℃停留兩分。分析條件trap、manifold及transfer line，溫度為200℃、50℃及300℃。定量以單位時間內樣品特徵斷裂碎片峰，累積圖總面積作為定量依據，以m/z 135+149計量。壬基酚之回收率及偵測極限分別為92.3%及50μg/L。

鄰苯二甲酸酯類 ：取樣加入正己烷，於超音波振盪器震盪10分鐘，重覆添加正己烷萃取二次，以GC-FID進行分析。層析管柱：DB1701 capillary column。分析條件為流速為0.27mL/min，輔助氣體流速為60mL/min，分流比為20/1，管柱初溫為150℃以每7℃速率升溫至220℃，二階段升溫為每分2.5℃升溫至260℃。終溫260℃維持8分鐘。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)及鄰苯二甲酸二丁酯之回收率分別為95.5,及97.5%，偵測極限則為1.0及1.0μg/L。

雙酚-A ：取樣加入正己烷，以震盪器震盪2分鐘，置於超音波震盪器震盪5分鐘，重覆添加正己烷萃取二次，取懸浮液以0.2μm PTEF濾膜過濾，以HPLC分析。分析條件為動相組成為氰甲烷和超純水，條件為流速1mL/min，注射成分為50(%)：50(%)，螢光偵測器激發波長和散射波長分別為280及320nm。雙酚-A之回收率及偵測極限分別為96.3%及100μg/L。

杏鮑菇及靈芝基質酵素對於有機毒化物質之去除效率如表三所示，反應1天杏鮑菇基質酵素對2mg/L之壬基酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)及雙酚-A之去除效率分別為99.1%、100.0%、93.7%及98.2%；反應1天靈芝基質酵素對2mg/L之壬基酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)及雙酚-A之去除效率分別為99.9%、100.0%、95.7%、99.0%。顯示杏鮑菇及靈芝基質酵素添加ABTS能有效去除壬基酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)及雙酚-A等有機毒化物質，且杏鮑菇基質酵素去除效果大於靈芝基質酵素。

由前述之結果顯示靈芝及杏鮑菇對有機毒化物之去除有極佳效果，而以杏鮑菇更佳。此外杏鮑菇栽培後基質經酵素純化後對BPA之去除，於質譜圖中代謝產物的產生如圖6所示，經NIST資料庫比對後為2,4-雙(1,1-二甲基乙基)，推測為BPA之中間代謝產物。

根據本發明證實，靈芝及杏鮑菇等栽培後基質生產木質素分解酵素具有去除毒化物之能力，因此本發明已開發利用靈芝及杏鮑菇等白腐真菌採收後培養基質於工業大量生產此類酵素，使其來源更為充足，成本更為低廉，且可作資源回收再利用，並達到節能減碳之目的。將靈芝及杏鮑菇採收後培養基質為原料來生產木質素分解酵素，作成綠色產品，將我們生活環境中許多殘留化學品一一去除，達到資源回收再利用，並加以應用於去除我們日常生活中食用容器的洗滌、嬰兒奶瓶、天然洗潔精等之清洗，甚至開發新一代二次洗潔精等以去除所殘留之化學品，增加環境永續生產，亦是本發明另一可行的應用方向。

以上的描述及圖式已揭示本創作之較佳實施例，必須瞭解到各種增添、修改和取代可能使用於本創作較佳實施例，而不會脫離如所附申請專利範圍所界定的本創作原理之精神及範圍。熟悉該技藝者將可體會本創作可能使用於很多形式、結構和材料的修改。因此，本文於此所揭示的實施例於所有觀點，應被視為用以說明本創作，而非用以限制本創作。本創作之範圍應由後附申請專利範圍所界定，並涵蓋其合法均等物，並不限於先前的描述。

圖1顯示於進行酵素萃取前，存放時間對太空包漆氧化酵素活性影響，測試時間點為0、4及9個月。

圖2顯示菇類栽培基質在4℃條件下利用不同緩衝液萃取，對漆氧化酵素(laccase)活性之影響。其中(A)靈芝；(B)杏鮑菇。

圖3顯示菇類栽培基質與緩衝液以不同固液比例，對漆氧化酵素活性之影響。其中(A)靈芝；(B)杏鮑菇。

圖4顯示菇類栽培基質在不同溫度下，經震盪培養萃取後，漆氧化酵素(Laccase)的表現量。其中(A)靈芝；(B)杏鮑菇。

圖5顯示靈芝太空包酵素粗萃液經純化後，酵素活性的維持條件測試結果。(A)溫度，緩衝液；(B)添加物。

圖6為BPA於杏鮑菇栽培基質處理後之代謝產物分析結果。

Claims (5)

1. 一種自杏鮑菇之栽培後基質生產及純化木質分解酵素之方法，其包含下列步驟：(1)將經杏鮑菇子實體採收後之栽培後基質(組成包含木屑、米糠與麥糠)存放於4℃下以維持酵素活性；(2)於4-20℃下以基質和緩衝液比例為1：5至1：25的醋酸鈉-醋酸緩衝液(0.2M,pH 5)進行震盪萃取三小時至一天；(3)以8000rpm離心15分鐘，取上清液而得到酵素萃取液；(4)將酵素萃取液加入50-100%硫酸銨(ammonium sulfate)進行鹽析；(5)將鹽析後的產物移入透析膜(12-14kDa)進行透析(0.01M磷酸鹽緩衝液pH 7.0)；及(6)回收與濃縮得酵素蛋白質。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該基質和緩衝液比例為1：5。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中係以4℃作為酵素萃取的最適萃取溫度。
4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該步驟(2)之酵素萃取時間為3小時。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該栽培後基質係來自杏鮑菇之太空包培養。