TWI475213B - 螢光檢測方法 - Google Patents

Description

螢光檢測方法

本發明與包含酶或微生物之測定或檢驗方法有關，特別是有關於一種螢光檢測方法。

利用螢光，是檢測核酸的一種技術。是利用適當波長的光照射具有螢光性質的樣品，樣品會吸收光的能量而被激發至高能量狀態，並在極短時間內回復低能量狀態，同時以放光的形式將多餘能量釋出。當樣品上結合有螢光或可呈色的化學物質，便能提供光源，使化學物質產生螢光反應。藉此，由外部觀察是否有螢光反應，便能知道樣品有沒有結合化學物質，或者是結合化學物質的樣品是否存在。

習知的螢光技術系統通常包含一激發光源、一感光元件、一聚光裝置。當光源照射在樣品上，樣品吸收能量產生光致螢光效應後發出螢光，但因為螢光訊號微弱且亦受其他光源干擾如激發光源，需藉由聚光裝置收集後才能由感光元件感測。上述的聚光裝置通常由多片透鏡、反射鏡及放射光濾片(Emission Filter)組成，其光路複雜且不容易精確。而且光源通常為汞燈、氙燈或鹵素燈等，雖其發光波長涵蓋範圍長，但激發光源需針對不同的螢光指示劑下去做選擇波段，所以還必須使用不同濾鏡做搭配，耗費成本高且激發能量弱。而感光元件感測光訊號後將其轉為電流訊號，又需藉由轉阻放大器(Trans-impedance Amplifier,TIA) 將此電流訊號轉換為類比電壓訊號，再利用類比數位轉換電路(Analog to Digital Converter,ADC)將類比電壓訊號轉為數位電壓訊號，才能得出所需的實驗要據，如此一來手續繁雜又需增加額外成本支出。

一般由外部判斷螢光反應的技術，是直接接收螢光，當螢光強度高於特定值，便視為有螢光反應。然而接收螢光的技術，容易受環境影響，難有穩定的準確度。且習知的螢光檢測技術裝置大體上為體積龐大的複雜系統，攜帶不便，如有須檢測之樣品需帶回實驗室才有辦法進行檢測，浪費時間且麻煩。

有鑑於上述問題，本發明提供了一種方便且檢測準確度更為穩定之一種螢光檢測方法。

因此本發明之一技術態樣在於提供一種螢光檢測方法，利用灰階影像與比對技術準確快速地分辨出樣品是否有螢光訊號。

將螢光檢測試劑加入樣品中；將樣品盛裝至一樣品盤中。其中該樣品盤包含至少一列背景樣品孔。以及至少一列待測樣品孔。以一背景光源照射該樣品盤。取得該樣品盤之一背景灰階影像。

根據本發明一實施方式，上述螢光檢測方法更包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後之背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的 邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業。

依據本發明又一實施方式，上述對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之步驟，包含以背景光源照射樣品盤；取得樣品盤之一待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像，取得位於待測樣品孔內的灰階畫素資料。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於背景信號臨界值；以及當位於待測樣品孔內的灰階畫素資料大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。

依據本發明另一實施方式，上述對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之步驟，更包含根據待測灰階影像，取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料；根據位於背景樣品孔內的灰階畫素資料，判斷是否讀出光源訊號，當未讀出光源訊號時，判斷為異常狀況，並終止實驗。

依據本發明再一實施方式，其中對於取得樣品盤之背景灰階影像之步驟係以電荷耦合元件(Charge-couple Device,CCD)或互補式金屬氧化物半導體(Complementary Metal Oxide Semiconductor,CMOS)等光感測器為之。

依據本發明又一實施方式，其中背景樣品孔上覆蓋有一減光片或偏光片，且待測樣品孔上覆蓋有一螢光濾鏡。而背景光源為一發光二極體或一雷射光源，且背景光源照射樣品盤的方向，是選自樣品盤的上方、側邊、下方、及其組合。

根據本發明另一實施方式係在提供一種螢光檢測方法包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後之背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業。其中對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之步驟，包含以背景光源照射該樣品盤。以相異曝光之時間取得該樣品盤之複數待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像。取得位於待測樣品孔內的灰階畫素資料。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於背景信號臨界值。以及當位於待測樣品孔內的灰階畫素資料大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。

依據本發明再一實施方式，上述其中取得樣品盤之待測灰階影像可為兩次、三次、四次或以上，且曝光時間隨著待測樣品距離光感測器遞增而遞增，藉由擷取待測灰階影像的時間相異以浮動方式讓起始量測值一致。

根據本發明又一實施方式係在提供一種螢光檢測方法包含下述步驟。一定位步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後之背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣 品孔進行螢光訊號讀取作業。

依據本發明另一實施方式，其中該定位步驟包含直接由樣品管內之樣品透出光定位。

依據本發明又一實施方式，其中該定位步驟包含實驗前樣品孔座標定位。

依據本發明再一實施方式，其中該定位步驟包含由樣品管加上一減光片或一偏光做樣品管定位。

依據本發明另一實施方式，其中該定位步驟包含外加至少兩光源輔助定位。

藉此，本創作之螢光訊號讀取作業不易受環境之影響，且移動後之螢光訊號讀取作業也可以藉由定位步驟做量測之校準；且本創作方法的穩定度與準確度高。

第1圖繪示本發明一實施方式係在提供一種螢光檢測方法，包含下述步驟。將螢光檢測試劑加入樣品中。將樣品盛裝至一樣品盤中，其中樣品盤包含至少一列背景樣品孔，以及至少一列待測樣品孔。以一背景光源照射樣品盤。取得樣品盤之一背景灰階影像。請參照第2圖，如上述之螢光檢測方法更包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後之背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測 樣品孔進行螢光訊號讀取作業。

其中前述的樣品，能結合螢光或可呈色的化學物質。但不確定其中有多少部分已結合前述的化學物質，亦不知有多少部分未結合。因此需要利用前述方法分析。

其中取得灰階影像的技術，是取得背景光源中穿過背景樣品孔的可見光影像，再分析影像中每個像素的亮度所得。其中均值濾波的技術，是將背景灰階影像分割成複數個由4x4立方的16像素組成的區塊。將16個像素的灰階值相加後除以16，再用此值表示此區塊的灰階值，便能完成均值濾波的技術。其中二值化的技術是將大於臨界灰階值的區塊設定為極大值，也就是黑色；將小於臨界灰階值的區塊設定為極小值，也就是白色，進而完成二值化。且臨界灰階值並非固定數值，而是依照使用者需求而調整，故於此不討論之。

背景光源所發射的光線會透過背景樣品孔，因此當背景灰階影像二值化而成黑白畫面後，便能利用白色的發光部分在背景灰階影像上找到背景樣品孔的邊緣，並確定背景樣品孔的位置。由於早已知道背景樣品孔與待測樣品孔的尺寸與位置等相對關係，因此能根據背景樣品孔的邊緣與位置，在背景灰階影像上標示出待測樣品孔的邊緣與位置。

第3圖繪示第2圖之對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業的流程圖。根據背景灰階影像中背景樣品孔在二值化前的灰階畫素資料，取平均值設定為背景信號臨界值。利用背景信號臨界值，便能對待測樣品孔進行螢光訊號讀取 作業，判斷待測樣品孔中是否有螢光反應，其方法如下。以背景光源照射樣品盤。取得樣品盤之一待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像。取得位於待測樣品孔內的灰階畫素資料。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於背景信號臨界值。當位於各待測樣品孔內的灰階畫素資料大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。

第4圖係繪示本發明之另一實施方式流程圖，其對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之步驟如下，以背景光源照射樣品盤。以相異曝光之時間取得該樣品盤之複數待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像。取得位於待測樣品孔內的灰階畫素資料。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於背景信號臨界值。當位於各待測樣品孔內的灰階畫素資料大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。

第5圖及第6圖為應用本發明一實施方式之一螢光感測裝置400示意圖及繪示複數次取得樣品盤之待測灰階影像之整合示意圖。其中第6圖詳細說明其取得樣品盤之待測灰階影像之步驟。第一次取得樣品盤之一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像之曝光時間為2秒。第二次取得樣品盤之一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像之曝光時間為4秒。第三次取得樣品盤之一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像之曝光時間為6秒。第四次取得樣品盤之一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像之曝光時間為8秒。由圖6中可以看到光感測器500感測超過背景信號臨界值之待 測樣品410，隨著時間變化而不同，以黑色實心表待測樣品410已到達背景信號臨界值，離光感測器500越遠的待測樣品410其大於背景訊號臨界值的時間需越長，所以需使用此曝光時間隨著該些待測樣品距離光感測器遞增而遞增的方法，能避免不同待測樣品410起始背景信號臨界值之實驗數據上的誤差，但如果曝光時間太久，離光感測器500越近的待測樣品410其所得之灰階影像會影響整個實驗準確及一致性。最後將這四次所感測之四灰階影像再做均值濾波，藉此能得到更為精確且一致之複數個待測樣品410資料。

由於前面取得背景信號臨界值的過程中，已界定出待測樣品孔的位置，因此待測灰階影像不需要二值化。只要根據待測灰階影像，找出各待測樣品孔的灰階畫素資料，並與背景信號臨界值比較，便能確認各待測樣品孔內是否有螢光反應。

另外，前述的螢光訊號讀取作業，除了前述方法外，還能增加下述方法。根據待測灰階影像，取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料。根據位於背景樣品孔內的灰階畫訴資料，判斷是否讀出光源訊號，當未讀出光源訊號時，判斷為異常狀況，並終止實驗。

也就是說，當所有待測樣品孔內皆無螢光反應時，便停止螢光訊號讀取作業。如此實驗人員可以立刻檢查或更換樣品，以利實驗的續行。

其中取得背景灰階影像或待測灰階影像的技術，可以利用互補式金屬氧化物半導體或是電荷耦合元件等光感測 器擷取。而光感測器擷取待測灰階影像的時間相異以浮動方式讓起始量測值一致，即藉由預設的軟體判斷，隨著不同待測樣品的螢光強度而變化，當螢光強度遞增而其曝光時間遞減。

其中待測樣品孔上覆蓋著螢光濾鏡。由於非螢光的光線無法通過螢光濾鏡，因此能確保通過待測樣品孔的都是樣品所發射的螢光。

其中背景光源可以是發光二極體，或者是雷射光源。當要激發不同樣品發出螢光時，能選擇使用適合的色光，而不必再搭配激發光濾片(Excitation filter)加上控制馬達來替換濾片得到所需的激發波長。

值得一提的是本發明利用均值濾波其灰階影像，並使用二值化做分析樣品的技術，使用更為單純且背景信號臨界值可依據不同實驗的需求而做更動，比起習知技術還須對實驗數據圖做分析更為簡單直觀，再加上對複數個待測樣品作多次相異時間擷取複數灰階影像，來整合取得複數個待測樣品最準確一致的數據。

而根據本發明又一實施方式係在提供一種螢光檢測方法包含下述步驟。將樣品盛裝至一樣品盤中，其中樣品盤包含至少一列背景樣品孔，以及至少一列待測樣品孔。一定位步驟。以一背景光源照射樣品盤。取得樣品盤之一背景灰階影像。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後之背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階畫素資料， 並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業。

依據本發明一實施方式，上述該定位步驟包含以下方式。當樣品管置放於樣品孔，樣品孔之座標可直接由樣品管內之樣品的透出光藉由一分析軟體來加以定位其樣品孔座標，該透出光之分析方法不限定為影像分析或光電分析。

或者在此螢光檢測方法之實驗前藉由一軟體設定好樣品孔之座標做定位。

也可在樣品管外額外加上一減光片或一偏光做樣品管之定位，利用減光片或偏光片所透射之光源藉由一分析軟體來加以定位其樣品孔座標，該透出光之分析方法不限定為影像分析或光電分析。

或者藉由外加至少兩光源如發光二極體來輔助定位，其光源放置在樣品孔兩側，並藉由上述之分析軟體分析樣品受光照射位置並定位其座標。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

400‧‧‧螢光感測裝置

410‧‧‧待測樣品

500‧‧‧光感測器

第1圖繪示本發明一實施方式之螢光檢測方法的流程圖。

第2圖繪示本發明一實施方式之螢光檢測方法的流程 圖。

第3圖繪示第1圖之對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業的流程圖。

第4圖繪示對待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之另一實施方式流程圖。

第5圖繪示應用本發明之實施方式螢光感測裝置示意圖。

第6圖繪示複數次取得樣品盤之待測灰階影像之整合示意圖。

Claims (19)

1. 一種螢光檢測方法，包含：將螢光檢測試劑加入樣品中；將樣品盛裝至一樣品盤中，其中該樣品盤包含至少一列背景樣品孔及至少一列待測樣品孔；以一背景光源照射該樣品盤；取得該樣品盤之一背景灰階影像；均值濾波該背景灰階影像；二值化該背景灰階影像；根據二值化後之該背景灰階影像，計算出該列背景樣品孔的邊緣位置；根據該列背景樣品孔的邊緣位置，計算出該列待測樣品孔的邊緣位置；取得位於該列背景樣品孔內的灰階畫素資料，並將其平均，作為一背景信號臨界值；以及根據該列待測樣品孔的邊緣位置以及該背景信號臨界值，對該列待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業。
2. 如請求項1所述之螢光檢測方法，其中對該列待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之步驟包含：以該背景光源照射該樣品盤；取得該樣品盤之一待測灰階影像；均值濾波該待測灰階影像；取得位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料； 逐個判斷位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於該背景信號臨界值；以及當位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料大於該背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。
3. 如請求項1所述之螢光檢測方法，其中取得該樣品盤之該背景灰階影像之步驟係以互補金氧式半導體或電荷耦合元件等光感測器為之。
4. 如請求項1所述之螢光檢測方法，其中該列待測樣品孔上覆蓋有一濾鏡。
5. 如請求項1所述之螢光檢測方法，其中該背景光源為發光二極體或雷射。
6. 如請求項1所述之螢光檢測方法，更包含：以該背景光源照射該樣品盤；以相異曝光之時間取得該樣品盤之複數待測灰階影像；均值濾波該些待測灰階影像；取得位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料；逐個判斷位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於該背景信號臨界值；以及當位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料大於該背景 信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。
7. 如請求項6所述之螢光檢測方法，其中取得該樣品盤之該背景灰階影像之步驟係以互補金氧式半導體或電荷耦合元件等光感測器為之。
8. 如請求項6所述之螢光檢測方法，其中相異曝光之時間由一軟體判斷，隨著螢光強度遞增而遞減。
9. 如請求項6所述之螢光檢測方法，其中該列待測樣品孔上覆蓋有一濾鏡。
10. 如請求項6所述之螢光檢測方法，其中該背景光源為發光二極體或雷射。
11. 如請求項1所述之螢光檢測方法，其中均值濾波該背景灰階影像之步驟前更包含一定位步驟。
12. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中對該列待測樣品孔進行螢光訊號讀取作業之步驟包含：以該背景光源照射該樣品盤；取得該樣品盤之一待測灰階影像；均值濾波該待測灰階影像；取得位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料； 逐個判斷位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料是否大於該背景信號臨界值；以及當位於該列待測樣品孔內的灰階畫素資料大於該背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光訊號。
13. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中取得該樣品盤之該背景灰階影像之步驟係以互補金氧式半導體或電荷耦合元件等光感測器為之。
14. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中該列待測樣品孔上覆蓋有一濾鏡。
15. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中該背景光源為發光二極體或雷射。
16. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中該定位步驟包含直接由樣品管內之樣品透出光定位。
17. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中該定位步驟包含實驗前樣品孔座標定位。
18. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中該定位步驟包含由樣品管加上一減光片或一偏光做樣品孔定位。
19. 如請求項11所述之螢光檢測方法，其中該定位步驟包含外加至少兩光源輔助定位。