TWI467016B - Ｏｃｔ４及ＳｉｒＴ１之基因傳遞及其醫藥組合物 - Google Patents

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Taipei Veteran General Hospital
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Description

Oct4及SirT1之基因傳遞及其醫藥組合物
本發明係關於哺乳動物細胞(包括人類)中之基因組DNA表觀遺傳學修飾。特定言之，本發明係關於用以在哺乳動物細胞(包括人類)中降低Oct4啟動子甲基化程度之方法及組合物。
Oct4，POU域轉錄因子家族成員之一，係表現於多功能胚胎幹細胞及生殖細胞中(Okamotoet al .,Cell.(1990),60(3)：461-72；Rosneret al .,Nature(1990),345(6277)：686-92；及Burdonet al .,Trends Cell Biol.(2002),12(9)：432-8)。Oct4之表現在分化過程中受到負調控，暗示Oct4在哺乳動物之發育中扮演關鍵角色(Pesceet al .,Mech Dev.1998；71(1-2)：89-98)。SirT1係維持基因安定性所需，此使其成為真核細胞抗老化研究之潛力目標(Oberdoerfferet al .,Cell.2008；135(5)：907-18)。與SirT1相關之延壽功效與其神經保護能力已被認為係因其可增強抗氧化壓力反應並降低炎性損傷(Seddinget al .,Biol Chem.2008；389(3)：279-83；及Ganet al .,Aging Cell.2010；9(5)：924-9)。
細胞重編程(Cellular reprogramming)具有抵消細胞老化機制之能力，並使細胞成為自我更新、更生(rejuvenate)之狀態(Prigioneet al .,Stem Cells.2010；28(4)：721-33；及Liet al .,Biomaterials.2011；32(26)：5994-6005)。多能性調控子(諸如Oct4)啟動子區域中之低DNA甲基化程度係幹細胞或重編程性多能性幹細胞之代表特徵(Okitaet al .,Nature.2007；448(7151)：313-7；及Mikkelsenet al .,Nature.2008；454(7200)：49-55)。自我更新及多功能性係胚胎幹細胞之重要特徵，而Oct4在此等作用之維持上扮演關鍵角色(Burdonet al .,Trends Cell Biol.2002；12(9)：432-8；及Boianiet al .,Nat Rev Mol Cell Biol.2005；6(11)：872-84)。內源性之Oct4表現對於維持類幹細胞多能性而言極為重要(Boianiet al .,Genes Dev.2002；16(10)：1209-19)，而Oct4啟動子之去甲基化已被認為係細胞核重編程作用之潛力標記(Lowryet al .,Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(8)：2883-8)。
本發明係基於非可預期發現Oct4及SirT1之組合在目標細胞中之表現可經由降低該細胞Oct4啟動子之甲基化程度而誘發內源性Oct4轉錄作用。因此，本發明提供一種用以在目標細胞中降低Oct4啟動子甲基化程度並使目標細胞更生(rejuvenate)之方法及組合物。
在一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含編碼Oct4之DNA片段(稱為「Oct4 cDNA」)以及編碼SirT1之DNA片段(稱為「SirT1 cDNA」)，或一包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸。
在另一方面，本發明亦提供一種Oct4 cDNA及SirT1 cDNA或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸用於製造降低目標細胞之Oct4啟動子甲基化程度及/或誘發內源性Oct4轉錄作用之藥物之用途。
本發明亦提供一種Oct4 cDNA及SirT1 cDNA或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸用於製造誘發目標細胞之細胞保護反應之藥物之用途。
咸相信具有本發明所屬技藝通常知識者可在無須進一步說明之情形下，根據本文之敘述，將本發明應用至其最廣範圍。因此，下文之敘述應被視為具說明性目的而非以任何方式限制本發明之範圍。
除非另外定義，本文中所用之所有技術及科學辭彙具有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。本文所提及之所有出版品係納入本文做為參考，以揭示或敘述與該引用出版品相關之方法及/或材料。
在本文中，單數形式「一」及「該」包括其複數參照，除非文內明確指定為他種情形。因此，舉例而言，「一樣本」包括複數之此等樣本及熟習技藝者所知之其對等物。
在一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含編碼Oct4之DNA片段(稱為「Oct4 cDNA」)以及編碼SirT1之DNA片段(稱為「SirT1 cDNA」)，或是一種聚核苷酸，其包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA。根據本發明，該醫藥組合物具有降低目標細胞Oct4啟動子甲基化程度並誘發內源性Oct4轉錄作用及細胞保護反應之功效。
在另一方面，本發明亦提供一種Oct4 cDNA及SirT1 cDNA或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸用於製造降低目標細胞之Oct4 啟動子甲基化程度及/或誘發內源性Oct4轉錄作用之藥物的用途。
本文所用之術語「啟動子」係指基因中一轉錄因子及/或RNA聚合酶可結合之區域，其係用以控制相關編碼序列之表現。啟動子通常(但並非絕對)位於基因之5'-非編碼區域中，位於轉譯起始密碼子之上游。
本文所用之術語「內源性」係指由該細胞之基因組天然產生之物質。
本文所用之術語「轉錄」係指RNA聚合酶根據DNA樣板所進行之RNA合成。轉錄係基因表現之第一步驟且為基因表現調控之最重要步驟。
另一方面，本發明尚提供一種Oct4 cDNA及SirT1 cDNA或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸用於製造誘發目標細胞之細胞保護反應之藥物的用途。
本文所用之術語「細胞保護反應」係指可保護細胞對抗有害物質之細胞機制。細胞保護反應包括，但不限於，抗氧化活性之正調控。
在部分具體實施例中，該Oct4 cDNA及SirT1 cDNA可由載體攜帶。
在一具體實施例中，該Oct4 cDNA包含SEQ ID NO：1之核酸序列。在另一具體實施例中，該SirT1 cDNA包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
在本發明之一具體實施例中，該載體係封裝於聚合物中。在一特定具體實施例中，該聚合物係陽離子聚胺酯-短支鏈聚乙烯亞胺(polyurethane-short branch polyethylenimine(PU-sbPEI))。
在本發明之部分具體實施例中，該Oct4 cDNA及該SirT1 cDNA之比例係介於0.5：1及2：1之間，較佳係0.8：1~1.2：1。於某一實例中，該Oct4 cDNA及該SirT1 cDNA之比例係1：1。
本發明藉由下列之實例進一步說明，該等實例係為說明而非限制之目的而提供。
實例 1. 材料及方法 1.1 人類AMD及非AMD視網膜之分離
本研究遵循赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)之原則，並取得 捐贈病患之知情同意書，該等病患之特徵摘述於表1。簡言之，茲自10位人類捐贈者選擇20隻眼。根據標準流程將眼球去核並冷凍。該等捐贈者在死亡時為41至74歲不等。大部分之捐贈者係因交通意外、中風、或癌症死亡。AMD及非AMD視網膜係根據目視及組織病理學檢驗兩者定義，包括後極存在玻璃膜疣以及H&E染色。由非AMD及AMD捐贈者分離連結之視網膜色素上皮細胞(RPEs)，並培養為初代RPEs。有關我們RPE培養方法之詳述已於先前發表(Bonnelet al .,Exp Gerontol.2003；38(8)：825-31)。使細胞在含有添加5%胎牛血清、2-mM L-麩胺酸、1-mM丙酮酸鈉、0.1-mM非必需胺基酸、青黴素(100 U/mL)、及鏈黴素(100 μg/mL)之營養混合物F12,50/50混合物(Cellgro,Herndon,VA,USA)的杜氏改良伊氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)中生長。將細胞在完整培養基中以2×105 細胞/mL之密度播種於組織培養盤上，並於含5% CO2 空氣之濕潤環境中及37℃下，使細胞生長至約80%鋪滿度(1-2天)。接著以含有青黴素(100 U/mL)及鏈黴素(100 μg/mL)之新鮮無血清培養基置換該培養基，接著再以各種試劑處理該等細胞。
1.2 聚胺酯及短支鏈PU-PEI(PU-sbPEI)之合成
將L-離胺酸-二異氰酸酯(LDI)0.145g(1)及N,N’-雙-(2-羥乙基)-哌嗪(PPA)0.1024g(2)分別溶於1 mL之無水DMF溶劑中，並在無水氮氣吹洗下，於三頸反應瓶中混合，在60℃加熱，並使用0.5 wt%之二月桂酸二丁基錫催化劑，使其進行反應12小時。接著將過量之甲醇(4ml)緩慢加入反應混合物中，直到無法偵測到未反應之異氰酸酯為止。沉澱出聚胺酯，再在乙酸乙酯中純化，並在真空下於40℃進行乾燥。以FT-IR及1 H NMR定性該聚合物。1 H-NMR(400 MHz,DMSOd6 ,ppm)δ：2.50-2.71(-N2 (CH2 CH2 )2 ),2.99,3.9(-NCH2 CH2 O-),3.12(-NHCH(COOCH3 )CH2 -),1,21-1.81(6H,-CH(COOCH3 )CH2 CH2 CH2 CH2 -),2.90(-CH2 CH2 NH-),3.67(-NHCOOCH3 ),3.4(-COOCH3 ),8.01(-NHCH(COOCH3 )CH2 -),3.51(-CH2 NHCOOCH3 )。使用圖1之聚胺酯(3)與短支鏈PEI(MW=600)(sbPEI)之胺解反應合成PU-sbPEI。首先，將0.1 g聚胺酯溶於1 mL無水DMF溶劑中，並將0.6g sbPEI(4)溶於0.5 mL MeOH及1mL Et3N中。緩慢混合該二溶液，並使其在45℃下反應至少48 hrs。於過量之無水乙酸乙酯中沉澱出該聚合物。將上述之聚合物再次溶於3mL MeOH中，並於4 mL乙酸乙酯中沉澱，重複3次後於40℃真空乾燥以進行純化。藉由FTIR及1 H NMR進一步定性該聚合物(PU-sbPEI)(5)。PU-sbPEI：1 H-NMR(400 MHz,D2 O,ppm)δ：2.48(-N2 (-CH2 -CH2 )2 ),2.91(-NCH2 CH2 O-),3.99(-NCH2 CH2 O-),4.35(-NHCH(CO-)CH2 -),2.84,1.32,1.53(-CHCH2 CH2 CH2 -),2.91(-CH2 CH2 NH-),3.56(-O-CH3 ),3.8(-CONHCH2 -),2.48,3.14(PEI：-CH2 -CH2 -),3.51(-CH2 NHCOCH-),8.01(-NHCH(CONH-)CH2 -),0.95(PEI：-NH-)。
1.3 以PU-sbPEI傳遞Oct4及SirT1基因
pcDNA3.1-SirT1質體係由Dr.Wenlong Bai慷慨贈與(Yanget al .,EMBO J.2005；24(5)：1021-32)。pMXs-hOct3/4質體係購自Addgene(劍橋公司，美國)。將SirT1 cDNA及Oct3/4 cDNA之片段進一步次選殖至pEGFP-C1載體(Clontech，美國)中。將Oct4及SirT1質體以1 g/L之終濃度溶於Opti-MEM培養基中。以5：1之比例混合DNA及PU-sbPEI(亦以PU註記)，並共置30 min以形成DNA-PU-PEI複合物。於轉染前，使細胞生長至約70%鋪滿度。將該等複合物直接加入細胞中，並在轉染後6小時移除。48小時後，收集細胞，並以RT-PCR及西方點漬法檢驗Oct4及SirT1之表現量。
1.4 實時逆轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
如前人所述進行實時RT-PCR(Chenet al .,PLoS One.2008；3(7)：e2637)。為進行實時RT-PCR，使用RNAeasy套組(Qiagen，瓦倫西亞，加州，美國)，依照製造商之指示，萃取總體RNA。使用0.5 μg之寡dT及200 U Superscript II RT(Invitrogen，卡爾斯巴德，加州，美國)，在20 μL中對各樣本之總體RNA(1 μg)進行逆轉錄。擴增係在含有0.5 μM之各引子、4 mM MgCl2 、2 μl LightCyclerTM-FastStart DNA Master SYBR green I(羅氏分子系統，阿拉米達，加州，美國)、及2 μl之1：10稀釋cDNA的20 μl總體積中進行。PCR反應係在ABI PRISM® 7900HT序列偵測系統及ABI Prism 5700 SDS(應用生命系統)上進行。在各實驗中，擴增GAPDH管家基因(housekeeping gene)作為參照標準品。目標基因之引子序列顯示於表2。以二重試驗製備反應物，並在95℃加熱10分鐘，接著進行40次循環之95℃變性10秒、55℃黏合5秒、72℃延伸20秒。所有之PCR反應皆以二重試驗進行。對各樣本中之各目標基因及內參照(GAPDH)製備標準曲線(循環閾值對樣板濃度)。為確認PCR反應之專一性，在1.2%瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行電泳。
1.5 西方點漬分析及免疫螢光分析
將細胞固定、在冰PBS中清洗一次，刮取，以萃取緩衝液裂解，再以10,000 rpm(9,730 g)離心10分鐘以除去不溶物質。使用蛋白分析套組(Bio-Rad，海克力斯，加州，美國)測定蛋白濃度。將樣本緩衝液中之細胞萃取物置於沸水中5分鐘，接著以10% SDS-PAGE凝膠分離。在電泳後，將該凝膠轉漬至PVDF膜上進行免疫點漬分析。將該膜在室溫下置於脫脂乳中0.5小時以進行阻斷，並於4℃下與SirT1抗體(1：1000；聖克魯斯生物技術，聖克魯斯，加州，美國)、Oct4抗體(1：500；聖克魯斯生物技術公司)共置16小時，以tris-緩衝鹽水tween-20(TBST)清洗五次，再於室溫下與辣根過氧化物酶複合性二級抗體共置2小時。以TBST清洗該膜六次，再以化學發光(ECL，聖克魯斯)顯像特定條帶。為以巢蛋白(nestin)及武藏蛋白(musashi)進行免疫螢光研究，使用以PBS/3% Triton X-100/10%正常羊血清(NGS)稀釋之對抗巢蛋白(1：500；DAKO)及武藏蛋白(1：500；Chemicon)之單株抗體對球狀體進行免疫染色，再於37℃下分別與蓋玻片進行共置2小時。以PBS清洗該等蓋玻片三次(每次各10分鐘)，再於37℃下與適當之二級抗體(1：200；Sigma，聖路易斯，密蘇裡州，美國)進行共置30分鐘。以PBS沖洗蓋玻片三次，並以蒸餾水沖洗一次，再以Fluoesave(Calbiochem，拉霍亞，加州，美國)裝置於玻片上。針對各球體，在10個非重疊區域中評估巢蛋白及武藏蛋白陽性細胞之數目。以4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI；1 mg/mL)對細胞核進行對比染色以測定各區域中之總細胞數。
1.6 微陣列分析及生物資訊分析
使用Trizol試劑(生命技術公司，貝塞斯達，馬里蘭州，美國)自細胞萃取整體RNA，並以Qiagen RNAeasy(Qiagen，瓦倫西亞，加州，美國)管柱進行純化。遵照AffymetrixTM 之建議，完成cRNA探針製備、陣列雜交、及資料分析。使用AffymetrixTM HG-U133 Plus 2.0全基因組 晶片。以R統計程式語言之Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/)套裝軟體之‘affy’程式包，由Affymetrix GeneChip陣列數據計算RMA對數表現單位。使用RMA系統設定值進行所有表現值之背景校正、正規化及匯總。使用Bioconductor之‘limma’程式包辨識樣本組間之顯著差異。簡言之，由各基因計算出t-統計值作為正常值，接著使用改良式排列檢定(permutation test)計算p-值。為控制多重試驗誤差，將錯誤發現率(false discovery rate，FDR)算法應用於該p-值，以計算出一組q-值：偽陽性之預期比例閾值，或虛無假設之錯誤拒絕。藉由dChip軟體(http：//biosun1.harvard.edu/complab/dchip/)產生熱圖(Heatmap)。亦以dChip軟體進行主成分分析(Principle component analysis,PCA)，以提供各個不同樣本組間如何相關之視覺印象。以DAVID生物資訊資源6.7介面(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/ )進行基因功能註解(Gene annotation)及基因本體資訊(gene Ontology)。為取得功能調節網絡，以Cytoscape軟體(http：//www.cytoscape.org/ )之插件處理取自陣列分析之過濾後數據。Cytoscape背後之知識基礎係根據科學證據建構，以人工由數千份期刊文獻、教科書、及其他資料來源收集。在上傳簽名基因(signature gene)表列後，使用焦點基因間之交互作用，以及來自於該知識基礎之彼此作用性基因及分子間之交互作用，根據其具有較隨機所預期之更多焦點基因的可能性，將基因結合為網絡。在Cytoscape中，名辭「網絡」並非具有獨特功能之生物或典型途徑，而係反映特定蛋白如文獻所定義之所有交互作用。
1.7 亞硫酸鹽定序(Bisulfite sequencing)
根據製造商之指示，使用印記DNA修飾套組(Imprint DNA Modification Kit,Sigma)進行亞硫酸鹽反應。在每個單一步驟修飾反應中，使用500毫微克之基因組DNA。清理修飾後之DNA，再如先前所述使用引子進行PCR擴增(Colemanet al .,Lancet.2008；372(9652)：1835-45；及Dinget al .,Prog Retin Eye Res.2009；28(1)：1-18)。將PCR產物選殖進入pGEM-T簡易載體(Promega)中，並對各樣本之10個隨機選擇之克隆進行定序。
1.8 丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、榖胱甘肽過 氧化物酶(GSH-Px)、及觸酶(CAT)活性之測定
以Draper及Hadley(Simonelliet al .,Mol Ther.2010；18(3)：643-50)之雙重加熱法測定MDA之含量。將結果以nmol/g蛋白表示。根據製造商之操作流程，以超氧化物歧化酶活性比色分析套組(Abcam)測定整體SOD活性。以單位/g蛋白表示SOD活性。以榖胱甘肽過氧化物酶細胞活性分析套組及觸酶分析套組(兩者皆購自Sigma)測量GSH-Px及CAT活性。以單位/g蛋白及μmoles/min/g蛋白表示GSH-Px及CAT活性值(Maguireet al .,N Engl J Med.2008；358(21)：2240-8)。
1.9 胞內活性氧(ROS)生成及榖胱甘肽(GSH)含量之測定
以PBS清洗培養之aRPE細胞兩次，並以100 μM H2 O2 處理。8小時後，除去培養基，並收集細胞以進行後續之實驗。藉由探針2' ,7' -二氯螢光素二乙酸酯(DCFH-DA；Molecular Probes，尤金，俄勒岡州，美國)測量胞內ROS生成之方法如先前所述(Thomaset al .,Nat Rev Genet.2003；4(5)：346-58)。簡言之，於37℃下使細胞與5 μmol/L DCFH-DA在培養基中共置30分鐘，接著以PBS清洗，並進行流式細胞計數分析。藉由GSH-400套組(OXIS International，波特蘭，俄勒岡州，美國)進行比色分析，偵測胞內GSH含量。在該GSH-400分析中，加入4-氯-1-甲基-7-三氟甲基-喹啉鎓硫酸甲酯鹽，以與樣本中之所有硫醇反應，形成取代產物硫酯。接著，使用30%氫氧化納媒介β-消去反應，並特定地將GSH-硫酯轉化為發色團硫酮，以光譜儀偵測之最大吸收波長為400 nm。
1.10 動物及Oct4/SirT1基因傳遞
所有之實驗皆遵循實驗動物管理及使用委員會之守則並符合ARVO眼科與視覺研究動物使用規定而進行。茲盡力將所用動物之數目及其犧牲減至最低。將體重各為150至250克之4週齡、雄性、Sprague-Dawley大鼠飼養於環境控制性動物房之塑膠籠中並維持在昏暗光循環下(5 lux，12小時開/關)。所有動物皆可自由攝取食物及水。肌內注射0.15 mL/kg之2%利多卡因(苦息樂卡因(Xylocaine)；阿斯特拉公司，南泰利耶，瑞典)及50 mg/mL愷他命(Ketalar；帕克-戴維斯，摩里斯普拉因斯，紐澤西，美國)等體積混合物以麻醉大鼠。在大 鼠麻醉後，以1滴0.5%鹽酸丙美卡因(愛爾卡因(Alcaine)；愛爾康-庫弗勒，皮爾斯，比利時)麻醉角膜，以1%托品胺(1% Mydriacyl；艾爾康實驗股份有限公司，漢普斯泰德，英國)擴瞳，接著以橡膠套筒徐緩使眼突出。以他處所述並稍加修改之方法進行基因傳遞(Wuet al .,Invest Ophthalmol Vis Sci.2002；43(11)：3480-8)。簡言之，進行上顳球結膜環切，並以30號針之尖端在後1 mm處進行鞏膜切開術。將33號鈍針(漢密爾頓，雷諾，內華達州，美國)插至視網膜下，再注射5μL PU-PEI-OS混合物(留置該針1分鐘以減少回流)，並以視網膜水泡狀突起之形成而辨識。當發生大量視網膜下出血時廢棄該等眼。類似地，以PU-載體注射對側眼作為控制組。
1.11 光照實驗 在進行PU顆粒之視網膜下傳遞2週後，以些微修飾如前所述之方法進行光照實驗(Wenzelet al .,Prog Retin Eye Res.2005；24(2)：275-306)。自9：00 AM起，在對側及地面具有鏡子之Plexiglas籠中，使該等大鼠接觸10,000 lux之白光2小時。在強烈光照之前，使該等大鼠進行暗適應24小時。在進行光照前以1%托品胺(1% Mydriacyl；愛爾康)擴瞳。使籠內溫度維持在24℃。在2小時照光之後，立刻使該等大鼠維持在昏暗光循環下(5 lux，12小時開/關)。為進行組織學及免疫組織學分析，在光照起始後之3天、5天及2週後，以二氧化碳窒息犧牲實驗動物，接著摘除眼。為進行西方點漬及酶活性分析，收集此等時點之視網膜以測定Oct4及SirT1之含量，並測定丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、榖胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、及觸酶(CAT)活性。 1.12 外核層(outer nuclear layer(ONL))厚度測量
在光照後3天、5天及2週後，在二氧化碳飽和艙中犧牲大鼠，以10 ml PBS灌流。由摘除之眼製備石蠟包埋之視網膜切片(3 μm)，並以蘇木紫及伊紅(H&E)染色。針對各個切片，使用數位成像系統，以4x放大、1300 x 1030畫素，捕捉整個視網膜之數位影像。為涵蓋整個視網膜，自各個切片取得5個影像。以Image J軟體，在視神經頭(ONH)之上下0.5、1.0、1.5、2.0、及2.5 mm、以及其周圍(距視網膜上下邊 緣100 μm)，測量ONL之厚度。積分取自ONH上方2.5 mm及下方2.5 mm之厚度直方圖下之面積而計算ONL面積。
1.13 視網膜電圖描記術(ERG)
使該等大鼠隔夜進行暗適應至少24小時，並以如前所述並加以改良之方法(Penget al .,Biomaterials.2010；31(7)：1773-9)於光照後3天、5天、或2週後，記錄ERGs。簡言之，以肌內注射50 mg/mL愷他命/0.15 mL/kg之利多卡因麻醉該等實驗動物，以1滴0.5%鹽酸丙美卡因麻醉角膜，再以1%托品胺擴瞳。將大鼠置於可使其體溫在整個實驗過程中維持在35-36℃的加熱板上。接地電極係置於尾內之皮下針，而參考電極係皮下置於雙眼之間。將隱形眼鏡作用電極置於角膜上。使用市售系統(RETIport ERG筆記型電腦版，Acrivet，德國)分差放大反應，光脈衝為800 cds/m2 ，於0.3至500 Hz過濾帶通，以0.25-至0.5-ms間隔數位化，並貯存進行資料處理。由a-波之基線至谷值測量a-波之振幅，而b-波之振幅則由a-波之谷值至b-波之峰值測量。a-波及b-波之隱含期則由刺激之起始至各波之峰值測量。
1.14 統計分析
結果係以平均值±SD表示。使用比較兩組之t -檢定進行統計分析，並使用單因子或二因子ANOVA，接著使用邦弗朗尼檢定(Bonferroni test)，針測三或多個群組間之差異。以皮爾森相關係數(Pearson’s correlation coefficient)及非成對學生氏t值檢定(unpaired Student t test)分析表現量及年紀間之相關性。將P <0.05之結果視為具有統計顯著性。所有之分析皆使用SPSS 12.0進行。
2. 結果 2.1 經Oct4 及SirT1 轉染細胞之自我更新能力
視網膜病變，諸如老年性黃斑病變(AMD)，已成為全球眼盲之主要肇因。因視網膜極易受到活性氧(ROS)之損害，氧化壓力誘發性損傷已被認為係造成AMD之重大風險(Colemanet al .,Lancet.2008；372(9652)：1835-45)。具有持續性慢性發炎之氧化細胞損傷已被證明可逐漸造成晚期AMD之永久性光感受器喪失及視網膜色素上皮細胞(RPE)失能(Dinget al .,Prog Retin Eye Res.2009；28(1)：1-18)。RPEs 可維持視網膜神經感覺層之生理功能。藉著在老化之視網膜色素上皮細胞(aRPE)中過表現此兩種因子，檢驗Oct4/SirT1之可能救援角色。聚胺酯-短支鏈聚乙烯亞胺(PU-PEI，亦以PU註記)並無細胞毒性且具有高轉染效率(Hunget al .,J Control Release.2009；133(1)：68-76；及Liuet al .,Biomaterials.2009；30(34)：6665-73)。在此研究中，使用PU-PEI傳遞系統(圖1)及編碼EGFP、Oct4、及SirT1 cDNA之質體載體，由衍生自7號捐贈者(最年長之AMD捐贈者)之原初aRPEs產生穩定之Oct4/SirT1過表現性aRPE(aRPE-PU-OS)細胞。亦同時產生空白載體傳遞控制組細胞(aRPE-PU)。PU-PEI媒介之基因傳遞之流程示意圖係顯示於圖2A。傳遞效率(以EGFP陽性細胞之比例評估)係約70%。有趣的是，於兩個穩定克隆(aRPE-PU-OS#1及aRPE-PU-OS#2)中共過表現Oct4/SirT1，造成aRPE-PU細胞形成球狀體，而控制組細胞則無產生球狀體之跡象(圖2B)。定量RT-PCR及西方點漬分析分別確認了二aRPE-PU-OS克隆中之Oct4及SirT1 mRNA(圖3A)以及蛋白(圖3B)之過表現。相較於母aRPEs及aRPE-PU細胞，在24天期間內，aRPE-PU-OS細胞之增殖速率亦獲得增加(圖3C)。由於球體形成係評估前驅細胞自我更新能力之關鍵行為(Penget al .,Eur Neuropsychopharmacol.2008；18(2)：128-40)，茲檢驗連續傳代後成功形成球體之能力。值得注意的是，在於無血清培養基中連續繼代後，aRPE-PU-OS細胞保有高球體形成能力(圖3D)。此等數據說明aRPE細胞在異位過表現Oct4及SirT1後之較高自我更新能力。
2.2 經Oct4 及SirT1 轉染細胞之類前驅細胞特徵
使用基因表現微陣列分析近一步檢驗aRPE-PU-OS細胞及aRPE-PU控制組細胞之基因性狀。基因表現譜及基因本體資訊(GO)資料庫顯示，在使用階層式分群法檢驗時，相較於母aRPEs或aRPE-PU細胞，500探針組之表現在aRPE-PU-OS細胞中有顯著之不同(圖4A，左欄)。在aRPE-PU-OS細胞中主要受到正調控之作用包括該等與神經元發育、細胞型態發生之調控、胞外結構之組織、細胞移動性、損傷復原有關者(圖4A，右上欄)。相對的，受到負調控之基因包括與核分裂、胞器裂殖、及DNA複製相關者(圖4A，右下欄)。根據主成份分 析，微陣列數據顯示Oct4及SirT1之共過表現可促使aRPE基因模式改變朝向視網膜前驅細胞(圖4B)。同時，平均距離分析顯示，aRPE-PU-OS細胞之基因表現模式較類似視網膜前驅細胞，而與aRPE-PU細胞及母aRPEs較不相似(圖4G)。值得注意的是，相較於aRPE-PU細胞，數種幹細胞及視網膜前驅細胞相關基因，包括Nanog、Klf-4、Sox2、CD44、CD133、及Pax6，亦在aRPE-PU-OS細胞中受到正調控(圖4C)。同時，免疫螢光之定量顯示，相較於aRPE-PU細胞，神經前驅細胞標記巢蛋白(Nestin)(圖4H)及武藏蛋白(Musashi)(圖4I)在該二aRPE-PU-OS克隆中皆顯著增加。多能性調控子(諸如Oct4)啟動子區域中之低DNA甲基化程度係幹細胞或重編程性多能性幹細胞之代表特徵(Okitaet al .,Nature.2007；448(7151)：313-7；及Mikkelsenet al .,Nature.2008；454(7200)：49-55)。由於aRPE-PU-OS基因表現模式改變朝向類視網膜前驅細胞，茲近一步驗證aRPE-PU-OS細胞以及僅過表現Oct4或SirT1之aRPE-PU細胞(分別為aRPE-PU-Oct4及aRPE-PU-SirT1)中Oct4啟動子甲基化模式之改變。亞硫酸鹽定序之結果顯示，相較於aRPE-PU細胞，aRPE-PU-OS細胞之Oct4啟動子具有低許多之甲基化狀態(圖4D)。值得注意的是，僅有Oct4或SirT1之異位表現並不會顯著降低aRPE-PU細胞Oct4啟動子之甲基化程度(圖4D及4E)。使用專一標靶內源性而非外源性之Oct4轉錄物之引子，qRT-PCR顯示Oct4及SirT1之外源性表現可誘發內源性Oct4轉錄(圖4F)。此一發現可支持Oct4/SirT1之共過表現具有協同作用之假設，該作用可在aRPE細胞中部分地經由去甲基化機制而增進Oct4啟動子活性，造成Oct4下游目標基因之正調節。
2.3 aRPE-PU-OS 細胞中之抗氧化特性
使用所有MEDLINE記錄(篇名及摘要)之文獻基礎性網絡分析以及Cytoscape軟體，將取自我們的微陣列數據之目標連結基因分組，對基因及蛋白質名稱使用自然語言處理(Natural Language Processing(NLP))方案。在aRPE-PU-OS細胞中辨識到涉及Pou5f1(Oct4)、SirT1、Nanog、Pax6、及ppargc1a(PGC-1α)之網絡基因，但在aRPE-PU細胞中則否(數據未顯示)。流式細胞計數分析指出，相較於aRPE-PU 細胞，aRPE-PU-OS細胞中之胞內ROS含量減少並維持於低量(圖5A)。相對的，aRPE-PU-OS細胞中之GSH含量則顯著高於母aRPEs或aRPE-PU細胞(圖5B)。與顯示PGC-1α基因正調節之微陣列分析結果相符，qRT-PCR顯示PGC-1α以及數種抗氧化酶(諸如，SOD1、SOD2、CAT、及GSH-Px)之表現量在該兩個RPE-PU-OS克隆中皆高度增加(p<0.05；圖5C)。
為進一步描述由Oct4/SirT1過表現所誘發之抗氧化特性，使用H2 O2 在aRPE-PU及aRPE-PU-OS細胞中誘發氧化損傷。相較於aRPE-PU細胞，aRPE-PU-OS細胞具有較低之ROS及MDA基礎胞內含量(分別為圖6A之左及右側部分)。H2 O2 處理可顯著增加ROS及MDA兩者含量，而該兩種氧化物質之H2 O2 誘發性增加在aRPE-PU-OS細胞中顯著降低(分別為圖6A之左及右側部分)。此外，在基礎及H2 O2 處理兩種條件下，GSH含量以及三種抗氧化酶SOD、CAT及GSH-Px之活性在aRPE-PU-OS細胞中皆顯著增加(分別為圖6B之左上、右上、左下、及右下部分)。值得注意的是，PGC-1α及ROS-清除基因之含量在aRPE-PU-OS細胞中皆較高，而所有此等基因之表現可由H2 O2 進一步提升(圖6C)。以內源性ROS生產者1-S,R -丁胱亞磺酰亞胺(BSO；Sigma)(其係γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶之選擇性抑制劑)挑戰細胞，確認Oct4/SirT1過表現之抗氧化功效。茲發現aRPE-PU-OS細胞具有較低之ROS生成，並在BSO處理時具有較低之細胞死亡率(圖6D及6E)。再者，以4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧(Tempol；Sigma)(其係一種膜滲透性自由基清除劑)預處理細胞可減少aRPE-PU細胞之H2 O2 誘發性ROS生成及細胞死亡(Tempol/H2 O2 及H2 O2 組間之p<0.05；圖6D及6E)，但相較於aRPE-PU細胞，aRPE-PU-OS細胞之Tempol處理則並未進一步增進Oct4/SirT1-相關性抗氧化及細胞保護作用(aRPE-PU-OS/Tempol/H2 O2 及aRPE-PU/Tempol/H2 O2 組間之p>0.05；圖6D及6E)。此等數據建議，aRPE-PU-OS之細胞保護功效係藉由降低氧化壓力而中介。綜言之，相較於aRPE-PU細胞，在反應H2 O2 誘發性氧化壓力時，aRPE-PU-OS細胞具有顯著較高之抗氧化特性及較高之細胞存活率。
2.4 Oct4/SirT1 基因傳遞可改善受到光損傷之視網膜
為檢驗PU載體是否可將Oct4/SirT1有效轉導至視網膜組織中，在基因轉移2週後，在勻漿化之視網膜中，評估此兩種蛋白之表現(圖7A)。西方點漬分析顯示，在投與PU之視網膜組織中具有顯著較高之Oct4及SirT1蛋白含量，因而指出藉由PU-OS之視網膜下注射已成功轉導該外源性之二基因。為評估Oct4/SirT1基因傳遞對於光損傷性大鼠視網膜之救援功效，在光照後5天及2週後，檢驗外核層(ONL)厚度之變化(圖7B及7C)。在控制組及PU載體處理組大鼠中，相較於未接受光照之大鼠，光照會顯著減少ONL之厚度(圖7B及7C)。相較於經PU載體處理之光照實驗動物，對接受光照之大鼠投與PU-OS可顯著抑制ONL之薄化(圖7B及7C)。根據此等數據，PU-OS之投與對於光誘發性ONL薄化之保護功效可維持至2週。相較於在光照後5天(34.3±5.6 μm)及2週(19.9±3.1 μm)後進行PU載體處理之平均ONL厚度，PU-OS處理分別可顯著抑制5天(43.5±6.1 μm)及2週(31.7±4.2 μm)時之光誘發性ONL薄化(兩者皆p<0.05，圖7D及7E)。為進一步測定投與PU-OS後光損傷性大鼠視網膜中之Oct4及SirT1蛋白表現，使用三重染色免疫螢光分析。在光照後3天，於光損傷性視網膜中偵測Oct4及視紫質(光感受器標記)信號(藍色，DAPI：核染色)。結果顯示，與經PU載體處理之視網膜相較，發現經PU-OS載體處理之視網膜之ONL中具有突出之Oct4免疫反應性。在第5天之14個光損傷性視網膜中，相較於經PU載體處理之視網膜，經PU-OS處理之視網膜中之Oct4陽性細胞百分比顯著較高(p<0.05，圖7F)。相較於經PU載體處理之視網膜，經PU-OS處理之光損傷性視網膜中之SirT1陽性細胞百分比亦顯著較高(圖7G)。此等發現指出，在進行Oct4及SirT1基因之PU媒介的傳遞之後，光損傷性視網膜中存在細胞保護作用。
2.5 Oct4/SirT1 之傳遞修復受損之ERG
為研究PU-OS之投與對於光誘發性視網膜功能障礙之作用，在光照後5天及2週後，觀察ERG反應之變化(圖8A及8B)。在控制組大鼠中，相較於未接受光照之控制組大鼠(平均a-波及b-波振幅分別為179.2±61.3 μV及387.5±71.8 μV；圖8C及8D)，光照會在第5天 造成平均a-波及b-波振幅之顯著降低(分別為35.7±17.4 μV及91.7±39.4 μV；圖8C及8D)。相較於對照光動物之PU載體處理所產生者(平均a-波及b-波振幅分別為41.2±17.2 μV及88.2±46.4 μV)，在第5天對光照大鼠投與PU-OS可使平均a-波(95.3±45.8 μV)及b-波(197.2±78.4 μV)振幅之降低情形顯著最小化(兩者皆p<0.05，圖8C及8D)。
於2週時，亦在接受光照之控制組大鼠中，觀察到相較於未接受光照之控制組大鼠(平均a-波及b-波振幅分別為174.6±45.6 μV及376.6±67.5 μV)的平均a-波(32.9±18.2 μV)及b-波(71.4±31.5 μV)振幅之類似降低情形(兩者皆p<0.05，圖8C及8D)。相較於對照光動物之PU載體處理所產生者(平均a-波及b-波振幅分別為28.2±15.8 μV及77.8±47.2 μV)，在此時點對光照大鼠投與PU-OS可使平均a-波(67.2±45.2 μV)及b-波(147.3±85.2 μV)振幅之降低情形顯著最小化(兩者皆p<0.05，圖8C及8D)。我們的數據顯示，PU-OS之傳遞可抑制視網膜ERG a-及b-波振幅之光誘發性降低情形。
由於我們的發現顯示Oct4及SirT1之共過表現在aRPE-PU-OS細胞中具有顯著之抗氧化作用(圖6)，茲進一步評估光照後5天後經PU-OS或PU載體處理大鼠之視網膜MDA含量以及抗氧化酶活性(SOD、CAT、及GSH-Px)。光照會增加MDA含量(圖8E)並抑制抗氧化酶活性(圖8F-H)。重要的是，相較於PU載體處理，光損傷性視網膜之PU-OS處理可造成較低之MDA含量(圖8E)、較高之PGC-1α含量(圖8I)、以及較高之SOD及GSH-Px活性但無CAT活性(圖8F-H)。此等數據指出，光損傷性大鼠視網膜中之OS過表現可提供對於氧化壓力相關性損傷之抗性，並進一步有助於視網膜功能之修復。
為說明本發明，在圖式中顯示目前較佳之具體實例。然而，咸應明瞭，本發明並不限於所示之較佳具體實例。
在圖式中： 圖1說明聚胺酯及PU短支鏈聚乙烯亞胺(PU-PEI，亦縮寫為PU)之合成。
圖2提供(A)PU-PEI轉染進入細胞之流程圖式，以及(B)經帶有Oct4及SirT1 cDNA或是空白載體之PU-PEI轉染之原初aRPEs細胞照片，其中經空白載體轉染之細胞示於左欄(aRPE-PU)；而經Oct4及SirT1共轉染之細胞則以兩個獨立之穩定克隆示於中欄(aRPE-PU-OS #1)及右欄(aRPE-PU-OS #2)(橫條=50 μm)。
圖3提供在aRPE細胞中以PU-PEI轉染之結果，其中(A)顯示與母aRPE細胞相較下，針對aRPE-PU-OS#1及aRPE-PU-OS#2克隆中Oct4及SirT1表現之定量RT-PCR分析；(B)顯示由西方點漬分析之Oct4及SirT1蛋白含量(欄1：母aRPE，欄2：aRPE-PU，欄3：aRPE-PU-OS#1，欄4：aRPE-PU-OS#2)；(C)顯示母aRPE、aRPE-PU、及兩個aRPE-PU-OS克隆在24天期間之生長曲線；而(D)顯示球體形成分析之結果；其係定量由該兩個aRPE-PU-OS克隆、aRPE-PU、及aRPE細胞在三個繼代中所產生之球體。以母aRPE細胞作為控制組(*p<0.05；所示數據為三次獨立實驗之平均值±SD)。
圖4提供Oct4及SirT1促使aRPE細胞重編程成為類視網膜前驅細胞之結果，其中(A)顯示500個探針組之基因表現微陣列分析(基因樹)，其在aRPE-PU-OS細胞中有相較於aRPE-PU細胞之差異表現，以階層式熱圖顯示；將該500個探針組表現之時間依賴性變化藉由R統計程式語言軟體提供之表現值之對數尺度表示；(B)顯示主要組成分析之結果(PC1：縱軸；PC2：橫軸；單位：D-晶片單位)，其係用於使用生物資訊方法而測量表現譜；(C)顯示幹細胞相關性基因表現之定量分析RT-PCR結果，以母aRPE細胞作為控制組；及(D)顯示aRPE-PU、SirT1過表現性aRPE(aRPE-PU-SirT1)、Oct4過表現性aRPE(aRPE-PU-Oct4)、及aRPE-PU-OS細胞中Oct4啟動子之DNA甲基化特徵之亞硫酸鹽定序結果；空心圓係指明未甲基化之雙核苷酸，而實心圓則係指明甲基化之CpG雙核苷酸；(E)顯示Oct4啟動子甲基化狀態之定量結果；(F)顯示以內源基因專一性引子之qRT-PCR分析之內源性(endo)Oct4轉錄物之含量；總體RNA係萃取自aRPE細胞、aRPE-PU細胞、兩個aRPE-PU-OS克隆、及人類胚胎幹細胞H9細胞系；(G)顯示平均距離分析之結果；茲使用平均譜系轉錄組(transcriptome)距離分 析顯示其與H9之距離(“HiPS”表示人類誘發性多功能幹細胞；“NPC”表示神經前驅細胞；“RSC”表示視網膜幹細胞；而“yRPE”表示年輕之視網膜色素上皮細胞)；而(H)-(I)顯示在aRPE-PU-OS細胞中相較於母及控制組aRPE-PU細胞之巢蛋白(Nestin)(H)及武藏蛋白(Musashi)(I)表現之免疫螢光分析結果(*p<0.05；ns，不顯著(p>0.05)；所示數據為三次獨立實驗之平均值±SD)。
圖5提供aRPE細胞中之Oct4-SirT1共過表現誘發性抗氧化作用之結果，其中(A)顯示由流式細胞計數所測定之aRPE-PU細胞及兩個aRPE-PU-OS克隆中之胞內ROS含量；(B)顯示由流式細胞計數所偵測之榖胱甘肽(GSH)含量(控制組之%)；而(C)顯示抗氧化基因之定量RT-PCR分析。以母aRPE細胞作為控制組(*p<0.05；所示數據為三次獨立實驗之平均值±SD)。
圖6提供經H2 O2 處理之aRPE細胞中之Oct4-SirT1共過表現誘發性抗氧化作用之結果，其中(A)顯示在細胞與100 μM H2 O2 接觸8小時後所測定之胞內ROS含量(左)及MDA活性之相對變化(右)；(B)顯示在細胞與100 μM H2 O2 接觸8小時後所測定之榖胱甘肽(GSH)含量(控制組之%，左上)、SOD(右上)、CAT(左下)、及GSH-Px(右下)之相對變化；(C)顯示在細胞與100 μM H2 O2 接觸8小時後於所示組群中定量抗氧化基因相對含量之qRT-PCR；而在(D)-(E)中，細胞在有或無1 mmol/L BSO(一種γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶抑制劑)及0.5 mmol/L Tempol(一種膜滲透性自由基清除劑)之情形下預處理，接著再在24小時後以100 μM H2 O2 處理，並於再8小時後測定ROS生成(控制組之倍數)(D)以及存活率(控制組之%)(E)(#p<0.05；*p<0.05；ns，不顯著(p>0.05)；所示數據為三次獨立實驗之平均值±SD)。
圖7提供光損傷性視網膜中由投與PU-OS而取得之細胞保護作用結果，其中(A)顯示在注射PU-OS或PU載體後視網膜組織中Oct4及SirT1表現之西方點漬分析；(B)-(C)顯示在強光損傷後第5天(B)及第14天(C)之視網膜切片之代表性H&E染色影像；(D)-(E)分別顯示在強光損傷後第5天(D)及第14天(E)時所示組群((B)及(C)中之箭頭)中之ONL厚度定量；而(F)-(G)顯示在光損傷後第5天及第14天之視 網膜切片中Oct4-陽性及SirT1-陽性細胞之免疫螢光分析定量(#p<0.05；*p<0.05；**p<0.01；橫條=40 μm；所示數據為三次獨立實驗之平均值±SD；GCL，神經節細胞層；IPL，內叢狀層；INL，內核層；ONL，外核層；IS，內段；OS，外段；RPE，視網膜色素上皮細胞)。
圖8提供光損傷性視網膜中PU-OS處理修復視網膜描記反應及增進抗氧化劑含量之結果，其中(A)-(B)顯示在強光損傷後第5天(A)及第14天(B)之代表性ERG波反應；(C)-(D)顯示在光損傷後第5天及第14天之a-波(C)及b-波(D)振幅定量；(E)-(H)顯示在光損傷後第5天之MDA含量(E)、以及SOD(F)、CAT(G)、及GSH-Px(H)活性之相對變化(#p<0.05；*p<0.05；所示數據為三次獨立實驗之平均值±SD)；而(I)顯示在光損傷後第5天時所示組群中定量PGC-1α mRNA相對含量之qRT-PCR結果。
<110> 台北榮民總醫院
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Claims (11)

  1. 一種用於在視網膜色素上皮細胞中降低Oct4啟動子甲基化程度之醫藥組合物，其包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA或一包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸，其中該Oct4 cDNA及SirT1 cDNA係以對於降低Oct4啟動子甲基化程度具有協同作用之有效量存在。
  2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該Oct4 cDNA、SirT1 cDNA、或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸係由載體攜帶。
  3. 如申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該由載體攜帶之Oct4 cDNA、SirT1 cDNA、或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸係封裝於聚合物中。
  4. 如申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該聚合物係陽離子聚胺酯-短支鏈聚乙烯亞胺(polyurethane-short branch polyethylenimine(PU-sbPEI))。
  5. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該Oct4 cDNA包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該SirT1 cDNA包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1項醫藥組合物，其中該Oct4 cDNA及該SirT1 cDNA之比例係介於0.8：1及1：1.2之間。
  8. 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該Oct4 cDNA及該SirT1 cDNA之比例係1：1。
  9. 一種Oct4 cDNA及SirT1 cDNA或包含Oct4 cDNA及SirT1 cDNA之聚核苷酸用於製造降低視網膜色素上皮細胞之Oct4啟動子甲基化程度之醫藥組合物之用途，其中該Oct4 cDNA及SirT1 cDNA係以對於降低Oct4啟動子甲基化程度具有協同作用之有效量存在於該醫藥組合物中。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該Oct4 cDNA包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
  11. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該SirT1 cDNA包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
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