TWI435880B - 矽殼之表面化學性改質及其應用 - Google Patents

Description

矽殼之表面化學性改質及其應用

本發明係關於矽殼表面之改質方法，特別係關於將矽藻矽殼(frustule)之表面進行化學性改質，並鍵結上螯合劑，以使其能固定化金屬離子的方法。

固定化金屬親和性層析法(immobilized metal affinity chromatography;IMAC)已經普遍應用於純化帶有組胺酸標識(his-tag)之蛋白質。大致上習知技術所使用的固相載體可分為有機(organic)及無機(inorganic)兩大類。有機固相載體大多是親水性佳的天然高分子或合成聚合物，例如：纖維素(cellulose)、葡聚醣(dextran)、瓊脂糖(agarose)等，此等有機固相載體具有許多缺點，包括機械穩定性差、會發生膨脹，以及孔洞大而使得動力學慢等，且在工業上長期使用時容易受微生物分解。而於無機固相載體中，矽膠(silica)除了沒有上述的缺點外，其化學結構穩定，而且能夠耐酸、耐高溫。

矽殼(frustules)主要是由biosilica(SiO₂ )所構成，其具有機械強度高、化學結構穩定、耐酸性、具生物性相容、不易受微生物分解等優點，若經過適當的化學性改質，可發展做為適合應用在純化蛋白質的生物性材料。矽殼表面富含許多3D結構的孔洞，最外層之大孔洞直徑約249-360 nm，大孔洞內又有2-4個不等的小孔洞，直徑約50 nm-115 nm，小孔洞內可見更微小孔洞約20 nm。此多孔性可增加接觸的表面積，提升表面化學之基團改質密度。另外，矽殼表面帶有矽醇(silanol)官能基，以UV光激發時會使矽殼散發出藍綠色的螢光。

矽殼之二氧化矽表面帶有的矽醇基(Si-OH)可能有三種形式，第一種形式是獨立的矽醇基(isolated silanol)，亦即矽與矽殼表面有三個鍵結，而矽的第四個鍵則是與-OH基之氧鍵結；第二種形式為鄰或橋接矽醇基(vicinal or bridged silanols)，指兩相鄰獨立的矽醇基之間產生氫鍵；第三種形式稱geminal矽醇基，指一矽醇基之矽原子上帶有兩分子的羥基。由於矽醇基的化學性質不活潑，必需透過不同程序來將其官能基化，促使其表面帶有反應性官能基，而可與目標物直接反應，或者做為後續化學性改質作用之中間官能基。

A. V. Rao等人曾使用多種不同類型的有機矽氧烷(alkyl-alkoxy/chloro silane)當做改質劑，而對化學合成之二氧化矽進行表面改質，使其顯示出不同的物理及化學特性。結果顯示，該等矽氧烷改質劑必須至少帶有一個烷氧基/氯基(alkoxy/chloro)基團，才能進行二氧化矽的表面改質。覆蓋在表面的烷基(-R2)基團越多，則二氧化矽表面具有的疏水性越高；另外一方面，含(-OR1)基團數目減少，則長期暴露在水中會使重量增加(Raoet al .,Applied Surface Science (2003)206 :262-270)。因此改質的首要步驟，是挑選合適的有機矽烷當作改質劑。在2004年，P. K. Jal等人將經過有機矽烷改質之二氧化矽再接上金屬螯合劑，以使其能固定化金屬離子，並應用於萃取金屬離子(Jalet al .,Talanta (2004)62 :1005-1028)。此方法可延伸應用於固定化金屬親和性層析。亦即，將螯合劑IDA、NTA等以共價鍵結方式固定於二氧化矽表面上，再利用螯合劑固定金屬Cu²⁺ 、Ni²⁺ 、Zn²⁺ 等，並將其應用於吸附帶有his-tag的蛋白質，或者能藉由IMAC純化之蛋白質。

已知先前技藝中所使用的二氧化矽材料，大多係經由化學合成法獲得，鮮少揭示以天然矽殼為材料者。Helen E. Townley等人曾將矽藻Coscinodiscus wailesii 的矽殼表面進行改質而接上3-胺基丙基三甲氧基矽烷(3-aminopropyl trimethoxy silane)，再以此為基礎來固定生物分子(例如抗體)，進而將其應用於微型全分析系統(microscale total analysis systems)(參見，Townleyet al .,Advanced Functional Materials (2008)18 (2)：369-374)。

因此，本發明採用培養簡單又成本低廉的矽藻，以經濃硫酸萃取後之細胞壁(矽殼，SiO₂ )當做固相無機物載體基質，再將其表面的矽醇(silanol)基團進行化學性改質，並鍵結上螯合劑(例如IDA)，使其能固定金屬離子(例如Cu²⁺ )，進而將經改質之矽殼用於吸附可被IMAC純化的蛋白質，以期望能應用於此類蛋白質之純化系統上。

於本發明之一方面，係提供一種矽藻矽殼表面之化學性改質方法，其包含：將矽藻以濃硫酸處理收取其細胞壁(矽殼SiO₂ )作為固相載體基質；接著將矽殼表面之矽醇基經由有機矽氧烷將矽殼表面官能基化，使其表面外側帶有異氰酸官能基(-N=C=O)；再將金屬螯合劑以與該異氰酸官能基進行共價鍵結的方式，固定於該矽殼表面上；以及將金屬離子固定化於該矽殼表面之金屬螯合劑上，而得到經化學性改質之矽殼。

於本發明之具體實施例，所使用之有機矽氧烷改質劑可為(3-異氰氧丙基)三乙氧基矽烷(IPS)。金屬螯合劑則可選用亞胺基二乙酸(IDA)、腈三乙酸(NTA)、羧甲基化天冬胺酸(CM-Asp)或叄(羧甲基)-乙二胺(TED)，其中尤其以亞胺基二乙酸(IDA)為較佳。

於本發明之具體實施例，固定化金屬離子可為Cu²⁺ 、Ni²⁺ 或Zn²⁺ ，其中以銅離子(Cu²⁺ )為較佳。

本發明之另一方面係關於，一種由如申請專利範圍第1項所述之方法製得的經化學性改質之矽殼。本發明之經化學性改質矽殼可用於吸附及純化帶有his-tag之蛋白質。本發明之經化學性改質矽殼較佳可應用於固定化金屬親和層析術(IMAC)中做為吸附載體。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例

根據本發明所呈現的各種實施例，下述各種儀器、裝置、方法和其相關結果者，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。

實施例一：矽殼(Frustules)表面之化學性改質

矽殼之萃取步驟如下：將矽藻(小碗形藻)全部收集於50 ml離心管中(離心3000 rpm，10 min)，以去離子水清洗細胞液三次(離心3000 rpm，10 min)，最後一次盡量去除上清液。加入濃硫酸(97%)，約三倍矽殼體積，放置於70℃水浴槽熱浴10分鐘後，再加入適量之1M KNO₃ (約為濃硫酸1/3倍體積)，反覆進行上述之熱浴與抽氣步驟共三次，接著依序以去離子水及70%酒精各清洗三次，最後將經過萃取後之矽殼保存於去離子水中，放置於4℃冰箱備用。

矽殼表面之改質方法如下：首先將經濃硫酸萃取之矽殼、95%(3-異氰氧丙基)三乙氧基矽烷((3-isocyanatopropyl) triethoxysilane(IPS),Alfa Aesar公司)及0.2 M亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid(IDA),ACROS ORGANICS公司)放入密閉式手套箱中，填充氮氣(N₂ )使手套箱內的溼度低於20%，在手套箱內取5 ml矽殼、1.042 ml IPS與4.375 ml IDA混合於離心管，並用石臘膜(parafilm)將管口密封，放置於室溫下搖晃2小時(已移出至手套箱外)。接著以離心方式(3000 rpm，10分鐘)去除上清液，並且用去離子水重複清洗三次(3000 rpm，10分鐘)。接著，加入20.16 ml CuSO₄ (0.1M,SHOWA)與鍵結在矽殼上之IDA反應，放在室溫下搖晃2小時。重覆如上所述之清洗步驟，以去除未反應的銅離子。最後，將經過表面化學性改質之矽殼保存於4℃。

實施例二：IPS-IDA改質之矽殼的分子結構分析及固定化銅離子濃度檢測

本實例係利用掃描式電子顯微鏡、能量色散X射線光譜儀、及傅立葉轉換紅外線光譜儀分析，比較改質前後的矽殼外觀、形態、組成元素比例、或是鍵結的差異。首先，改質的矽殼以掃描式電子顯微鏡來觀察矽殼的整體結構與表面狀態，矽殼的主要構造並未改變(圖一a)，但是矽殼表面較粗糙(圖一b)。以能量色散x射線光譜儀分析組成元素的原子含量比(圖一c)，經換算得到莫耳數比為Si:O:C:N=1:5.4:2.7:0.8，相較於未改質之矽殼的Si:O=1:4.6略微提高。此外，銅離子固定於改質後之矽殼的含量相當低，與矽的比值為0.012，不易被EDS所偵測。

以傅立葉轉換紅外線光譜儀(FT-IR，本實例中所使用的機型為FT-720,HORIBA)，分析經改質後矽殼的分子結構及官能基，顯示除了原本的主要特性峰Si-O-Si鍵結(位置在1045-1095 cm^-1 (stretching)及797-800 cm^-1 (bending))之外，在原本Si-OH(1630-1640 cm-1)特性峰位置可測得醯胺基(amide)的N-H group(1620-1640 cm^-1 )、C=O group(1630-1680 cm^-1 )，羧基(carboxyl)的C=O group(1700-1730 cm^-1 )等特性峰(圖二)，依照峰形改變判斷為Si-OH經反應後消失，取而代之的是其他三個特性峰，並且醯胺基的C-N group的特性峰出現在1350 cm^-1 ，證實IDA經由IPS鍵結於矽殼表面。

微量盤螢光連續光譜分析儀(Infinite M200pro,Tecan,Switzerland)可用於偵測冷光、吸收光及螢光光譜，且文獻指出二價銅離子在波長800-820 nm會有吸收值(Zaki & Alqasmi,Fresenius' Journal of Analytical Chemistry ,306 (5): 400-400,1981)，因此利用此儀器來計算，固定化在經表面化學性改質之矽殼上的銅離子量。將不同濃度的CuSO₄ 與EDTA混合，並測量混合液在波長800 nm之吸收值，畫出濃度對應於波長800 nm吸光值的標準圖(圖三)。另外，金屬螯合劑EDTA有六個牙基，而IDA僅有三個牙基，對銅離子的螯合強度為EDTA>IDA，EDTA溶液可將已固定在經IDA改質之矽殼上的銅離子釋出，而測得波長800 nm讀值，再將該吸光值帶回圖三的校正曲線Y=13.49 X+0.36進行換算，即可得到於經IDA改質之矽殼上，所固定化銅離子的鍵結量。

未改質之矽殼為淡黃色，經IPS-IDA改質後之外觀顏色並未改變，而鍵結上銅離子之IPS-IDA-Cu矽殼則呈現藍色。使用儀器infinite M200 pro於800 nm時測量EDTA溶液中的已知銅離子濃度，得公式y=13.49x+0.36。將體積0.1 ml的IPS-IDA-Cu矽殼與100 μl之0.1 M EDTA混合並收集上清液，移除銅離子後的IPS-IDA矽殼顏色恢復為淡黃色，測量上清液在波長800 nm之吸光值，帶入上述公式，計算得於經銅離子固定改質之矽殼上的銅離子鍵結量為191±10 μmole Cu²⁺ /ml經改質矽殼(參見下表一)。

實施例三：表面經化學性改質之矽殼對SVP吸附之分析

本實例係將有或無經過銅離子固定改質之矽殼，與不同濃度的重組VP2-441蛋白(呈一種表面帶有組胺酸之次病毒顆粒(SVP))進行吸附實驗，以測試本發明表面經化學性改質之矽殼的吸附能力。將改質後帶有銅離子之矽殼體積固定為0.1 ml，與5-1300 μg的SVP(5 μg、10 μg、20 μg、40 μg、80 μg、160 μg、250 μg、300 μg、350 μg、700 μg、900 μg、1100 μg、及1300 μg)，於IMAC緩衝溶液(20 mM NaH₂ PO₄ ,500 mM NaCl,pH7.8)進行吸附平衡實驗，反應總體積為1200微升(μl)。將反應物架於試管旋轉架上旋轉混合，於4℃反應1小時，使之達吸附平衡。樣品以1000 xg離心20秒，收集上清液。將上清液以2000 xg離心10分鐘，去除雜質或粉末，再取100 μl進行HPLC分析。以HPLC分析測得溶液中殘餘之未吸附蛋白質濃度(M)，再以下列公式：

吸附濃度(Q)=(起始蛋白量-未吸附蛋白量)/矽殼體積

求得吸附濃度(Q)，並繪製出平衡濃度(C)(為X軸)相對於Q(為Y軸)的恆溫吸附圖(參見圖四)。結果顯示，當起始蛋白質濃度增加時，吸附濃度(Q)逐漸趨緩。在SVP為1300 μg之組別，蛋白質吸附濃度(Q)為3.1±0.037 x10^-9 莫耳/ml經化學性改質之矽殼。整體而言，未經改質前之矽殼(圖中以倒三角形記號表示者)與經化學性改質之矽殼比較，經過銅離子固定改質之矽殼可以使矽殼基質對重組VP2-441蛋白質之吸附量提升約28倍。證實銅離子固定改質之矽殼具有發展成純化蛋白質之潛力。

實施例四：表面經化學性改質之矽殼對m-GFP5蛋白質吸附之 分析

m-GFP5H為一C端帶有6個組胺酸(His)之螢光蛋白，本實例係測試表面經化學性改質之矽殼對於m-GFP5H蛋白的吸附能力。將Hi-5昆蟲細胞以5 x 10⁵ cells/ml的接種密度，培養於20 ml之ESF921培養基中，當細胞密度達2 x 10⁶ cells/ml時，以MOI=10加入重組桿狀病毒(v mGFP5H)感染Hi-5昆蟲細胞，並在27℃培養60小時。每20 ml的細胞沉澱物以2.5 ml作用緩衝液(binding buffer;20 mM Hepes pH 8.0,500 mM NaCl,0.5 mM PMSF,10 mM imidazole)回溶並打破細胞，以2000 xg離心20分鐘後，收取含可溶性蛋白的上清液。將其與1 ml Ni-NTA反應1小時。收取流出液，再以作用緩衝液20 ml分五次來清洗，接著以沖提緩衝液(elution buffer;10 mM Hepes pH 8.0,20 mM NaCl,0.5 mM PMSF,250 mM imidazole)2 ml與Ni-NTA作用15分鐘後沖提目標蛋白，重覆以2 ml之沖提緩衝液沖提蛋白1次，透析去除imidazole並置換成TAP蛋白萃取緩衝液(TAP native protein extraction buffer;50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,10%甘油,0.1% NP-40,1 mM DTT,1mM PMSF,pH 7.5)，分裝保存在-20℃。

取20 μl之矽殼與100 μg之蛋白質m-GFP5進行吸附，作用緩衝溶液為IMAC緩衝溶液pH 7.8(20 mM NaH₂ PO₄ ,500 mM NaCl,pH 7.8)，反應總體積為1020 μl。架於試管旋轉架上旋轉混合，於4℃反應1小時。之後，於3000 rpm離心10分鐘去移除上清液，再以IMAC緩衝溶液(pH 7.8)清洗矽殼，共三次，以去除殘留未吸附的m-GFP5。最後，取出適量的矽殼製成試片，以共軛焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,Fluoview FV1000,Olympus,Japan)觀察。

由圖五之結果顯示，未經過化學性改質之矽殼對於m-GFP5H蛋白的吸附能力差，以致在顯微鏡下未觀察到m-GFP5H之螢光反應(圖五A)。而相較於前述之結果，本發明經過化學性改質之矽殼對於m-GFP5H蛋白有顯著較佳的吸附能力，於共軛焦顯微鏡之觀察下，於矽殼表面清楚呈現m-GFP5H的螢光反應(圖五B)。證實，銅離子固定改質之矽殼可有效提升對於m-GFP5H之吸附量。

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。

從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與改質，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

圖一顯示表面經化學性改質之矽殼的微結構圖(a,b)及組成元素比(c)。

圖二為矽殼改質前、後的傅立葉轉換紅外線光譜圖之比較。

圖三為銅離子濃度校正曲線與改質矽殼之固定化銅離子濃度。

圖四顯示表面經化學性改質之矽殼對SVP吸附之分析結果。

圖五顯示以觀察未經過(A)及經過(B)化學性改質之矽殼對於m-GFP5H蛋白的吸附能力。

Claims (10)

1. 一種矽藻矽殼表面之化學性改質方法，其包含：(a)將矽藻以濃硫酸處理，收取其細胞壁(矽殼SiO₂ )作為固相載體基質；(b)將矽殼表面之矽醇基經由一種帶有異氰氧烷基之有機矽氧烷將矽殼表面官能基化，使其表面外側帶有異氰酸官能基(-N=C=O)；(c)將金屬螯合劑以與該異氰酸官能基進行共價鍵結的方式固定於該矽殼表面上；及(d)將金屬離子固定化於該矽殼表面之金屬螯合劑上，而得到經化學性改質之矽殼。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該有機矽氧烷為(3-異氰氧丙基)三乙氧基矽烷(IPS)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該金屬螯合劑係選自亞胺基二乙酸(IDA)、腈三乙酸(NTA)、羧甲基化天冬胺酸(CM-Asp)及叄(羧甲基)-乙二胺(TED)。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該金屬螯合劑為亞胺基二乙酸(IDA)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該金屬離子為Cu²⁺ 、Ni²⁺ 或Zn²⁺ 。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該金屬離子為Cu²⁺ 。
7. 一種由如申請專利範圍第1項所述之方法製得的經化學性改質之矽殼，其具有如下之結構式：
8. 如申請專利範圍第7項所述之經化學性改質之矽殼，其係用於固定化金屬親和層析術(IMAC)純化蛋白質。
9. 一種純化蛋白質之方法，其特徵在於包含利用如申請專利範圍第7項所述之經化學性改質之矽殼吸附欲純化蛋白質的步驟。
10. 如申請專利範圍第9項所述之蛋白質純化方法，其中該蛋白質為帶有組胺酸標識(his-tag)之重組蛋白質。