TWI429426B - ４，５－雙胺基－３－鹵基－２－羥基苯甲酸衍生物、製法及其用途 - Google Patents

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Description

4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物、製法及其用途
本發明係關於一種可抗流感病毒之成分，特別是關於一種可作為流感病毒神經胺酸酶抑制劑之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物。
流行性感冒(influenza)，簡稱流感(flu)，是一由流行性感冒病毒(influenza virus，簡稱流感病毒)所引起的急性呼吸道傳染病。因其病毒抗原變異性高、傳播速度快，很容易引發全球性的大流行(pandemic)，對人類的健康及經濟發展造成嚴重危害。在二十世紀期間，流感病毒就曾分別於1918(“Spanish”influenza，H1N1)、1957(“Asian”influenza，H2N2)與1968(“Hongkong”influenza，H3N2)年造成人類三次的大流行，其中以1918到1919年間的大流行最為嚴重，估計造成超過四千萬人的死亡。1997年香港爆發首次的人類禽流感H5N1(H5N1 avain influenza)流行，由於其傳染力強、高致死率且對於目前市售的抗流感病毒藥物易產生高度抗藥性，引起世界各國的關注。研究發展有效的抗流感病毒藥物以防範下一波世界性全面大流行已成為重要議題。神經氨酸酶(neuraminidase)為流感病毒表面重要糖蛋白之一，與病毒的複製與感染息息相關，由於其活性區(active site)在所有A型及B型流感病毒間是高度保留的，故在抗流感藥物的設計上被認為是一個具潛力的抑制目標。
(一)、流感病毒之類型
流感病毒為一負性單鏈RNA病毒(negative-sense single-stranded RNA virus)，屬於正黏液病毒科(familyOrthomyxoviridae )，依其內部的核酸蛋白(nucleoprotein)及基質蛋白(matrix protein)抗原性的不同可分為A、B、C三型：
1. A型流感病毒(Influenza A virus)-
◆　屬於流感病毒A屬(Influenzavirus A )，感染宿主範圍廣，如人、豬、馬、貂、鯨、雞、鴨、鵝等。
◆　抗原變異性高，易引起規模較大的流行，前幾次的世界大流行都是由A型病毒所引起的。
◆　依照其表面兩種抗原，血凝素(hemagglutinin，簡稱HA)和神經氨酸酶(neuraminidase，簡稱NA)的不同，可再區分為不同亞型。血凝素有16種亞型(H1-H16)，神經氨酸酶有9種亞型(N1-N9)。所有亞型都能夠在禽鳥類中發現，但目前只有3種HA亞型(H1、H2和H3)和兩種NA亞型(N1和N2)能在人類間廣泛傳佈。
◆　所有的A型流感病毒亞型都可在野鳥中傳佈，因此野鳥被認為是A型流感病毒的天然宿主。而在鳥類之間傳播的流行性感冒稱之為禽流感(Avian influenza)，禽流感病毒(Avian influenza virus)通常只感染鳥類，不直接傳染給人或在人之中相互傳染，但至目前為止已發現H5N1、H7N7、H9N2三種禽流感病毒可以跨物種傳染給人類。
2. B型流感病毒(Influenza B virus)-
◆　屬於流感病毒B屬(Influenzavirus B )，感染宿主僅限於人類。
◆　僅具有一種血凝素及一種神經氨酸酶，抗原變異性不高，不會造成大規模的流行，僅會導致區域性的流行(epidemic)。
3. C型流感病毒(Influenza C virus)-
◆　屬於流感病毒C屬(Influenzavirus C )，感染宿主為人類及豬。
◆　感染所產生的症狀輕微，不易造成流感疾病及流行。
(二)、流感病毒之型態
參閱第一圖，流感病毒為多形態、具套膜之病毒，其中球狀的病毒株直徑約為100 nm，而絲狀者長度可達300 nm以上，為一層源於宿主的脂肪包膜(lipid envelope)，包膜上鑲嵌著刺突(spike)狀的醣蛋白(glycoprotein)，就A型及B型流感病毒而言，包括兩種重要的抗原(antigen)：血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)，C型流感病毒則僅具有一種表面醣蛋白：血凝素-酯酶-融合(hemagglutinin/esterase/fusion，簡稱HEF)蛋白，兼具了血凝素及神經氨酸酶的功能。包膜上另有一些次要的蛋白，具有離子通道蛋白之功能：A型流感病毒的M2 蛋白、B型流感病毒的BM2蛋白和C型流感病毒的CM2蛋白。此外，B型流感病毒有一獨有的蛋白：NB蛋白，結構類似通道蛋白，但在病毒複製時並非為一必須的蛋白，功能至今仍不清楚。緊臨著包膜之下的為基質蛋白(matrix protein，簡稱M1)，具有保護病毒核醣核蛋白體(ribonucleoprotein，簡稱RNP)核心及維繫病毒結構的功能，且在病毒完成複製離開宿主細胞的過程中扮演重要角色。流感病毒基質蛋白內部主要為核醣核蛋白體，為對稱的螺旋髮夾形(helical hairpin)結構，包含了基因體及四種蛋白質：病毒的基因體由多段的單股負性RNA(segmented negative-sense single-strand RNA)所組成，A型及B型流感病毒具八段，而C型流感病毒具七段，每段RNA均由核蛋白(nucleoprotein，簡稱NP)纏繞形成具保護作用的外殼，而環節(loop)的另一端則與RNA聚合酶(RNA polymerase,由PA、PB1及PB2三種蛋白所構成)相結合。除此之外，基質蛋白內部亦有一些少量的非結構蛋白(nonstructural protein)：出核轉運蛋白(nuclear export protein，簡稱NEP/NS2)，在病毒之核醣核蛋白體自宿主細胞核內運送至細胞質中扮演重要角色。
(三)、流感病毒之表面醣蛋白
A型與B型流感病毒表面具兩種醣蛋白：血凝素與神經氨酸酶，與病毒的抗原變異性息息相關，以下僅就此兩種重要的抗原蛋白作論述。
1.　血凝素(hemagglutinin)
流感病毒利用血凝素辨識宿主表面的受體，此外血凝素亦與病毒包膜與宿主細胞膜的融合有關。血凝素為一由約550個胺基酸組成的多肽單體HA0利用非共價鍵所形成的具功能性的三聚體，H0可被蛋白酶裂解活化成兩個次單位：HA1和HA2，兩個次單位間以絲氨酸-14(cys-14，源自HA1)和絲氨酸-137(cys-137，源自HA2)間形成的雙硫鍵相連。血凝素整體結構可分為球狀的頭部和由三股螺旋α螺旋組成的莖狀結構(stem-like structure)，頭部僅由HA1所組成，上面具有受體結合位(receptor-binding domain)，病毒以此結合位和宿主細胞上的受體-唾液酸(sialic acid)結合；莖部主要則由HA2組成，HA2的C端為HA可穿入並固定於病毒包膜的部分，而N端則為融合胜肽(fusion peptides)的部分。當病毒以內吞方式進入宿主細胞後，受內質體(endosome)內pH質降低調整為酸性的影響，使得HA0的結構被裂解為HA1和HA2，本被包埋住的HA2上的融合胜肽因而暴露出來，融合胜肽能插入宿主細胞膜中，促使病毒包膜與宿主細胞模的融合(參閱第二圖)。HA可被視為一N-醣基化的蛋白質(N-glycosylated protein)：HA1上有許多可被醣基化的位置，稱抗原位，其抗原性與病毒辨識宿主的能力有關，病毒的抗原位的變異導致其抗原變異性，可感染人類細胞的病毒亞型就有H1、H2、H3、H5、H9之多。因為至今血凝素的晶形結構尚未被完全解析，再加上病毒亞型間的相對保留位置不多(所有的胺基酸序列相似度低於50%)，在藥物設計研究上仍未有較大的發展與突破。
2.　神經氨酸酶(neuraminidase)
神經氨酸酶具破壞受體的功用，當病毒完成複製，以出芽方式離開宿主細胞時，須藉由神經氨酸酶催化水解宿主細胞上唾液酸，病毒才可真正離開宿主進而感染新的細胞。神經氨酸酶和血凝素一樣皆是N-醣基化的蛋白質，而這些表面的抗原位與其抗原性相關連。結構上，神經氨酸酶為一由單一多肽鏈為單體所組成的四聚體(參閱第三圖)，具有一高度保留的胞質尾區(cytoplasmic tail)及疏水性的穿膜蛋白區(hydrophobic transmembrane region)，包括了用於附著的莖狀區(stalk domain)及圓狀的頭部(head domain)，病毒以其N端插入固定在病毒包膜上，每一單體包括了六組相同的以四條反向平行的肽鏈組成的β摺板(four-stranded antiparallel β-sheet)，且每一單體皆具抗原與酵素活性。唾液酸可結合到每個單體的活性區中進行催化，且在此過程中唾液酸的構形並不會有所改變。
B型流感病毒只有一種神經氨酸酶，而A型流感病毒有16種亞型，而這16種亞型又可以其結構分為兩類型：group-1和group-2。group-1包括N1、N4、N5、N8四種亞型；group-2包括N2、N3、N6、N7、N9五種亞型，group-1相較於group-2在活性區旁還相連接了一個150-cavity的空間，增大了其活性區的寬度。150-cavity造成的原因有(i)兩類型間的150-loop(胺基酸147-152所構成)空間構形上的不同：在group-1上的第49號胺基酸(val 149)的疏水端是指離活性區的；但group-2的(Ile 149)則是指向活性區。(ii)在兩類型上都具相同的胺基酸基Glu 119，但其在構形上有所不同，group-2上的Glu 119會與Arg 156形成氫鍵，group-1則否。此150-cavity在藥物設計的專一性上提供了新的方向。除了A型流感病毒group-1活性區上多了150-cavity的空間以外，基本上，神經氨酸酶的活性區在A型與B型流感病毒間是呈現高度保留的狀態的(保留度高達75%)，故相較於變異性較高的血凝素，神經氨酸酶在藥物設計發展上是一個很好的標的物，而至今市面上也已經有兩種利此原理所開發的藥物，Oseltamivir及Zanamivir，以第三圖為例，Oseltamivir可結合在神經氨酸酶上的活性區(如圖中箭頭所指位置)。
(四)抗流感藥物(anti-influenza virus agents)之簡介
流感病毒在複製過程中其RNA聚合酶缺少了校正(proof-reading)的功能，導致病毒結構及抗原性是持續地改變。儘管「疫苗的注射」是避免感染流行性感冒的最佳方法，但注射一種疫苗後所產生的抵抗力僅侷限於特定抗原型的病毒，所以當病毒發生重大突變引發流感的流行時，往往會缺乏有效的疫苗，此時所仰賴的即抗流感藥物。利用了解病毒的複製週期，找尋適當的抗病毒藥物標的，研發有效的抗流感藥物已是刻不容緩，以下將針對目前市面上可用於治療流行性感冒的藥物做介紹。
1. M2蛋白抑制劑(M2 inhibitors)
下列所示的結構式為金剛烷衍生物(adamantine derivatives)，包括了金剛胺(amantadine)及金剛乙胺(rimantadine)兩種，以金剛乙胺之毒性和副作用較低，而金剛胺容易產生影響中樞神經的副作用。金剛胺首次被核准使用於抑制流感病毒的合成藥物，此藥物僅對於抑制A型流感有效。金剛胺用於抑制M2離子蛋白通道的作用，導致胞質體中的氫離子無法進入病毒粒子內，進而抑制病毒RNP的釋放。但此類藥物容易產生抗藥性及造成產生抗藥性的病毒的傳播，近幾年發現，H3N2流感病毒已對此類藥物產生了抗藥性。
2.　單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑(IMP dehydrogenase inhibitors)
單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑(IMP)包括了Ribavirin及Viramidine。Ribavirin為一廣泛使用的抗病毒藥劑，亦發現可用於對抗流感病毒，Viramidine則為Ribavirin的前驅藥(prodrug)，仍在試驗的階段，希望此藥能較Ribavirin有更好的抗流感活性。Ribavirin為合成的核苷類似物，作用是在抑制IMP脫氫酶，IMP被IMP脫氫酶催化形成XMP之後經一連串反應形成GTP，與RNA的合成有關，故IMP脫氫酶的抑制普遍的可以抑制病毒RNA的合成，研究顯示Ribavirin對H5N1流感病毒具抑制效果，其EC50 (50% effective concentration，50%有效抑制濃度)的範圍在6至22 μM之間。
3.　神經氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitors)
包括了Oseltamivir和Zanamivir(結構式如下所示)。神經氨酸酶會切斷唾液酸與宿主細胞表面醣蛋白的鍵結，使病毒粒子能離開宿主細胞，而神經氨酸酶抑制劑會抑制神經氨酸酶的作用，使病毒粒子無法釋放。研究發現，唾液酸在催化過程中的過渡態(transition state)結構對於神經氨酸酶有好的抑制能力，Oseltamivir和Zanamivir即是以此結構做修飾所發展出來的藥物，對於A型即B型流感都有好的抑制能力(Oseltamivir: Ki ~0.2 nM，Zanamivir：Ki ~0.1 nM)。Zanamivir為第一個核准上市的神經氨酸酶抑制劑，但由於其生物利用性不高，僅只能以吸入的方式用藥；Oseltamivir則以口服方式用藥，為一乙酯類前驅藥物(ethyl ester prodrug)，當進入體內後會被體內的酯水解酶(esterase)轉換成具活性的結構，為目前效果最好、使用較廣泛的抗流感藥物。
相較於M2抑制劑僅侷限於抑制A型流感病毒、副作用較嚴重及易產生抗藥性等問題，神經氨酸酶抑制劑抑制流感病毒的種類較為廣泛可遍及A型與B型流感病毒且較不易產生抗藥性，現今市面上兩種此類的治療藥物Zanamivir及Oseltamivir，雖具有不錯的治療效果，但有鑑於不斷變異的流感病毒，新型的藥物研究開發是有其必要性的。此類藥物是以神經氨酸酶做為標的物：神經氨酸酶在流感病毒離開宿主細胞的過程扮演了重要的角色，另也有研究指出此醣蛋白亦與流感病毒在呼吸道中的擴散能力有關。神經氨酸酶的活性區在所有A型及B型流感病毒中是高度保留的，故運用此特點，期許能發展出有效的抗流感藥物。以下將針對流感病毒的神經氨酸酶作用機轉與其活性區做探討，提供未來藥物設計上一個正確的研究方向。
神經氨酸酶作用機轉之簡介
請同時參閱下列反應式，其顯示了神經氨酸酶作用之機制。當唾液酸於神經氨酸酶的活性區時，會與此酵素有鍵結作用，再加上唾液酸上帶負電的羧基(carboxyl group)會與周圍的酵素環境有靜電作用力，導致本來椅形結構(chair conformation)會扭曲成船型(boat)的結構，隨之因為構形的張力(conformational strain)，致使唾液酸與本來相連接的醣蛋白分離，此催化過程中，先會產生唾液酸的過渡態(transition state)結構－唾液酸陽離子(sialosyl cation)，此結構可以被活性區內負電荷的環境穩定，水分子會與之作用然後釋放出α-唾液酸，緊接著再變(mutarotate)成較穩定的β-唾液酸，研究顯示，相較於β-唾液酸，α-唾液酸能與神經氨酸有結合能力。另外唾液酸陽離子也有可能被其他的神經氨酸酶抓住，反應產生唾液酸陽離子－酵素的中間產物(glycosyl-enzyme intermediate)，其最後一樣也是會被水解生成α-唾液酸(參閱如下反應式)。研究發現以α-唾液酸做為抑制劑時抑制效果微弱(Ki =5×10-5 M)，而模擬唾液酸過渡態的結構的抑制劑，DANA(2-deoxy-2,3-didehydro-N -acetylneuraminic acid，Neu5Ac2en)反而具較好的抑制能力(Ki =4×10-6 M)，推論唾液酸過渡態的結構與神經氨酸酶的活性區有較好的作用能力，故可以此結構為主體做修飾預期發展出具潛力的藥物，現今市面上所見的Oseltamivir及Zanamivir即以此概念設計發展而來的。
神經氨酸酶作用活性區之分析
利用電腦蛋白質晶體結構分析能解析出神經氨酸酶的活性區與受體間的作用情形，在2003年由Stoll等人所在Biochemistry 期刊所發表的文章中，將活性區分成五個部分，S1、S2、S3、S4、S5，以DANA為例，清楚的闡述了活性區中的氨基酸與受質之間的作用力，以下將針對這五個部分做討論，請同時參閱第四圖。
S1區： 此區域內包括了三個精氨酸，Arg118、Arg292、Arg371，提供了帶正電的環境，DANA上的羧基會與之產生氫鍵的作用力、電荷交互作用力(charge-charge interaction)等離子作用力。這三個精氨酸所形成的「triarginyl cluster」也是決定抑制劑在活性區中位向的重要關鍵，在此位置除了羧基外，可置換為亞磷酸基團(phosphonic group，-PO(OH)2 )、磺酸基(sulfonic group，-SO2 (OH))或亞磺酸基(sulfinic group，-SO(OH))等基團。
S2區： 此區包括了兩個麩氨酸，Glu119c及Glu227，提供了帶負電荷的環境，DANA的C-4上氫氧基(hydroxyl group)會與之產生氫鍵作用力。由於此區域的負電性，在C-4上置換為帶正電的鹼性基團，可產生更強的離子作用力，如胺基(amino group，-NH2 )、胍基(guanidino group，-NHC(NH2 )NH)。此外，S2區附近的天門冬氨酸(Asp151)雖未被定域在此區域內，但研究發現其帶負性的酸基與切斷唾液酸與醣蛋白間的醣苷鍵過程中扮演重要角色。
S3區： 此區包括了由色氨酸(Trp178)及異亮氨酸(Ile222)等組成的一小的疏水性區域及由精氨酸(Arg152)加上一水分子所構成的親水性區域。Arg152會與DANA上的羰基有氫鍵作用力，一般不同抑制劑分子修飾上都在此位置接上乙醯胺基(acetamido group)，或許在此部位置換成其他疏水性基團可增加抑制劑與酵素的接合能力。
S4區與S5區： S4區由異亮氨酸(Ile222)、丙氨酸(Ala246)及精氨酸(Arg224)的疏水面所構成的疏水性區域，DANA分子並未與此部位有作用。S5區包括了一個麩氨酸(Glu276)，會與DANA上的丙三醇側鏈(glycerol side chain)產生氫鍵作用力，此外Glu276存在另一偏轉的構型(gauche conformation)，當其旋轉自另一方向時會與S4上的Ala246產生作用力，形成一個大的疏水性口袋(hydrophobic pocket)。故在此部位接合上疏水性的基團可提高其抑制能力。
由前述內容中對於神經氨酸酶活性區的探討，可得知模擬唾液酸過渡態的結構為較有潛力的抑制劑，先前研究以DANA為主體架構對其側鏈做修飾所得的結構，如將C4的氫氧基取代為胍基所得結構，都有顯著的抑制能力，但由於其容易被生理系統所代謝排除掉，使此類藥物的發展無法繼續前進下去。本發明發現一些以苯環為主體架構做修飾的衍生物，亦具有抑制效果。如下列結構式所示，比較唾液酸、DANA及苯環衍生物GBA(4-(acetylamino)-3-guanidino-benzoic acid)對H1N9流感病毒神經氨酸酶之抑制活性：
對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid，簡稱為PAS)為二線的抗結核病藥物，本發明以PAS做為起始物，在(i) C-1上保留原本的羧基結構或是轉換成其它酯類，(ii) C-3上的氫原子保留或是替換成其它的支鏈，(iii) C-4上的胺基轉換成醯胺基，(iv) C-5上的氫原子以胺基或是胍基取代(如下列結構式所示，係顯示對-氨基水楊酸之結構與藥物設計之概要)。
本發明之一目的在提供一種可作為流感病毒神經氨酸酶抑制劑之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物，係以通式(I)表示：
其中取代基R1 係為H、CH3 或C2 H5 ；取代基R2 係為H或Br；取代基R3 係為CH3 或C3 H7 ；以及取代基R4 係為H或C(=NH)-NH2 。
本發明提供之實施例中共計得到10種化合物，分別為：4-醯胺基-5-胺基-2-羥基苯甲酸(4-(amido)-5-amino-2-hydroxybenzoic acid；化合物6a,6c) ；烷基4-(醯胺基)-5-胺基-2-羥基苯甲酸酯(alkyl -(amido)-5-amino-2-hydroxybenzoate；化合物6b,6e) ；甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoate；化合物6f) ；4-(乙醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoic acid；化合物7a) ；烷基4-(醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(alkyl 4-(amido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7b,7e) ；甲基4-(乙醯胺基)-3-溴-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-3-bromo-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7f) ；4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoic acid；化合物8) ；而其合成的中間產物計有11個：甲基4-胺基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-amino-2-hydroxybenzoate；化合物1) ；4-(醯胺基)-2-羥基苯甲酸(4-(amido)-2-hydroxybenzoic acid；化合物2a,2c) ；甲基4-(醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(amido)-2-hydroxybenzoate；化合物2b,2d) ；4-(醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸(4-(amido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoic acid；化合物3a,式3c) ；烷基4-(醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(alkyl 4-(amido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物3b,3d,4) ；甲基4-(乙醯胺基)-3-溴-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-3-bromo-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物5) 。
本發明之另一目的在提供一種抗流感病毒之醫藥組成物，包括如前述之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物或其藥學上可接受鹽類。
本發明之又一目的在提供一種4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物在製備用於抗流感病毒之藥物之用途，包括對一個體施予一有效劑量之如前述之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物。
本發明所提供之各個4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物，經流感病毒生物活性試驗，所有的化合物在100 μg/ml以下均對犬腎上皮細胞株MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞無毒性，表示均無明顯的細胞毒性，而其中化合物6a、6b、6c、6e、6f、7a、7b、8均較起始物PAS有較好的抗H1N1流感病毒活性。未來在應用上，可以本發明所提供之各個化合物，以神經氨酸酶做為標的物，針對包括A型及B型流感，發展出有效的抗流感藥物。
如上述反應式所示：對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid)與甲醇(methanol)以濃硫酸為催化劑，進行酯化反應生成methyl 4-amino-2-hydroxybenzoate(化合物1 )，對氨基水楊酸和化合物1 分別與醋酸酐(acetic anhydride)在無水丙酮(dry acetone)中反應生成其乙醯胺基衍生物(化合物群2 )，化合物群2 再分別與發煙硝酸(fuming nitric acid)於醋酸酐中生成其硝基衍生物(化合物群3 )。
如上述反應式所示：對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid)與甲醇(methanol)以濃硫酸為催化劑，進行酯化反應生成methyl 4-amino-2-hydroxybenzoate(化合物1) ，對氨基水楊酸和化合物1 分別與醋酸酐(acetic anhydride)在無水丙酮(dry acetone)中反應生成其乙醯胺基衍生物4-acetamido-2-hydroxybenzoic acid(化合物2a) 及methyl 4-acetamido-2-hydroxybenzoate(化合物2b) 。另外，對-氨基水楊酸和化合物1 分別再與丁酸(butyric acid)於三氟化硼-乙醚錯合物(boron trifluroride etherate)和三氯氧化磷(phosphorus oxychloride)中反應生成其丁醯胺基衍生物4-(butyramido)-2-hydroxybenzoic acid(化合物2c) 及methyl 4-(butyramido)-2-hydroxybenzoate(化合物2d) 。
反應概要III
一系列合成好的對-氨基水楊酸衍生物(化合物群2 )與發煙硝酸(fuming nitric acid)反應生成其硝基衍生物(化合物群3 )，其中methyl 4-acetamido-2-hydroxy-5-nitrobenzoate(化合物3b )續與氯化丁醯(butyryl chloride)於三氟化硼-乙醚錯合物(boron trifluroride etherate)反應得到ethyl 4-(butyramido)-2-hydroxy-5-nitrobenzoate(化合物4 )；4-acetamido-2-hydroxy-5-nitrobenzoic acid續與溴水(bromine)反應生成methyl 4-acetamido-3-bromo-2-hydroxy--nitrobenzoate(化合物5 )，一系列硝基衍生物(化合物群3、4、5) 接著與氯化亞錫(tin chloride)或聯胺(hydrazine)進行硝基的氫化反應得一系列胺基衍生(化合物群6 )，續與氨基氰(cyanamide)反應生成一系列胍基衍生物(化合物群7 )。
將化合物6f ，置於1N NaOH溶液水解成羧調整為酸性化合物8 。本發明之合成產物之化學結構鑑定，均依其理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜等分析數據而鑑定。合成的標的產物計有11種：4-醯胺基-5-胺基-2-羥基苯甲酸(4-(amido)-5-amino-2-hydroxybenzoic acid；化合物6a,6c) ；烷基4-(醯胺基)-5-胺基-2-羥基苯甲酸酯(alkyl 4-(amido)-5-amino-2-hydroxybenzoate；化合物6b,6d,6e) ；甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoate；化合物6f) ；4-(乙醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoic acid；化合物7a) ；烷基4-(醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(alkyl 4-(amido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7b,7e) ；甲基4-(乙醯胺基)-3-溴-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-3-bromo-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7f) ；4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoicacid；化合物8) ；而其合成的中間產物計有11個：甲基4-胺基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-amino-2-hydroxybenzoate；化合物1) ；4-(醯胺基)-2-羥基苯甲酸(4-(amido)-2-hydroxybenzoic acid；化合 物2a,2c) ；甲基4-(醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(amido)-2-hydroxybenzoate；化合物2b,2d) ；4-(醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸(4-(amido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoic acid；化合物3a,式3c) ；烷基4-(醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(alkyl 4-(amido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物3b,3d,4) ；甲基4-(乙醯胺基)-3-溴-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-3-bromo-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物5) 。
較佳實施例 實施例1：合成中間產物甲基4-胺基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-amino-2-hydroxybenzoate：化合物1)
在含對-氨基水楊酸(p -aminosalicyclic acid;15.3 g,100.1 mmol)之無水甲醇(anhydrous methanol;230 ml)中加入濃硫酸(15 ml)，在冰水浴中以磁石慢速攪拌。將反應混合物回流48 hr。在冷卻至室溫後，將溶劑以真空蒸發除去。殘餘物以飽和碳酸氫鈉(NaHCO3 )調整為鹼性並以乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取。有機層以稀釋鹽酸(HCl)調整為酸性並以水進行萃取。將有機層以硫酸納(Na2 SO4 )乾燥，過濾並濃縮後得到棕色粉末的化合物1 (13.8 g,86%)。
化合物1之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：167.16;Rf ：0.47(ethyl acetate:hexane=1:2);1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):3.77(3H,s,OCH 3 ),5.98(1H,d,J =2.1Hz,ArH -3),6.10(1H,dd,J =6.6,2.1 Hz,ArH -5),6.14(2H,s,NH 2 ),7.43(1H,d,J =8.7 Hz,ArH -6),10.76(1H,s,OH )。
實施例2：合成中間產物4-(乙醯胺基)-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-2-hydroxybenzoic acid；化合物2a)
在含對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid;15.3 g,100.1 mmol)之無水甲醇(anhydrous methanol;230 ml)中加入乙酸酐(acetic anhydride;10 ml,105.8 mmol)，在冰水浴中以磁石攪拌24 hr。將溶劑以真空蒸發除去。固體殘餘物以水洗滌並過濾後得到白色粉末的化合物2a( 18.5 g,95%)。
化合物2a之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：195.17;Rf ：0.31(dichloromethane:methanol=3:1).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.05(3H,s,CH 3 ),7.02(1H,dd,J =6.9,2.0 Hz,ArH -5),7.33(1H,d,J =2.1 Hz,ArH -3),7.68(1H,d,J =8.7 Hz,ArH -6),10.18(1H,s,ArNH ),11.34(1H,s,OH )。
實施例3：合成中間產物甲基4-(乙醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-2-hydroxybenzoate；化合物2b)
在含化合物1b(2.46 g,15.3 mmol)之去水丙酮(anhydrous acetone;25 ml)中加入乙酸酐(3 ml,31.7 mmol)，在冰水浴中以磁石攪拌19 hr後，將溶劑以真空蒸發除去。殘餘物以水洗滌並過濾後得到白色粉末的化合物2b (2.74 g,86%)。
化合物2b之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：209.20;Rf ：0.50(ethyl acetate:hexane=1:1).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.06(3H,s,CH 3 ),3.85(3H,s,OCH 3 ),7.04(1H,dd,J =6.6,2.1 Hz,ArH -5),7.37(1H,d,J =1.8 Hz,ArH -3),7.70(1H,d,J =8.7 Hz,ArH -6),10.22(1H,s,ArNH ),10.6(1H,s,OH )。
實施例4：合成中間產物4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸(4-(butyramido)-2-hydroxybenzoi cacid；化合物2c)
在含對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid;3 g,20 mmol)及丁酸(butyric acid;5 ml,55 mmol)之三氯氧磷(POCl3 ;30 ml)混合液中加入氟化硼-乙醚錯合物(BF3 -Et2 O;7 ml)後，在冰水浴中以磁石攪拌。將反應混合物回流0.5 hr。在冷卻至室溫後，將反應混合液緩慢倒入冷稀釋鹽酸。沉澱物以水過濾後得到粗產物。將其以乙醚洗滌後得到淡黃色粉末的化合物2c (1.17 g,26%)。
化合物2c之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：223.23;Rf ：0.25(ethyl acetate:hexane=2:1).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.89(3H,t,J =7.5 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.53~1.65(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.29(2H,t,J =7.2,CH 2 CH2 CH3 ),7.04(1H,dd,J =6.6,2.0 Hz,ArH -5),7.35(1H,d,J =2.1 Hz,ArH -3),7.68(1H,d,J =8.7 Hz,ArH -6),10.13(1H,s,ArNH ),11.30(1H,s,OH )。
實施例5：合成中間產物甲基4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(butyramido)-2-hydroxybenzoate；化合物2d)
在含化合物1b(1g,6.2 mmol)及丁酸(butyric acid;1.5 ml,14.4 mmol)之三氯氧磷(POCl3 ;8 ml)並加入三氟化硼-乙醚錯合物(BF3 -Et2 O;4 ml)後，在冰水浴中以磁石攪拌。將反應混合物進行回流20 min。在冷卻至室溫後，將反應混合液緩慢倒入冷稀釋鹽酸。沉澱物經過濾及冷水洗滌後得到黃色粉末的化合物2d (0.77 g,52%)。
化合物2d之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：237.25;Rf ：0.47(ethyl acetate:hexane=1:7).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.89(3H,t,J =7.4 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.53~1.65(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.30(2H,t,J =7.2 Hz,CH 2 CH2 CH3 ),3.85(3H,s,OCH 3 ),7.07(1H,dd,J =6.9,2.1 Hz,Ar H-5),7.39(1H,d,J =2.1 Hz,Ar H-3),7.70(1H,d,J =8.7 Hz,Ar H-6),10.16(1H,s,ArNH),10.60(1H,s,OH)。
實施例6：合成中間產物4-(醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸(4-(amido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoic acid；化合物3a,3c)
在含化合物2a及2c(2.7 mmol)之乙酸酐中，加入發煙硝酸(fuming nitricacid;0.13 ml,2.9 mmol)，在-20℃~-15℃下以磁石攪拌24 hr後，回溫至0℃直至反應完成(TLC)。將反應溶液注入冷水且將沉澱物以冷水過濾後得到粗產物。將其以乙醇洗滌並以丙酮濃縮、洗滌後得到化合物3a及3c 。(如表一)
化合物3a之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：240.17;Rf ：0.25(dichloromethane:methanol=4:1).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.14(3H,s,CH 3 ),7.54(1H,s,ArH -3),8.46(1H,s,ArH -6),10.44(1H,s,ArNH )。
化合物3c之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：268.22;Rf ：0.3(dichloromethane:methanol=4:1).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.92(3H,t,J =7.4 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.55~1.67(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.40(2H,t,J =7.2,CH2 CH2 CH3 ),7.65(1H,s,ArH -3),8.45(1H,s,ArH -6),10.41(1H,s,ArNH )。
實施例7：合成中間產物甲基4-(醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(methyl 4-(amido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物3b,3d)
於含有化合物2b及2d(1.9 mmol)之乙酸酐(5 ml)中，在-20℃下加入發煙硝酸(fuming nitric acid;0.1 ml,2.2 mmol)，在-5℃下以磁石攪拌15 min。將反應混合液注入冷水且將沉澱物以冷水過濾後得到粗產物。將其以乙醇洗滌後得到化合物3b及3d 。(如表二)
表二
化合物3b之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：254.20;Rf ：0.52(ethyl acetate:hexane=1:7).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.16(3H,s,CH 3 ),3.86(3H,s,OCH 3 ),7.56(1H,s,ArH -3),8.44(1H,s,ArH -6),10.41(1H,s,ArNH ),11.40(1H,s,OH )。
化合物3d之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：282.25;Rf ：0.66(ethyl acetate:hexane=1:7).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.92(3H,t,J =7.4 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.55~1.67(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.41(2H,t,J =7.2,CH 2 CH2 CH3 ),3.85(3H,s,OCH 3 ),7.76(1H,s,ArH -3),8.45(1H,s,ArH -6),10.40(1H,s,ArNH ),11.42(1H,s,OH )。
實施例8：合成中間產物乙基4-(丁醯胺基)-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(ethyl 4-(butyramido)-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物4)
含化合物3a(1g,4.2 mmol)、丁酸(1.5 ml,14.4 mmol)之BF3 -Et2 O(8 ml)混合物中，進行回流1.5 hr。冷卻至室溫後，將反應混合物緩慢注入冷水中。沉澱物經冷水過濾及洗滌。殘餘物利用矽膠管柱層析以正己烷/乙酸乙酯(n-hexane/ethyl acetate;8:1)冲提得到棕色粉末之化合物4 (0.2 g,16%)。
化合物4之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：296.28;Rf ：0.47(ethyl acetate:hexane=1:9).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.92(3H,t,J =7.5 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.32(3H,t,J =7.1 Hz,COCH2 CH 3 ),1.55~1.67(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.41(2H,t,J =7.2 Hz,CH 2 CH2 CH3 ),4.33(2H,q,J =7.2 Hz,COCH 2 CH3 ),7.74(1H,s,ArH -3),8.44(1H,s,ArH -6),10.41(1H,s,NH ),11.42(1H,s,OH )。
實施例9：合成中間產物甲基4-(乙醯胺基)-3-溴-2-羥基-5-硝基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-3-bromo-2-hydroxyl-5-nitrobenzoate；化合物5)
於0℃下，將溴(Br2 ;0.2 ml,3.9 mmol)加入含化合物3b(0.8 g,3.3 mmol)及叔丁基胺(t-butylamine;0.37 ml,3.5 mmol)之三氯甲烷(chloroform;10 ml)中。在室溫下攪拌1 hr後，以Na2 S2 O3 溶液進行處理，接著以NaHCO3 溶液進行調整為鹼性。將三氯甲烷以真空蒸發除去。將殘餘物以Na2 S2 O3 溶液進行處理，以鹽酸進行調整為酸性並以乙酸乙酯進行萃取。有機層以Na2 SO4 進行乾燥，經過濾及濃縮後得到白色粉末之化合物5 (0.84 g,88%)。
化合物5之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：333.09;Rf ：0.25(ethyl acetate:hexane=2:1).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.07(3H,s,CH 3 ),3.95(3H,s,OCH 3 ),8.43(1H,s,ArH -6),10.38(1H,s,ArNH ),11.80(1H,s,OH )。
實施例10：合成本發明化合物4-醯胺基-5-胺基-2-羥基苯甲酸(4-(amido)-5-amino-2-hydroxybenzoic acid；化合物6a,6c)
在含有化合物3a或3c(2.0 mmol)之EtOH(10 ml)混合液中加入10% Pd-C(鈀碳催化劑)及5% HCl(1 mL)作為催化劑。將溶於EtOH(10 mL)之聯氨(Hydrazine hydrate;80%,0.35 mL)緩慢加入上述的混合液(在冰水浴中)。將反應溶液進行回流24 hr。Pd-C經過矽藻土之過濾，且乙醇經真空濃縮後得到粗產物。從MeOH中再結晶所得之產物即為化合物6a或6c 。
表三
化合物6a之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：210.19;Rf ：0.50(ethyl acetate:methanol=2: 1);mp：295-297℃;UV(MeOH)：λmax nm(logε)=219(1.43). HRMS(EI)m /z (%)：calcd.:210.0641(M+ ),found:192.0529(M-18,5),148.0633(100).1 H-NMR(D2 O/CD3 COOD,300 MHz)δ(ppm):1.30(3H,s,CH 3 ),5.66(1H,s,ArH -6),6.73(1H,s,ArH -3).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):12.34,99.59,111,77,115.59,124.54,136.10,153.54,158.61,171.39。
化合物6c之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：238.24;Rf ：0.26(ethyl acetate:methanol=6:1);mp：198-200℃;UV(MeOH)：λmax nm(logε)=219(1.35). HRMS(EI)m /z (%)：calcd.:238.0954(M+ ),found: 220.0893(M-18,32.2),202.0736(100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.93(3H,t,J =7.4 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.70~1.82(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.76(2H,t,J =7.1 Hz,CH 2 CH2 CH3 ),6.81(1H,s,ArH -6),7.20(1H,s,NH 2 ),7.89(1H,s,ArH -3).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):13.34,21.07,30.08,98.67,110.14,116.49,156.76,157.83,172.41。
實施例11：合成本發明化合物烷基4-(醯胺基)-5-胺基-2-羥基苯甲酸酯(alkyl 4-(amido)-5-amino-2-hydroxybenzoate；化合物6b,6e)
將含有化合物3b或4(5.9 mmol)及SnCl2 ‧2H2 O(6 g,56.3 mmol)之乙醇中(40 ml)加入兩滴濃鹽酸並以磁石攪拌。反應混合液進行回流1~1.5 hr。在冷卻至室溫後，以真空蒸發除去溶劑。將剩餘部分加入水中，以飽和的NaHCO3 溶液進行調整為鹼性，並以水及乙酸乙酯過濾。過濾後所得部分以乙酸乙酯及水進行萃取。有機層以Na2 SO4 進行乾燥，過濾並濃縮後得到化合物6b、6d 或6e 。
化合物6b之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：224.21;Rf ：0.47(ethyl acetate);mp：204-206 ℃;UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=225(2.37). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:224.0797(M+ ),found:206.0688(M-18,22.6),174.0426(100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.40(3H,s,CH 3 ),3.90(3H,s,OCH 3 ),6.90(1H,s,ArH -6),7.89(1H,s,ArH -3),10.53(1H,s,ArNH ),12.26(1H,s,OH ).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):14.51,52.22,97.01,106.73,119.03,137.21,140.58,153.68,156.53,170.70。
化合物6d之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：252.27;Rf ：0.33(ethyl acetate：hexane=1：1);mp：132-134 ℃;UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=233(3.42).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.93(3H,t,J =7.2 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.70~1.82(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.74(2H,t,J =7.7 Hz,CH 2 CH2 CH3 ),3.90(3H,s,OCH 3 ),6.91(1H,s,ArH -6),7.90(1H,s,ArH -3),10.53(1H,s,ArNH ),12.22(1H,s,OH ).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):13.34,20.38,30.30,52.10,99.28,106.74,116.49,134.05,143.50,156.20,158.25,170.54。
化合物6e之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：266.29;Rf ：0.44(ethyl acetate:hexane=2:1);mp：135-137 ℃;UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=202.5(0.31). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:266.1267(M+ ) found: 248.1168(M-18,20.2),202.0740(100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):0.90(3H,t,J =7.5 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.33(3H,t,J =7.1 Hz,COCH2 CH 3 ),1.67~1.79(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.72(2H,t,J =7.5 Hz,CH 2 CH2 CH3 ),4.34(2H,q,J =7.2 Hz,OCH 2 CH3 ),6.88(1H,s,ArH -6),7.90(1H,s,ArH -3),10.62(1H,s,ArNH ),12.23(1H,s,OH ).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):13.75,14.25,20.85,30.57,61.57,99.54,107.49,117.66,156.59,158.88,170.59。
實施例12：合成本發明化合物甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoate；化合物6f)
將含有化合物5(0.84 g,2.9 mmol)及SnCl2 ‧2H2 O(3.2 g,30 mmol)之乙醇中(20 ml)加入兩滴濃鹽酸並以磁石攪拌。反應混合液進行回流1 hr。在冷卻至室溫後，以真空蒸發除去溶劑。將剩餘部分加入水中，以飽和的NaHCO3 溶液進行調整為鹼性，並以水及乙酸乙酯過濾。過濾後所得部分以乙酸乙酯及水進行萃取。有機層以Na2 SO4 進行乾燥，過濾並濃縮後得到淡黃色粉末的化合物6f (0.13 g,17%)。
化合物6f之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：303.11;Rf ：0.40(ethyl acetate);mp：217-219 ℃;UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=228.5(1.94). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:301.9902(M+ ),found:283.9811(M-18,5.3),253.9510(100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.52(3H,s,CH 3 ),3.95(3H,s,OCH 3 ),7.83(1H,s,Ar H-6),11.04(1H,s,ArNH ),12.26(1H,s,OH ).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):12.06,52.77,98.33,108.06,108.97,126.21,141.89,152.40,153.49,170.04。
實施例13：合成本發明化合物4-(乙醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoic acid；化合物7a)
將含有化合物6a (0.63 g,3 mmol)及氨基氰(cyanamide;1.26g,30 mmol)之乙醇中(40 ml)加入兩滴濃鹽酸並以磁石攪拌。反應混合液進行回流24 hr。在冷卻至室溫後，以真空蒸發除去溶劑。將剩餘部分以乙醇洗滌後得到棕色粉末的化合物7a (0.42 g,56%)。
化合物7a之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：252.23;Rf ：0.44(ethyl acetate:methanol=4:1);mp：334-357℃;UV(MeOH)：λmax nm(logε)=217.5(2.49). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.: 252.0859(M+ ),found: 192.0529(M-60,2.5),174.0426(100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm): 2.52(3H,s,CH 3 ),7.41(1H,s,ArH -6),7.96(1H,s,ArH -3),11.90(1H,s,OH )。
實施例14：合成本發明化合物甲基4-(乙醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(methyl4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7b)
將含有化合物6b(0.12 g,0.54 mmol)及氨基氰(cyanamide;0.22 g,5.2 mmol)之乙醇中(10 ml)加入兩滴濃鹽酸並以磁石攪拌。反應混合液進行回流24 hr。在冷卻至室溫後，以真空蒸發除去溶劑。將剩餘部分以乙酸乙酯洗滌後得到白色粉末的化合物7b (0.13 g,93%)。
化合物7b之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：266.25;Rf ：0.40(ethyl acetate:hexane=4:1);mp：233-234 ℃;UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=225(2.75). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:266.1015(M+ ),found:206.0648(M-60,100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.45(3H,s,CH 3 ),3.90(3H,s,OCH 3 ),5.41(4H,s,NH CNH (NH 2 )),6.91(1H,s,ArH -6),7.89(1H,s,Ar H-3),8.42(1H,s,OH ),10.54(1H,s,ArNH CO).13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):14.51,52.24,99.33,106.81,116.38,134.16,143.54,154.73,156.29,159.63,170.63。
實施例15：合成本發明化合物乙基4-(丁醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(ethyl 4-(butyramido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7e)
將含有化合物6e(0.13 g,0.48 mmol)及氨基氰(0.4 g,936 mmol)之乙醇中(10 ml)加入兩滴濃鹽酸並以磁石攪拌。反應混合液進行回流17 hr。在冷卻至室溫後，以真空蒸發除去溶劑並以乙酸乙酯及NaHCO3 溶液進行萃取。有機層以Na2 SO4 進行乾燥，過濾並濃縮後得到白色粉末的化合物7e (0.02 g,13%)。
化合物7e之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：308.33;Rf ：0.47(ethyl acetate:hexane=3:1);UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=216.5(2.02). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:308.1485(M+ ),found:248.1154(M-60,28.7),202.0741(100).1 H-NMR(CD3 OD,300 MHz)δ(ppm):1.01(3H,t,J =7.4 Hz,CH2 CH2 CH 3 ),1.43(3H,t,J =7.1 Hz,COCH2 CH 3 ),1.76~1.91(2H,m,CH2 CH 2 CH3 ),2.84(2H,t,J =7.5 Hz,CH 2 CH2 CH3 ),4.44(2H,q,J =7.1 Hz,COCH 2 CH3 ),4.61(4H,s,NH CNH (NH 2 )),6.93(1H,s,ArH -6),8.05(1H,s,ArH -3)。
實施例16:合成本發明化合物甲基4-(乙醯胺基)-3-溴-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(methy1 4-(acetamido)-3-bromo-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7f)
將含有化合物6f(0.081 g,0.27 mmol)及氨基氰(0.13 g,3.1 mmol)之乙醇中(5 ml)加入一滴濃鹽酸並以磁石攪拌。反應混合液進行回流5 hr。在冷卻至室溫後,以真空蒸發除去溶劑並以乙酸乙酯及NaHCO3 溶液進行萃取。有機層以無水Na2 SO4 進行乾燥,過濾並濃縮後得到淡橘色粉末的化合物7f (0.02 g,13%)。
化合物7f之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：345.15;Rf ：0.50(ethyl acetate);mp：238-240 ℃;UV(MeOH)：λmax nm(log ε)=217(1.14). HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:344.0120(M+ ),found:283.9799(M-60),240.0295(100).1 H-NMR(CD3 OD,300 MHz)δ(ppm):2.57(3H,s,CH 3 ),4.00(3H,s,OCH 3 ),7.96(1H,s,ArH -6),13 C-NMR(DMSO-d 6 ,75 MHz)δ(ppm):14.49,52.68,104.56,107.70,114.75,132.17,141.00,151.65,152.70,155.60,170.38。
實施例17：合成本發明化合物4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoic acid；化合物8)
在含有化合物6f(0.3 g,1 mmol)之1N NaOH(10 ml)中以磁石隔夜攪拌。以1N HCl調整其pH約為6，以真空蒸發除去溶劑。剩餘部份溶入MeOH(20 ml)並過濾。過濾後所得物經濃縮並收集其沉澱部分之米黃色粉末即為化合物8 (260 mg,產率=90%)。
化合物8之分子量、理化特性、光譜、質譜及核磁共振光譜分別表示如下：Mwt：289.09;Rf ：0.36(ethyl acetate/methanol=2:1);mp：210-211 ℃. HRMS(EI)m/z (%)：calcd.:289.0871(M+ ),found:271.0819(M-18),185.0795(100).1 H-NMR(DMSO-d 6 ,300 MHz)δ(ppm):2.19(3H,s,CH 3 ),7.74(1H,s,Ar H-6),10.34(1H,s,ArNH )。
實施例18：流感病毒生物活性試驗(Anti-influenza assay)
本實驗係委託三軍總醫院病理部測試，實驗方法及步驟如下：
一、細胞之培養
採用的細胞株為為犬腎上皮細胞株MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞。將細胞植於96微量孔板培養槽(96-well microplates)中，以含有10%胎牛血清FBS(Fetal bovine serum)之DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養。於37 ℃/5%CO2 培養箱中培養約24小時(參閱第五圖)。
二、病毒及藥物的加入
至細胞長滿七、八分滿，每個well的細胞以PBS(Phosphate buffered saline)沖洗，分為三組做比較：(i)空白對照組，不含化合物、不含病毒株，將MDCK細胞單純培養於TPCK-trypsin medium中；(ii)D組，加入100 μL預測試的化合物至培養於TPCK-trypsin medium細胞中；(iii)DV組，加入50 μL病毒與50 μL預測試的化合物於細胞。分別靜置於37℃/5%CO2 培養箱中培養48小時。
病毒採用0.01 MOI(multiplicity of infection，MOI=病毒顆粒數/轉染細胞數)的H1N1流感病毒，培養於TPCK-trypsin medium中；欲測試的化合物溶於DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亞碸)，再分別稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 μg/ml九種濃度。
三、細胞存活率與抑制病毒活性之分析
加入MTT試劑，避光培養五小時後移去上清液加入DMSO溶解formazan結晶，放入培養箱等待約十至十五分鐘，續以ELISA reader在波長550 nm下測其吸光值。
利用MTT assay以檢測細胞的存活率，進一步分析測化合物的最小抑制濃度MIC(Minimumi nhibitoryc oncentration)、半數細胞毒性所需濃度CC50(The 50% cell cytotoxic concentration)。
MTT(Methylthiazoleltetrazolium bromide)為一種黃色水溶有機鹽染料，可與活細胞粒腺體內琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)反應將tetrazolium環解開生成藍紫色結晶formazan(參閱下列反應式)。因formazan的生成量與存活細胞數成正比，故可用以檢驗細胞的存活率。細胞存活率之計算公式如下：
細胞生存率(Cell viability)(%)=
結果：
本發明共有化合物6a,6b,6c,6e,6f,7a,7b,7e,7f,8十個化合物送測藥理活性。以欲測試的化合物溶於DMSO，再分別稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 μg/ml九種濃度，始進行藥理活性測試，每同一狀況的測試重複三次，初篩結果以(表五)呈現：如表五之結果所示，所有的化合物在100 μg/ml以下均對MDCK細胞無毒性，表示均無明顯的細胞毒性，而其中化合物6a、6b、6c、6d、6e、6f、7a、7b、8均較起始物PAS有較好的抗H1N1流感病毒活性：化合物6a之MIC值為50 μg/mL，SI值為選擇性指數(selective index=CC50 /MIC)大於2；化合物6b之MIC值為1.56 μg/mL，SI值大於64；化合物6c之MIC值為25 μg/mL，SI值大於4；化合物7a之MIC值為25 μg/mL，SI值大於4；化合物7b之MIC值為25 μg/mL，SI值大於4；化合物8之MIC值為1.56 μg/mL，SI值大於64；而化合物7e與7f似無抑制活性。
表五：MDCK細胞中化合物6及7之抗流感(H1N1)活性
CC50 ：半細胞毒性濃度；MIC：最小抑制濃度(細胞存活率>75%)；ND：未確定；SI：選擇性指數(selective index=CC50 /MIC)。PAS：對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid)。
由表五之結果可知，未來在應用上，以前述具有抗流感病毒活性之化合物(化合物6a、6b、6c、6d、6e、6f、7a、7b、8)，可有效抑制流感病毒之活性，較優異的為化合物6b、6d、6e、6f及8，因此該些化合物係可添加於醫藥組成物的成分中，此醫藥組成物除包含有效劑量之本發明化合物外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。該醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將有效成分劑量之該些化合物與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。
由以上之實施例可知，本發明所提供之可作為流感病毒神經氨酸酶抑制劑之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
第一圖係顯示流感病毒結構之模型；
第二圖係顯示血凝素單體及其構形改變之過程之示意圖；
第三圖係顯示神經氨酸酶之四聚體結構及其活性區與oseltamivir結合之示意圖；
第四圖係顯示DANA抑制劑與神經氨酸酶活性區之作用關係；
第五圖係顯示流感病毒生物活性試驗之細胞培養流程。

Claims (9)

  1. 一種抗流感病毒之醫藥組成物，包括4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物或其藥學上可接受鹽類，其中該4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物係選自由4-乙醯胺基-5-胺基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-2-hydroxybenzoic acid；化合物6a)、甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-2-hydroxybenzoate；化合物6b)、5-胺基-4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸(5-amino-4-(butyramido)-2-hydroxybenzoic acid；化合物6c)、甲基5-胺基-4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(methyl 5-amino-4-(butyramido)-2-hydroxybenzoate；化合物6d)、乙基5-胺基-4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(ethyl 5-amino-4-(butyramido)-2-hydroxybenzoate；化合物6e)、甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoate；化合物6f)、4-(乙醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoic acid；化合物7a)、烷基4-(醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7b)及4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoic acid；化合物8)所組成的群組。
  2. 一種4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物在製備用於抗流感病毒之藥物之用途，包括對一罹患流感之個體施予一有效劑量之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物，其中該4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物係選自由4-乙醯胺基-5-胺基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-2-hydroxybenzoic acid；化合物6a)、甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-2-hydroxybenzoate；化合物6b)、5-胺基-4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸(5-amino-4-(butyramido)-2-hydroxybenzoic acid；化合物6c)、甲基5-胺基-4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(methyl 5-amino-4- (butyramido)-2-hydroxybenzoate；化合物6d)、乙基5-胺基-4-(丁醯胺基)-2-羥基苯甲酸酯(ethyl 5-amino-4-(butyramido)-2-hydroxybenzoate；化合物6e)、甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoate；化合物6t)、4-(乙醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoic acid；化合物7a)、烷基4-(醯胺基)-5-胍基-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-guanidino-2-hydroxybenzoate；化合物7b)及4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoic acid；化合物8)所組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物係為抑制該個體之流感病毒之神經氨酸酶。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該個體所罹患之流感係為A型流感或B型流感。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該流感病毒係為H1N1病毒。
  6. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物之方法，其步驟包括：以對-氨基水楊酸(p -aminosalicylic acid；PAS)做為起始物，其中保留在C-1上原本的羧基或是C-1的羧基與甲醇以濃硫酸為催化劑轉換成其它酯類；C-3上的氫原子保留或與溴水於鹼性條件中反應成為Br，轉換C-4上的胺基以醋酸酐在無水丙酮中反應成為醯胺基，C-5上的氫原子與發煙硝酸於醋酸酐中反應成為硝基後進一步與氯化亞錫或聯胺進行氫化反應形成胺基或是胍基；
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物係為甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯(methyl 4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoate；化合物6f)。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，進一步包括把該甲基4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸酯置於氫氧化鈉溶液中，以形成4-(乙醯胺基)-5-胺基-3-溴-2-羥基苯甲酸(4-(acetamido)-5-amino-3-bromo-2-hydroxybenzoic acid；化合物8)。
  9. 一種4,5-雙胺基-3-鹵基-2-羥基苯甲酸衍生物，係以通式(I)表示： 其中取代基R1 係為H或CH3 ；取代基R2 係為Br；取代基R3 係為CH3 ；以及取代基R4 係為H。
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