TWI426903B - ２－芳基－４－喹唑啉酮化合物及其醫藥組合物 - Google Patents

Description

2-芳基-4-喹唑啉酮化合物及其醫藥組合物

一種化合物及其醫藥組合物，尤指一種2-芳基-4-喹唑啉酮化合物及其醫藥組合物，並用於抗癌症或腫瘤，尤指惡性神經膠瘤之用途。

根據統計，原發性腦腫瘤及脊髓腫瘤係為美國前十大死因之一，每年約有1萬六千人死於此種疾病，且每年約22,500之新增案例中，約有70%為惡性神經膠瘤(malignant gliomas)，儘管惡性神經膠瘤之盛行率不及肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸直腸癌及肝癌等癌症，但惡性神經膠瘤之致死率卻相當高。在台灣，惡性神經膠瘤於男性之致死率為1.06%，致死率排名為第15名；惡性神經膠瘤於女性之致死率為1.45%，致死率排名為第13名。世界衛生組織(WHO)並依照細胞類型分類，將惡性程度分成第一級到第四級，其中多型性神經膠母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)係屬於惡化程度最高的第四級。據統計資料顯示，患者存活期僅有12至15個月。現今除了外科手術、放射治療及化學治療之外，患有惡性神經瘤病患之預後甚差，故研發抗惡性神經膠瘤之抗癌藥劑，實有迫切之需要。

有鑑於現有技術的前述缺失，為達成有效治療癌症或腫瘤的目的，特別是治療腦腫瘤及脊髓腫瘤之目的，本發明係提供一種具有化學式1的化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物：

其中R₅ 、R₆ 、R₇ 及R₈ 係分別為氫(H)、氫氧基(OH)、氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、C₁ 至C₆ 之烷基(alkyl group)、C₁ 至C₆ 之烷氧基(alkoxyl group)、C₁ 至C₆ 之烯基(alkenyl group)、C₂ 至C₆ 之烯氧基(alkenoxyl group)、C₂ 至C₆ 之炔基(alkynyl group)、C₂ 至C₆ 之炔氧基(alkynoxyl group)、胺基(amine group)、單或雙取代胺基(mono-or di-substituted amino group)、環狀C₁ 至C₅ 之烷胺基(alkylamino group)、哌嗪基(piperazinyl group)、咪唑基(imidazolyl)或嗎啉基(morpholino group)，且其選擇性的以一個或一個以上之羥基(hydroxy)或鹵素(halo)取代；

其中Ar係為

其中R₁ ’、R₂ ’、R₃ ’、R₄ ’、R₅ ’、R₆ ’、R₇ ’及R₈ ’係分別為氫(H)、氫氧基(OH)、氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、C₁ 至C₆ 之烷基(alkyl group)、C₁ 至C₆ 之烷氧基(alkoxyl group)、C₁ 至C₆ 之烯基(alkenyl group)、C₂ 至C₆ 之烯氧基(alkenoxyl group)、C₂ 至C₆ 之炔基(alkynyl group)、C₂ 至C₆ 之炔氧基(alkynoxyl group)、胺基(amine group)、單或雙取代胺基(mono-or di-substituted amino group)、環狀C₁ 至C₅ 之烷胺基(alkylamino group)、哌嗪基(piperazinyl group)、咪唑基(imidazolyl group)或嗎啉基(morpholino group)，且其選擇性的以一個或一個以上之羥基(hydroxy)或鹵素(halo)取代；其中X係為亞氨(NH)、氧(O)或硫(S)。

依據本發明，用語「C₁ 至C₆ 之烷基(alkyl group)」如此處所使用的係指具碳數為1至6之支鏈或直鏈之烷基，例如甲烷基、乙烷基、丙烷基、丁烷基、戊烷基或己烷基；同理，用語「C₁ 至C₂ 之烷基(alkyl group)」如此處所使用的係指具碳數為1至2之烷基。

依據本發明，用語「C₂ 至C₆ 之烯基(alkenyl group)」如此處所使用的係指具碳數為2至6之支鏈或直鏈之烯基及含有至少一個雙鍵，例如乙烯基或丙烯基。

依據本發明，用語「C₂ 至C₆ 之炔基(alkynyl group)」如此處所使用的係指具碳數為2至6之支鏈或直鏈之基及含有至少一個三鍵，例如乙炔基(ethynyl)或3-甲基-1-丁炔基(3-methyl-1-butyl)。

依據本發明，用語「單-取代胺基」如此處所使用的係指具有支鏈或直鏈之烷基取代基之一級胺基；同理，用語「雙-取代胺基」如此處所使用的係指具有支鏈或直鏈之烷基取代基之二級胺基。在本發明之較佳實施例中，雙-取代胺基係指二甲胺基(dimethylamino group)。

較佳的，所述之環狀C₁ 至C₅ 之烷胺基(alkylamino group)包括，但不限於：吡啶基基團(pyridinyl group)、吡咯啶基基團(pyrrolidinyl group)及哌啶基基團(piperidinyl group)。

在本發明之實施例中，其中Ar係選自於由萘基基團(naphthalenyl group)、吲哚基基團(indolyl group)及苯并噻吩基團(benzothiophenyl group)所構成之群組。

在本發明之實施例中，其中R₆ 係由選自於甲氧基(methoxy group)、二甲胺基基團(dimethylamino group)、吡咯啶基基團(pyrrolidinyl group)、哌啶基基團(piperidinyl group)及嗎啉基基團(morpholino group)所構成之群組。

較佳的，所述之具有如化學式1之化合物的具體實施例包含，但不限於下列者：

依據本發明，用語「藥學上可接受之鹽類」如此處所使用的係指由無毒性的酸所製備而得的酸加成鹽，以及由無毒性的鹼所製得之鹼加成鹽類。較佳的，合適的酸包括，但不限於乙酸(acetic acid)、藻酸(alginic acid)、鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)、苯磺酸(benzenesulfonic acid)、安息香酸(benzoic acid)、樟腦磺酸(camphorsulfonic acid)、檸檬酸(citric acid)、乙烯基磺酸(ethenesulfonic acid)、甲酸(formic acid)、富馬酸(fumaric acid)、糠酸(furoic acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)，半乳糖醛酸(galacturonic acid)，環氧乙基甲酸(glycidic acid)、溴氫酸(hydrobromic acid)、鹽酸(hydrochloric acid)、2-羥乙磺酸(isethionic acid)、乳酸(lactic acid)、順丁烯二酸(maleic acid)、蘋果酸(malic acid)、杏仁酸(mandelic acid)、甲磺酸(methanesulfonic acid)、黏酸(mucic acid)、硝酸(nitric acid)、亞甲基雙羥萘酸(pamoic acid)、泛酸(pantothenic acid)、苯乙酸(phenylacetic acid)、丙酸(propionic acid)、磷酸(phosphoric acid)、水楊酸(salicylic acid)、硬脂酸(stearic acid)、琥珀酸(succinic acid)、磺胺酸(sulfanilic acid)、硫酸(sulfuric acid)、酒石酸(tartaric acid)、對甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)或其他酸類。更佳的，合適的酸包含鹽酸(hydrochloric acid)、溴氫酸(hydrobromic acid)、磷酸(phosphoric acid)及磺酸(sulfuric acid)。

較佳的，所述之適合的鹼包括，但不限於：鹼金屬陽離子，例如氫氧化鉀及氫氧化鈉；鹼土金屬陽離子，例如鈣或鎂；銨、水溶性之胺類及低烷胺(lower alkanolammonium)。更佳的，所述之合適的鹼包含鋁(aluminium)、精胺酸(arginine)、芐乍生(benzathine)、鈣(calcium)、氯(choline)、二乙胺(diethylamine)、二乙醇胺(diolamine)、甘胺酸(glycine)、離胺酸(lysine)、氨基丁三醇(tromethamine)、氫氧化鎂(hydroxide of magnesium)、美洛明(meglumine)、乙醇胺(olamine)、鉀(potassium)、鈉(sodium)或鋅(zinc)。

依據本發明，用語「溶劑合物」如此處所使用的係指藉由可變異之化學計量的溶劑及溶質所形成之複合物，所述的溶質係本發明中的具有化學式1之化合物。在本發明中，溶劑幾乎不會干擾溶質之生物活性，例如，合適的溶劑包含水、乙醇及醋酸。較佳的，溶劑係為藥學上可接受之溶劑，諸如水、乙醇及醋酸。

本發明之具有化學式1之化合物可以全部立體異構物型式存在，所述的立體異構物型式包括鏡像異構物(enantiomers)、非對映異構物(diastereoisomers)、順式異構物(cis-isomers)及反式異構物(trans- isomers)。例如，R₆ 為烯基(alkenyl group)時，包括(Z)及(E)之鏡像異構物型式的化合物皆為可行的。

在本發明中，製備幾何軸線異構物(geometrical isomers)的方法係為本技術領域所廣知，製備對掌性異構物(chiral isomers)的方法亦為本技術領域所廣知，例如使用對掌性起始化合物(chiral starting compound)之合成、對掌性誘導反應(chiral induction)、對映選擇性酵素轉換法(enantioselective enzymatic conversions)及於對掌性基質上的光學異構物之色層分析法(chromatography of stereoisomers on chiral media)。

本發明之具有化學式1之化合物可呈任何經同位素標記之型態(isotopically labeled forms)。例如，以氘(₂ H)、氚(₃ H)、碳-11(₁₁ C)、碳-13(₁₃ C)、碳-14(₁₄ C)、碘-131(₁₃₁ I)、碘-125(₁₂₅ I)、碘-123(₁₂₃ I)或氟-18(₁₈ F)標記之化合物。該經標記的化合物可於體外(in vitro )或體內(in vivo )的各種不同檢測方法中用於追蹤一標記分子。

本發明亦提供一種組成物，其係包括：具有化學式1之化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物；以及其藥學上可接受之載體。

在本發明之較佳的實施例中本發明之化合物及組成物可用於治療之疾病或病變包括，但不限於皮膚癌、肺癌、胃腸癌、卵巢癌、腎臟癌、胰臟癌、骨癌、脾臟癌、肝癌、膽囊癌、咽喉癌或鼻腔癌。更佳的，所述之癌症或腫瘤包括，但不限於惡性神經膠瘤(malignant gliomas)、肉瘤(sarcoma)、惡性瘤(carcinoma)或腺瘤(adenoma)。

較佳的，本發明提供一種治療或減輕惡性神經膠瘤的方法，該方法之步驟係將本發明之化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物或本發明的組成物投藥於患有惡性神經膠瘤之病患。

較佳的，本發明之化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物或本發明的組成物可與其他藥學上活化之化合物結合使用。

本發明之具有化學式1之化合物係包含一系列之2-芳基-4-喹唑啉酮化合物(2-aryl-4-quinazolinones)，該2-芳基-4-喹唑啉酮化合物對於許多種類之人類腫瘤細胞具有抗癌細胞增殖的效果。更具體的說，2-芳基-4-喹唑啉酮化合物於體外(in vitro )及體內(in vivo )之試驗中皆有優異抗惡性神經膠瘤的效果。6-吡咯啶-1-基-2-萘-1-基喹唑啉基-4-酮[6-(Pyrrolidin-1-yl)-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one]係為2-芳基-4-喹唑啉酮化合物之一，不僅具有優異抗惡性神經膠瘤的效果，也是相當具有抗惡性神經膠瘤潛力之新藥。

在以下之實施例中，一系列之2-芳基-4-喹唑啉酮化合物被合成，並以體外(in vitro )癌細胞及體內(in vivo )之動物模型證實該2-芳基-4-喹唑啉酮化合物確實具有抗癌活性。所述的癌細胞包含有：M21(人類惡性黑色素瘤細胞)，CH27(人類肺鱗狀癌細胞)，Hep3B(人類肝癌細胞)，H460(非小細胞肺癌細胞)，HSC-3(人類口腔鱗狀癌細胞)，HT29-5FUR(人類大腸癌細胞)，U87、U251、T98G、U373(人類神經膠質瘤細胞)，RT2(大鼠神經膠質瘤細胞)及C6(大鼠神經膠質瘤細胞)。

6-(吡咯啶-1-基)-2-(萘-1-基)喹唑啉基-4-酮[6-(pyrrolidin-1-yl)-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one](化合物23，MJ-66)係為最具有細胞毒性之化合物，且該化合物具有微莫耳濃度(micromolar)至奈莫耳濃度(nanomolar)之低的最大半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration)(IC₅₀ )。例如，化合物23(MJ-66)於試管中，分別可以30奈莫耳濃度(nM)之濃度抑制人類惡性黑色素瘤細胞及以60 nM之濃度抑制惡性神經膠瘤細胞，且於神經膠瘤細胞的異種移植動物模型(glioma xenograft animal model)中，也能有效抑制腫瘤生長。故此，新合成之2-芳基-4-喹唑啉酮化合物及其醫藥組合物對於治療癌症有很大的潛力，尤其於體外及體內皆有優異之抗人類惡性神經膠瘤之效果。

本發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明之範疇。

實施例：

1.一般材料及方法

(1)化學藥品與試劑

所有溶劑及試劑皆來自商業且不需再純化。反應過程中係藉由薄層色層層析法(thin-layer chromatograohy)來監控，其係使用默克(Merck)公司之螢光指示劑TLC片。管柱色層分析法(column chromatography)係使用矽膠(silica gel)。熔點係由Yanaco MP-500D熔點測定器所決定及未校正(uncorrected)。核磁共振光譜(NMR spectra)係以Bruker Avance DPX-200 FT-NMR光譜儀(spectrometer)於DMSO-d ₆ 中測定。下列係所使用之縮寫：mp係為熔點(melting point)、s 係為單峰(singlet)、d 係為二重峰(doublet)、dd 係為二重峰(double doublet)、t 係為三重峰(triplet)、q 係為四重峰(quartet)、m 係為多重峰(multiplet)、br 係指寬峰(broad)。質譜光譜(MS spectra)係藉由高解析質譜儀(Finnigan/Thermo Quest MAT 95XL instrument)所測量。元素分析(碳、氫及氮)係藉由元素分析儀(Perkin-Elmer 2400 Series II CHNS/O analyzer或Elementar vario EL III Heraeus CHNOS Rapid F002)測量，且結果係±0.4%計算值內。

3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-硫苯基)-2氫-四唑{3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,MTS}、{3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴}{3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT}、N-乙醯半胱胺酸(N-acetylcysteine,NAC)、環孢靈A(cyclosporine A)及二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購自美國Hyclone公司或美國sigma公司；L-麩醯胺酸(L-glutamine)、青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin)、RPMI1640培養液、杜氏改良英格爾培養基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)、最小必須培養基(Minimum Essential Medium,MEM)購自美國Invitrogen公司；F12培養液(F12 medium)、胰蛋白酶-乙二胺四醋酸(trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid,trypsin-EDTA)、Neuralbasal A medium購自美國Gibco公司。

2.細胞培養

M21細胞(人類惡性黑色素瘤細胞)係來自唐烽堯(Feng-Yao Tang)博士所提供，細胞以單層培養培養於含有10%胎牛血清(購自美國Hyclone公司)、每毫升100 U(U/ml)之青黴素(penicillin)及每毫升100微克(μg/ml)之鏈黴素(streptomycin)(購自美國Gibco公司)之RPMI-1640培養液、MEM培養液或DMEM培養液(購自美國Invitrogen公司)，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

CH27細胞(人類肺鱗狀癌細胞)，細胞以單層培養培養於含有5%胎牛血清(購自美國Hyclone公司)、100 U/ml之青黴素、100 μg/ml之鏈黴素(購自美國Gibco公司)及2 mM之L-麩醯胺酸(購自德國Merck公司)之DMEM培養液(購自美國Life Technologies公司)，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

Hep3B細胞(人類肝癌細胞)及H460細胞(非小細胞肺癌細胞)，細胞以單層培養培養於含有5%胎牛血清(購自美國Hyclone公司)、100U/ml之靑黴素、100μg/ml之鏈黴素(購自美國Gibco公司)及2mM之L-麩醯胺酸(購自德國Merck公司)之DMEM培養液(購自美國Life Technologies公司)，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

HSC-3細胞(人類口腔鱗狀細胞癌)，細胞以單層培養培養於含有10%胎牛血清(購自美國Hyclone公司)、100U/ml之靑黴素、100μg/ml之鏈黴素(購自美國Gibco公司)及2mM之L-麩醯胺酸(購自德國Merck公司)之1：1之DMEM培養液及F12培養液，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

HT29-5FUR細胞(人類大腸癌細胞)係由楊家欣(Jai-Sing Yang)博士(中國醫藥大學)所提供，細胞培養在含有10%胎牛血清、100U/ml之靑黴素及100μg/ml之鏈黴素之RPMI-1640培養液(購自美國Invitrogen公司)，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。U87、U251、T98G及U373細胞株(人類神經膠質瘤細胞)及RT2 cell line(大鼠神經膠質瘤細胞)係由蕭宏昇(Michael Hsiao)博士(中央研究院基因體研究中心)所提供，細胞培養於含有10%胎牛血清(購自美國Sigma公司)、100U/ml之靑黴素、100μg/ml之鏈黴素(購自Caisson公司)及2mM之L-glutamine(購自Caisson公司)之1：1之DMEM培養液(購自Caisson公司)中，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

C6細胞(大鼠神經膠質瘤細胞)係由曾淑芬(Shun-Fen Tzeng)博士(台灣國立成功大學)所提供，細胞培養於含有10%胎牛血清、100U/ml之靑黴素、100μg/ml之鏈黴素及 2mM之L-麩醯胺酸之DMEM培養液及F12培養液(購自Caisson公司)中，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

SVGP12細胞(人類正常神經膠質細胞)係由蕭宏昇(Michael Hsiao)博士(中央研究院基因體研究中心)所提供，細胞培養於含有10%胎牛血清、100U/ml之靑黴素、100μg/ml之鏈黴素及2mM之L-麩醯胺酸之MEM培養液(購自美國Invitrogen公司)中，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

原始神經膠質細胞係來自手術，並來自新生0至2天之史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rats)(國立成功大學實驗動物中心)之無腦膜之大腦皮層，並於0.05%胰蛋白酶-EDTA(購自Biowest公司)於37℃予以分離(dissociated)10分鐘後，加入培養液並來回吸取幾次後，於1000rpm離心5分鐘後去除上清液，並將神經膠質細胞過濾於70微米(μm)(購自BD Falcon公司)之過濾器，然後培養於含有10%胎牛血清(購自Sigma公司)、100U/ml之靑黴素、100μg/ml之鏈黴素、2mM之L-麩醯胺酸及17.5mM之D-葡萄糖(D-glucose)之Neuralbasal A培養液(購自Gibco公司)中，並將細胞培養於塗佈有50μg/ml多聚-D-賴氨酸(poly-D-lysine,PDL)(購自Sigma公司)之培養盤，並於37℃含有5%二氧化碳之環境培養。

3.細胞增生及存活試驗

3.1 MTS試驗

細胞增殖可藉由MTS(購自Promega公司)[四唑化合物(tetrazolium compound),{3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-硫苯基)-2氫-四示}{3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium}]試驗來評估。MTS試驗係一種比色試驗去測定細胞之存活率。MTS四唑化合物會被活細胞粒線體之菸鹼醯胺腺[嘌呤]二核苷酸(NADH)或菸鹼醯胺腺[嘌呤]二核苷磷酸(NADPH)所產生之去氫酶(dehydrogenase)還原，並生成有色之甲臢(formazan)。

將每孔1×10³ 之細胞培養於96孔盤中24小時後，將含有1、0.1、0.05、0.025、0.0125及0.00625微莫耳濃度(μM)連續濃度之MJ-66、MJ-68、MJ-78或0.1% DMSO之培養液加入96孔盤中，並於37℃培養，然後分別於0、24、48及72小時後去除培養液，並加入含有20 μl/孔(well)之MTS溶液及100 μl/孔之新鮮培養液之後，於37℃培養1至4小時，可溶性的甲之吸光值利用微量讀測儀(microplate reader)(購自Molecular device公司)之波長490 nm測量。細胞的存活率係以吸光值相對於未處理控制組的百分比判定。全部的結果以三次獨立實驗進行。

3.2 MTT試驗

培養於96孔培養盤中之每孔1X10⁴ 細胞分別以MJ-66處理，並以配於培養液之0.1% DMSO作為載劑控制組。經由24及48小時培養後，將100 ml之濃度為0.5 mg/ml之MTT溶液加入各孔中，並將該孔盤培養於37℃歷經4小時之後，加入含有0.04 N鹽酸(HCl)之100 ml異丙醇(isopropanol)溶液，再測量各孔於波長570 nm下的吸光值。細胞存活率係以佔控制組之百分比表示。全部的結果以三次獨立實驗進行。

3.3　錐蟲藍排除測試(trypan blue exclusion test)

細胞存活率亦可由錐蟲藍排除測試(trypan blue exclusion test)來評估。將每孔2x10⁴ 之細胞培養於6孔培養盤中，於37℃下培養歷經24小時。分別於每孔盤中加入待測之化合物，並以0.006% DMSO之培養液當作控制組，經由0、24、48、72及96小時於37℃下培養後，利用0.05%胰蛋白酶-EDTA將細胞懸浮並以0.4%錐蟲藍(trypan-blue)(購自Sigma公司)進行染色。細胞存活率可藉由死細胞相對於所有細胞的百分比來評估，細胞生長曲線可藉由活細胞相對於所有細胞量而評估。

4.細胞週期分析(cell cycle assay)

可藉由流式細胞儀(flow cytometry)分析細胞的去氧核糖核酸(DNA)之含量，故將3x10⁵ 之細胞培養於10公分培養盤中，於37℃下培養歷經24小時。分別於每培養盤中加入含有MJ-66(IC₅₀ )及0.006% DMSO之培養液，再於37℃下培養歷經24小時。於0、6、12、24及48小時之時間點，利用0.05%胰蛋白酶-EDTA將大於10⁶ 細胞懸浮，並以70%乙醇於-20℃固定超過1小時。之後以磷酸鹽緩衝溶液(phosphate-buffered saline,PBS)清洗兩次後，加入1 ml碘化丙啶-吐溫X-100染色溶液(propidium iodide/Triton X-100 staining solution)[濃度20μg/ml PI、0.1% Triton-X 100以及0.2 mg/ml核苷酸酶A(RNase A)(購自Sigma公司)]將細胞懸浮，於室溫避光染色30分鐘。以35 μm尼龍篩網(nylon mesh)(購自Falcon公司,352235)過濾後，以流式細胞儀(flow cytometry)(FACScan,購自BD Bioscience公司)分析DNA5之含量，並以WinMDI軟體分析1萬顆細胞之細胞週期分布(subG1、G1、S、G2/M及大於4N之DNA含量)。

5.利用胞嘧啶阿拉伯醣(cytosine arabinoside,Ara-C)於G1週期同步化

為了分析胞嘧啶阿拉伯醣苷(cytosine arabinoside,Ara-C)對於MJ-66處理之神經膠質瘤細胞的影響，故將3x10⁵ 之細胞培養於10公分培養盤中，於37℃培養歷經24小時。先給予4.17 mM/ml之胞嘧啶阿拉伯醣苷處理12小時後，再給予含有MJ-66(IC₅₀ )及0.006% DMSO之培養液，並於0、6、12、24及48之時間點，利用0.05%胰蛋白酶-EDTA將大於10⁶ 細胞懸浮，並以70%乙醇於-20℃歷經大於1小時固定後，以上述之PI進行染色，並以流式細胞儀分析1萬顆細胞之DNA含量。

6.免疫螢光染色

分別將2x10⁴ 之細胞培養於含有多聚-D-賴氨酸塗層之12 mm蓋玻片之24孔培養盤中，於37℃歷經24小時培養並使細胞能夠附著，分別於每培養盤中加入MJ-66(IC₅₀ )及0.006% DMSO之培養液，分別於0、12及24小時之時間點，將細胞以含有4%三聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)之磷酸鹽緩衝溶液固定30分鐘。於再加入含有0.2%之吐溫X-100(Triton-X 100)之0.1M磷酸鹽緩衝溶液經10分鐘，再以含有10%甲醇及0.2%之吐溫X-100(Triton-X 100)之磷酸鹽緩衝溶液處理5分鐘予以穿孔(permeablized)後，再以3%胎牛血清(bovine serum albumin,BSA)(購自Sigma公司)阻隔(blocked)歷經1小時。利用老鼠之抗α-微管蛋白(α-tubulin)單株抗體(購自美國Sigma-Aldrich公司)及兔子之抗γ-微管蛋白(γ-tubulin)多株抗體(購自美國Genetex公司)處理後，使用綴合有Texas Red或FITC之適當的二級抗體(secondary antibodies)染色歷經1小時，細胞核係以0.5 μg/ml之赫斯特(Hoechst 33342)染劑(購自美國Sigma-Aldrich公司型號為B2261)染色10分鐘，再以共焦雷射掃描顯微鏡(FV1000,Olympus)偵測得螢光影像。

7.活體異種移植動物模型( In vivo Xenograft animal model)

為了解腫瘤新生，將濃度為每100 μl磷酸鹽緩衝溶液含有1x10⁶ 之U87細胞(神經膠質瘤細胞)係以皮下注射方式(subcutaneously)接種至8至10週大之雄裸鼠(male nude mice)(品種為BALB/cAnN-Foxnlnu/CrlNarl mice,購自國家實驗動物中心)之右側腹部，每3天測量腫瘤大小，其腫瘤之體積係以立方毫米(mm³ )=(長度x寬度² )/2計算(Zhou et al.,2005)，當腫瘤之平均體積到達50至70 mm³ ，於20天內，以每兩天一次之方式給予含有每公斤1.36微克(μg/kg)MJ-66之生理食鹽水溶液、DMSO或生理食鹽水溶液腫瘤內注射。

8.數據統計

實驗以至少三次重複之方式進行。全部的結果是以平均值±標準偏差表示。個別的實驗是以未配對的t試驗(unpaired t test)予以分析。P<0.05之程度被認為係有統計上之意義。

製備例1.依據反應流程1及2之起始5-取代-2-胺基苯甲醯胺(5-substituted-2-aminobenzamide)(化合物9至13)合成的一般流程

用於合成具有化學式1的2-芳基-4-喹唑啉酮(2-Aryl-4-quinazolinones)的起始2-硝基苯甲醯胺(2-nitrobenzamide)是藉由如下所列示之方式製備而得。

5-取代-2-硝基苯甲醯胺(5-substituted-2-nitrobenzamide)(化合物2、5至8)是從5-取代-2硝基苯甲酸(5-substituted-2-nitrobenzoic acid)(化合物1及3)利用諸如亞硫醯氯(SOCl₂ )、氨氣(NH₃ )及二甲基胺(dimethylamine)[或吡咯啶(pyrrolidine)、哌啶(piperidine)或嗎啉(morpholine)]等試劑以標準方法如反應流程1及2中所述的一般反應順序之條件下反應所製備出。化合物2及5至8是以配於甲醇中的氫/鈀碳(H₂ /Pd-C)進行處理，以獲得5-取代-2-胺基苯甲醯胺(5-substituted-2-aminobenzamide)(化合物9至13)。

合成5-取代-2-胺基苯甲醯胺(5-substituted-2-aminobenzamide)之反應過程如下：

(a)(i)於迴流條件下，將亞硫醯氯(Thionyl chloride,SOCl₂ )(1.5g,12.6 mmol)逐滴加入配於30 ml之二氯乙烷(dichloroethane)中之含有5-取代-2硝基苯甲酸(5-substituted-2-nitrobenzoic acid)(化合物1：1.2 g，6.3 mmol；化合物3：1.3 g，6.3 mmol)之懸浮液。於迴流條件下，對所得的混合物進行攪拌4小時，並以真空抽乾；(ii)殘留物溶於200毫升(ml)之二氯乙烷溶液中並於室溫中以無水氨氣(NH₃ )處理。去除溶劑後，獲得一中間產物5-甲氧基-2-硝基苯甲醯胺(5-methoxy-2-nitrobenzamide)(化合物2：1.1 g，92%)或5-氯基-2-硝基苯甲醯胺(5-chloro-2-nitrobenzamide)(化合物4：1.2 g，92%)。

(b)中間產物化合物4溶於二甲基甲醯胺(dimethyl formamide,DMF)中，並與N,N-二甲基胺(N,N-dimethylamine)，或者吡咯啶(pyrrolidine)、哌啶(piperidine)或嗎啉(morpholine)於110℃進行反應，獲得5-取代-2-胺基苯甲醯胺化合物(5-substituted-2-aminobenzamides)(化合物5：1.1g，88%；化合物6：1.2g，86%；化合物7：1.2g，80%；化合物8：1.2g，81%)

(c)5-取代-2-胺基苯甲醯胺化合物(5-substituted-2-aminobenzamides)(化合物2、5至8)溶於甲醇(MeOH)中，並於10%之鈀碳催化劑(Pd/C)存在下進行氫化反應歷經1至2小時。催化劑藉由過濾予以去除，溶液於真空抽乾後獲得一呈棕色粉末之5-取代-2-胺基苯甲醯胺化合物(5-substituted-2-aminobenzamides)(化合物9至13)(化合物9：0.8 g，86%；化合物10：0.9 g，85%；化合物11：0.9 g，85%；化合物12：0.9 g，82%；化合物13：0.9 g，82%)

製備例2.　6-取代-2-芳基-4-喹唑啉酮化合物(6-substituted-2-aryl-4-quinazolinones)(化合物17至31)合成之一般流程

於本實施例中，6-取代-2-芳基-4-喹唑啉酮化合物(6-substituted-2-aryl-4-quinazolinones)是衍生自製備例1所獲得之化合物9至13。首先，化合物9至13係分別於亞硫酸氫鈉(NaHSO₃ )存在下，於150℃與配於N,N-二甲基乙醯胺(N,N-dimethylacetamide,DMAC)中的經取代的苯甲醛(substituted benzaldehydes)反應。之後，經熱環化去水(thermal cyclodehydration)/脫氫作用(dehydrogenation)即獲得一2,6-雙取代-4-喹唑啉酮化合物(2,6-disubstituted-4-quinazolinones)(化合物17至31)，如反應流程3所示：

用於合成6-取代-2-芳基-4喹唑啉酮化合物之一般流程是藉由如下所列示之方式進行：

將亞硫酸氫鈉(NaHSO₃ )(0.8g，7.5 mmol)加入於前述步驟(c)所獲得之5-甲氧基-2-胺基苯甲醯胺(5-methoxy-2-aminobenzamide)(化合物9：1.2g，7.3 mmol)與1-萘醛(1-naphthaldehyde)(化合物14：1.1g，7.3 mmole)配於20毫升N,N-二甲基乙醯胺中的溶液中。混合物以150℃加熱伴隨攪拌歷經3小時，並倒入至200 ml冰水。收集沉澱物並以水清洗，再於真空抽乾。經由氯仿以矽膠管柱層析法[column chromatography(silica gel;chloroform)]並經於酒精中之再結晶作用，獲得淡黃色針狀之6-甲氧基-2-(萘-1-基)-4-喹唑啉酮[6-methoxy-2-(naphthalene-1-yl)-4-quinazolinone](化合物17)(1.5 g，70%)。使用製備化合物17之方法，係利用所指明之經取代的苯甲醛(substituted benzaldehyde)以及苯甲醯胺(benzamide)製備化合物18至31。化合物17至31進一步藉由如「一般材料及方法」中所述之方法分析。化合物17至31之特性分別敘述如下。

實施例1： 6-甲氧基-2-(萘-1-基)喹唑啉-4-酮[6-Methoxy-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one](化合物17)

化合物17係由5-甲氧基-2-胺基苯甲醯胺(5-methoxy-2-aminobenzamide)(化合物9： 1.2 g，7.3 mmol)及1-萘醛(1-naphthaldehyde)(化合物14： 1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.5克(70%)；淡黃色針狀物；mp 174-175℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ3.87(3H,s,OCH₃ )，7.22-7.34(2 H,m,2×ArH)，7.53-7.72(5 H,m,5×ArH)，7.95-8.22(3 H,m,3×ArH)，12.62(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 302；Anal.(C₁₉ H₁₄ N₂ O₂ )：C、H、N。

實施例2： 6-甲氧基-2-(1氫-吲哚-3-基)-喹唑啉-4-酮[6-Methoxy-2-(1H -indol-3-yl)quinazolin-4-one](化合物18)

化合物18係由5-甲氧基-2-胺基苯甲醯胺(5-methoxy-2-aminobenzamide)(化合物9： 1.2 g，7.3 mmol)及吲哚-3-羧醛(indo-3-carboxaldehyde)(化合物15： 1.1 g,7.3 mmol)反應而得：產率1.4克(68%)；棕色結晶物；mp 311-312℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ3.84(3H,s,OCH₃ )，7.15-7.19(2 H,m,2×ArH)，7.35-7.49(3 H,m,3×ArH)，7.63-7.68(1 H,m,1×ArH)，8.45(1 H,s,1×ArH)，8.46-8.63(1 H,m,1×ArH)，11.76(1 H,s,NH)，12.11(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 291；Anal.(C₁₇ H₁₃ N₃ O₂ )：C、H、N。

實施例3： 6-甲氧基-2-(苯[b]苯硫-3-基)喹唑啉-4-酮[6-Methoxy-2-(benzo[b]thiophen-3-yl)quinazolin-4-one](化合物19)

化合物19係由5-甲氧基-2-胺基苯甲醯胺(5-methoxy-2-aminobenzamide)(化合物9 ：1.2 g，7.3 mmol)及苯并噻吩-3-羧醛(thianaphthene-3-carboxaldehyde)(化合物16 ：1.2 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.3克(60%)；棕色結晶物；mp 289-290℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ3.89(3H,s,OCH₃ )，7.43-7.57(4 H,m,4×ArH)，7.76-7.80(1 H,m,1×ArH)，8.07-8.11(1 H,m,1×ArH)，8.73(1 H,s,1×ArH)，8.98-9.01(1 H,m,1×ArH),12.49(1 H,br s,NH) ppm;MS(ESI) m/z 308；Anal.(C₁₇ H₁₂ N₂ O₂ S)：C、H、N。

實施例4： 6-(N,N -二甲胺)-2-(萘-1-基)喹唑啉-4-酮[6-(N ,N -Dimethylamino)-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one](化合物20)

化合物20係由5-N ,N -二甲胺-2-胺基苯甲醯胺(5-N ,N -dimethyl-2-aminobenzamide)(化合物10 ：1.3 g，7.3 mmol)及1-萘醛(化合物14 ：1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.5克(65%)；黃色結晶物；mp 254-255℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ2.99(6H,s,N(CH₃ )₂ )，7.22-7.34(2 H,m,2×ArH)，7.51-7.72(5 H,m,5×ArH)，7.96-8.23(3 H,m,3×ArH)，12.39(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 315；Anal. (C₂₀ H₁₇ N₃ O)：C、H、N。

實施例5： 6-(N,N -二甲胺)-2-(1氫-吲哚-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(N ,N -Dimethylamino)-2-(1H -indol-3-yl)quinazolin-4-one](化合物21)

化合物21係由5-N ,N -二甲胺-2-胺基苯甲醯胺(5-N ,N -dimethyl-2-aminobenzamide)(化合物10 ：1.3 g,7.3 mmol)及吲哚-3-羧醛(indo-3-carboxaldehyde)(化合物15 )(1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.3克(60%)；黃色結晶物；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ2.99(6H,s,N(CH₃ )₂ )，7.17-7.34(4 H,m,4×ArH)，7.43-7.47(1 H,m,1×ArH)，7.58-7.63(1 H,m,1×ArH)，8.44(1 H,s,1×ArH)，8.65-8.69(1 H,m,1×ArH)，11.71(1 H,s,NH)，11.92(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 304；Anal. (C₁₈ H₁₆ N₄ O)；C、H、N。

實施例6： 6-(N,N -二甲胺)-2-(苯[b]苯硫-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(N ,N -Dimethylamino)-2-(benzo[b]thiophen-3-yl)quinazolin-4-one](化合物22)

化合物22係由5-N,N -二甲胺-2-胺基苯甲醯胺(5-N ,N -dimethyl-2-aminobenzamide)(化合物10 ：1.3 g,7.3 mmol)及苯并噻吩-3-羧醛(thianaphthene-3-carboxaldehyde)(化合物16 ：1.2 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.5克(62%)；淡黃色針狀物；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ2.99(6H,s,N(CH₃ )₂ )，7.20-7.67(5 H,m,5×ArH)，8.02-8.05(1 H,m,1×ArH)，8.63(1 H,s,1×ArH)，8.97-9.01(1 H,m,1×ArH),12.21(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 321；Anal.(C₁₈ H₁₅ N₃ OS)：C、H、N。

實施例7： 6-(吡咯啶-1-基)-2-(萘-1-基)喹唑啉-4-酮[6-(Pyrrolidin-1-yl)-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one(化合物23)](MJ-66)

化合物23係由5-吡咯啶基-2-胺基苯甲醯胺(5-pyrrolidinyl-2-aminobenzamide)(化合物11 ：1.5 g，7.3 mmol)及1-萘醛(1-naphthaldehyde)(化合物14 ：1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.6克(65%)；黃色針狀物；mp 276-277℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ1.99(4H,m,CH ₂ CH₂ NCH₂ CH ₂ )，3.27(4H,m,CH₂ NCH₂ )，7.10-7.21(2 H,m,2×ArH)，7.56-7.76(5 H,m,5×ArH)，8.01-8.21(3 H,m,3×ArH)，12.34(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 341；Anal. (C₂₂ H₁₉ N₃ O)：C、H、N。

實施例8： 6-(吡咯啶-1-基)-2-(1H -吲哚-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(Pyrrolidin-1-yl)-2-(1H -indol-3-yl)quinazolin-4-one](化合物24)

化合物24係由5-吡咯啶基-2-胺基苯甲醯胺(5-pyrrolidinyl-2-aminobenzamide)(化合物11 ：1.5 g，7.3 mmol)及吲哚-3-羧醛(indo-3-carboxaldehyde)(化合物15 )(1.1 g,7.3 mmol)反應而得：產率1.5克(61%)；棕色粉狀物；mp 298℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ1.94(4H,m,CH ₂ CH₂ NCH₂ CH ₂ )，3.28(4H,m,CH₂ NCH₂ )，6.97-7.20(4 H,m,4×ArH)，7.39-7.43(1 H,m,1×ArH)，7.53-7.58(1 H,m,1×ArH)，8.38(1 H,s,1×ArH)，8.61-8.65(1 H,m,1×ArH)，11.68(1 H,s,NH)，11.88(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 330；Anal.(C₂₀ H₁₈ N₄ O)：C、H、N。

實施例9： 6-(吡咯啶-1-基)-2-(苯[b]苯硫-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(Pyrrolidin-1-yl)-2-(benzo[b]thiophen-3-yl)quinazolin-4-one(化合物25)](MJ-78)

化合物25係由5-吡咯啶基-2-胺基苯甲醯胺(5-pyrrolidinyl-2-aminobenzamide)(化合物11 ：1.5 g,7.3 mmol)及苯并噻吩-3-羧醛(thianaphthene-3-carboxaldehyde)(化合物16 ：1.2 g,7.3 mmol)反應而得：產率1.5克(60%)；棕色粉狀物；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ1.97(4H,m,CH ₂ CH₂ NCH₂ CH ₂ )，3.47(4H,m,CH₂ NCH₂ )，7.43-7.57(4 H,m,4×ArH)，7.76-7.80(1 H,m,1×ArH)，8.07-8.11(1 H,m,1×ArH)，8.73(1 H,s,1×ArH)，8.98-9.02(1 H,m,1×ArH)，12.51(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 347；Anal.(C₂₀ H₁₇ N₃ OS)：C、H、N。

實施例10： 6-(哌啶-1-基)-2-(萘-1-基)喹唑啉-4-酮[6-(Piperidin-1-yl)-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one](化合物26)(MJ-68)

化合物26係由5-哌啶基-2-胺基苯甲醯胺(5-piperidinyl-2-aminobenzamide)(化合物12 ：1.6 g，7.3 mmol)及1-萘醛(1-naphthaldehyde)(化合物14 ：1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.6克(65%)；棕色針狀物；mp 233-235℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ1.57-1.62(6H,m,(CH ₂ )₂ CH₂ NCH₂ CH ₂ )，3.26-3.31(4H,m,CH₂ NCH₂ )，7.48-7.65(6 H,m,6×ArH)，7.72-7.76(1 H,m,1×ArH)，8.00-8.13(3 H,m,3×ArH)，12.43(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 355；Anal.(C₂₃ H₂₁ N₃ O)；C、H、N。

實施例11： 6-(哌啶-1-基)-2-(1H -吲哚-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(Piperidin-1-yl)-2-(1H -indol-3-yl)quinazolin-4-one](化合物27)

化合物27係由5-哌啶基-2-胺基苯甲醯胺(5-piperidinyl-2-aminobenzamide)(化合物12 ：1.6 g，7.3 mmol)及吲哚-3-羧醛(indo-3-carboxaldehyde)(化合物15 ：1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.6克(64%)；棕色結晶物；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ1.59-1.62(6H,m,(CH ₂ )₂ CH₂ NCH₂ CH ₂ )，3.20-3.24(4H,m,CH₂ NCH₂ )，7.18-7.21(2 H,m,2×ArH)，7.41-7.48(3 H,m,3×ArH)，7.50-7.62(1 H,m,1×ArH)，8.46(1 H,s,1×ArH)，8.65-8.69(1 H,m,1× ArH)，11.73(1 H,s,NH)，11.96(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 344；Anal.(C₂₁ H₂₀ N₄ O)：C、H、N。

實施例12 ：6-(哌啶-1-基)-2-(苯[b]苯硫-3-基)喹唑啉基-4-酮[6-(Piperidin-1-yl)-2-(benzo[b]thiophen-3-yl)quinazolin-4-one](化合物28)

化合物28係由5-哌啶基-2-胺基苯甲醯胺(5-piperidinyl-2-aminobenzamide)(化合物12 ：1.6 g，7.3 mmol)及苯并噻吩-3-羧醛(thianaphthene-3-carboxaldehyde)(化合物16 ：1.2 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.6克(60%)；淡黃色結晶物；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ1.57-1.59(6H,m，(CH ₂ )₂ CH₂ NCH₂ CH ₂ )，3.22-3.25(4H,m,CH₂ NCH₂ )，7.42-7.54(4 H,m,4×ArH)，7.63-7.67(1 H,m,1×ArH)，8.03-8.07(1 H,m,1×ArH)，8.66(1 H,s,1×ArH)，8.97-9.00(1 H,m,1×ArH)，12.30(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 361；Anal.(C₂₁ H₁₉ N₃ OS)：C、H、N。

實施例13： 6-(嗎啉)-2-(萘-1-基)喹唑啉-4-酮[6-(Morpholino)-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-one](化合物29)

化合物29係由5-嗎啉基-2-胺基苯甲醯胺(5-morpholinyl-2-aminobenzamide)(化合物13 ：1.6 g，7.3 mmol)及1-萘醛(1-naphthaldehyde)(化合物14 ：1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.7克(64%)；黃色結晶物；mp 291-293℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ3.22(4H,t,J =4.7 Hz,CH₂ NCH₂ )，3.77(4H,t,J =4.7 Hz,CH₂ OCH₂ )，7.51-7.66(6 H,m,6×ArH)，7.73-7.76(1 H,m,1×ArH)，8.00-8.11(3 H,m,3×ArH)，12.48(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 357；Anal.(C₂₂ H₁₉ N₃ O₂ )：C、H、N。

實施例14： 6-(嗎啉)-2-(1H -吲哚-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(Morpholino)-2-(1H -indol-3-yl)quinazolin-4-one](化合物30)

化合物30係由5-嗎啉基-2-胺基苯甲醯胺(5-morpholinyl-2-aminobenzamide)(化合物13 ：1.6 g，7.3 mmol)及吲哚-3-羧醛(indo-3-carboxaldehyde)(化合物15 ：1.1 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.6克(65%)；棕色結晶物；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ2.97(4H,t,J =4.7 Hz,CH₂ NCH₂ )，3.74(4H,t,J =4.7 Hz,CH₂ OCH₂ )，7.12-7.22(2 H,m,2×ArH)，7.41-7.63(4 H,m,4×ArH)，8.43(1 H,s,1×ArH)，8.60-8.64(1 H,m,1×ArH)，11.76(1 H,s,NH)，12.01(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 346；Anal.(C₂₀ H₁₈ N₄ O₂ )：C、H、N。

實施例15： 6-(嗎啉)-2-(苯[b]苯硫-3-基)喹唑啉-4-酮[6-(Morpholino)-2-(benzo[b]thiophen-3-yl)quinazolin-4-one](化合物31)

化合物31係由5-嗎啉基-2-胺基苯甲醯胺(5-morpholinyl-2-aminobenzamide)(化合物13 ：1.6 g，7.3 mmol)及苯并噻吩-3-羧醛(thianaphthene-3-carboxaldehyde)(化合物16 ：1.2 g，7.3 mmol)反應而得：產率1.6克(60%)；棕色結晶物(1.6 g,60%)；mp>300℃；¹ H NMR(DMSO-d ₆ )δ2.47(4H,t,J =4.7 Hz,CH₂ NCH₂ )，3.75(4H,t,J =4.7 Hz,CH₂ OCH₂ )，7.44-7.59(4 H,m,4×ArH)，7.67-7.72(1 H,m,1×ArH)，8.03-8.07(1 H,m,1×ArH)，8.67(1 H,s,1×ArH)，8.96-9.00(1 H,m,1×ArH)，12.31(1 H,br s,NH) ppm；MS(ESI) m/z 363；Anal.(C₂₀ H₁₇ N₃ O₂ S): C、H、N。

實施例16：2-芳基-4-喹唑啉酮化合物之體外( in vitro )細胞毒性測試

實施例1至15製備之2-芳基-4-喹唑啉酮化合物17-31，如以下表1所示，註記為MJ-66至-80並且指明其分子量。

藉由錐蟲藍排除測試評估化合物17至31對於M21、CH27、H460、Hep3B及HSC-3細胞抗增生之影響。化合物17至31對於各種癌細胞株之最大半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC₅₀ )的結果呈現於表2中。結果顯示，化合物17、20、23、24、26、27及29對於這些癌細胞株具有細胞毒性，但化合物17對於HSC-3細胞則無效，於上述中，化合物23，亦即MJ-66，在體外(in vitro )最有潛力對抗上述之人類癌細胞。

實施例17：2-芳基-4-喹唑啉酮化合物(MJ-66)抑制人類 大腸癌細胞(Human colon adenocarcinoma,HT29-5FUR)增生

MJ-66對於抑制HT29-5FUR細胞生長抑制的影響被研究。關於細胞存活試驗，HT29-5FUR細胞被培養並被0、25、50、100及200 nM的MJ-66處理，存活細胞之百分比可由「一般材料及方法」中「MTT試驗」所述的方法來評估：如圖1所示，HT29-5FUR細胞之數量相對於控制組之培養，歷經24及48小時不同濃度之MJ-66(0、25、50、100及200 nM)之處理後，呈劑量依賴性的減少(dose-dependent decreases)。

實施例18：2-芳基-4-喹唑啉酮化合物抑制神經膠質瘤細胞增生

為了研究本發明之2-芳基-4-喹唑啉酮化合物對於細胞增生之影響，故將神經膠質瘤細胞給予MJ-66、MJ-68或MJ-78處理。MJ-66、MJ-68及MJ-78之結構如表1所示。為了測定MJ-66、MJ-68或MJ-78對於大鼠神經膠質瘤細胞C6細胞(註記為C6)以及人類神經膠質瘤細胞U87細胞(註記為U87)的影響，細胞是以不同濃度(0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1及1 μM)之2-芳基-4-喹唑啉酮化合物予以處理歷經48小時。各組的細胞之存活率是以MTS方法進行分析(平均值±SEM，n=3)。如圖2所示，於第48小時，神經膠質瘤細胞之存活率有效地被MJ-66所抑制。(MJ-66之IC₅₀ 值：C6=0.056±0.009 μm，U87=0.054±0.01 μM)。然而，MJ-68或MJ-78並未如MJ-66有效地抑制神經膠質瘤細胞(MJ-68之IC₅₀ 值：C6=0.47±0.16 μM，U87=0.54±0.24 μm；MJ-78之IC₅₀ 值：C6>1 μM，U87>1 μM)。這些結果顯示MJ-66對於神經膠質瘤細胞具有顯著的細胞毒性。

MJ-66對於其他神經膠質瘤細胞之影響被更進一步試驗。包括C6及RT2細胞的大鼠神經膠質瘤細胞以及及包括U87、U251、T98G及U373細胞的人類神經膠質瘤細胞於24、48及72小時以一系列不同濃度(0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1及1 μM)之MJ-66處理，以MTS方法去評估細胞存活率(平均值±SEM，n=3)。神經膠質瘤細胞的存活率被MJ-66以不同的時間期間處理。如圖3A及圖3B所示，細胞存活率是以時間-依賴以及劑量-依賴的方式降低，而以0.1% DMSO處理並不影響細胞存活率。

實施例19：藉由錐蟲藍排除分析評估2-芳基-4-喹唑啉酮MJ-66誘導神經膠質瘤細胞死亡

為了研究MJ-66所誘發的神經膠質瘤細胞死亡，細胞存活率可由錐蟲藍排除測試來評估。將U87細胞及C6細胞以不同濃度之MJ-66(30、60及90 nM)或0.009%之DMSO處理歷經24、48及72小時，以0.4%錐蟲藍染色後利用亮視野顯微鏡(bright field microscope)觀察細胞型態。細胞死亡之百分比及細胞生長曲線藉由錐蟲藍排除測試之細胞計數予以測定(平均值±SEM，n=3)。相對於總細胞數目，錐蟲藍正性細胞被定義為死細胞。

如圖4A所示，經MJ-66處理之神經膠質瘤細胞之型態係集中(rounding up)，且附著能力以時間-依賴及劑量-依賴之方式降低。如圖4B所示，經MJ-66處理之C6細胞於72小時(左上及左下區)時，而U87細胞於48小時(右上及右下)時的細胞死亡的百分比顯著的被誘發(相對於控制組*p<0.05)。

實施例20：2-芳基-4-喹唑啉酮(MJ-66)誘發神經膠質瘤細胞停滯於G2/M(glioma G2/M arrest)以及細胞死亡

為了研究經MJ-66處理之神經膠質瘤細胞的細胞週期，將C6細胞以60 nM之MJ-66處理歷經0、6、12、24、36以及48小時，且細胞於subG1、G1、S及G2M期之細胞週期分布百分比以及DNA含量係以PI染色並以流式細胞儀(flow cytometry)監測。

如圖5A所示，C6細胞經MJ-66處理於6及12小時後顯著增加G2/M之細胞族群(cell population)。此外，如圖5B所示，MJ-66於24、36及48小時後以時間-依賴之方式增加sub G1及大於4N DNA含量的細胞族群。這些數據說明MJ-66能有效誘發神經瘤細胞G2/M休止(G2/M arrest)，然後發生細胞死亡。然而，MJ-66對於正常神經膠質細胞是否有細胞毒性未測定，於下一實施例中會進一步試驗MJ-66對於正常神經膠質細胞之影響。

實施例21：2-芳基-4-喹唑啉酮MJ-66不會造成非增生之神經膠質瘤細胞(glioma cells)發生細胞死亡

為了研究MJ-66對於諸如人類正常神經膠質細胞SVGP12及大鼠原始神經膠質細胞的正常神經膠質細胞的影響，細胞以不同濃度(0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1及1 μM)之MJ-66處理歷經不同時間(0、6、12及24小時)後，細胞之存活率是以MTS試驗評估。單獨的或處理予DMSO的細胞被使用作為控制組。如圖6A所示，SVGP12細胞及大鼠初級神經膠質細胞的細胞存活率皆被MJ-66所抑制，此說明神經膠質細胞於試管內仍持續增生，故MJ-66於試管內仍對正常神經膠質細胞具有細胞毒性。但大部分於動物體內之神經膠質細胞是靜止的，且它們的增生率幾乎是停止。因此，胞嘧啶阿拉伯醣苷(Ara-C)，其係為去氧核糖核酸合成抑制劑(DNA synthesis inhibitor)，被使用抑制神經膠質瘤細胞增生，且神經膠質瘤細胞以如「一般材料及方法」中所述的方法，以MJ-66或DMSO處理。特定地，C6細胞(大鼠神經膠質瘤細胞)以41.6 nM之Ara-C處理12小時後，以60 nM之MJ-66或溶劑(DMSO)處理0、6、12及24小時，細胞的DNA含量及其細胞週期分布係藉由PI染色及流式細胞儀(flow cytometry)監測。C6細胞以41.6 nM之Ara-C處理12小時作為控制組。

如圖6B所示，C6神經膠質細胞以胞嘧啶阿拉伯醣(Ara-C)處理12小時後，會停留在G1期。如圖6C所示，相較於未以Ara-C處理之C6細胞，神經膠質瘤細胞並不因MJ-66處理12或24小時後而誘發發生細胞死亡，這說明化合物23(MJ-66)僅會導致增生中的神經膠質瘤細胞死亡，而並不誘發非增生中的神經膠質瘤細胞之細胞死亡發生。

實施例22：2-芳基-4-喹唑啉酮MJ-66誘發神經膠質瘤細胞細胞凋亡(apoptosis)

為了觀察經MJ-66處理之神經膠質細胞之細胞型態，C6或U87神經膠質瘤細胞以培養基或60 nM之MJ-66處理24小時後，分別以Hoechst 33342及帶有FITC之抗α-微管蛋白(α-tubulin)抗體或帶有FITC之抗γ-微管蛋白(γ-tubulin)抗體及帶有Texas Red之抗α-微管蛋白抗體染色，並藉由共焦雷射掃描顯微鏡偵測。如圖7A及圖7B所示，經MJ-66處理的U87細胞會形成不正常的核性狀(nuclear phenotype)，但控制組細胞並不會。且經MJ-66處理的細胞會形成多核巨大細胞(multinuclear giant cells)。於初期階段，經MJ-66處理的細胞會呈現異常之多極紡綞體(aberrant multipolar spindle)及不正常排列的染色體(unaligned chromosome)，其係以數量化方式呈現於圖7C中。係MJ-66處理後所形成多核巨大細胞之百分比。而異常之多極紡綞體及不正常排列的染色體為典型有絲分裂災變(mitotic catastrophe)之特徵。有絲分裂災變被定義為一種由不正常之有絲分裂所引起之細胞死亡的類型。結果顯示，MJ-66會誘發神經膠質瘤細胞死亡。

實施例23：2-芳基-4-喹唑啉酮化合物(MJ-66)抑制活體異種移植動物模型之腫瘤生長

由於MJ-66能有效地於試管內誘發神經膠質瘤細胞發生有絲分裂災變，本實施例接下來將測試MJ-66於U87人類神經膠質瘤活體異種移植動物模型中是否能抑制腫瘤生長。將1x10⁶ 之U87細胞以皮下注射方式接種至裸鼠(nude mice)，當腫瘤之平均體積到達50至200 mm³ ，每2天共10次給予1.36 μg/kg之配於食鹽水(saline)中的MJ-66、DMSO或食鹽水(Ctrl)注射處理。每3天測量腫瘤大小一次，總共觀察50天。

如圖8所示，經MJ-66治療40天後，腫瘤之生長顯著的受抑制，該腫瘤之體積大小：控制組為1007.3 mm³ ，DMSO組為922.5 mm³ ，MJ-66組為435.1 mm³ (**p<0.01)(控制組為7隻，DMSO組為7隻，MJ-66組為8隻)。

本發明由上述之實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明之範疇。

圖1係MJ-66對於HT29-5FUR細胞存活率之影響之折線圖。

圖2係MJ-66、MJ-68及MJ-78濃度-依賴對神經膠質瘤細胞株包括C6及U87細胞處理歷經48小時之影響(平均值±SEM，n=3)，其中C6係代表大鼠神經膠質瘤細胞及U87係代表人類神經膠質瘤細胞。

圖3A係藉由MJ-66以時間-依賴以及劑量-依賴的方式抑制神經膠質瘤細胞之增生，神經膠質瘤細胞係為C6、RT2、U87、U373、U251及T98G細胞。

圖3B係藉由MTS方法評估60 nM之MJ-66以時間-依賴的方式降低細胞存活率(平均值±SEM，n=3)，其中大鼠神經膠質瘤細胞株C6及RT2、人類神經膠質瘤細胞U87、U373、U251及T98G細胞為所述之標的細胞。

圖4A及圖4B係說明MJ-66誘發神經膠質瘤細胞死亡。圖4A係C6細胞及U87細胞以30、60及90nM之MJ-66或0.009%之DMSO處理於指定時間處理，並於200倍亮視野顯微鏡(bright field microscope)之細胞型態。圖4B係C6及U87神經膠質瘤細胞以60 nM MJ-66或媒介(培養液或DMSO)處理歷經不同時間(平均值±SEM，n=3)(相對於控制組*p<0.05)。

圖5A及圖5B係說明MJ-66誘發神經膠質瘤細胞G2/M休止及細胞死亡。圖5A係以60 nM MJ-66歷經不同時間點處理C6細胞之細胞週期分佈。圖5B係由圖5A之subG1、G1、S、G2/M及>4N DNA含量分析之百分比圖。

圖6A、圖6B及圖6C係證實MJ-66不會誘發非增生之神經瘤細胞死亡。

圖6A係藉由MTS試驗，以一系列濃度之MJ-66於不同時間點處理SVGP12細胞(人類正常神經膠質細胞)及大鼠初級神經膠質細胞之影響。

圖6B係以41.6 nM之胞嘧啶阿拉伯醣(Ara-C)處理C6神經膠質瘤細胞歷經12小時之流式細胞分析(flow cytometric analysis)之結果。

圖6C係證實，上方區塊，係60 nM之MJ-66處理C6細胞歷經指定時間點之結果；中間及下方區塊係Ara-C與DMSO或MJ-66歷經指定時間點處理C6細胞之結果。

圖7A、圖7B及圖7C係證實MJ-66誘發神經瘤細胞呈現多核表現型(multinuclear phenotype)及多極紡綞體(multipolar spindle)。

圖7A提供代表性的圖式顯示以60 nM之MJ-66處理U87神經膠質瘤細胞歷經24小時，以Hoechst 33342及α-tubulin(綠色螢光)之抗體染色及U87神經膠質瘤細胞以含有0.006% DMSO之培養液處理作為控制組。

圖7B提供共焦雷射掃描顯微鏡將細胞以含有0.006% DMSO之培養液或60 nM之MJ-66處理歷經12小時，以α-tubulin(紅色螢光)及γ-tubulin(綠色螢光)染色，箭號係指多核細胞(multinuclear cells)；箭頭係指多極紡綞體(multipolar spindle)；白色比例尺係等於10μm。

圖7C係以60nM之MJ-66歷經不同時間點處理後之多核細胞(multinuclear cells)之量化結果圖。

圖8係MJ-66於活體異種移植動物模型中抑制腫瘤生長(**p<0.01)，相對於控制組及DMSO。

Claims (6)

1. 一種具有化學式1之化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物： 其中R₅ 、R₇ 及R₈ 係分別為氫(H)、氫氧基(OH)、氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)；其中Ar係萘基基團(naphthalenyl group)；且R₆ 係由甲氧基(methoxy group)、二甲胺基(dimethylamino group)、吡咯啶基(pyrrolidinyl group)、哌啶基(piperidinyl group)及嗎啉基(morpholino group)所構成之群組；其中溶劑合物係溶劑及溶質所形成之複合物，且溶質係化學式1之化合物，溶劑為水、乙醇及醋酸。
2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物，其化合物係具有如下之化學式：
3. 一種醫藥組合物，其包括一如申請專利範圍第1至2項任一項所述之具有化學式1的化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物；以及其藥學上可接受之賦形劑。
4. 一種如申請專利範圍第1至2項任一項的化合物或其藥學上可接受之鹽類、溶劑合物、立體異構物用於製造治療疾病或病變的醫藥組合物之用途。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該疾病或病變係皮膚癌、肺癌、胃腸癌、卵巢癌、腎臟癌、胰臟癌、骨癌、脾臟癌、肝癌、膽囊癌、咽喉癌或鼻腔癌。
6. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該疾病或病變係惡性神經瘤(malignant gliomas)、肉瘤(sarcoma)、惡性瘤(carcinoma)或腺瘤(adenoma)。