TWI419695B - Use 2-methoxy estradiol to treat sepsis - Google Patents

Description

使用2-甲氧基雌二醇來治療敗血症

本發明是有關於使用2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)來治療敗血症(sepsis)。

敗血症是一種經由病原體(pathogen)的感染所引起的全身性發炎反應症候群(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。在敗血症的疾病發展過程中，病原體會侵害宿主體內的特定組織或細胞並且引發血液中毒(blood poisoning)，進而使得免疫細胞(immune cell)[諸如嗜中性球(neutrophil)以及巨噬細胞(macrophage)]往受損害之處聚集[被稱為浸潤(infiltration)]。經聚集的巨噬細胞會被病原體表面的脂多醣(lipopolysaccharides,LPS)活化，接著經活化的巨噬細胞會促進自身的誘導性一氧化氮合成酶基因(inducible nitric oxide synthase gene,iNOS gene)的表現並促使一氧化氮(nitric oxide,NO)的生成，同時會釋放出各種前發炎性細胞激素(proinflammatory cytokines)[諸如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、介白素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及介白素-6(interleukin-6,IL-6)]來引發全身性發炎反應。

當全身性發炎反應持續過久時會使得前發炎性細胞激素累積過多而對細胞或組織造成損害，進而導致組織壞死(tissue necrosis)，甚至造成多重器官功能異常(multiple organ dysfunction,MOD)[亦被稱為多重器官衰竭(multiple organ failure)]，最後可能導致嚴重的敗血症(severe sepsis)。當嚴重的敗血症引發低血壓(hypotention)或器官的低灌注(hypoperfusion)時，可能會導致敗血性休克(septic shock)而死亡。

目前臨床上常用於治療敗血症的方式可被歸納為下面4大類：

(1)抗生素療法(antibiotics therapy)：例如，氯黴素(chloramphenicol)、第3代頭孢菌素(cephalosporin)以及安比西林(ampicillin)等；

(2)早期目標導向療法(early goal directed therapy)[亦即休克復甦(shock resuscitation)]：例如，補充氧氣-氣管套管術(supplemental oxygen-endotracheal intubation)、中央靜脈與動脈導管插入法(central venous and arterial catheterization)、類晶體流體的靜脈灌注(intravenous infusion of crystalloid fluid)以及血管加壓劑(vasopressor)的投藥等；

(3)支持性療法(supportive therapy)：對重要器官進行支持性照護(supportive care)以防止器官衰竭並且幫助器官功能的恢復，同時避免感染(infection)以及其它併發症(complications)；以及

(4)輔助性療法(adjuvant therapy)：例如，皮質類固醇(corticosteroids)[諸如氫化可體松(hydrocortisone)以及甲基去氫皮質醇(methylprednisolone)]、內毒素的中和劑(neutralizing agent of endotoxin)(諸如抗內毒素抗體)、非專一性抗發炎與免疫調節藥物(non-specific anti-inflammatory and immunomodulating drugs)、前發炎性細胞激素的抑制劑(inhibitor)[諸如抗TNF-α抗體以及IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist)]以及重組型人類活化蛋白質C(recombinant human activated protein C)(商品名稱為)等。

雖然上面所提及的治療方式或藥物具有控制器官功能異常以及避免併發症的功效，但是在臨床應用上仍存在有療效不佳以及容易產生副作用(side effect)的問題。例如，抗生素療法可能會導致病原菌產生抗藥性(drug resistance)，早期目標導向療法僅適用於具有休克症狀的敗血症病患，而重組型人類活化蛋白質C可能會導致嚴重的出血(serious bleeding)。因此，本領域的相關研究人員仍致力於開發有用的藥物來供治療敗血症。

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)是一種17β-雌二醇(17 β-estradiol)的內生性代謝物(endogenous metabolite)。已知2-甲氧基雌二醇在癌細胞以及內皮細胞(endothelial cells)中具有抗增生(anti-proliferative)、促進細胞凋亡(apoptosis)以及抗血管生成(anti-angiogenic)的活性，因而被認為具有發展成為一抗癌試劑(anti-cancer agent)的高潛力。目前，已有第一與第二期臨床試驗(Phase I and II clinical trials)在評估2-甲氧基雌二醇對於各種腫瘤類型[諸如乳癌(breast cancer)、前列腺癌(prostate cancer)以及多發性骨髓瘤(multiple myeloma)]的治療效用。

此外，有研究顯示，2-甲氧基雌二醇會在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)、肺高血壓(pulmonary hypertension,PH)、肺纖維化(pulmonary fibrosis)以及急性肺損傷(acute lung injury)的動物模型(animal models)中展現出抗發炎(anti-inflammation)的活性，因而被預期可供用於治療該等疾病。例如，在S. M. Plumet al .(2009),BMC Musculoskelet. Disord .,10:46-58中，S. M. Plum等人發現在帶有類風濕性關節炎的小鼠的後肢(hind limbs)中，2-甲氧基雌二醇可以抑制發炎性細胞激素(inflammatory cytokines)(諸如IL-1β、IL-6以及TNF-α)以及血管生成細胞激素(angiogenic cytokine)(諸如VEGF以及FGF-2)的基因表現，因而被認為可作為一種針對類風濕性關節炎的疾病調節劑(disease modifying agent)。

在S. P. Tofovicet al .(2009),Vascul. Pharmacol .,51:190-197中，S. P. Tofovic等人發現在雌激素-缺乏(estrogen-deficient)且帶有博來黴素-誘發的肺纖維化與肺高血壓(bleomycin-induced pulmonary fibrosis and PH)的大鼠中，2-甲氧基雌二醇具有抗發炎、抗纖維變性(anti-fibrotic)以及抗血管再成型(anti-vascular remodeling)的效用，因而能提高大鼠的存活率。S. P. Tofovic等人據此而認為：2-甲氧基雌二醇在博來黴素-誘發的肺纖維化與肺高血壓上具有保護效用。

在F. H. W. Shandet al .(2010),J. Pharmacol. Exp. Ther .,336:962-972中，F. H. W. Shand等人發現2-甲氧基雌二醇在活體外(in vitro )會抑制經脂多醣/干擾素-γ刺激的J774鼠類巨噬細胞(murine macrophage)的IL-6以及前列腺素E₂ (prostaglandin E₂ )生成，並且會抑制人類單核球(human monocyte)的TNF-α生成。此外，2-甲氧基雌二醇在活體內(in vivo )亦可藉由降低在帶有LPS-誘發的急性肺損傷的小鼠的肺中之IL-6基因的表現來抑制發炎反應。

就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示2-甲氧基雌二醇可被應用於治療敗血症。

發明概要

於是，本發明提供一種用於治療敗血症的藥學組成物，其包含有2-甲氧基雌二醇。

本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有敗血症的個體的方法，其包括對該個體投藥以2-甲氧基雌二醇。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

如本文中所用的，術語“敗血症(sepsis)”意欲涵蓋敗血症(septicemia)[諸如菌血症(bacteremia)以及內毒血症(endotoxemia)]、嚴重的敗血症(severe sepsis)、敗血性休克(septic shock)、多重器官功能異常症候群(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等病況(conditions)，以及與上述各個病況有關聯的臨床症狀(clinical symptoms)和併發症(complications)。

在開發可用於治療敗血症的藥物上，申請人意外地發現：2-甲氧基雌二醇具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示2-甲氧基雌二醇供應用於製備一用來治療敗血症之醫藥品的用途。

特別地，申請人經由實驗結果證實：當被誘發敗血症的小鼠被給予2-甲氧基雌二醇時，牠們的敗血症症狀(包括發炎反應、細胞損傷以及器官功能障礙等)都獲得明顯改善，進而提高被誘發敗血症的小鼠的存活率。因此，本發明提供一種用於治療敗血症的藥學組成物，其包含有2-甲氧基雌二醇。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性的進展(progression of severity)。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、局部地(topically)或口服地(orally)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)以及類似之物。

依據本發明的藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。

在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於以腹膜內注射而被投藥的劑型。

在本發明的另一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於口服投藥的劑型。

依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。

依據本發明，該藥學上可接受的載劑包含有一選自於下列群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該溶劑是一磷酸鹽緩衝生理鹽水。

本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有敗血症的個體的方法，其包括對該個體投藥以2-甲氧基雌二醇。

依據本發明，2-甲氧基雌二醇之投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式來被投藥。當該藥學組成物被口服地投藥時，每日投藥劑量通常是20至100 mg/Kg體重；而當該藥學組成物被非經腸道地投藥時，每日投藥劑量通常是0.5至3 mg/Kg體重。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 一般實驗材料： 1.　實驗動物：

在下面實施例中所使用的雄性BALB/c小鼠(BALB/c mice)(6-8週大，體重約20 g)是購自於國立成功大學實驗動物中心(National Cheng Kung University Laboratory Animal Center)。所有的實驗動物是依據台灣國家科學委員會(National Science Council,Taiwan)所認可的準則而被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在25±1℃以及相對濕度維持在60±5%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的一切實驗程序均符合台灣動物保護法(Animal Protection Act of Taiwan)的規定並且依據奇美醫學中心(Chi-Mei Medical Center)的動物飼養管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)所認可的標準章程規範來進行。

一般實驗方法： 1.　敗血症的誘發(induction of sepsis)：

在下面的實施例中，BALB/c小鼠是依據下面所述的方式藉由脂多醣(lipopolysaccharides,LPS)的注射或盲腸結紮穿刺術(cecal ligation and puncture,CLP)而被誘發敗血症：

(a)　LPS-誘發的敗血症(LPS-induced sepsis)：

將LPS(Sigma-Aldrich)腹膜內注射(intraperitoneal injection)(劑量為30 mg/kg)至小鼠體內，而使得小鼠被誘發敗血症。

(b)　盲腸結紮穿刺術(CLP)-誘發的敗血症[cecal ligation and puncture(CLP)-induced sepsis]：

有關於小鼠的盲腸結紮穿刺術是參考S. Hoferet al. (2009),Crit. Care. ,13:R11當中所述方法來進行。簡言之，將克他明(ketamine)(Ketanest,Pfizer Pharma,Karlsruhe,Germany)(劑量為100 mg/kg)肌肉內注射(intramuscular injection)至小鼠體內俾以麻醉小鼠。接著，在牠們的腹部(abdomen)執行一長度約為1至1.5公分的中線剖腹術(midline laparotomy)，而使得盲腸(caecum)被顯露出來。

之後，在一距離該盲腸頂端的6 mm之處將該盲腸進行結紮(ligation)，繼而使用一G23注射針進行一個單一穿刺(single puncture)，藉此而使得一小量的糞便(stool)從該盲腸的穿刺處被排出(expelled)以確保盲腸的開放性(patency)。然後，將該經穿刺的盲腸置放回腹腔內，並使用一5/O聚丙烯手術縫線(5/O prolene thread)(Ethicon,Norderstedt,Germany)來縫合傷口。在整個手術的過程中，沒有使用任何抗生素(antibiotics)。

2.　腹水(peritoneal fluid)的收集：

將戊巴比妥(pentobarbital)(SCI Pharmtech,Taiwan)腹膜內注射(劑量為75 mg/kg)至小鼠體內俾以麻醉小鼠，接著使用手術刀(surgical knife)將該小鼠的皮膚層(skin)切開而使得在皮膚層下方的腹膜(peritoneum)被顯露出來，繼而將3 mL的生理鹽水(saline)腹膜內注射至該小鼠體內。之後，溫合地捏揉(knead)該小鼠的腹腔以混合腹腔內的流體，繼而藉由腹部穿刺(abdominal puncture)並使用一注射器(syringe)[搭配一個22號的注射針(needle)]來收集該小鼠的腹水。

3.　血清樣品的製備：

藉由心臟穿刺(cardiac puncture)並使用一經苷素潤洗的注射器(heparin-rinsed syringe)[搭配一個23號的注射針(needle)]來採集小鼠的血液，繼而在4℃下以3,200 rpm予以離心歷時10分鐘，由此所得到的血清樣品被冷凍保存於-80℃下備用。

4.　統計學分析(Statistical analysis)：

在下面實施例1與2中所得到的實驗數據是藉由卡本-麥爾估計量(Kaplan-Meier estimator)來進行分析，藉此而得到各組小鼠的存活曲線(survival curve)，接著使用對數等級檢定(log-rank test)來分析各組小鼠的存活曲線之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p ＜0.05，這表示有統計顯著性(statistical significance)。

在下面實施例3至5中所得到的實驗數據是採用Sigma Plot 9.0軟體(Systat Software Inc.,Point Richmond,CA)來進行統計分析。實驗數據是以“平均值(mean)±標準偏差(standard deviation,SD)”來表示。所有的數據是藉由無母數統計方法(nonparametric statistical methods)[亦即，曼-懷特尼U檢定(Mann-Whitney U test)或克拉斯卡-瓦立斯ANOVA檢定(Kruskal-Wallis ANOVA test)]，繼之以鄧恩氏檢定(Dunn’s test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p ＜0.05，這表示有統計顯著性。

實施例1　2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)對於帶有敗血症的小鼠的存活率的影響：

在本實施例中，申請人選用帶有LPS-誘發的敗血症以及CLP-誘發的敗血症的小鼠來進行活體內動物實驗，並且在敗血症被誘發之後的第3小時之時進行2-甲氧基雌二醇(2ME2)的腹膜內注射，俾以評估2-甲氧基雌二醇(2ME2)對於敗血症的治療效用。

實驗方法：

首先，將BALB/c小鼠隨機分成2個病理對照組(pathological control group)(亦即病理對照組1以及2)以及2個實驗組(亦即，LPS組以及CLP組)(每組n=6)，其中LPS組以及病理對照組1的小鼠是依照上面“一般實驗方法”的「1.敗血症的誘發」的第(a)點當中所述的方法來誘發敗血症，而CLP組以及病理對照組2的小鼠則是依照上面“一般實驗方法”的「1.敗血症的誘發」的第(B)點當中所述的方法來誘發敗血症。

在敗血症被誘發之後的第3小時之時，病理對照組1以及2的小鼠分別被腹膜內注射(intraperitoneally injected)以載劑(vehicle)[含有0.1%二甲亞(dimethylsulfoxide,DMSO)的磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)，劑量為25 mL/kg]，而LPS組以及CLP組的小鼠分別被腹膜內注射以2-甲氧基雌二醇(2ME2)(配於載劑中，劑量為5 mg/kg)。

各組小鼠接而被飼養歷時45小時，並於敗血症被誘發之後的第0、6、12、18、24、30、36、42以及48小時之時分別計算各組小鼠的存活率(survival rate)。有關各組小鼠的存活率是參照下面的公式(1)而被計算出：

公式(1)：A=(B/6)×100%

其中：A=存活率(%)

B=各組小鼠在敗血症被誘發之後的各個時間點的存活數目

所得到的實驗數據是依照上面“一般實驗方法”的「4.統計學分析」當中所述方法來進行分析。

結果：

圖1A以及1B分別顯示帶有LPS-誘發的敗血症以及CLP-誘發的敗血症的小鼠在2-甲氧基雌二醇(2ME2)的腹膜內注射之後，牠們的存活率隨著時間的變化。

從圖1A以及1B可見，當被誘發敗血症的小鼠被腹膜內注射以2-甲氧基雌二醇(2ME2)之後，牠們的存活率被顯著地提高。特別地，在敗血症被誘發之後的第36小時之時，病理對照組1與2的小鼠的存活率皆為零，而LPS組以及CLP組的小鼠的存活率至少都有50%。這個實驗結果顯示：2-甲氧基雌二醇可以明顯地提高被誘發敗血症的小鼠的存活率。

實施例2　2-甲氧基雌二醇(2ME2)的劑量對於帶有LPS-誘發的敗血症的小鼠的存活率的影響：

在本實施例中，申請人選用帶有LPS-誘發的敗血症的小鼠來進行活體內動物實驗，並且在敗血症被誘發之時立即投藥以不同劑量的2-甲氧基雌二醇(2ME2)，俾以評估2-甲氧基雌二醇(2ME2)的劑量對於敗血症的治療效用的影響。

實驗方法：

首先，將BALB/c小鼠隨機分成1個病理對照組以及4個實驗組(亦即，實驗組1、2、3以及4)(每組n=6)，繼而依照上面“一般實驗方法”的「1.敗血症的誘發」的第(A)點當中所述的方法來誘發敗血症。

當敗血症被誘發時，病理對照組的小鼠立即被腹膜內注射以載劑(含有0.1% DMSO的PBS，劑量為25 mL/kg)，而實驗組1至4的小鼠分別被腹膜內注射以不同劑量(亦即1、2、5以及10 mg/kg)的2-甲氧基雌二醇(2ME2)(配於載劑中)。

各組小鼠接而被飼養歷時2天，並於敗血症被誘發之後的第0、6、12、18、24、30、36、42以及48小時之時分別計算各組小鼠的存活率。有關各組小鼠的存活率是參照上面實施例1當中所示的公式(1)而被計算出。所得到的實驗數據是依照上面“一般實驗方法”的「4.統計學分析」當中所述方法來進行分析。

結果：

圖2顯示當被誘發敗血症的小鼠立即被腹膜內注射以不同劑量(亦即1、2、5以及10 mg/kg)的2-甲氧基雌二醇時，牠們的存活率隨著時間的變化。從圖2可見，與病理對照組相較之下，實驗組1至4的小鼠的存活率都有顯著的提高，並且會隨著2-甲氧基雌二醇的投藥劑量的增加而更趨於明顯。這個實驗結果顯示：2-甲氧基雌二醇可以明顯地提高被誘發敗血症的小鼠的存活率並且呈一劑量-依賴性(dose-dependently)的現象。

實施例3　2-甲氧基雌二醇(2ME2)對於敗血症所導致的細胞損傷(cell injury)以及器官功能障礙(organ dysfunction)的影響：

在本實施例中，申請人選用C-反應蛋白(C-Reactive Protein,CRP)、血清麩胺酸草乙酸轉胺酶(serum glutamic oxaloacetic transaminase,SGOT)、血清麩胺酸丙酮酸轉胺酶(serum glutamic pyruvic transaminase,SGPT)、血液尿素氮(blood urinary nitrogen,BUN)以及肌酸肝(creatinine)來作為檢視小鼠器官功能的指標，並且對肺臟(lung)以及肝臟(liver)進行組織學檢驗(histological examination)，俾以評估2-甲氧基雌二醇對於敗血症所導致的細胞損傷與器官功能障礙的影響。

實驗方法：

首先，將BALB/c小鼠隨機分成1個正常對照組(normal control)、1個病理對照組以及1個實驗組(每組n=6)，其中正常對照組的小鼠被腹膜內注射以PBS(pH 7.4)(劑量為25 mL/kg)，而其它各組的小鼠皆依照上面“一般實驗方法”的「1.敗血症的誘發」的第(A)點當中所述的方法來誘發敗血症。當敗血症被誘發時，病理對照組的小鼠立即被腹膜內注射以載劑(含有0.1% DMSO的PBS，劑量為25 mL/kg)，而實驗組的小鼠被腹膜內注射以2-甲氧基雌二醇(2ME2)(配於載劑中，劑量為5 mg/kg)。至於正常對照組的小鼠則沒有接受任何處理。

在敗血症被誘發之後的第12小時之時，各組小鼠藉由腹腔內注射以戊巴比妥(30 mg/kg)而被麻醉，繼而進行頸椎脫位術(cervical dislocation)來予以犧牲，接著依據上面“一般實驗方法”的「3.血清樣品的製備」當中所述的方法來製備各組小鼠的血清樣品以供進行下面第A項的實驗。另外，取出各組小鼠的肺臟(lung)以及肝臟(liver)來進行下面第B項的實驗。

A、血清中的C-反應蛋白(CRP)、SGOT、SGPT、尿素氮(BUN)以及肌酸酐的濃度測定：

有關各組小鼠的血清中的CRP、SGOT、SGPT、尿素氮以及肌酸酐的濃度測定是委託台灣小鼠診所(Taiwan Mouse Clinic)依據標準操作程序來代為進行。所得到的實驗數據是依照上面“一般實驗方法”的「4.統計學分析」當中所述方法來進行分析。

B、組織學檢驗(histological examination)：

將上面所取得的各組小鼠的肺臟以及肝臟分別以10%三聚甲醛(paraformaldehyde)來進行固定處理(fixation)歷時至少12小時，繼而進行乙醇脫水處理(ethanol dehydrating)。之後，將經脫水的組織樣品以二甲苯(xylene)予以洗淨(clearing)，繼而以石蠟(paraffin)予以包埋(embedding)，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為4 μm的組織切片(tissue sections)。

在脫蠟(dewaxing)之後，使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來對該組織切片進行染色。經染色的組織切片是藉由使用光學顯微鏡(OLYMPUS DP21)並在一為400倍的放大倍率下來進行觀察，繼而使用數位相機(OLYMPUS Microscope Digital Came DP21)來進行拍照。

結果：

下面表1顯示在敗血症被誘發之後的第12小時之時，於各組小鼠的血清中所測得的CRP、SGOT、SGPT、尿素氮以及肌酸酐的濃度。從表1可見，在敗血症被誘發之後的第12小時之時，與正常對照組的小鼠相較之下，病理對照組小鼠的血清中的CRP、SGOT、SGPT、尿素氮以及肌酸酐的濃度均顯著地被增高，這表示LPS會誘發小鼠產生敗血症並造成細胞損傷以及器官功能障礙。而與病理對照組的小鼠相較之下，實驗組小鼠的血清中的CRP、SGOT、SGPT、尿素氮以及肌酸酐的濃度則顯著地被降低並且展現統計顯著性(p <0.05)。這個結果顯示：2-甲氧基雌二醇(2ME2)可以有效地改善敗血症所導致的細胞損傷以及器官功能障礙。

圖3顯示在敗血症被誘發之後的第12小時之時，所取得的各組小鼠的肝臟與肺臟的組織藉由蘇木精-伊紅染色而被觀察到的結果。從圖3可見，與正常對照組相較之下，病理對照組小鼠的肝臟與肺臟組織切片會出現大量的嗜中性球浸潤(neutrophil infiltration)以及組織壞死(tissue necrosis)的現象，這表示LPS會誘發小鼠產生發炎反應以及敗血症並導致組織壞死。另外，與病理對照組相較之下，實驗組小鼠的肝臟與肺臟組織切片當中所出現的嗜中性球數目以及壞死性組織(necrotic tissue)則顯著地被減少。這個實驗結果顯示：2-甲氧基雌二醇(2ME2)具有改善敗血症所造成的嗜中性球浸潤以及組織壞死的現象。

實施例4　2-甲氧基雌二醇(2ME2)對於帶有LPS-誘發的敗血症的小鼠之血清(serum)與腹水(peritoneal fluid) 中的前發炎性細胞激素(proinflammatory cytokines)以及一氧化氮(NO)的表現量的影響：

在本實施例中，帶有敗血症的小鼠的血清與腹水中的前發炎性細胞激素的表現量是以IL-1β、IL-6以及TNF-α的濃度來作為評估指標，而一氧化氮(NO)的表現量是以亞硝酸鹽(nitrite)的濃度來作為評估指標，俾以瞭解2-甲氧基雌二醇對於敗血症所導致的發炎反應的影響。

實驗方法：

首先，將BALB/c小鼠隨機分成1個病理對照組以及1個實驗組(每組n=6)，繼而依照上面“一般實驗方法”的「1.敗血症的誘發」的第(A)點當中所述的方法來誘發敗血症。當敗血症被誘發時，病理對照組的小鼠立即被腹膜內注射以載劑(含有0.1% DMSO的PBS，劑量為25 mL/kg)，而實驗組的小鼠被腹膜內注射以2-甲氧基雌二醇(2ME2)(配於載劑中，劑量為5 mg/kg)。

在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時，分別依照上面“一般實驗方法”的「2.腹水的收集」以及「3.血清樣品的製備」當中所述的方法來製備各組小鼠的腹水以及血清樣品以供進行下面第A項與第B項的實驗。

A、IL-1β、IL-6以及TNF-α的濃度測定：

有關各組小鼠的血清與腹水樣品中之IL-1β、IL-6以及TNF-α的濃度測定分別是使用小鼠IL-1β免疫分析套組(mouse IL-1β immunoassay kit,R&D systems,Cat. No. SMLB00B)、小鼠IL-6免疫分析套組(mouse IL-6 immunoassay kit,R&D systems,Cat. No. SM6000B)以及小鼠TNF-α免疫分析套組(mouse TNF-α immunoassay kit,R&D systems,Cat. No. SMTA00B)並依照廠商所提供的操作指南來進行酵素結合免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試驗，繼而以一ELISA讀取儀(ELISA reader)在波長490 nm下來量測吸光值(OD₄₉₀ )。

各組針對IL-1β、IL-6以及TNF-α進行ELISA試驗所測得的OD₄₉₀ 吸光值分別根據預先以具有不同已知濃度的IL-1β、IL-6或TNF-α標準品相對於它們自身的吸光值所作出的相關曲線(correlation curve)而被換算成濃度(pg/mL)來表示。所得到的實驗數據是依照上面“一般實驗方法”的「4.統計學分析」當中所述方法來進行分析。

B、一氧化氮(NO)的含量測定：

各組小鼠的血清與腹水中之一氧化氮的含量是以亞硝酸鹽的濃度來作為評估指標，而有關於亞硝酸鹽的濃度測定大體上是參照C.H. Hsinget al .(2011),PLos one ,6:e17598當中所述的方法來進行。簡言之，對上面所得到之各組小鼠的腹水以及血清樣品分別取20 μL，並加入至96-井微量培養盤(96-well microplate)的各井中。接著，對各井分別加入100 μL的革利士試劑(Griess reagent)[含有1%胺苯璜醯胺(sulfanilamide)、0.1% N-萘基乙烯二胺二氯化氫(N-naphthylethylenediamine dihydrochloride)以及2.5% H₃ PO₄ ]並予以混合均勻，繼而將所得到的混合物置於室溫下進行反應歷時30分鐘。

之後，以一96-井微量培養盤讀取儀(96-well microplate reader)(Spectra MAX 340PC)來讀取各井在波長540 nm下的吸光值(OD₅₄₀ )。由此所得到的OD₅₄₀ 數值分別根據預先以具有不同已知濃度的亞硝酸鈉(sodium nitrite,NaNO₂ )相對於它們自身的OD₅₄₀ 數值所作出的一標準曲線而被換算成亞硝酸鹽濃度(μM)來表示。若所測得的亞硝酸鹽濃度越高，代表一氧化氮的含量越高。

所得到的實驗數據是依照上面“一般實驗方法”的「4.統計學分析」當中所述方法來進行分析。

結果：

圖4顯示在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時，各組小鼠的血清中之IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度。而圖5顯示在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時，各組小鼠的腹水中之IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度。

從圖4與圖5可見，在敗血症被誘發之後的第12小時之時，病理對照組小鼠的血清與腹水中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度皆顯著地被增高。而與病理對照組小鼠相較之下，實驗組小鼠的血清以及腹水中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度則顯著地被降低。這個實驗結果顯示：2-甲氧基雌二醇(2ME2)能夠藉由降低前發炎性細胞激素(包括IL-1β、IL-6、TNF-α)的表現量以及減少NO的生成來改善敗血症所導致的發炎反應。

實施例5　2-甲氧基雌二醇(2ME2)對於帶有LPS-誘發的敗血 症的小鼠的腹膜巨噬細胞(peritoneal macrophage)的前發炎性細胞激素以及一氧化氮(NO)的表現量的影響：

在本實施例中，得自於帶有敗血症的小鼠的腹膜巨噬細胞的培養上澄液被拿來進行IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽濃度的量測，俾以評估2-甲氧基雌二醇對於腹膜巨噬細胞的活性以及敗血症所導致的發炎反應的影響。

實驗方法： A、腹膜巨噬細胞的分離：

首先，將BALB/c小鼠隨機分成1個正常對照組、1個病理對照組以及1個實驗組(每組n=6)，其中正常對照組的小鼠被腹膜內注射以PBS(pH 7.4)(劑量為25 mL/kg)，而其它各組的小鼠皆依照上面“一般實驗方法”的「1.敗血症的誘發」的第(A)點當中所述的方法來誘發敗血症。當敗血症被誘發時，病理對照組的小鼠立即被腹膜內注射以載劑(含有0.1% DMSO的PBS，劑量為25 mL/kg)，而實驗組的小鼠被腹膜內注射以2-甲氧基雌二醇(2ME2)(配於載劑中，劑量為5 mg/kg)。至於正常對照組的小鼠則沒有接受任何處理。

在敗血症被誘發之後的第6小時之時，將戊巴比妥腹膜內注射(劑量為30 mg/kg)至小鼠體內俾以麻醉小鼠，接著使用手術刀將皮膚層切開而使得在皮膚層下方的腹膜被顯露出來。之後，將3 mL的PBS腹膜內注射至該小鼠體內以進行腹膜灌洗(peritoneal lavage)，繼而溫合地按摩該小鼠的腹腔，而使得腹腔內的細胞被充分地散浮於PBS中，然後使用一注射器(搭配一個23號的注射針)來收集腹腔內的細胞懸浮液。所得到的細胞懸浮液以1000 rpm來進行離心歷時10分鐘，接著移除上澄液並以杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Gibco,USA)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、2 mM L-麩醯胺酸(L-glutamine)、15 mM HEPES、100 IU/mL盤尼西林(penicillin)以及100 μg/mL鏈黴素(streptomycin)]來充分散浮細胞沉澱物(cell pellet)。然後，將所形成的細胞懸浮液加入至一培養皿(petri dish)內並在培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時1小時，藉此而使得該細胞懸浮液中的腹膜巨噬細胞可貼附於該培養皿的底部。接著，移除細胞培養基，並收取貼附於該培養皿底部的腹膜巨噬細胞。

之後，將所得到的各組小鼠的腹膜巨噬細胞分別加入至含有1 mL的DMEM的6-井培養盤(6-well plate)(2x10⁶ 細胞/井)中，並在培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時12小時。接著，收取細胞培養物，繼而在4℃下以1000 rpm進行離心歷時10分鐘，然後收取培養上澄液(culture supernatant)並將之拿來進行下面第B項與第C項的實驗。

B、IL-1β、IL-6以及TNF-α的濃度測定：

培養上澄液中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的濃度是參照上面實施例4的「A. IL-1β、IL-6以及TNF-α的濃度測定」當中所述的方法來進行測定。

C、一氧化氮(NO)的含量測定：

培養上澄液中的一氧化氮的含量是參照上面實施例4的「B.一氧化氮(NO)的含量測定」當中所述的方法來進行測定。

結果：

圖6顯示從各組小鼠的腹腔內所分離出的腹膜巨噬細胞在培養歷時12小時後，所得到的培養上澄液中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度。從圖6可見，與正常對照組小鼠相較之下，病理對照組小鼠的腹膜巨噬細胞的培養上澄液中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度皆顯著地被增高。而與病理對照組小鼠相較之下，實驗組小鼠的腹膜巨噬細胞的培養上澄液中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度則顯著地被降低。這個實驗結果顯示：2-甲氧基雌二醇(2ME2)可以藉由抑制腹膜巨噬細胞的活性來降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表現量以及減少NO的生成，進而改善敗血症所導致的發炎反應，因此2-甲氧基雌二醇(2ME2)被預期可供用於治療敗血症。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

圖1A以及1B分別顯示本案實施例1當中的各組小鼠的存活率隨著時間的變化，其中“＊”表示：當LPS組與病理對照組1比較，p ＜0.05；以及“#”表示：當CLP組與病理對照組2比較，p ＜0.05；

圖2顯示本案實施例2當中的各組小鼠的存活率隨著時間的變化，其中“＊”表示：當與病理對照組相比較，p ＜0.05；

圖3顯示在敗血症被誘發之後的第12小時之時，從本案實施例3當中之各組小鼠的肝臟與肺臟中所取得的組織藉由蘇木精-伊紅染色而被觀察到的結果，其中黑色箭頭標示之處代表嗜中性球的位置；以及紅色箭頭標示之處代表壞死性組織的位置；

圖4顯示本案實施例4當中的各組小鼠在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時，牠們的血清中之IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度，其中“＊”表示：當病理對照組在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時作比較，p ＜0.05；以及“#”表示：在敗血症被誘發之後的第12小時之時，當實驗組與病理對照組比較，p ＜0.05；

圖5顯示本案實施例4當中的各組小鼠在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時，牠們的腹水中之IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度，其中“＊”表示：當病理對照組在敗血症被誘發之後的第0小時與第12小時之時作比較，p ＜0.05；以及“#”表示：在敗血症被誘發之後的第12小時之時，當實驗組與病理對照組比較，p ＜0.05；以及

圖6顯示從本案實施例5當中的各組小鼠的腹腔內所分離出的腹膜巨噬細胞在培養歷時12小時後，所得到的培養上澄液中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及亞硝酸鹽的濃度，其中“＊”表示：當病理對照組與正常對照組比較，p ＜0.05；以及“#”表示：當實驗組與病理對照組比較，p ＜0.05。

Claims (4)

1. 2-甲氧基雌二醇供應用於製備一用來治療敗血症之醫藥品的用途。
2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
3. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品是呈一供腹膜內注射的劑型。
4. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。