TWI419686B - 左旋正丁基苯酞的預防和治療癡呆的用途 - Google Patents

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左旋正丁基苯酞的預防和治療癡呆的用途

本發明係關於左旋正丁基苯酞及含有左旋正丁基苯酞的組合物之治療癡呆之用途。

老年性癡呆或稱阿茲海默病(Alzheimer's disease, AD)係一種以臨床及病理爲特徵的進行性退行性神經病。其臨床主要表現：爲記憶力(特別是近記憶力)減退，認知能力低下，思維遲鈍，空間定向障礙等。病理表現爲β-澱粉樣肽(Aβ)及其它分子、神經元及非神經細胞結成一起在細胞外沈積成老年斑以及細胞內神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)的形成。我國AD患病率在0.2%~5.98%之間，該病多發生在60歲以上的人群。隨年齡提高而增多，據估計我國現有AD患者在360萬人以上。在北京地區調查癡呆發病率發現血管性癡呆(VD)多於AD。(張明園等：『癡呆及阿茲海默病的發病率』，『中華精神科雜誌』1998;31(4):195-196)由於我國己進入老齡化時期，癡呆患者逐年增多。並且，在老年人群中腦血管病發生率很高，據估計中風後癡呆之發病率爲約9~30.8%，長期腦供血不足亦係導致血管性癡呆之重要原因。總之，癡呆患者不僅對本人極爲痛苦，且對家庭及社會之負擔很大，因此尋找有效藥物以延緩、控制AD及VD病情之發展極爲重要。

阿茲海默氏病(AD)係老年人認知功能進行性減退的最主要原因。其主要病理改變係形成以β-澱粉樣肽(β-amyloid, Aβ)沈積爲核心的老年斑及神經纖維繞結。研究表明，腦中膽鹼能系統與人的學習記憶功能相關。在AD病人的腦中ACh水平下降，催化合成ACh的膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)之活性低下，其降低程度與認知功能減退密切相關。此外，氧化應激及炎症反應參與AD的病因亦愈來愈受到重視。Aβ係由39-43個胺基酸組成，爲β前體蛋白(APP)的降解產物。Aβ沈積的範圍與神經損傷及認知功能缺損密切相關。先前研究證實：持續側腦室灌注(i.c.v.)Aβ (1-40)或Aβ (1-42)能引起大鼠學習及記憶損傷(Nitts.等人，β-Amyloid protein-induced Alzheimer's disease animal model. Neurosci. Lett. 1994;170:63-66)，暗示腦中Aβ聚集所造成之記憶損傷可模擬AD病人的症狀。經研究，左旋正丁基苯酞(L-NBP)能明顯改善線粒體功能，改善腦微循環及能量代謝，抑制神經細胞凋亡，抗氧化損傷，抑制炎症反應，抗血栓，降低細胞內鈣，抑制穀胺酸的釋放等腦保護作用。爲此，可選用持續側腦室灌注(i.c.v.)Aβ (1-40)作爲模型。用Morris水迷宮及生化方法檢測所試化合物對動物近記憶及空間位置記憶功能及對氧化損傷的影響。

血管性癡呆(VD)係由腦血管疾病引起腦功能障礙而產生的癡呆，多數伴有多發性較大的腦動脈梗塞或腔隙性腦梗塞或腦低灌。腦血流降低程度與癡呆嚴重性相關(Roman等人，Vascular dementia: diagnostic criteria for research studies. Neurology 1993;43:250-260)。慢性進行性腦供血不足，使其對氧及葡萄糖及其他必需的代謝物質利用率下 降，其結果引起氧化損傷，線粒體功能及神經細胞的生物合成受損，突觸傳遞功能受阻，最後導致神經病理學改變，即發生神經退行性變化(Beal等人，Do defects in mitochondrial metabolism underlie the pathology of neurodegenerative disease Trends Neurosci. 1993;16:125-131)。VD病人主要表現爲近記憶及空間知覺進行性衰退及認知功能缺損。血管性癡呆的發生及發展與膽鹼能神經系統之信息傳遞密切相關，亦與神經細胞之氧化損傷相關，在病理上VD病人皮質下白質稀疏。大量研究表明，ACh被認爲係學習及記憶的重要神經遞質。AD病人的膽鹼能通路功能降低，表現爲神經遞質ACh水平下降，此係其記憶功能受損及認知缺損的重要原因之一(Toghi等人，Cerebrospinal fluid acetylcholine and choline in vascular dementia of Binswanger and multiple small infarct types as compared with Alzheimer-type dementia. J.Neural Transm. 1996; 103:1211-1220)。所試之化合物對ChAT活性有提高作用，表明其能使膽鹼能神經ACh水平增加，有利於改善記憶功能。

近十餘年來，許多實驗室用Morris水迷宮檢測大鼠近記憶及空間位置的記憶力，可敏銳地反映動物中樞神經系統受損及其功能變化(Richard Morris. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat J.Neurosci Methods. 1984;11:47-60)，並觀察藥物對該模型之作用。由於癡呆病人主要表現爲認知缺損，特別是對近記憶及空間知覺的進行性損傷，因此該模型不失爲一個較 理想的觀察藥物對早老性癡呆病(AD)及VD是否具有治療作用的模型。而用大鼠雙側頸總動脈阻斷(2-VO)模型持續低灌可模擬臨床上供血不足引起的血管性癡呆，因此使用本法可反映藥物治療癡呆的作用(Ni.J.W.等人，Neuronal damage and decrease of central acetylcholine level following permanent occlusion bilateral common carotid arteries in rats. Brain Res. 1995; 673:290-296)。

1988年於澍仁報導的芹菜甲素(3-正丁基苯酞，Ag-1)係合成之消旋體3-正丁基苯酞，其對馬桑內酯造成大鼠學習及記憶障礙具有改善作用，對大鼠海馬細胞具有保護作用(於澍仁等：『芹菜甲素增強學習記憶的作用』，『中國藥理學報』1985, 9(5):385-388)。此後，有報導認爲芹菜提取液對中老年小鼠學習記憶有改善作用(李靜等『芹菜提取液對中老年小鼠學習記憶的影響』，『中草藥』，1996, 27(2):104-105；劉洛生等：『安清益智膠囊的質量標準研究』『山東醫科大學學報』，2001, 39(6):562-564)，但迄今尚未見到有關光學立體異構體-左旋正丁基苯酞(L-NBP)治療老年性癡呆的報導。

爲克服現有技術之不足，本發明提供了如通式(I)所示 之左旋正丁基苯酞(以下簡稱L-NBP )用作抗癡呆的藥物。

本發明所用的左旋正丁基苯酞係經化學合成，先得到消旋正丁基苯酞，後經化學拆分爲左旋光學異構體正丁基苯酞，通過核磁、質譜及紅外等光譜分析，特別是用Hp 5890氣相色譜儀、手性氣相色譜柱(Chiraldex G-TA)進行分析，證明了本品的光學純度及化學純度爲單一光學立體異構體-左旋正丁基苯酞(比旋光度>-66.49∘，光學純度>98%，化學純度>98%)，拆分方法參見中國專利『製備光學活性3-正丁基苯酞的方法』，申請號99109673.8，公開號CN1283621。本品的化學結構式係與食用芹菜及其籽中所含之芹菜甲素結構相同。

本發明使用國際上公認的方法即用Morris水迷宮實驗檢測了動物近記憶及空間定向力。

本發明通過建立永久性阻斷大鼠雙側頸總動脈(2-VO)引起持續低灌模型，用Morris水迷宮法檢測L-NBP對動物近記憶及空間位置功能的影響，用生化方法檢測了L-NBP對氧化損傷的某些指標及對膽鹼能神經神經系統的影響。鑒於腦低灌引起行爲改變，伴隨著腦膠質細胞激活，白質變稀疏。因此本研究採用病理學及免疫組織化學的方法，用膠質細胞纖維酸性蛋白(GFAP)及K-B染色(反映神經元髓鞘之病理變化)作爲指標，觀察了藥物對其之影響。

本發明的實驗顯示對於腦供血不足大鼠的近記憶及空間位置功能障礙，本發明的左旋正丁基苯酞具有明顯的改善作用。水迷宮試驗的學習及保留實驗經常用於評價低灌注 大鼠的空間記憶能力。實驗結果顯示，在水迷宮實驗中，在第一天訓練中，各組間潛伏期無顯著差異，表明所有動物在第一天對該項實驗操作並不熟悉。經過5天的訓練，假手術組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期(12.6±3.34秒)明顯縮短，表明動物經過訓練己具有一定的記憶力及空間定向力。而溶劑對照組的搜索策略無明顯轉變，仍爲邊緣式及隨機式，潛伏期(47.6±5.88秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P<0.01)。L-NBP10mg/kg組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期(26.85±5.98秒)明顯縮短，與溶劑對照組比較有明顯差異(P<0.001兩因素方差分析)，而與假手術組比較無顯著差異，表明該劑量組對記憶力及空間定向力有明顯改善作用。其它藥物如DL-NBP10 mg/kg, DL-NBP30 mg/kg及D-NBP 30 mg/kg的改善作用均不明顯。

在5天的學習訓練結束後，進行平臺探索實驗，將安全島撤去以測試大鼠是否已形成對安全島的空間記憶。除溶劑對照組外，所有大鼠在目標象限的停留時間都大於25%，表明都已經形成了對安全島之相對位置的記憶。假手術組的停留時間爲17.73±1.19秒，而溶劑組對照組的停留時間(14.40±0.73秒)明顯縮短。通過單因素方差分析統計，兩組間有明顯差異(P<0.05)。L-NBP10 mg/kg組在平臺所在象限的停留時間較溶劑對照組明顯延長(17.62±1.27秒)，兩組間比較有顯著意義(P<0.05)。DL-NBP組(10 mg/kg及30 mg/kg)均無作用。爲了排除動物運動能力對其影響，經測定，各 組間游泳速度無差異。以上表明只有左旋正丁基苯酞對腦供血不足大鼠的近記憶及空間位置功能缺損有明顯作用，而消旋及右旋正丁基苯酞則無作用。

SOD係重要的抗氧化酶，正常對照組皮層組織中SOD的活性爲100.07±3.64(NU/mg protein)；海馬組織中的活性爲57.90±7.41(U/mg protein)。大鼠永久性結紮雙側頸總動脈後，海馬SOD的活性與對照組相比明顯升高(P<0.05)，此可能係一種補償性反應。經L-NBP(10 mg/kg)治療後，該酶活性明顯接近於正常水平(P<0.05)。MDA係爲脂質過氧化的標誌，可反映在體內的脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。在本實驗中，模型組皮層MDA的含量升高了19.9%，與正常對照組相比具有顯著性差異(P<0.001)。經L-NBP(10 mg/kg)治療後，皮層MDA的含量明顯降低了20.7%(P<0.001)。大鼠永久性結紮雙側頸總動脈後，皮層ChAT的活性顯著降低，與正常對照組相比，下降了34.4%(P<0.05)，表明低灌注可致膽鹼能神經功能受損。而L-NBP(10 mg/kg)連續投藥16天後，可使皮層組織中ChAT的活性較模型組提高37.1%，具有顯著性差異(P<0.05)。由該等結果可得出以下結論：L-NBP 10 mg/kg組能明顯改善2-VO動物近記憶及空間位置的記憶障礙，而消旋丁基苯酞及右旋丁基苯酞對改善記憶功能障礙均無效。本發明在2-VO後第10天開始投藥(連續投藥至第35天)，目的在於觀測藥物對腦低灌引起的神經元退行性病變的治療作用，以排除對急性低灌缺血期的影響。

本發明通過病理學及免疫組織化學方面的研究表明L-NBP對血管性癡呆有明顯的治療作用。永久性結紮雙側頸總動脈後，模型組可見皮層及海馬CA1區的神經元明顯減少，細胞皺縮及神經元深染，而L-NBP(10 mg/kg)治療後能明顯改善低灌注誘導的神經元損傷。文獻報導雙側頸總動脈結紮可以誘導腦中膠質細胞活化，並伴有白質稀薄。 白質稀薄按其嚴重程度一般分爲4級：0級，正常；1級，神經纖維錯排；2級，明顯空泡形成；3級，存在有髓鞘的纖維消失。在吾人之實驗中，模型組的視束較正常對照組顯示出明顯的白質稀薄，有大量的空泡出現，L-NBP(10 mg/kg)長期投藥後可顯著改善該情況，視束的空泡明顯減少。免疫組化實驗發現，GFAP-陽性的星形膠質細胞在正常對照組海馬、尾核、胼胝體等部位很少檢測到，但雙側頸總動脈結紮4週後，許多GFAP-陽性反應的星形膠質細胞及小膠質細胞出現。經L-NBP(10 mg/kg)治療後，GFAP-陽性的膠質細胞顯著減少(見圖3,4)。總之，L-NBP對ChAT活性具有提高作用，表明能使膽鹼能神經ACh水平增加，有利於改善記憶功能。此外L-NBP能明顯抑制氧化損傷，表明L-NBP能降低神經細胞的損傷。由2-VO引起的腦低灌之病理特徵爲白質稀疏、空泡及膠質細胞增多(Narri.等人，Chronic cerebral hypoperfusion-induced neuropathological changes in rats. Jpn.J.Psychopharmacol. 1998; 18:181-188)，而L-NBP均能改善該等病理改變。以上該等作用機製對L-NBP改善2-VO大鼠引起的記憶障礙提供了依據。依據以上結果 得知，L-NBP對血管性癡呆具有明顯的治療作用。

本發明的實驗結果顯示，對於β-澱粉樣肽(1-40)引起的大鼠記憶及空間定向力障礙，本發明的左旋正丁基苯酞具有明顯的改善作用。在大鼠腦室內持續灌流Aβ後的水迷宮實驗中，第一天訓練中，各組間潛伏期沒有顯著性差異。經過5天的訓練，假手術組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期(13.02±2.77秒)明顯縮短。而模型組的搜索策略沒有明顯的轉變，仍爲邊緣式及隨機式，潛伏期(30.18±4.81秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P<0.01)。經L-NBP治療後，大鼠在水迷宮試驗中的潛伏期明顯縮短，其中L-NBP10 mg/kg組及30 mg/kg組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期分別爲27.28±6.42秒及25.88±5.51秒，與模型組比較有明顯差異(P<0.05兩因素方差分析)，而與假手術組比較無顯著差異，表明經1-NBP治療的大鼠已接近正常水平，見圖4。在工作記憶測驗中，第一次實驗及第2-5次實驗的潛伏期見圖5 A、B。雖然在第一次實驗中，各組的潛伏期沒有顯著性差異，但在以後4次實驗中，假手術組的潛伏期爲9.15±0.91秒，模型組的潛伏期爲14.05±1.88秒，後者潛伏期明顯延長，二者有顯著性差異(P<0.01)。L-NBP組可劑量依賴性地顯著改善工作記憶能力(P<0.01)。

L-NBP還能增加GSH-Px活性及降低MDA的含量。GSH-Px係重要的抗氧化酶，在吾人的實驗中，假手術組皮層組織中GSH-PX的活性爲15.86±0.91(U/mg protein)；海馬組織中 的活性爲16.19±1.19(U/mg protein)。大鼠Aβ (1-40)持續灌流後，GSH-Px的活性與假手術組相比在皮層及海馬分別降低了29.5%及42.4%，具有顯著性差異(P<0.01及P<0.001)。經L-NBP治療後，30 mg/kg組對該酶活性明顯升高(P<0.01)，L-NBP(10 mg/kg)亦具有升高該酶之活性的作用，但沒有統計學意義。MDA係脂質過氧化的標誌，反映體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。在本實驗中，大鼠Aβ (1-40)持續灌流後皮層及海馬MDA的含量分別升高了25.7%及23.6%，與假手術組相比具有顯著性差異(P<0.05及P<0.01)。經L-NBP治療後，皮層及海馬MDA的含量明顯降低，10 mg/kg組分別降低了28.4%及24.3%(P<0.05及P<0.01)，30 mg/kg的作用弱於10 mg/kg組，但與Aβ (1-40)模型組相比，仍具有顯著性差異(P<0.05)。

本發明的實驗可以得出如下結論：大鼠持續側腦室灌流Aβ (1-40)引起的記憶障礙係公認的觀測藥物對AD治療作用的模型。由以上結果可見，L-NBP不僅對2-VO導致供血不足引起血管性癡呆的模型有明顯作用，且對大鼠持續側腦室灌流Aβ (1-40)引起的近記憶及空間位置的記憶障礙亦有明顯改善作用。此表明L-NBP對不同原因引起的近記憶及空間位置記憶障礙均具有明顯改善作用。此外，L-NBP有阻斷氧化損傷之作用(提高GSH-Px活性及降低MDA含量)，結合其明顯的腦保護作用，暗示L-NBP有治療老年性癡呆的作用。

總而言之，本發明用Morris水迷宮檢測大鼠近記憶及空 間位置的記憶力，用大鼠2-VO模型持續低灌以模擬臨床上供血不足引起的血管性癡呆，因此本法完全可反映藥物治療癡呆的作用。本發明的實驗結果表明L-NBP 10 mg/kg組能明顯改善2-VO動物近記憶及空間位置之記憶障礙，而消旋丁基苯酞及右旋丁基苯酞對改善記憶功能障礙均無效。ACh被認爲係學習及記憶的重要神經遞質。AD病人之膽鹼能通路功能降低，表現爲神經遞質ACh水平下降，此係其記憶功能受損及認知缺損之重要原因之一。而L-NBP對ChAT活性具有提高作用，表明能使膽鹼能神經ACh水平增加，有利於改善記憶功能。L-NBP能明顯抑制氧化損傷，表明L-NBP能降低神經細胞的損傷。由2-VO引起之腦低灌之病理特徵爲白質稀疏、空泡及膠質細胞增多，而L-NBP均能改善該等病理改變。因此，本發明之如通式(I)所示之化合物左旋正丁基苯酞對血管性癡呆具有預防及治療作用。

持續的側腦室灌注Aβ (1-40)引起大鼠學習及記憶損傷可模擬早老性癡呆病人之症狀。用Morris水迷宮檢測大鼠近記憶及空間位置之記憶功能。L-NBP對近記憶及空間位置記憶障礙均有明顯改善作用，而D-NBP及DL-NBP則無作用。GSH-Px係重要的抗氧化酶；MDA反映體內脂質過氧化之程度，間接地反映出腦細胞損傷之程度。L-NBP能提高GSH-Px活性及降低MDA含量的作用，表明L-NBP能阻斷氧化損傷，具有保護腦損傷之作用，而D-NBP及DL-NBP則無作用。因此，本發明之如通式(I)所示之化合物左旋正丁基 苯酞對早老性癡呆具有預防及治療作用。總之，左旋正丁基苯酞具有預防及治療老年性癡呆作用，而消旋丁基苯酞及右旋丁基苯酞均無作用。

因此本發明另外係關於含有作爲活性成份之本發明化合物及習知醫藥賦形劑或佐劑的醫藥組合物。通常本發明之醫藥組合物含有0.1-95重量%之本發明化合物。

本發明化合物之醫藥組合物可依據此項技術中已知之方法製備。用於此目的時，(若需要)可將本發明化合物與一種或多種固體或液體醫藥賦形劑及/或佐劑組合，製成可作爲人藥或獸藥使用之適當的施用形式或劑量形式。

本發明化合物或含其之醫藥組合物可以單位劑量形式投藥，投藥途徑可爲經腸道方式或非經腸道方式，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮膚、腹膜或直腸等。

本發明化合物或含其之醫藥組合物的投藥途徑可爲注射投藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射及穴位注射等。

投藥劑型可爲液體劑型、固體劑型。如液體劑型可爲真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、懸浮劑型。其他劑型例如錠劑、膠囊劑、滴丸劑、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍乾粉針劑等。

本發明化合物可製成普通製劑，亦可爲緩釋製劑、控釋製劑、靶向製劑及各種微粒投藥系統。

爲將單位投藥劑型製成錠劑，可廣泛使用此項技術中已知之各種載劑。關於載劑的例子爲(例如)：稀釋劑與吸收 劑，如澱粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、矽酸鋁等；濕潤劑與黏合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如乾燥澱粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻澱粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化矽、玉米澱粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將錠劑進一步製成包衣片，例如，糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片及多層片。

舉例而言，爲將投藥單元製成丸劑，可廣泛使用此項技術中已知之各種載劑。關於載劑的例子爲(例如)：稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；黏合劑，如阿拉伯膠、黃著膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或麵糊等；崩解劑，如瓊脂粉、乾燥澱粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。

舉例而言，爲將投藥單元製成膠囊劑，將有效成分本發明化合物與上述之各種載劑混合，並將由此得到之混合物置於硬的明膠膠囊或軟膠囊中。亦可將有效成分本發明化 合物製成微囊劑，懸浮於水性介質中形成懸浮劑，亦可裝入硬膠囊中或製成注射劑應用。

舉例而言，將本發明化合物製成注射用製劑，如溶液劑、懸浮劑溶液劑、乳劑、凍乾粉針劑，該製劑可含水或非水，可含一種及/或多種藥學上可接受之載劑、稀釋劑、黏合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。例如，稀釋劑可選自：水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化之異硬脂醇、多氧化之異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，爲製備等滲注射液，可向注射用製劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可添加習知之助溶劑、緩衝劑、pH調節劑等。該等輔料係在此項技術中常用。

此外，若需要，亦可向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

爲達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或醫藥組合物可以任何已知之投藥方法投藥。

本發明化合物的醫藥組合物的投藥劑量取決於許多因素，例如，所要預防或治療疾病的性質及嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應，投藥途徑、投藥次數、治療目的，因此本發明的治療劑量可存在大範圍的變化。一般而言，本發明中醫藥成分的使用劑量係熟悉此項技術者已知的。可依據本發明化合物組合物中最終製劑中所含有之實際藥物數量，進行適當的調整，以達到其治療有效量之要求，完成本發明的預防或治療目的。本 發明化合物的每日合適劑量範圍較佳爲0.1-100 mg/kg體重，更佳爲0.1-100 mg/天/人。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(例如二、三或四個)劑量形式投藥，此受限於投藥醫生的臨床經驗以及包括運用其它治療手段的投藥方案。

每一種治療所需總劑量可分多次或按一次劑量投藥。本發明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對症藥物合併使用並調整劑量。

術語 ：L-NBP：左旋正丁基苯酞

2-VO模型：永久性雙側頸總動脈結紮

實施例1左旋正丁基苯酞對老年性癡呆之一種，血管性癡呆的治療作用

材料及方法

試劑及藥品

L-、D-、DL-NBP由本所合成室提供，光學及化學純度>98%，旋光度依次爲-66.49、+66.88及0度。以植物油配製。

儀器

Morris水迷宮自動監控儀，避暗箱由中國醫學科學院藥物研究所儀電室研製

2-VO模型建立

雄性Wistar大鼠，10週齡，體重280克左右，每5只放置1籠中，室溫保持在23℃，自由進食及飲水。大鼠用戊巴比 妥鈉麻醉(40 mg/kg)，雙側頸總動脈暴露，仔細分離頸總動脈的包膜及迷走神經。低灌注模型組使用5-0絲線結紮雙側頸總動脈。假手術組除不結紮雙側頸總動脈外接受相同的手術。術後在傷口上撒少許滅菌結晶磺胺粉，縫合皮膚。手術一個月後進行水迷宮實驗及避暗實驗。

實驗分組及設計

大鼠隨機分成8組，每組10只。1)假手術組：除不結紮雙側頸總動脈，其餘操作均與低灌注組相同；2)溶劑對照組：僅口服植物油；3)DL-NBP 10 mg/kg組；4)DL-NBP 30 mg/kg組；5)L-NBP 10 mg/kg組；6)L-NBP 30 mg/kg組；7)D-NBP 30 mg/kg組；自手術後第10天開始灌服藥物或溶劑。水迷宮實驗在術後第29-33天進行，避暗實驗在第34-35天進行。動物在第36天處死，進行生化測定或病理學檢查。在行爲學實驗中，均在實驗前40分鐘投藥。

水迷宮實驗

Morris水迷宮主要由一金屬圓柱形水池(池高60cm，直徑120cm)及自動顯示、監測、記錄裝置及安全島(直徑10cm的平臺)組成。預先在水池中注入清水，然後加入溶有1000g之新鮮奶粉的水溶液，使池水成爲不透明的乳白色，水面 高出平臺15 mm。由此動物不能通過聽、視及嗅覺到達平臺，以便檢測動物對空間位置的敏銳性。水溫保持23±1℃，水池分爲4個象限(東、南、西、北)，平臺置於西南象限的中心。每只大鼠的游泳活動通過電視儀進行監測，直接連於計算機進行處理分析。水迷宮實驗連續進行5天。每只大鼠1天接受2次訓練尋找平臺，兩次分別自東北象限及西北象限的中點，頭朝向池壁入水，兩次訓練間隔10分鐘。記錄找到平臺的時間(潛伏期)，並將2次實驗結果進行平均。若大鼠在60秒內未找到平臺，則潛伏期以60秒計算。無論在60秒內是否找到平臺，大鼠都在平臺上停留10秒。第一次實驗開始前將大鼠放於平臺上10秒以適應。隨訓練次數的增加，各組大鼠尋找安全島的潛伏期縮短。最後一次訓練後進行探索實驗。移去平臺，大鼠自由游泳60秒尋找平臺，記錄大鼠在每個象限花費的時間。大鼠在原來平臺所在象限停留的時間長，暗示大鼠已對該空間目標存在記憶。

吾人將搜索策略分爲4類：(1)邊緣式，大鼠沿水池邊緣運動，無尋找動機；(2)隨機式，大鼠搜索時無明確方向；(3)趨向式，大鼠已記得安全島的大概位置，在發現安全島前轉彎少於4次；(4)直線式，大鼠已明確記得安全島的位置，直接遊向安全島。實驗結果以大鼠找到安全島的時間即潛伏期及搜索策略來表示。

對膽鹼乙醯基轉移酶、抗氧化酶及MDA的檢測

將大鼠斷頭取腦，在冰浴上剝離出皮層及海馬組織，稱重後迅速置於液氮中冷凍待用。樣品加入預冷的pH7.0磷酸 鉀緩衝液0.05 mol．L^-1 (內含0.5 mol．L^-1 EDTA及7%甘油)，冰浴製成10%的組織勻漿，蛋白定量以Lowry比色法測定。

1.膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)的測定：反應體系中加入磷酸鈉緩衝液0.5 mol．L^-1 ，乙醯輔酶A 0.0062 mol．L^-1 ，氯化膽鹼1.0 mol．L^-1 ，甲基硫酸新斯的明76 mol．L^-1 ，NaCl 3 mol．L^-1 及EDTA 0.011 mol．L^-1 ，鹽酸肌酸酐0.5 mol．L^-1 各401，最後各管加入蒸餾水至0.8 ml。置於37℃溫浴5 min後，各管加入200 1組織勻漿液，然後將各管放入沸水2 min，之後加入2.5 mmol．L^-1 砷酸鈉0.8 ml，室溫下15000×g離心3 min，取2.0 ml上清液加入40 13 mmol．L^-1 4-PDS，置於25℃溫浴15 min後，測定OD值(λ=324 nm)，計算ChAT活性，以nmol CoA．SH/mg蛋白質/小時表示。

超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)的測定參照南京建成試劑公司試劑盒說明書進行。

病理學及免疫組織化學檢測

每組隨機選取4-6只動物，行爲學實驗後，戊巴比妥麻醉(100 mg/kg ip)，依次剪開皮膚，胸腔，充分暴露心臟，剪開左側心尖部，以灌注針朝主動脈方向插入，止血鉗夾閉，輸注生理鹽水，於右心耳下部剪開右心房，生理鹽水灌注15-20 min(200-300 ml)，流出液變清澈，換以4%多聚甲醛PBS液繼續灌注15-20 min(150-200 ml)，動物全身僵硬，肝臟發白爲止，然後斷頭取腦，以刀片切去前部端腦及後部小腦，放入4%多聚甲醛繼續固定48h(石蠟切片)或20%的蔗糖多聚甲醛溶液固定48h(冰凍切片)。

石蠟切片經固定、包埋，切片後採用Hematoxylin-Eosin (HE)染色、K-B(Klűver-Barrera Luxol fast blue)染色進行病理檢測，免疫組化的方法檢測GFAP在腦組織中含量的變化。

統計分析

所有結果採用均數±標準誤差表達。水迷宮實驗中各組的潛伏期差異比較採用重複測定的兩因素方差分析。組間差異採用post hoc LSD或Turkey檢驗。水迷宮平臺探索實驗採用單因素方差分析。避暗實驗採用Kruskal-Wallis檢驗及Mann-Whitney U檢驗。生化測定採用單因素方差的分析。P<0.05爲有顯著性差異。

實驗結果

L-NBP對大鼠水迷宮學習記憶的影響 在水迷宮實驗中，學習及保留實驗經常用於評價低灌注大鼠的空間記憶能力。在第一天訓練中，各組間沒有顯著性差異。經過5天的訓練，假手術組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期(12.6±3.34秒)明顯縮短。而溶劑對照組的搜索策略沒有明顯的轉變，仍爲邊緣式及隨機式，潛伏期(47.6±5.88秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P<0.01)。L-NBP10 mg/kg組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期(26.85±5.98秒)縮短明顯，與溶劑對照組比較有明顯差異(P<0.001兩因素方差分析)，而與假手術組比較無顯著差異。其它藥物如DL-NBP10 mg/kg、DL-NBP30 mg/kg及D-NBP 30 mg/kg的改善作用均 不明顯，見圖1A、B及圖2。在5天的學習訓練結束後，進行平臺探索實驗，將安全島撤去以測試大鼠是否已形成對安全島的空間記憶。除溶劑對照組外，所有大鼠在目標象限的停留時間都大於25%，表明都已經形成了對安全島的相對位置的記憶。假手術組的停留時間(17.73±1.19秒)明顯長於溶劑對照組(14.40±0.73秒)，通過單因素方差分析統計，有明顯差異(P<0.05)見圖3。L-NBP10 mg/kg組在平臺所在象限的停留時間較溶劑對照組明顯延長(17.62±1.27秒，P<0.05)。DL-NBP組(10 mg/kg及30 mg/kg)均無作用。爲排除動物運動能力對其之影響，經測定，各組間游泳速度無差異。以上表明只有左旋正丁基苯酞對腦供血不足大鼠的近記憶及空間位置功能缺損有明顯作用，而消旋及右旋正丁基苯酞則無作用。

對SOD、ChAT活性及MDA含量的影響 SOD係重要的抗氧化酶，正常對照組皮層組織中SOD的活性爲100.07±3.64(NU/mg protein)；海馬組織中的活性爲57.90±7.41(U/mg protein)。大鼠永久性結紮雙側頸總動脈後，海馬SOD的活性與對照組相比明顯升高(P<0.05)，此可能係一種補償性反應。經L-NBP(10 mg/kg)治療後，該酶活性接近正常水平(P<0.05)，MDA係脂質過氧化的標誌，可反映在體內的脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。在此實驗中，模型組皮層MDA的含量升高了19.9%，與正常對照組相比具有顯著性差異(P<0.001)。經L-NBP(10 mg/kg)治療後，皮層MDA的含量明顯降低了 20.7%(P<0.001)。大鼠永久性結紮雙側頸總動脈後，皮層ChAT的活性顯著降低，與正常對照組相比，下降了34.4%(P<0.05)，表明低灌注可導致膽鹼能神經功能受損。L-NBP(10 mg/kg)連續投藥16天後，可使皮層組織中ChAT的活性較模型組提高37.1%，具有顯著性差異(P<0.05)。(見表1)。

對病理學及組織化學的影響 永久性結紮雙側頸總動脈後，模型組可見皮層及海馬CA1區的神經元明顯減少，細胞皺縮及神經元深染，而L-NBP(10 mg/kg)治療後能明顯改善低灌注誘導的神經元損傷。文獻報導雙側頸總動脈結紮可以誘導腦膠質細胞活化，並伴有白質稀薄。白質稀薄按其嚴重程度一般分爲4級：0級，正常；1級，神經纖維錯排；2級，明顯空泡形成；3級，存在髓鞘的纖維消失。在吾人之實驗中，模型組的視束較正常對照組顯示了明顯的白質稀薄，出現大量的空泡，L-NBP(10 mg/kg)長期投藥後可顯著改善該情況，視束的空泡明顯減少。免疫組化實驗發現， GFAP-陽性的星形膠質細胞在正常對照組海馬、尾核、胼胝體等部位很少檢測得到，但雙側頸總動脈結紮4週後，出現許多GFAP-陽性反應的星形膠質細胞及小膠質細胞。經L-NBP(10 mg/kg)治療後，GFAP-陽性的膠質細胞顯著減少(見圖3,4)。

實驗結論

由結果可得出以下結論：L-NBP 10 mg/kg組能明顯改善2-VO動物近記憶及空間位置的記憶障礙，而消旋丁基苯酞及右旋丁基苯酞對改善記憶功能障礙均無效。本研究在2-VO後第10天開始投藥(一直投藥至第35天)，目的在於觀測藥物對腦低灌引起的神經元退行性病變的治療作用，以排除對急性低灌缺血期的影響。

L-NBP對ChAT活性具有提高作用，表明能使膽鹼能神經ACh水平增加，有利於改善記憶功能。此外L-NBP能明顯抑制氧化損傷，表明L-NBP能降低神經細胞之損傷。由2-VO引起之腦低灌的病理特徵爲白質稀疏，空泡及膠質細胞增多(Narri.等人，Chronic cerebral hypoperfusion-induced neuropathological changes in rats. Jpn.J.Psychopharmacol. 1998;18:181-188)，而L-NBP均能改善該等病理改變。以上該等作用機製對L-NBP改善2-VO大鼠引起之記憶障礙提供了依據。依據以上結果，暗示了L-NBP對血管性癡呆具有明顯治療及預防作用的可能。

實施例2左旋正丁基苯酞能明顯改善β-澱粉樣肽(1-40)引起的老年性癡呆症狀 材料及方法

試劑及藥品 ：L-NBP由本所合成室提供，以植物油配製。 Aβ (1-40)購自Sigma公司。Alzet腦微滲透泵灌流裝置購自美國DURECT公司。

儀器 ：Morris水迷宮自動監控儀及實驗方法，參見以上腦低灌注大鼠學習記憶損傷實驗

模型建立 ：雄性Wistar大鼠，10週齡，體重280克左右，每籠放置1只動物，室溫保持在23℃，自由進食及飲水。大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)，腹臥位固定於立體定位儀上，剪開頭部皮膚，將用於灌流Aβ (1-40)的套管植入右側腦室，根據Paxions及Watson的大鼠腦立體定位圖譜，植入部位在前囟後0.3 mm，右1.1 mm，深4.0 mm。套管與一個微量滲透泵相連接。將微量滲透泵置於大鼠的背部。使Aβ (1-40)溶於35%乙腈/0.1三氟乙酸，以300 pmol/天持續腦室灌流(i.c.v)，對照組僅灌流溶劑35%乙腈/0.1%三氟乙酸。先前實驗證實在該流速下，溶劑不會引起大鼠行爲及神經化學的改變。

實驗分組及設計 ：大鼠隨機分成4組，每組10只。1)假手術組：大鼠腦室僅灌流35%乙腈/0.1三氟乙酸＋溶劑；2)模型組：Aβ (1-40)＋溶劑；3)Aβ (1-40)+L-NBP10 mg/kg組；4)Aβ (1-40)+L-NBP30 mg/kg組。自手術後第2天開始灌服藥物及溶劑。水迷宮訓練試驗在術後第9-13天進行，第13天進行平臺探索試驗，第14-16天進行工作記憶測驗。動物在第17天處死，斷頭取腦進行生化測定。在行爲學實驗中， 均在實驗前40分鐘投藥。

水迷宮實驗 ：自icv Aβ (1-40)後第9-13天進行水迷宮訓練試驗，第13天進行平臺探索試驗。在icv Aβ (1-40)後第14-16天進行工作記憶測驗(見上圖)，該測驗係在訓練試驗及平臺探索試驗後動物已獲得一定的記憶基礎上，觀察改變平臺及象限後動物的快速學習空間記憶能力。除了平臺每天改變位置，實驗過程與標準的水迷宮訓練試驗相似。每天5次實驗，大鼠分別自5個入水點開始進行游泳。每天的第一次實驗稱爲示範試驗，大鼠被允許遊到處於新位置之平臺上，並停留10秒鐘，其後的四次試驗，平臺位置保持不變，只是入水點的象限不同。工作記憶能力的潛伏期取第2到第5次試驗的平均值，每只大鼠之工作記憶能力通過3天之實驗平均值進行計算。

生化實驗 ：丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的測定，同以上實驗。

統計分析 ：所有結果採用均數±標準誤差表達。水迷宮實驗中各組的潛伏期差異比較採用重複測定的兩因素方差分 析。組間差異採用post hoc LSD或Turkey檢驗。水迷宮平臺探索試驗，工作記憶測驗，生化測定採用單因素方差分析。P<0.05係有顯著性差異。

實驗結果 L-NBP對大鼠水迷宮學習記憶的影響

在第一天訓練中，各組間沒有顯著性差異。經過5天的訓練，假手術組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期(13.02±2.77秒)明顯縮短。而模型組的搜索策略沒有明顯的轉變，仍爲邊緣式及隨機式，潛伏期(30.18±4.81秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P<0.01)。經L-NBP治療後，大鼠在水迷宮試驗中的潛伏期明顯縮短，其中L-NBP10 mg/kg組及30 mg/kg組的搜索策略自邊緣式及隨機式轉向趨向式及直線式，潛伏期分別爲27.28±6.42秒及25.88±5.51秒，與模型組比較有明顯差異(P<0.05兩因素方差分析)，而與假手術組比較無顯著差異，表明經L-NBP治療的大鼠已接近正常水平，見圖4。在工作記憶測驗中，第一次實驗及第2-5次實驗的潛伏期見圖5 A、B。雖然在第一次示範實驗中，各組的潛伏期沒有顯著性差異，但在以後4次實驗中，假手術組的潛伏期爲9.15±0.91秒，模型組的潛伏期爲14.05±1.88秒，後者潛伏期明顯延長，二者有顯著性差異(P<0.01)。L-NBP組可劑量依賴性地顯著改善工作記憶能力(P<0.01)。

L-NBP增加GSH-Px活性及降低MDA的含量

GSH-Px係重要的抗氧化酶，在吾人之實驗中，假手術組 皮層組織中GSH-PX的活性爲15.86±0.91(U/mg protein)；海馬組織中的活性爲16.19±1.19(U/mg protein)。大鼠Aβ (1-40)持續灌流後，GSH-Px的活性與假手術組相比在皮層及海馬分別降低了29.5%及42.4%，具有顯著性差異(P<0.01及P<0.001)。經L-NBP治療後，30 mg/kg組對該酶活性明顯提高(P<0.01)，L-NBP(10 mg/kg)亦有升高該酶之活性作用，但無統計學意義。MDA係脂質過氧化之標誌，反映體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。在此實驗中，大鼠Aβ (1-40)持續灌流後皮層及海馬MDA的含量分別升高了25.7%及23.6%，與假手術組相比具有顯著性差異(P<0.05及P<0.01)。經L-NBP治療後，皮層及海馬MDA的含量明顯降低，10 mg/kg組分別降低了28.4%及24.3%(P<0.05及P<0.01)，30 mg/kg的作用弱於10 mg/kg組，但與Aβ (1-40)模型組相比，仍具有顯著性差異(P<0.05)，見表2。

實驗討論：

大鼠持續側腦室灌流Aβ (1-40)引起之記憶障礙係已知的觀測藥物對AD治療作用的模型。由以上結果可見，L-NBP不僅對2-VO導致供血不足引起之血管性癡呆的模型具有明顯作用，且對大鼠持續側腦室灌流Aβ (1-40)引起之近記憶及空間位置的記憶障礙亦具有明顯的改善作用。此表明L-NBP對由不同原因引起之近記憶及空間位置記憶障礙均具有明顯的改善作用。此外，L-NBP有阻斷氧化損傷的作用(提高GSH-Px活性及降低MDA含量)，結合其明顯的腦保護作用，暗示L-NBP有治療及預防老年性癡呆的作用。

圖1水迷宮實驗，1A第五天大鼠的搜索路線；1B第五天平台探索實驗中大鼠的搜索路線。

圖2永久性雙側頸總動脈結紮後口服L-NBP對大鼠在水迷宮實驗中的空間記憶障礙的影響。圖2A表示在訓練階段潛伏期的改變；圖2B表示移去平臺後的平臺探索實驗，大鼠自由游泳60秒鐘，其在平臺所在象限(Q4)停留的時間。 所有數值以均數±標準誤差表示。每組12-14只大鼠；#P<0.05與假手術(sham)組比較。*P<0.05與溶劑對照組(vehicle)比較。

圖3雙側頸總動脈結紮5週後大鼠海馬CA1區(A, B, C)及皮層(D, E, F)的H-E染色的顯微鏡下圖像改變(40倍)。假手術組(A, D)；溶劑對照組(B, E);L-NBP(10 mg/kg)治療組(C, F)。

圖4雙側頸總動脈結紮5週後大鼠視束K-B染色(A, B, C放大40倍)及尾核GFAP免疫組化染色(D, E, F放大20倍)的顯微鏡下圖像變化。假手術組(A, D)；溶劑對照組(B, E);L-NBP(10 mg/kg)治療組(C, F)。

圖5L-NBP對大鼠持續側腦室灌流Aβ (1-40)後在水迷宮實驗中的記憶障礙的影響。圖示爲訓練階段逃避潛伏期的改變；所有數值以均數±標準誤差表示。每組10只大鼠。

圖6L-NBP對大鼠持續側腦室灌流Aβ (1-40)造成之記憶障礙的影響。工作記憶測驗(每天5次)在Aβ (1-40)灌流後第14-16天進行。圖5A表示在第一次實驗中潛伏期的改變；圖5B表示後4次實驗中潛伏期的改變。所有數值以均數±標準誤差表示。每組10只大鼠。##P<0.01與假手術組相比；*P<0.05與Aβ (1-40)模型組相比。

Claims (5)

1. 一種如通式(I)所示左旋正丁基苯酞的在製備預防或治療癡呆的藥物中的應用
2. 根據請求項1的應用，其中所述的癡呆是阿爾茨海默病。
3. 根據請求項1的應用，其中所述的癡呆是血管性癡呆。
4. 根據請求項1的應用，其中該化合物的有效治療劑量為：0.1~100mg/kg/天。
5. 根據請求項1的應用，其中所述的藥物包括片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋製劑、控釋製劑及各種微粒給藥系統。