TWI415939B - 人類呼吸道融合病毒（ｒｓｖ）疫苗 - Google Patents

Description

人類呼吸道融合病毒(RSV)疫苗

本發明係關於人類呼吸道融合病毒(RSV)疫苗；詳言之，係關於一種包含重組腺病毒構築體之疫苗組合物，該構築體攜帶編碼RSV蛋白質之核苷酸序列。

呼吸道融合病毒(RSV)為一種單股反義RNA之多形性包膜肺炎病毒，屬於副黏液病毒科。人類RSV之基因組包含八個結構基因及兩個非結構基因，其中主要的基因分別編碼附著醣蛋白(G蛋白質)、融合蛋白(F蛋白質)及小型疏水性膜蛋白(SH蛋白質)。

RSV感染會誘發針對該病毒之體液及細胞免疫反應。有些研究已證實，在動物模型中RSV專一性中和抗體及細胞毒性淋巴細胞(CTL)有助於對抗RSV感染及/或疾病。例如，有報導指出，RSV專一性抗體在預防RSV感染上扮演著重要角色，這是基於被動輸送含有RSV專一性抗體之免疫血清所產生的保護功效，其中該血清係以活RSV攻毒未經疫苗接種之小鼠而得(Graham et al.,Immunoprophylaxis and immunotherapy of respiratory syncytial virus-infected mice with respiratory syncytial virus-specific immune serum；Pediatr Res 1993 Aug；34(2)：167-72)。亦有報導指出，在感染RSV而發展出輕微症狀之成人中較易偵測到RSV專一性CTL(Isaacs D.,Viral subunit vaccines；Lancet 1991 May 18；337(8751)：1223-4)。

有證據顯示，對於作為疫苗抗原而言，RSV之F蛋白質較RSV G蛋白質更佳，這是因為表現RSV之G蛋白質的重組牛痘病毒(vacvG)在小鼠感染RSV時，會促使肺部嗜伊紅血 球增多(eosinophilia)(相關報導參見，例如，Openshaw et al.,Pulmonary eosinophilic response to respiratory syncytial virus infection in mice sensitized to the major surface glycoprotein G；Int Immunol 1992 Apr；4(4)：493-500)。然而，亦有報導指出經F1-RSV疫苗接種(以RSV F蛋白質之F1次單元作為疫苗接種)後，針對RSV感染之Th-2型反應在不正常反應中發揮作用，該不正常反應之特徵包括血液中嗜伊紅血球大量增加，氣喘，以及氣道過度反應(Kim et al.,Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine；Am J Epidemiol 1969 Apr；89(4)：422-34)，且Th-2關聯性細胞激素IL-4及IL-13皆促使肺部嗜伊紅血球增多(Johnson and Graham,Secreted respiratory syncytial virus G glycoprotein induces interleukin-5(IL-5),IL-13,and eosinophilia by an IL-4-independent mechanism；J Virol 1999 Oct；73(10)：8485-95；及Johnson et al.,IL-13 is sufficient for respiratory syncytial virus G glycoprotein-induced eosinophilia after respiratory syncytial virus challenge；J Immunol 2003 Feb 15；170(4)：2037-45)。

綜上所述，仍需發展新型之無副作用疫苗，以預防RSV感染或受疫苗誘發之疾病(如嗜伊紅血球增多)。

本發明之特徵為新穎之RSV DNA疫苗，此疫苗之特徵在於複製缺陷性重組腺病毒構築體，其攜帶編碼RSV之F蛋白質之核苷酸序列。超乎預期地發現，本發明之RSV疫苗不會產生此一領域已知RSV疫苗所導致的不良副作用，如發炎及嗜伊紅血球增多。

在一方面，本發明提供一種疫苗組合物，其包含複製缺陷性重組腺病毒構築體，該構築體攜帶編碼RSV之F蛋白質或 其片段之核苷酸序列。

在另一方面，本發明提供一種預防RSV感染相關疾病之方法，包括對有需要之對象投予疫苗組合物，該疫苗組合物包含複製缺陷性重組腺病毒構築體，該構築體攜帶編碼RSV之F蛋白質或其片段之核苷酸序列。

除非另有定義，本文中使用的所有技術及科學術語具有熟習本發明所屬技藝者一般所瞭解之意義。本文中使用之下列術語具有所給予之意義，除非另有指定。

本文中使用之「一」或「一種」乙詞係指一或多於一個(例如至少一個)所述名詞。例如，「一元素」係指一個元素或多於一個元素。

「編碼」乙詞係指聚核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的一種固有特性及其所造成的生物特定，其係在生物過程中作為合成其他聚合物及巨分子之模板，所合成之聚合物或巨分子具有特定的核苷酸序列(如rRNA、tRNA及mRNA)或特定的胺基酸序列。因此，如一基因所產生之mRNA在細胞或其他生物系統中發生轉錄及轉譯後產生蛋白質，則稱該基因「編碼」該蛋白質。熟習本技藝者均瞭解，由於遺傳密碼的簡併作用(degeneracy)，許多不同的聚核苷酸及核酸可編碼相同的多肽。熟習本技藝者亦瞭解，可使用例行技術製造出不影響所述聚核苷酸所編碼之多肽序列之核苷酸取代物，俾反映欲表現該多肽之任何特定宿主生物之密碼子使用偏好。因此，除非另有指定，所述「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括編碼相同胺基酸序列且互為對方之簡併版本的所有核苷酸序列。編碼蛋白質及RNA之核苷酸序列可包括內含子(intron)。

「重組」乙詞係用於描述具有非自然連結在一起之序列的 聚核苷酸或核酸。重組核酸可以構築體形式存在。本文中使用之「構築體」乙詞可包含一指定的目標核苷酸序列，以及一些表現該目標核苷酸序列所需之序列，例如調控序列。構築體可用於表現指定的核苷酸序列，或保有指定的核苷酸序列，以供複製、操作、或在不同位置間(例如在不同生物間)轉移。為達上述目的可將構築體導入適當之宿主細胞中。

構築體之實例包括但不限於：質體、黏接質體(cosmid)、噬菌體、YAC或PAC。典型地，構築體中所含指定的核苷酸序列係可操作地連結至調控序列，因此當該構築體被導入宿主細胞中時，該指定的核苷酸序列可在該調控序列的控制下表現。調控序列可包含例如(但不限於)：啟動子序列(如巨細胞病毒(CMV)啟動子、猴病毒40(SV40)早期啟動子、T7啟動子及酒精氧化酶基因(AOXI)啟動子)、起始密碼子、複製起始點、促進子、操作子序列、分泌訊息序列(如α-交配因子訊息)及其他控制序列(如Shine-Dalgarno序列及終止序列)。較佳者，構築體可進一步包含標記序列(如抗生素抗性標記序列)，以利後續之篩選過程。更佳者，在構築體中指定的目標核苷酸序列可連接至非屬上述調控序列之核苷酸序列，從而產生融合多肽，以利於後續之純化過程。該等融合多肽包括但不限於：His-標籤融合多肽及GST融合多肽。

本文中使用之「片段」乙詞係指在胺基端及/或羧基端有缺失之肽，但剩餘之胺基酸序列與主要或目標多肽(例如，來自蛋白質之全長序列)之對應位置在序列上相同。

「疫苗」乙詞係指化學劑或組合物，其包含活性成分，而可有效地在對象體內誘發針對特定病原體或疾病之治療等級之免疫反應。傳統上，疫苗的活性成分為衍生自病原體(其為該疫苗之標的)之多肽。「DNA疫苗」乙詞係指活性成分為DNA之疫苗。

需要治療之「對象」係指人類或非人之哺乳動物。非人之 哺乳動物包括但不限於靈長類、有蹄類、犬科及貓科。

本文中所稱之「腺病毒」乙詞係指分離自人類之47種以上的腺病毒亞型，以及分離自其他哺乳動物及鳥類者。參見Strauss,"Adenovirus infections in humans,"in The Adenoviruses,Ginsberg,ed.,Plenum Press,New York,N.Y.,pp.451 596(1984)。

本發明提供一種疫苗組合物，其包含複製缺陷性重組腺病毒構築體，該構築體攜帶編碼RSV之F蛋白質或其片段之核苷酸序列。

在本發明之具體實例中，該疫苗組合物包含經編碼RSV之F蛋白質之核苷酸序列轉形之複製缺陷性重組腺病毒構築體。如以下實例所示，本發明之疫苗組合物有效地誘發體液及細胞免疫反應。本發明之疫苗組合物之進一步特徵在於無不良副作用，例如，嗜伊紅血球增多及白細胞介素(如IL-17)關聯性發炎反應。

依據本發明，RSV之F蛋白質可來自任何自然發生之RSV品系或重組RSV，較佳為人類RSV品系，如A2品系、Long品系或B品系。在本發明之具體實例中，RSV品系為RSV-B1品系。

依據本發明，RSV F蛋白質可為全長之RSV之F蛋白質或其片段。在本發明之具體實例中，編碼RSV之F蛋白質之核苷酸序列係編碼RSV之全長F蛋白質(F0)，例如，SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在本發明之具體實例中，編碼RSV之F蛋白質之核苷酸序列具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列(GenBank,NC_001803)。RSV之F蛋白質可為與SEQ ID NO：1之核苷酸序列至少具有約75%(較佳為大於約85%)同源性之任何序列。

在本發明之另一具體實例中，該核苷酸序列亦可編碼RSV之F蛋白質的片段。該片段係由胺基端或羧基端之缺失或二者 所造成。缺失的程度可由熟習本技藝者決定，以便於(例如)達成重組腺病毒之較佳產率。在本發明之具體實例中，該片段為跨膜區截除之F蛋白質(F0△TM)，其係由F蛋白質的全長序列進行截除而得。在本發明之較佳具體實例中，該核苷酸序列係編碼跨膜區截除之F蛋白質(F0△TM)，例如，SEQ ID NO：4之胺基酸序列。在本發明之具體實例中，跨膜區截除之F蛋白質(F0△TM)具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列。F蛋白質之片段亦可為F蛋白質的F1功能區域(domain)或F2功能區域。

作為本發明重組疫苗構築體骨架之腺病毒構築體較佳為「第一代」之腺病毒構築體。此類腺病毒構築體係本技藝已知者，其特徵為具有複製缺陷性。該等病毒典型地具有經截除或去活化之E1基因區域，較佳係再額外具有經截除或去活化之E3基因區域。在本發明之具體實例中，所使用之第一代複製缺陷性腺病毒構築體為第5血清型腺病毒(Ad5)，其在E1(Ad5鹼基對342至3523)及E3(Ad5鹼基對28133至30818)有缺失。對於第2血清型腺病毒(Ad2)，其E1缺失較佳為559至3503鹼基對之缺失，E3缺失較佳為28812至29773鹼基對之缺失(Genbank gb：J01917)。熟習本技藝者可輕易決定其他血清型之等同序列，例如，第4、12、6、17、24、33、42、31、16血清型。

在本發明之具體實例中，可使用第2及5血清型腺病毒，特別是第5血清型，這是因為相較於其他血清型，目前對於該等血清型之一般瞭解較多，且其完整DNA序列已為公眾所知悉。第5血清型腺病毒之原型已完成全部定序(Chroboczek et al,1992 J.Virology 186：280)。它們亦屬於C亞群之腺病毒，與人類或嚙齒類之惡性腫瘤無關。然而，本發明亦可使用任何血清型腺病毒，包括非人類血清型病毒，因為截除E1基因應可使所有腺病毒不具腫瘤生成性。此外，使用在野外較不普遍存 在之血清型可能是有利的，因為病患對較少見之血清型比較少有先前曾暴露的機會(也就是較少可能具有已經存在的抗體)。

依據本發明之重組腺病毒可藉由任何熟習此技藝者已知之技術製備(Levrero et al.,Gene 101(1991)195,EP 185 573；Graham,EMBO J.3(1984)2917)。具體而言，可藉由腺病毒與攜帶編碼F蛋白質之DNA序列的質體二者間之同源重組來製備。同源重組發生於該腺病毒與質體共同轉染至適當之細胞株後。使用之細胞株較佳為(i)可由該等元件轉形者，及(ii)包含可補足腺病毒所缺基因組部分之序列，較佳係以嵌入的形式存在，以避免重組的危險。細胞株的實例包括人類胚胎腎臟細胞株293(Graham et al.,J.Gen.Virol.36(1977)59)，其特別包含嵌入其基因組之Ad5腺病毒基因組之左段部分(12%)。

本發明之疫苗組合物可進一步包含一或多種佐劑。本文中使用之「佐劑」乙詞係指可增進抗原之免疫原性，但本身未必具有免疫原性之化學劑。佐劑之作用可為將抗原局部地維持於投藥位置附近，製造出貯藏效應，以利抗原緩慢而持續地釋放至免疫系統之細胞。佐劑亦可將免疫系統之細胞吸引至抗原貯藏處，並刺激該等細胞誘發免疫反應。

在另一方面，本發明提供一種預防RSV感染或RSV感染相關疾病之方法，包括對有需要之對象投予疫苗組合物，該疫苗組合物包含複製缺陷性重組腺病毒構築體，該構築體攜帶編碼RSV F蛋白質或其片段之核苷酸序列。

RSV感染相關疾病包括但不限於中耳炎、細枝氣管炎、嗜伊紅血球增多及肺炎。

如以下實例所示，本發明疫苗組合物以鼻內投藥時可有效誘發黏膜免疫反應。因此，雖然本發明疫苗組合物可以任何傳統途徑投藥，例如，皮下、皮內、肌肉內及靜脈內注射，但較佳為以經黏膜途徑如鼻內或口內(胃內)投藥。在本發明之較佳具體實例中，該疫苗組合物係以鼻內投藥。

本發明亦可使用其他投藥方式，包括栓劑及口服配方。可將本發明疫苗組合物併入醫藥上可接受之賦形劑，而調配出任何適當之疫苗配方，例如，水、生理鹽水、甘油及乙醇，以及如濕潤劑、乳化劑或pH緩衝劑等物質。

本發明之疫苗組合物亦可與其他病原體之抗原以多價疫苗的形式共同投藥。

現在參考下列具體實例更詳細地說明本發明，該等具體實例之目的係供舉例而非限制。

實例1：以rAd5-F構築體表現RSV之F抗原 構築及生產rAd-F0及rAd-F0△TM

在維持於37℃及5% CO₂ 之培養器中，培養人類胚胎腎臟細胞(293A)(Invitrogen,CA,USA)並使其維持於DMEM培養基(Hyclone,Cat No.SH300)中，該培養基添加10%胎牛血清(Biological)及1%盤尼西林/鏈黴素(Biological)。以PCR分別擴增編碼全長F蛋白質F0(SEQ ID NO：1)及F0△TM(SEQ ID NO：3，缺少編碼跨膜區之序列)之RSV-B1融合(F)醣蛋白基因，並將之插入穿梭載體pENTRY4(Invitrogen)中，以利插入之F基因可隨後重組進入△E1/△E3(缺少複製能力)Ad5載體，即pAd/CMV/V5-DEST(Mizuguchi與Kay,Efficient construction of a recombinant adenovirus construct by an improved in vitro ligation method.Hum Gene；Ther 1998 Nov 20；9(17)：2577-83；及Mizuguchi與Kay,A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors；Hum Gene Ther 1999 Aug 10；10(12)：2013-7)。將重組質體pAd-F0及pAd-F0△TM DNA個別轉染至包裝細胞株293A中，分別生產重組腺病毒rAd-F0及rAd-F0△TM(圖1A)。

以15%蔗糖/PBS梯度，在20,000rpm進行超離心60分鐘，以達成重組構築體之純化及濃縮。然後，將病毒重新懸浮 於pH 7.2之PBS，以下述經修飾之標準溶菌斑分析測定病毒效價。簡言之，將各種稀釋度之rAd-F0及rAd-F0△TM病毒添加至6孔槽組織培養盤中，各孔槽含有293A細胞。然後，加入含0.75%甲基纖維素之DMEM，覆蓋培養物，於37℃下培養10至12天後，計數溶菌斑。rAd-F0及rAd-F0△TM之產量通常為1 x 10⁹ pfu/mL左右。

測定經rAd-F0及rAd-F0△TM感染之293A細胞中之RSV F基因表現

使用活RSV感染293A細胞之方法測定rAd-F0或rAd-F0△TM之感染力，並評估個別之F基因表現。為此，以2 x 10⁵ pfu之rAd-F0或rAd-F0△TM感染2 x 10⁶ 個293A細胞。三天後，以刮取法收集細胞並置於50mL之滅菌離心管(Corning)中。將收集的細胞等量均分，並以10.0mL之冰冷PBS(pH 7.2)清洗二次，以去除殘餘的FBS。使用RNeasy迷你套組(Qiagen)，依據供應商提供之程序，從細胞沉澱物之一部分中萃取總體RNA。然後使用SuperScript reverse^TM II反轉錄酶套組(Invitrogen)產生cDNA。使用下列正向及反向引子，擴增及測定全長F1 mRNA之593-1151區域，該區域係由F0(1722個核苷酸，SEQ ID NO：1)及F0△TM(1572個核苷酸，SEQ ID NO：3)插入序列轉錄而來：5’-ACATCGACAAGCAGCTGCTGC-3’(正向；SEQ ID NO：5)及5’-GAGGTGAACCTGTGCAACG-3’(反向；SEQ ID NO：6)。所得PCR產物之分子大小預期為559bps。使用下列F2引子對，擴增涵蓋核苷酸序列13-390之片段，以產生預期為378bps之PCR產物：5’-ATCCTGAAGGCTAAGGCTATC-3’(正向；SEQ ID NO：7)及5’-ACCAACGTGACCCTGTCCAA-3’(反向；SEQ ID NO：8)。在RT-PCR中，使用β-肌動蛋白專一性引子(Invitrogen,CA,USA)作為內部對照。 以凝膠電泳分析PCR產物。

將第二份細胞沉澱物水解，釋放出胞內蛋白質，供免疫墨點分析。以pH 8.0之水解緩衝液(包含50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1% Triton X-100及1 x蛋白酶抑制雞尾酒，Roche)處理細胞沉澱物，以進行細胞水解。置於冰上30分鐘進行水解，其間偶爾以移液器吸放。於4℃下以14,000xg離心20分鐘，以去除細胞碎片。對細胞水解物進行SDS-PAGE電泳，並將蛋白質轉移至Hybond ECL硝基纖維素薄膜(Amersham)上。於室溫下，以5%脫酯牛奶於Tris緩衝生理鹽水(pH 7.2)中對該薄膜進行1小時的封阻，以含0.05% Tween 20之PBS(PBST)清洗二次，然後以針對RSV之多株人類抗血清(Burney S.Graham,NIH,USA所贈)於4℃下隔夜浸泡。以PBST將薄膜清洗二次，然後添加抗人類辣根過氧化酶(HRP)共軛抗體(KPL Immunochemical)(以含5%脫酯牛奶之PBS作1：5000稀釋)至該薄膜，使蛋白質顯像。或者，使用來自經重組腺病毒免疫之小鼠的多株血清(1：500稀釋)作為初級抗體，以封阻經HIRSV-B1轉移之薄膜。清洗後，使用1：20000稀釋之HRP共軛驢子抗小鼠多株血清(Jackson)作為二級抗體。於室溫下浸泡1小時後，以PBST將薄膜清洗二次，然後以SuperSignal West Pico化學冷光受質(Pierce)處理，然後曝光於X光底片上。

當轉染至常態表現E1蛋白質之勝任293A細胞中，重組腺病毒即分別表現其F插入序列，RT-PCR反應可測定此等表現情形。結果顯示，以F2及F1引子對，分別自轉染rAd-F0及rAd-F0△TM之293A細胞，擴增RSV F0(F2+F1)或RSV F0△TM(F2+F1△TM)cDNA之13-390及593-1151核苷酸區域，分別得到378bps及559bps之PCR產物(圖1B)。反之，以對照組構築體rAd-LacZ感染之293A細胞則未產生該等大小之mRNA片段。F0及F0△TM之mRNA轉譯產物經辨識分 別具有62KDa及57KDa之分子大小，其係使用對抗活RSV之多株小鼠抗血清所進行之免疫墨點分析的結果(圖1C)。

實例2：在經rAd-F0及rAd-F0△TM構築體免疫之小鼠中產生RSV專一性體液免疫反應 製備RSV-B1品系、Long品系及A2品系之庫存

在維持於37℃及5% CO₂ 之培養室中，將人類咽喉癌細胞(Hep-2)(由美國國家衛生研究院之Burney Graham博士所提供)培養並維持於DMEM培養基(Hyclone,Cat No.SH300)中，該培養基添加10%胎牛血清(Biological)及1%盤尼西林/鏈黴素(Biological)。

在Hep-2細胞中培養人類RSV-B1品系(VR-1580)、Long品系(VR-26)及A2品系(VR-1540)(購自美國菌種保藏中心)。先使Hep-2細胞於150mm培養皿(Corning)中生長至80%的匯合度，然後再以0.2 m.o.i.(感染複數)之RSV-B1品系、Long品系或A2品系接種於細胞。感染4天後，以刮取方式收集細胞。將含有病毒之Hep-2細胞收集於50mL之滅菌離心管(Beckman)中，以3000rpm離心5分鐘使其沉澱。使用組織研磨器打破細胞沉澱物，釋放出病毒粒子。以3000rpm離心10分鐘以去除細胞殘骸。將細胞上清液以30,000rpm離心2小時通過15%蔗糖(於PBS中)梯度，進行病毒之部分純化。收集病毒並重新懸浮於pH 7.2之PBS中。RSV之病毒效價係以標準溶菌斑分析而測定。簡言之，將100μL之各種稀釋度之純化的病毒製備物添加至12孔培養盤(Corning)中，各孔槽含有Hep-2細胞(5 x 10⁵ 個)。加入含1.5%甲基纖維素之DMEM(Sigma-Aldrich)，覆蓋培養物後，培養5至6天以發展出溶菌斑。以蘇木精及伊紅將細胞染色，並於光學顯微鏡下計數溶菌斑。各病毒之濃度以每mL之溶菌斑形成單位 (pfu/mL)表示。

小鼠之免疫及活RSV攻毒

由台灣國家實驗動物中心購買六至八週齡之雌性BALB/c小鼠。在整個動物研究過程中，小鼠均飼養於國衛院實驗動物中心之無菌籠中。

以異氟烷將四組BALB/c小鼠麻醉，並以1 x 10⁷ pfu/50μL之rAd-F0△TM、rAd-F0、rAd-LacZ及加熱去活化之RSV(HIRSV-B1)，經由鼻內(i.n.)途徑進行初次免疫(prime)。二十天後，每隔20天，各個免疫原以相同劑量經由鼻內、皮下(s.c.)或腹膜內(i.p.)途徑，對動物進行加強免疫(boost)。初次免疫14天後或加強免疫10天後，對小鼠抽血，對各血清樣本針對HIRSV-B1或Ad5進行ELISA分析及病毒專一性中和活性分析。就攻毒研究而言，是在第二次免疫後30天，經由鼻內途徑投予1 x 10⁶ pfu之活RSV-B1。

各個BALB/c小鼠(H-2^d )經由鼻內途徑，投予1 x 10⁷ pfu之rAd-F0、rAd-F0△TM或rAd-LacZ，作為對照組。另一組動物則經由相同免疫途徑給予等量pfu之HIRSV-B1，以評估所誘發之病毒專一性免疫反應，俾與重組病毒所誘發者相比較。表1顯示兩次獨立實驗所得之ELISA試驗結果。

從接受rAd-F0△TM及rAd-F0鼻內初次免疫之小鼠收集之血清樣本，在兩次實驗中分別產生的平均HIRSV-B1專一性效價為104及44，以及88及38。以經HIRSV-B1免疫之動物而 言，針對固定化HIRSV-B1所測得之血清抗體平均效價，在實驗1中為136，在實驗2中則為112。相較之下，在接受空白載體(rAd-LacZ)初次免疫之小鼠的血清樣本中，則未偵測到HIRSV-B1反應性。重組腺病毒之rAd-LacZ成份具有免疫原性，因為經鼻內投予一劑rAd-F0△TM及rAd-F0之小鼠分別產生低抗rAd-LacZ(Ad5)IgG效價(平均值)為52及60；而投予rAd-LacZ之動物則為42。在第二次實驗中，在動物的免疫血清中測得之抗Ad5專一性效價平均值為76(投予rAd-F0△TM時)、96(投予rAd-F0時)及92(投予rAd-LacZ時)。

以各免疫原、經由鼻內、皮下(s.c.)或腹膜內(i.p.)等途徑進行加強免疫後，發現在實驗組小鼠血清樣本中測得之HIRSV-B1反應效價，有實質的增加。在實驗1中，對於經鼻內途徑投予兩次HIRSV-B1之動物而言，測得IgG抗體效價在2560及5120範圍內(平均值=4608)；而對於以HIRSV-B1經由鼻內途徑進行初次免疫以及經皮下與腹膜內進行加強免疫之小鼠而言，所得抗體效價範圍則分別在2560及10240範圍內(平均值=6144)以及1280及10240之間(平均值=6400)。在實驗2中，對於以HIRSV-B1追加接種之小鼠而言，所得HIRSV-B1結合抗體之效價平均值為2816(經由鼻內途徑)、10240(經皮下途徑)及12228(經由腹腔內途徑)。在兩次實驗中，在經由所測試之三種免疫途徑給予1 x 10⁷ pfu之rAd-LacZ之小鼠中，均未偵測到血清抗RSV-B1專一性IgG抗體。然而，在實驗1及2中，在以相同劑量的rAd-F0△TM經由鼻內免疫之動物血清中，則是偵測到高效價之HIRSV-B1 IgG結合抗體，分別在2560及10240之範圍內(平均值=6656)以及2560及5120之範圍內(平均值=3584)。該等抗體水平相較於在經由rAd-F0△TM鼻內接種、隨後進行皮下或腹腔內加強免疫之動物中所測得之抗體水平，兩者並無顯著差異。相較 於rAd-F0△TM，我們發現rAd-F0在所測試之三種免疫方法中，具稍微較低之免疫原性。在實驗1及2中，對於以rAd-F0進行鼻內疫苗接種之動物而言，所得血清HIRSV-B1專一性抗體效價分別在640及5120之範圍內(平均值=2432)，以及1280及5120之範圍內(平均值=2304)。在實驗1中，對於以rAd-F0經由鼻內初次免疫及皮下或腹膜內加強免疫之小鼠而言，所得HIRSV-B1結合IgG抗體效價分別在1280及10240之範圍內(平均值=6400)，以及160及10240之範圍內(平均值=4128)。在實驗2中，對於經上述二種免疫途徑以rAd-F0進行加強免疫之動物而言，在免疫血清中係偵測到相當水平的HIRSV-B1結合效價。有鑒於rAd-LacZ免疫並未導致抗HIRSV-B1抗體反應的產生，經rAd-F0△TM及rAd-F0疫苗接種之動物在初次免疫或加強免疫後，所得免疫血清中IgG抗體之專一性應係針對病毒F蛋白質。此外，統計分析後發現三種不同投藥途徑之F專一性抗體反應並無差異。惟，既然鼻內疫苗接種是有效途徑，我們選擇此免疫途徑，以進一步研究rAd-F0△TM及免疫原性較差之rAd-F0構築體所誘發之體液以及細胞免疫反應之本質。

測定血清及支氣管肺泡灌洗液(BAL)之IgA及IgG水平

使用HIRSV-B1作為標的抗原，以ELISA測定動物之血清及支氣管肺泡灌洗液(BAL)中之病毒專一性IgG及IgA抗體。對各實驗小鼠之肺部空腔進行兩次連續沖洗，以收集BAL液體，每次沖洗係使用1.0mL之含1倍蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)之無菌PBS(pH 7.4)。在測試其RSV專一性IgA及IgG抗體含量前，將所得樣本貯存於-80℃冷凍庫中。

就ELISA而言，在進行鼻內初次免疫14天後及加強免疫10天後，對各實驗小鼠尾部進行靜脈穿刺，以收集血液樣本，待其於室溫下凝固後，以12,000rpm離心20分鐘。以移液器 取出血清，並置於56℃下30分鐘，使其去活化。為進行ELISA，以測定RSV專一性IgG及IgA抗體，首先將100μL含有2.5x10pfu RSV-B1病毒之無菌碳酸鈉緩衝液(8.4g/L NaHCO₃ 及3.5g/L Na₂ CO₃ ，pH 9.5，其中該病毒係經氯化銫梯度純化及加熱去活化75℃，1小時)置於96孔Immulon 2B培養盤(Corning Life Sciences,USA)之孔槽中，於37℃下隔夜反應，使其固定附著於孔槽之表面上。對於以rAd-F0、rAd-F0△TM或空白載體rAd-LacZ經由鼻內初次免疫之小鼠而言，從尾部採血收集血清後，亦針對以相同條件固定於孔槽(每孔2.5x10⁴ pfu個病毒)上之rAd-LacZ，進行ELISA分析，以測定其抗腺病毒抗體之含量。然後將具有固定抗原之ELISA孔槽，以5%脫脂牛奶(溶於PBS中)於室溫下封阻1小時，並以200μL PBS(含0.05% Tween 20)清洗三次。將各血清作兩倍系列稀釋(80至163840)，取100μL添加至具有固定病毒之孔槽，於室溫下反應2小時。以200μL清洗緩衝液(含0.5% Tween 20之PBS)清洗孔槽三次。然後添加100μL之辣根過氧化酶(HRP)共軛驢子抗小鼠IgG抗體(Jackson)或抗小鼠IgA抗體(ZYMED)，以偵測抗RSV結合抗體之結合作用。於室溫下反應一小時後，以清洗緩衝液清洗培養盤四次，然後於孔槽中添加70.0μL SureBlue^TM TMB過氧化酶受質溶液(Kirkegaard & Perry Laboratories)。在黑暗中反應15分鐘後，以ELISA讀取機(SPECTRA NAX M2,Molecular Devices)中記錄波長450nm之吸收度。

本實例亦使用相同之ELISA程序，測定BAL中之IgA水平。結果顯示鼻內投予rAd-F0△TM或rAd-F0亦導致F蛋白質專一性IgA抗體的產生。發現相較於給予HIRSV-B1之動物樣本，經rAd-F0△TM免疫之小鼠，其血清及BAL中IgA抗體效價略低，但顯著高於在經rAd-F0疫苗接種之小鼠樣本所中測得之水平(圖2)。F蛋白質專一性IgG抗體並未在所有受試 BAL樣本中偵測到(數據未顯示)。

實例3：經鼻內途徑以rAd-F0及rAd-F0△TM產生之免疫血清之交叉反應性及病毒中和活性

在以rAd-F0△TM及rAd-F0經鼻內途徑進行免疫之小鼠中，其所產生的抗RSV-B1抗體亦與RSV Long品系或A2品系產生交叉反應。BALB/c小鼠接受兩次投予10⁷ pfu之rAd-F0、rAd-F0△TM、rAd-LacZ或HIRSV-B1，在追加投藥10天後收集其血清樣本，然後針對固定於ELISA培養盤孔槽中之加熱去活化的RSV B1品系、RSV Long品系及RSV-A2品系，分析其效價。如圖3A中之結果所示，來自rAd-F0△TM免疫小鼠之血清，其針對RSV Long品系之抗體效價在5120及40960之範圍內(平均值=18432)，而針對RSV-A2品系之抗體效價者則在320及5120之範圍內(平均值=1600)。類似地，以免疫原性較低之rAd-F0構築體所得之免疫血清顯示中度的病毒交叉反應性。針對RSV Long品系及RSV-A2品系之結合效價平均值分別為3968及1072，顯著低於rAd-F0△TM免疫所得抗體效價，但與rAd-F0所得抗體效價相當。我們以免疫墨點法進一步檢驗來自rAd-F0△TM及rAd-F0免疫小鼠之血清是否能專一性地辨識RSV-B1粒子之F蛋白質。結果顯示，可結合至RSV F蛋白質之F1次單元之人類多株抗RSV F抗體，以及來自經rAd-F0△TM及rAd-F0免疫的小鼠之血清可辨識F蛋白質，但經rAd-LacZ免疫的小鼠之血清則無法辨識(圖3B)。在墨點法的膜中，來自經rAd-F0△TM及rAd-F0免疫的小鼠之血清亦偵測到降解之F蛋白質。這可能是由於HIRSV-B1粒子之製備過程所致。

病毒中和試驗及病毒負荷量測定

為測定免疫血清之RSV專一性中和活性，將50μL經系 列稀釋之血清(以免疫前正常小鼠之血清進行等量稀釋)與50.0μL(10³ pfu)活RSV-B1品系、Long品系或A2品系混合，於37℃下反應1小時。然後將混合物加至每個孔槽含2 x 10⁵ Hep-2細胞之6孔培養盤中。一小時後，加入1.5%(w/v)半固態之甲基纖維素，覆蓋孔槽。以相同劑量之病毒處理Hep-2細胞培養物作為正對照組。5天後，以光學顯微鏡評估經RSV誘發所形成之細胞融合，並以回歸分析計算細胞融合的降低情形，得出60%之細胞融合降低效價(抑制60%之溶菌斑形成)。以3.7%福馬林固定第二組類似的實驗培養物，並以1%蘇木精及伊紅染色呈現出溶菌斑，在光學顯微鏡下計數之。

如圖4A所示，發現得自重組腺病毒免疫小鼠之血清具有病毒中和活性。相較於投予rAd-F0之動物，在rAd-F0△TM免疫小鼠中測得較高的RSV-B1專一性中和效價。給予HIRSV-B1之小鼠中之RSV-B1專一性中和抗體水平係位於80至320之範圍內(平均值=160)，顯著高於投予重組腺病毒之動物中所產生之抗體水平(圖4A)。經重組腺病毒免疫之小鼠中所產生之抗體亦針對RSV A2品系展現出強效的交叉中和活性。相較於rAd-F0免疫動物血清之效價平均值為64及56，以rAd-F0△TM產生之免疫血清具有較強的交叉中和活性效力，其針對RSV Long品系及RSV A2品系之效價平均值為116及104。HIRSV-B1疫苗接種小鼠中所產生之RSV-B1中和抗體亦可交叉中和RSV Long品系及RSV-A2品系單離物，其效力與來自投予rAd-F0△TM之動物產生的抗體之效力相當。

以各種稀釋度(4x、8x、16x、32x、64x及128x)之重組腺病毒免疫小鼠，培養4天後分別記錄小鼠BAL樣本中之IgA抗體量。如圖4B所示，類似於病毒中和活性，發現自經rAd-F0及rAd-F0△TM免疫小之鼠所收集之BAL樣本(各樣本以1：4稀釋)抑制了Hep-2細胞之RSV-B1感染(各BAL樣本係以1：4稀釋後進行分析)。進行不成對雙尾學生t試驗，以比較 得自不同實驗組小鼠之結果。當p值小於0.05時結果即表示具有統計上之顯著性(符號*及**分別用於表示p值小於0.05及小於0.01)。自該等實驗動物組收集之BAL樣本之間，具有相當效價水平之RSV-B1結合IgA抗體，其病毒中和活性在統計上並無顯著差異。具有顯著較高效價之病毒專一性IgA抗體的BAL樣本(來自經HIRSV-B1免疫之小鼠)具有效力較大的病毒中和活性。

實例4：在rAd-F0△TM及rAd-F0免疫小鼠中誘發病毒專一性CD4 ⁺ T細胞反應

本實例係研究有關經rAd-F0△TM及rAd-F0免疫之小鼠所誘發之F蛋白質專一性CD4⁺ 淋巴球反應情形，這是因為已知Th1及Th2表現型CD4⁺ 輔助T細胞所提供免疫學上的協助可調控抗原專一性體液及細胞毒性T細胞(CTL)反應。

由各實驗小鼠之脾臟製備脾細胞懸浮液。待細胞沉降後，添加5.0mL冰冷紅血球細胞(RBC)水解緩衝液(Gibco)至細胞沉澱物。以移液器持續地溫和吸放1分鐘，以利紅血球細胞水解。添加5.0mL培養基(CM：DMEM(Gibco)，含有10.0%胎牛血清及100μg/mL盤尼西林/鏈黴素混合物)使水解作用停止。於2,000rpm離心5分鐘使淋巴球沉澱，並且以10.0mL CM再依次清洗之。然後在10³ pfu HI-RSB-B1存在或不存在下，將脾細胞(2 x 10⁶ )培養於24孔組織培養盤(Corning)中。將培養物維持於37℃及5.0% CO₂ 之培養器中。48小時後，收集培養物上清液並在試驗前貯存於-80℃下。使用購自eBioscience之抗體對(IL-13-Cat.No.88-7137-88；IL-17-Cat No 88-7371-88；IL-4-Cat.No.BMS609MST；IL-5-Cat.No.BMS610MST；IL-10-Cat.No.BMS614MST)分別針對存在於培養物上清液中之Th1(IFN-γ)及Th2(IL-4、IL-5、IL-10及IL-13)細胞激素以及IL-17予以定量。作為標準物之重組IFN-γ 及IL-13係購自eBioscience，而重組IL-4、IL-5及IL-10則購自Bender MedSystems,Inc.。

以HIRSV-B1進行活體外再刺激後，經對照組構築體rAd-LacZ免疫之小鼠淋巴球產生582±138pg/mL(平均值)之IFN-γ背景水平。相較之下，分別投予rAd-F0△TM及rAd-F0之小鼠，在經HIRSV-B1刺激其脾細胞培養物上清液所測得之IFN-γ水平則顯著較高，分別為1709±433pg/mL及1988±429pg/mL(圖5)。如圖5所示，得自HIRSV-B1免疫組之脾細胞係分泌出較低量之IFN-γ(593±100pg/mL)。在Th2細胞激素分析組別中，經rAd-F0△TM及rAd-F0免疫之小鼠以HIRSV-B1刺激後分別分泌出IL-4之平均量為663±322及349±168pg/mL，IL-5之平均量為2221±483及1855±375pg/mL，IL-10之平均量為300±138pg/mL及無法測得，以及IL-13之平均量為2669±426及1520±94pg/mL。相較之下，經HIRSV-B1疫苗接種之小鼠在以RSV-B1刺激後，則產生顯著較高水平之該等細胞激素。另一值得注意的結果是，得自HIRSV-B1免疫小鼠之脾細胞對HIRSV-B1刺激之反應為產生相當大量之IL-17(3042±1398pg/mL)。這與經rAd-F0△TM或rAd-F0免疫之動物之脾細胞分泌幾乎無法測得之IL-17量明顯不同。有鑒於上述結果，經rAd-LacZ疫苗接種之動物以HIRSV-B1刺激後之脾細胞有明顯分泌IL-17的現象，該等結果表示由RSV-B1 F蛋白質所驅動之CD4⁺ 細胞活化不會導致具有生產IL-17之表現型的次族群分化。

實例5：在經rAd-F0及rAd-F0△TM疫苗接種之小鼠中誘發RSV F專一性CTL

本實例係研究以rAd-F0△TM及rAd-F0構築體免疫而誘發F專一性CTL的情形，藉以偵測經感染之標的細胞之細胞凋亡。使用顆粒酶B ELISPOT分析方法測量CTL針對F_85-93 肽 (即KL-9，KYKNAVTEL)之頻率。已知KL-9為免疫動物脾臟中之一種肽，包含RSV F蛋白質之免疫優勢H-2K^d 限制型抗原決定部位，且在10U/mL重組IL-2存在下於37℃中反應5天時，包含RSV F蛋白質之優勢K^d 限制型CTL抗原決定部位(Chang J,Srikiatkhachorn A,Braciale TJ.Visualization and characterization of respiratory syncytial virus F-specific CD8(+)T cells during experimental virus infection.J Immunol 2001 Oct 15；167(8)：4254-60)。

依據先前的描述，顆粒酶B釋放ELISPOT分析方法可測出抗原專一性CTL之作用細胞(effector)功能(Shafer-Weaver K,Sayers T,Strobl S,Derby E,Ulderich T,Baseler M,et al.The Granzyme B ELISPOT assay：an alternative to the 51Cr-release assay for monitoring cell-mediated cytotoxicity.J Transl Med 2003 Dec 29；1(1)：14)，其係用於評估免疫動物脾臟中RSV F蛋白質專一性CTL之存在。該分析方法係以2.0μg/mL之KL-9肽培養5x10⁶ 個脾細胞。在進行分析之前，標的細胞(p815細胞)先以30：1、10：1及1：1之比例加入2.0μg/mL之KL-9肽，放入有抗顆粒酶B捕捉抗體覆蓋的孔槽中，於37℃下反應2天。以未處理之p815細胞作為對照組。將細胞以每孔10⁴ 個(100μL)之數量添加至96孔培養盤之孔槽中，該孔槽已預先覆蓋小鼠顆粒酶B專一性單株捕捉抗體(R&D)(每孔0.1μg)，再加入適當數量經活體外再刺激之脾細胞(作為作用細胞)。以所設定之效應細胞：標的細胞(E：T)比例進行一式三份的細胞培養。兩天後，使細胞停止生長並以清洗緩衝液將培養盤清洗三次，然後添加100μL之PBS-Tween 20(含0.25μg小鼠顆粒酶B專一性單株偵測抗體)。將培養盤置於4℃下過夜，以清洗緩衝液清洗四次，然後添加100μL含有鏈黴親和素之鹼性磷酸酶，使培養盤於室溫下反應2小時。再次將孔槽清洗四次，然後添加100μL受質(BCIP/NBT)以呈 現出免疫點(immunospot)。於黑暗中反應30分鐘後，以水清洗培養盤，待其乾燥，並使用ELISPOT讀取機(C.T.L.IMMUNOSPOT,CELLULAR TECHNOLOGY LTD)計數免疫點數。

將得自rAd-LacZ免疫小鼠之脾細胞(作用細胞)與10⁴ 個加有KL-9肽之p815細胞(標的細胞)以30：1、10：1及1：1之作用細胞/標的細胞之比例共同培養後，得到分泌顆粒酶B之脾細胞效應細胞之平均背景數目。反之，rAd-F0△TM免疫小鼠較投予rAd-F0之動物達到顯著較強烈之KL-9限制反應。在HIRSV-B1免疫小鼠中並未偵測到KL-9限制之CTL反應(圖6)。

實例6：rAd-F0△TM及rAd-F0構築體對活RSV攻毒之免疫保護功效

本實例評估以rAd-F0△TM及rAd-F0施行鼻內免疫所誘發之抗病毒體液及細胞免疫反應，並與HIRSV-B1疫苗接種所產生之反應相比較，俾瞭解其對活RSV攻毒之免疫保護能力。所選定用於評估保護功效之參數包括測量肺部病毒血症、由初始體重下降之回復，以及血中嗜伊紅血球增多。

測定肺部病毒負荷量

將各小鼠以各別免疫原經鼻內途徑進行免疫，然後以10⁶ pfu之活RSV-B1施行鼻內攻毒。在攻毒5天後，使用溶菌斑形成試驗測定各小鼠肺中之病毒溶菌斑。將各實驗小鼠之完整肺部取出並均質化。均質化之組織於4℃下以3,000rpm離心10分鐘，使細胞殘餘物沉澱。收集上清液，進行系列稀釋，並以溶菌斑形成試驗測試其感染Hep-2細胞之能力。在圖7中，水平短槓符號代表得自各實驗組之溶菌斑平均值。

如圖7所示，相較於經對照組rAd-LacZ載體免疫之小鼠 肺中測得之376±120個溶菌斑，在經兩劑HIRSV-B1免疫且以1 x 10⁶ pfu活RSV-B1病毒攻毒之動物中，觀察到明顯降低的肺部病毒溶菌斑數(127±42)。在經rAd-F0△TM疫苗接種之小鼠中觀察到類似程度的保護作用，而經rAd-F0免疫之動物則受到較少的保護。

體重喪失

在本研究中，測量經活RSV-B1攻毒之小鼠的漸進體重，無論該小鼠係以rAd-F0△TM、rAd-F0、rAd-LacZ或HIRSV-B1免疫，均進行體重測量，另外，也測定一組未經處理之小鼠。然後以10⁶ pfu之活RSV-B1，對各動物進行鼻內接種。每日記錄各小鼠之體重。圖8之結果顯示，無論小鼠是以rAd-F0△TM、rAd-F0、rAd-LacZ或HIRSV-B1預先免疫，在以活RSV-B1攻毒後，均會發生初始體重喪失。發現經rAd-F0△TM、rAd-F0或HIRSV-B1預先免疫之實驗組小鼠，在病毒攻毒後2天時，達到最多體重喪失。在該等實驗組中，在該時點後，可見到體重逐漸回復。反之，在投予PBS及以rAd-LacZ免疫之小鼠中，體重喪失多進行了一日，在回復前於第4天達到其最大值。到第7天時，各實驗組小鼠之體重均已回到正常。

測定血中嗜伊紅血球增多

將各小鼠以免疫原經鼻內途徑免疫兩次，然後以10⁶ pfu之活RSV-B1施行鼻內攻毒。活RSB攻毒7天後以尾部靜脈穿刺取得周邊血液樣本，將之收集於內含5.0μL 3% EDTA之滅菌微量離心管(Corning)中。取5μL血塗抹於載玻片上。於室溫下乾燥該血液樣本，然後以1.0-2.0mL Wright-Giemsa染劑溶液(Sigma-Aldrich)於室溫下將其染色1.5分鐘。以去離子水將載玻片漂洗兩次以洗去多餘的染劑。於空氣中乾燥 後，於油封顯微鏡下計數呈紅色/粉紅色細胞之嗜伊紅血球，將其數量記錄為總白血球之百分比。

如圖9所示，血中嗜伊紅血球計數之結果顯示，在以rAd-F0及rAd-F0△TM免疫之小鼠中，分別有2.6%及3.2%之白血球為嗜伊紅血球(圖9)，其顯著低於以rAd-LacZ及HIRSV-B1免疫之小鼠中測得的嗜伊紅血球比例5.0%及4.7%。

以上實例顯示經各重組腺病毒疫苗接種之小鼠中所表現之F0及F0△TM蛋白質具有免疫原性，這可由F蛋白質專一性體液及細胞免疫反應的誘發判斷出來。存在於使用rAd-F0及rAd-F0△TM以鼻內/鼻內、鼻內/皮下或鼻內/腹膜內途徑進行初次免疫及加強免疫之小鼠的血清及BAL中之F蛋白質專一性抗體，具有病毒中和活性。進一步證實，腺病毒構築體所誘發之血清抗體可與RSV-long及-A2品系之F蛋白質交叉反應。本發明值得注意之發現為鼻內傳遞重組腺病毒在誘發免疫小鼠支氣管肺泡灌洗液中之F專一性IgA抗體方面之效力。以rAd-F0及rAd-F0△TM施行鼻內免疫亦使得RSV F蛋白質被正確處理，進而產生第1類MHC限制型CTL。

rAd-F0及rAd-F0△TM構築體所誘發之抗病毒免疫性可針對活RSV-B1病毒攻毒提供保護作用。這可由經重組腺病毒鼻內免疫之動物肺中之病毒負荷量較低，但rAd-LacZ構築體對照組則否獲得證明。以rAd-F0或rAd-F0△TM構築體施行疫苗接種，可使活RSV攻毒後之初始體重喪失加速回復，其較給予rAd-LacZ之小鼠中所觀察到之速度為快。保護作用研究顯示投予rAd-F0△TM之小鼠對RSV攻毒之抵抗性較強，相較於以免疫原性較低之rAd-F0構築體免疫之動物而言，可達到更強的病毒中和抗體及CTL反應。

由於目前並無RSV疫苗，本發明使用加熱去活化之RSV製備物，以比較提供對抗RSV感染之保護作用之抗病毒體液免疫反應。的確，經HIRSV-B1免疫之小鼠所產生之病毒專一 性結合及中和抗體水平，顯著高於投予rAd-F0或rAd-F0△TM之小鼠，且發現其在活RSV攻毒方面受到至少相等之保護。總而言之，經HIRSV-B1免疫之小鼠並未達到CTL反應，其抗病毒免疫性可能是來自針對F蛋白質及G抗原(亦含有病毒中和抗原決定部位)所產生之中和抗體所致。然而，在經本發明重組腺病毒構築體疫苗接種且隨後接受活RSV攻毒之小鼠中，所觀察到之嗜伊紅血球水平顯著低於經HIRSV-B1預先免疫且隨後接受活RSV攻毒之小鼠中者。因此，結論為以HIRSV-B1(而非本發明之F蛋白質表現腺病毒構築體)免疫導致了T細胞的產生而分泌出增量之Th2細胞激素。

在此亦觀察到，相較於經本發明重組腺病毒構築體rAd-F0疫苗接種之小鼠，經HIRSV-B1免疫之小鼠之脾細胞產生明顯較高水平之IL-17。出乎意料地，在經本發明疫苗rAd-F0△TM疫苗接種之小鼠脾臟中並未偵測到產生IL-17(與發炎反應有關)之Th17細胞。以上發現指出，G醣蛋白及F蛋白質跨膜部分的存在可能驅使CD4⁺ 細胞分化發展，而導致Th1及Th2表現型以及額外的Th17表現型之產生。因為Th17被發現與發炎反應的各方面有實質上的關聯性(Annunziato et al,The phenotype of human Th17 cells and their precursors,the cytokines that mediate their differentiation and the role of Th17 cells in inflammation；Int Immunol 2008 Nov；20(11)：1361-8)，本發明重組腺病毒疫苗使用RSV之F蛋白質取代醣蛋白應可避免不想要的副作用(發炎)，同時仍維持強大的免疫功效。

本申請案中所引用之所有出版品及專利文獻，無論引用之目的均以參考方式將其全文併入，併入程度相當於如同個別代表各出版品及專利文獻。

上述發明內容及實施方式與所附圖式一併閱讀將更增瞭 解。為達闡明本發明之目的，圖式中所示具體實例為目前較佳者。然而，應瞭解本發明並不限於所示之較佳具體實例。

圖1A顯示本發明兩種重組腺病毒構築體(rAd-F0及rAd-F0△TM)各部分之示意圖，其中rAd-F0係將RSV-B1之全長F基因(F0)選殖於複製缺陷性之腺病毒構築體，而rAd-F0△TM則為將跨膜區截除之RSV-B1 F基因(F0△TM)選殖於複製缺陷性之腺病毒構築體。

圖1B之影像顯示F0及F0△TM基因在293A細胞中之表現情形，其中可發現F0之559bps、F0△TM之378bps及β-肌動蛋白之267bps PCR產物。

圖1C之影像顯示由經rAd-F0及rAd-F0△TM構築體感染之293A細胞所製備之水解物之免疫墨點，其中F0及F0△TM蛋白質分別具有62KDa及57KDa之分子量。

圖2顯示經rAd-F0、rAd-F0△TM、rAd-LacZ及HIRSV疫苗接種之四組小鼠之免疫血清及支氣管肺泡灌洗液(BAL)中之RSV F專一性IgA效價。

圖3A顯示BALB/c小鼠血清中之RSV專一性IgG效價，其中各短槓符號表示rAd-F0、rAd-F0△TM、rAd-LacZ及HIRSV-B1等各組之平均效價。

圖3B之影像顯示以10² 個加熱去活化RSV-B1病毒顆粒作為抗原之SDS-PAGE電泳/薄膜轉移之免疫墨點，上述抗原係以由各組收集合併之血清(1：500稀釋)或人類多株抗RSV F血清(1：200稀釋)進行免疫墨點分析。

圖4A顯示各免疫血清在不同稀釋度下之活性，其中結果係以中和效價表示，該中和效價係依據免疫血清達到60%溶菌斑形成抑制之稀釋度而表示。

圖4B顯示不同稀釋度(4x、8x、16x、32x、64x及128x)之BAL培養4天後分別達到之溶菌斑數目，其中*及**分別代表p<0.05及p<0.01；該等結果指出rAd-F0及rAd-F0△TM 組之活性顯著較佳於經rAd-LacZ免疫之對照組(即rAd-LacZ組)活性。

圖5顯示在以rAd-LacZ、rAd-F0、rAd-F0△TM或HIRSV-B1經鼻內途徑免疫之小鼠所誘發之RSV專一性CD4⁺ T細胞反應，其中該等結果係以各細胞激素之濃度(pg/mL)表示(*及**分別代表p<0.05及p<0.01，表示該等反應與HIRSV-B1免疫組有顯著差異；p>0.05表示數值並無顯著差異)。

圖6顯示實驗小鼠脾臟中之顆粒酶B分泌細胞數，其中脾細胞係由經rAd-LacZ(˙)、rAd-F0(■)、rAd-F0△TM(△)、HIRSV-B1(O)或PSB(□)緩衝液免疫之小鼠所製備。該等結果係以各實驗組之顆粒酶B免疫點+/-兩個標準差表示。

圖7顯示實驗小鼠肺中病毒溶菌斑之測定，其中該等結果係以各實驗小鼠之溶菌斑數目表示(*及**分別代表p<0.05及p<0.01，表示結果與PBS免疫對照組有顯著差異)。

圖8顯示實驗小鼠經活RSV-B1攻毒後之體重監測，包括以PBS(■)、rAd-LacZ(O)、rAd-F0(˙)、rAd-F0△TM(◇)及HIRSV-B1(▲)經鼻內途徑免疫二次之五組小鼠，以及未處理組(＊)；該等結果係以每組5隻小鼠之體重變化%(平均值)及一個標準差表示(*及**分別代表p<0.05及p<0.01，表示rAd-F0及rAd-F0△TM組之結果與rAd-LacZ免疫對照組有顯著差異)。

圖9顯示未處理及經疫苗接種之小鼠之血中嗜伊紅血球增多情形，其結果係以總白血球中嗜伊紅血球%表示。

<110> 國家衛生研究院

<120> 人類呼吸道融合病毒(RSV)疫苗

<130> NHR0005_US

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1722

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1722)

<300>

<308> GenBank/NC_001803

<309> 2008-12-08

<313> (1)..(1722)

<400> 1

<210> 2

<211> 574

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 1572

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1572)

<300>

<308> GenBank/NC_001803

<309> 2008-12-08

<313> (1)..(1572)

<400> 3

<210> 4

<211> 524

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

Claims (8)

1. 一種複製缺陷性重組腺病毒構築體用於製備供預防RSV感染或RSV感染相關疾病同時避免產生發炎或嗜伊紅血球增多之副作用之疫苗組合物的用途，其中該重組腺病毒構築體於E1及E3基因經截除或去活化，並攜帶編碼RSV之全長F蛋白質之SEQ ID NO：1的核苷酸序列或攜帶編碼RSV之跨膜區截除之F蛋白質之SEQ ID NO：3的核苷酸序列，其中該疫苗組合物可誘導對抗RSV感染之保護性免疫力，同時避免產生發炎或嗜伊紅血球增多之副作用。
2. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該RSV為人類RSV。
3. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該重組腺病毒構築體攜帶編碼RSV之全長F蛋白質之SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
4. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該重組腺病毒構築體攜帶編碼RSV之跨膜區截除之F蛋白質之SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
5. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該複製缺陷性腺病毒為第5血清型腺病毒(Ad5)。
6. 根據申請專利範圍第1-5項中任一項之用途，其中該RSV感染相關疾病係選自由中耳炎、細枝氣管炎、嗜伊紅血球增多及肺炎所組成之群。
7. 根據申請專利範圍第1-5項中任一項之用途，其中該藥物係經黏膜投予。
8. 根據申請專利範圍第1-5項中任一項之用途，其中該藥物係經鼻內投予。