TWI411393B - 乙烯生物合成之化學抑制劑 - Google Patents

乙烯生物合成之化學抑制劑 Download PDF

Info

Publication number
TWI411393B
TWI411393B TW100120756A TW100120756A TWI411393B TW I411393 B TWI411393 B TW I411393B TW 100120756 A TW100120756 A TW 100120756A TW 100120756 A TW100120756 A TW 100120756A TW I411393 B TWI411393 B TW I411393B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
ethylene
compound
compounds
eto1
avg
Prior art date
Application number
TW100120756A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201212819A (en
Inventor
Long Chi Wang
Lee Chung Lin
Original Assignee
Academia Sinica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academia Sinica filed Critical Academia Sinica
Publication of TW201212819A publication Critical patent/TW201212819A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI411393B publication Critical patent/TWI411393B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/78—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 2
    • C07D239/84—Nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

乙烯生物合成之化學抑制劑
本發明係有關改良採收後植物之品質的方法。本發明亦有關適用於改良採收後植物之品質的新穎ACC合成酶抑制劑。
乙烯為一種重要的氣體植物激素，其在諸如種子萌芽、根發育、葉及花衰老以及果實成熟之過程中調節植物生長及發育，且對多種逆境產生反應(Bleecker等人,(2000)Annu Rev Cell Dev Biol 16 ,1-18；Johnson等人,(1998)Annu Rev Genet 32 ,227-254；Lin等人,(2009)J Exp Bot 60 ,3311-3336；Wang等人,(2002)Plant Cell 14 增刊,S131-151)。乙烯因具有多種功能而在植物之適應及存活中具有關鍵作用。在乙烯存在下，黃化幼苗呈現光形態形成表型，稱為三相反應(triple response)：頂端鉤(apical hook)之曲率擴大、胚軸徑向脹大，以及胚軸及根縮短(Ecker,J. R.(1995)Science 268 ,667-675)。三相反應表型已成功地在擬南芥(Arabidopsis thaliana )中用於鑑別在乙烯生物合成(biosynthesis)或反應方面具有缺陷之突變體(Ecker,J. R.(1995)Science 268 ,667-675；Chang等人,(1993)Science 262 ,539-544；Guzman等人,(1990)Plant Cell 2 ,513-523；Roman等人,(1995)Genetics 139 ,1393-1409)。針對乙烯突變體之進一步研究揭示在鼠耳芥屬(Arabidopsis )之乙烯生物合成及信號轉導中關鍵組分的遺傳層次((Lin等人,(2009)J Exp Bot 60 ,3311-3336；Yoo等人,(2009)Trends Plant Sci 14 ,270-279)。乙烯信號傳導首先由乙烯配位體與其位於內質網(ER)膜中之受體之間的進行相互作用啟動(Chen等人,(2002)J Biol Chem 277 ,19861-19866；Grefen等人,(2008)Mol Plant 1 ,308-320)。乙烯配位體結合至受體將使負調節劑CTR1產生不活化的狀況，而無法抑制EIN2(Bleecker等人,(1998)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 353 ,1405-1412)。在乙烯配位體不存在的狀態下，乙烯受體會活化CTR1從而抑制EIN2，因此乙烯受體被定義為乙烯反應之負調節劑(Huang等人,(2003)Plant J 33 ,221-233；Qiao等人,(2009)Genes Dev 23 ,512-521)。已知乙烯受體、CTR1及EIN2之間的功能性相互作用發生於ER膜中或ER膜附近(Chen等人,(2002)J Biol Chem 277 ,19861-19866；Bisson等人,(2009)Biochem J 424 ,1-6；Gao等人,(2003)J Biol Chem 278 ,34725-34732)。解除抑制的EIN2可藉由一種未知機制使本來不穩定之轉錄因子EIN3穩定(Qiao等人,(2009)Genes Dev 23 ,512-521；Alonso等人,(1999)Science 284 ,2148-2152；Guo等人,(2003)Cell 115 ,667-677；Potuschak等人,(2003)Cell 115 ,679-689)。接著，EIN3活化一系列負責乙烯反應的基因(Chao等人,(1997)Cell 89 ,1133-1144；Solano等人,(1998)Genes Dev 12 ,3703-3714)。雖然乙烯信號傳導之主要路徑已藉由研究鼠耳芥屬之基因突變體得到闡明，但某些調節關鍵組成因子之基因亦可經由其他方法而發掘(Guo等人,(2003)Cell 115 ,667-677；Potuschak等人,(2003)Cell 115 ,679-689；Yoo等人,(2008)Nature 451 ,789-795)，這些例子說明可使用新方法研究乙烯之功能。
幾乎所有的植物組織在氧存在下均可合成乙烯氣體(Yip等人,(1988)Plant Physiol 88 ,553-558)。在植物中，乙烯生物合成涉及3個步驟。SAM合成酶催化甲硫胺酸形成S-腺苷甲硫胺酸(S-AdoMet或SAM)。藉由1-胺基環丙烷-1-甲酸(ACC)合成酶(ACS)使SAM轉化為ACC來執行乙烯之生物合成(Yang等人,(1984)Annual Review of Plant Physiology 35 ,155-189)。隨後ACC氧化酶(ACO)使ACC氧化為乙烯。雖然ACO係常發性地表現且可進一步由創傷及乙烯誘導(Barry等人,(1996)Plant J 9 ,525-535；English等人,(1995)Plant Physiol 109 ,1435-1440)，但除非受到逆境信號誘導或處於某些發育階段，否則ACS之基礎活性極低(Tsuchisaka等人,(2004)Plant Physiol 136 ,2982-3000)。因此，ACS為乙烯生物合成途徑催化速率之限制步驟，該步驟在高等植物物種中為受到高度調節之過程(Yang等人,(1984)Annual Review of Plant Physiology 35 ,155-189)。乙烯生物合成途徑中所涉及的所有酶(包括SAM合成酶、ACC合成酶及ACC氧化酶)均由基因家族所編碼，說明乙烯之產生為一種複雜的多層次調節(Lin等人(2009)J Exp Bot 60 ,3311-3336)。
在乙烯生物合成之調節方面具有缺陷的基因突變體，多已在鼠耳芥屬中獲得鑑定(Guzman等人,(1990)Plant Cell 2 ,513-523；Roman等人,(1995)Genetics 139 ,1393-1409)。在黃化幼苗中，三種乙烯過量產生(ethylene overproducer ；eto )突變體eto1 、eto2 及eto3 產生的乙烯量為野生型芥菜屬中所產生量的5倍至50倍(Guzman等人,(1990)Plant Cell 2 ,513-523；Chae等人,(2003)Plant Cell 15 ,545-559)。鼠耳芥屬之ETO2 及ETO3 分別編碼為ACS5及ACS9(基因家族中2型ACS之兩種同功異型物)(Chae等人,(2003)Plant Cell 15 ,545-559；Vogel等人,(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95 ,4766-4771；Yoshida等人,(2005)BMC Plant Biol 5 ,14)。ETO1會與2型ACS蛋白結合且與SCF泛素E3連接酶中的CUL3相互作用(Yoshida等人,(2005)BMC Plant Biol 5 ,14；Christians等人,(2009)Plant J 57 ,332-345；Thomann等人,(2005)FEBS Lett 579 ,3239-3245；Wang等人,(2004)Nature 428 ,945-950)。ETO1及類-ETO1(E TO 1-L ike;EOL)蛋白藉由泛素-蛋白酶體路徑調節ETO2/ACS5及ETO3/ACS9之蛋白質穩定性(Christians等人,(2009)Plant J 57 ,332-345；Wang等人,(2004)Nature 428 ,945-950)。eto2-1 及eto3-1 中之超效對偶基因突變(hypermorphic mutation)分別破壞ACS5及ACS9與ETO1的蛋白質相互作用，引起ACS活性升高及隨後的乙烯過量產生，從而產生模擬ETO1 中之功能損失突變的表型(Guzman等人,(1990)Plant Cell 2 ,513-523；Chae等人,(2003)Plant Cell 15 ,545-559；Vogel等人,(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95 ,4766-4771)。ETO1與2型ACS之間的蛋白質-蛋白質相互作用，如何由內部及外部信號調節從而調節乙烯的產生仍不清楚。
藉由化學篩選在生物過程中作為臨床上重要蛋白質調節劑的小分子已廣泛應用於藥物開發中(Knight等人,(2007)Cell 128 ,425-430)。對於在遺傳突變體中致死性為關鍵問題的生物體中進行功能性的研究而言，小分子提供可逆、條件性及快速作用的優勢。在某種意義上，植物激素為可充當調節植物生理學之生物活性化合物的小分子。最近已意識到化學遺傳學為一種藉由組合化學篩選與遺傳學方法來探測鼠耳芥屬之植物生理學的新穎方法(Blackwell等人,(2003)Plant Physiol 133 ,448-455；Toth等人,(2010)Trends Plant Sci 15 ,81-88)。
本發明提供改良採收後植物之品質的方法，其包含向該等植物提供有效量之式I化合物：，其中R1 、R2 及R3 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；及R4 及R5 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之環烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。
在另一態樣中，本發明亦提供用於抑制植物中之1-胺基環丙烷-1-羧酸酯合成酶的化合物，其中該等化合物具有式I之結構：，其中R1 、R2 及R3 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；R4 及R5 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之環烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。
以引用的方式併入
本說明書中所提及的所有公開案、專利及專利申請案以引用的方式併入本文中用於所述目的，程度如同個別公開案、專利或專利申請案係明確且個別地指明以引用的方式併入一般。
本發明之新穎特徵具體闡述於隨附申請專利範圍中。藉由參考闡述利用本發明之原理之說明性實施例的以下【實施方式】及隨附圖式將獲得對本發明之特徵及優勢的更充分瞭解。
乙烯為對植物之適應及存活具有重要作用的氣體激素。為進一步瞭解乙烯之信號傳導及調節網路，使用基於表型的篩選策略鑑別干擾擬南芥之乙烯反應的化合物。藉由篩選具有10,000種結構不同小分子之集合物，鑑別出若干可抑制乙烯過量產生突變體eto1-4 之常發性三相反應表型的例示性發明化合物。例示性發明化合物在eto1-4 中降低對乙烯產生反應之報導基因的表現及以其他方式使乙烯含量升高。結構及功能分析揭示例示性發明化合物含有喹唑啉酮主結構。對涉及乙烯路徑之遺傳突變體及轉殖基因植物的進一步研究顯示，例示性發明化合物在ACC合成酶使S-腺苷甲硫胺酸轉化為1-胺基環丙烷-1-甲酸(ACC)之步驟中抑制乙烯的生物合成。利用活體外活性檢定及酶動力學分析進行的生物化學研究證明，代表性例示性化合物為ACC合成酶之非競爭性抑制劑。最後，全面基因表現型態分析(global gene expression profiling)發現，例示性發明化合物與胺基乙氧基乙烯基甘胺酸(一種ACC合成酶之有效抑制劑)可共調節很多基因。使用化學篩選可有效鑑別可調節鼠耳芥屬幼苗之乙烯反應的小分子。此等化合物之發現將有益於乙烯研究且將提供潛在適用於改良農業收穫物之品質的農用化學品。
藉由使用以表型為基礎(phenotype-based)之篩選策略，已鑑別出若干藉由干擾乙烯之生物合成而非信號轉導來抑制黃化eto1 幼苗之常發性三相反應表型的小分子。使用活體外活性檢定已證明，本發明分子為ACS酶之抑制劑。進一步酶分析顯示，例示性發明化合物不同於熟知胺基乙氧基乙烯基甘胺酸(AVG)而為新穎ACS抑制劑。另外，全面基因表現分析證明本發明小分子在乙烯反應中具有可使etol-4 中將近50%差異表現基因之表現恢復至野生型植物之表現量的生理學作用。
除非另有定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語具有與所屬之所主張標的物有關的標準含義。在本文術語存在複數種定義的情況下，以本章節中的定義為準。在提及URL或其他此類識別符或位址時，應瞭解此等識別符可變化且可存取網際網路上的特定資訊，但可藉由搜尋網際網路來發現等效資訊。提及其證明此類資訊可獲得且可公開傳播。
應瞭解上述一般性說明及下文詳細說明僅具例示性及說明性且不限制所主張之任何標的物。在本申請案中，除非另有具體說明，否則使用單數包括複數。須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「include」、「includes」及「included」)的使用不具有限制性。
如本文中所使用的術語「烷基」意謂含有1-10個碳原子的直鏈、分支鏈或環狀(在此情況下，其亦稱為「環烷基」)烴。烷基之說明性實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基己基、正庚基、正辛基、正壬基及正癸基。
如本文中所使用的術語「C1 -C6 烷基」意謂含有1-6個碳原子的直鏈、分支鏈或環狀(在此情況下，其亦稱為「環烷基」)烴。烷基之代表性實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、環丁基、正戊基、異戊基、新戊基、環戊基及正己基。
如本文中所使用的術語「環烷基」意謂僅含有碳及氫之單環或多環基團，且包括飽和、部分不飽和或完全不飽和基團。環烷基包括具有3至10個環原子的基團。環烷基之代表性實例包括(但不限於)以下部分：
。在一些實施例中，視結構而定，環烷基為單價基團或二價基團(例如伸環烷基)。
如本文中所使用的術語「芳族」係指具有含有4n+2個π電子之非定域π電子系統之平面環，其中n為整數。在一些實施例中，芳族環由五、六、七、八、九或九個以上原子形成。在其他實施例中，芳族物視情況經取代。該術語包括單環或稠合環多環(亦即，共用相鄰碳原子對之環)基團。
如本文中所使用的術語「芳基」係指形成該環之各原子為碳原子的芳族環。在一些實施例中，芳基環由五、六、七、八、九或九個以上碳原子形成。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基、菲基、蒽基、茀基及茚基。
在一些實施例中，如本文中所使用的術語「芳基」意謂視情況經1、2、3、4或5個獨立地選自由以下組成之群之取代基取代的芳基：烯基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基羰氧基、烷硫基、烷硫基烷基、炔基、羰基、氰基、甲醯基、鹵烷氧基、鹵烷基、鹵素、羥基、羥基伸烷基、巰基、硝基、-NRA RA 及(NRA RB )羰基。
如本文中所使用的術語「鹵基」或「鹵素」意謂-Cl、-Br、-I或-F。
術語「雜芳基」或「雜芳族」係指包括一或多個選自氮、氧及硫之環雜原子的芳基。含N「雜芳族」或「雜芳基」部分係指環中至少一個骨架原子為氮原子的芳族基。在一些實施例中，多環雜芳基為稠合或非稠合基團。例示性雜芳基包括(但不限於)以下部分：
。在一些實施例中，視結構而定，雜芳基為單價基團或二價基團(亦即伸雜芳基)。
術語「雜芳基」意謂經0、1、2、3或4個獨立地選自以下之取代基取代的雜芳基：烯基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基羰氧基、烷硫基、烷硫基烷基、炔基、羧基、氰基、甲醯基、鹵烷氧基、鹵烷基、鹵素、羥基、羥基伸烷基、巰基、硝基、-NRA RA 及-(NRA RB )羰基。
術語「經取代」意謂所提及之基團視情況經一或多個個別地且獨立地選自以下之基團取代(經其取代或未經其取代)：烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜脂環基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、烷基亞碸、芳基亞碸、烷基碸、芳基碸、氰基、鹵基、羰基、硫羰基、異氰酸酯基、硫氰基、異硫氰基、硝基、全鹵烷基、全氟烷基、矽烷基及胺基，包括經單取代之胺基及經二取代之胺基，及其經保護之衍生物。舉例而言，視情況選用之取代基為Ls Rs ，其中各Ls 獨立地選自一鍵、-O-、-C(=O)-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)2 -、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、S(=O)2 NH-、-NHS(=O)2 、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-(經取代或未經取代之C1 -C6 烷基)、或-(經取代或未經取代之C2 -C6 烯基)；且各Rs 獨立地選自H、(經取代或未經取代之低碳烷基)、(經取代或未經取代之低碳環烷基)、雜芳基或雜烷基。
如本文中所定義的術語「視情況經取代」意謂所提及之基團經零、一或多個如本文中所定義之取代基取代。
在本說明書中，基團及其取代基在某些實施例中經選擇可提供穩定的部分及化合物。
除非另有說明，否則使用質譜、NMR、HPLC、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。除非提供具體定義，否則使用關於分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學之標準實驗程序及技術所用的標準命名法。在某些情況下，化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞、以及治療患者均使用標準技術。在某些實施例中，重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉形(例如電穿孔、脂質體轉染)均使用標準技術。在一些實施例中，執行反應及純化技術，例如使用製造商說明書之套組或如通常所完成或如本文中所述來執行。
在一些實施例中，提供改良採收後植物之品質的方法，包含向該等植物提供有效量之式I化合物：，其中R1 、R2 及R3 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；R4 及R5 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之環烷基。在一些實施例中，R1 為H或視情況經取代之C1 -C8 烷基。舉例而言，R1 為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及其類似基團。在其他實施例中，R1 為視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。在某些實施例中，R1 為視情況經取代之苯基。在某些實施例中，R1 為視情況經取代之吡啶、哌啶或其類似物。在一些實施例中，R2 為H或視情況經取代之C1 -C8 烷基。舉例而言，R2 為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及其類似基團。在其他實施例中，R2 為視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。在某些實施例中，R2 為視情況經取代之苯基。在某些實施例中，R2 為視情況經取代之吡啶、哌啶或其類似物。在一些實施例中，R1 為H且R2 為視情況經取代之苯基。在某些實施例中，苯基係經烷氧基、鹵素或C1 -C8 烷基取代。在某些實施例中，苯基係經甲氧基、乙氧基、丙氧基及其類似基團取代。在某些實施例中，苯基係經F、Cl、Br或I取代。在某些實施例中，苯基係經甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及其類似基團取代。在其他實施例中，R1 及R2 獨立地為視情況經取代之C1 -C8 烷基或H。在某些實施例中，R1 及R2 獨立地為CH3 或H。在一些實施例中，R1 為CH3 且R2 為CH3 。在一些實施例中，R3 為視情況經取代之C1 -C8 烷基。在其他實施例中，R3 為H、甲基、乙基或正丙基。
在一些實施例中，提供改良採收後植物之品質的方法，包含向植物、植物之葉、芽、果實及/或花提供有效量之式1化合物。在其他實施例中，化合物施用於植物之根。
例示性發明化合物藉由例如噴灑於葉、芽、果實、花及/或根或「灌藥(drenching)」的方式來提供給植物。噴灑施用時，可利用此項技術中已知的技術將化合物噴灑於植物上，例如噴灑至溢流點。
在一些實施例中，本發明化合物係經調配成包含適當載劑的組合物。在某些實施例中，載劑包含有助於充分濕潤植物的陰離子型或非離子型界面活性劑。在灌藥方法中，可將含於適合調配物中的本發明化合物傾注至植物之週遭土壤中，或可利用此項技術中的任何已知技術向下施用於根。
在一些實施例中，採收後植物之經改良品質為維持葉、芽、果實及/或花在收穫後之新鮮度及品質。在某些實施例中，採收後植物之經改良品質為維持葉、芽、果實及/或花在收穫後之新鮮度。在某些實施例中，採收後植物之經改良品質為維持葉、芽、果實及/或花在收穫後之品質。在其他實施例中，採收後植物之經改良品質為延長切下之葉、芽及/或花之瓶插壽命(vase life)。在此等應用中，花卉批發商(commercial wholesale florist)可使用該方法來更早收穫花作物。另外，伴隨向開花植物施用例示性發明化合物的有益作用(諸如延長花壽命)可延續至收穫後的切花。
在一些實施例中，提供已用本發明化合物或包含本發明化合物之組合物處理的收穫之植物。本發明之採收後植物(包括植物之任何部分，例如葉、芽、果實及/或花)在收穫之後維持葉、芽、果實及/或花之新鮮度或品質。在一些情況下，本發明之採收後植物延長切下之葉、芽及/或花之瓶插壽命。
在一些實施例中，提供抑制植物中之1-胺基環丙烷-1-羧酸酯合成酶的化合物，其中該等化合物具有式I之結構：，其中R1 、R2 及R3 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；及R4 及R5 獨立地為H、視情況經取代之C1 -C8 烷基、視情況經取代之環烷基。
在一些實施例中，R1 為H或視情況經取代之C1 -C8 烷基。舉例而言，R1 為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及其類似基團。在其他實施例中，R1 為視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。在某些實施例中，R1 為視情況經取代之苯基。在某些實施例中，R1 為視情況經取代之吡啶、哌啶或其類似物。在一些實施例中，R2 為H或視情況經取代之C1 -C8 烷基。舉例而言，R2 為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及其類似基團。在其他實施例中，R2 為視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。在某些實施例中，R2 為視情況經取代之苯基。在某些實施例中，R2 為視情況經取代之吡啶、哌啶或其類似物。在一些實施例中，R1 為H且R2 為視情況經取代之苯基。在某些實施例中，苯基係經烷氧基、鹵素或C1 -C8 烷基取代。在某些實施例中，苯基係經甲氧基、乙氧基、丙氧基及其類似基團取代。在某些實施例中，苯基係經F、Cl、Br或I取代。在某些實施例中，苯基係經甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及其類似基團取代。在其他實施例中，R1 及R2 獨立地為視情況經取代之C1 -C8 烷基或H。在某些實施例中，R1 及R2 獨立地為CH3 或H。在一些實施例中，R1 為CH3 且R2 為CH3 。在一些實施例中，R3 為視情況經取代之C1 -C8 烷基。在其他實施例中，R3 為H、甲基、乙基或正丙基。
本發明提供干擾鼠耳芥屬之乙烯反應的例示性發明小分子。主要在鼠耳芥屬突變體中進行之習知遺傳學研究(揭示可以階層方式建立乙烯路徑的關鍵組分)已為瞭解乙烯反應如何起始及轉導奠定了基礎。在本文中，藉由使用乙烯突變體與化學篩選之組合進一步研究植物中之乙烯路徑來證明本發明方法。本發明已鑑別在結構上相關的喹唑啉酮為例示性發明化合物(表1)，根據以表型為基礎之篩選發現其可用作乙烯拮抗劑。例示性發明化合物之其他表徵揭示此等小分子為以非競爭方式抑制乙烯生物合成的新穎ACC合成酶抑制劑，且可潛在應用於(強烈建議接受以下修改)植物採收後熟之管理。
eto1-4 (以表型為基礎之化學篩選)被用來鑑別可干擾乙烯反應的例示性發明化合物，此干擾可發生於乙烯生物合成途徑中ACC合成酶使SAM轉化成ACC之下游的任何步驟。然而，所鑑別之例示性發明化合物僅影響乙烯生物合成，而不影響信號傳導路徑以完全抑制黃化eto1-4 中之三相反應表型。eto2-1 與eto1-4 胚軸表型之間並未發現顯著差異，不過eto2-1 產生的乙烯幾乎為eto1-4 的5倍(圖5)。雖然10 μM之例示性發明化合物完全抑制eto1-4 中之乙烯散發及胚軸表型，但其僅將eto2-1 之胚軸長度抑制25%，即使使用30 μM之最有效化合物7303亦是如此。此發現顯示，突變體表型之嚴重度及化合物之效能將決定以表型為基礎之化學篩選的結果。儘管AVG具有抑制乙烯生物合成之效能，但與eto1-4 相比，增加AVG濃度仍不能完全抑制etο2-1 之胚軸表型，而兩種突變體之乙烯產生量的減少程度相當(參見圖5)。eto2-1 之胚軸表型可能不完全依賴於過量產生之乙烯，且因此不完全受例示性發明化合物影響。
在一些實施例中，AVG及例示性發明化合物在抑制ACC合成酶方面之不同機制有助於其有效抑制乙烯產生。ACC合成酶為PLP依賴性酶且與胺基轉移酶相關(Yang等人,(1984)Annual Review of Plant physiology 35,155-189；Eliot等人,(2004)Annu Rev Biochem 73,383-415)。AVG為與SAM競爭ACC合成酶之催化位點的競爭性抑制劑(Boller等人,(1979)Planta 145,293-303；Hyodo等人,(1986)Plant Cell Physiol . 27,391-398)。另外，對來自蘋果及番茄之ACC合成酶的晶體結構研究提供的原子細節說明了PLP及AVG在ACS酶之活性位點中的化學相互作用(Capitani等人,(2002) J Biol Chem 277,49735-49742；Capitani等人,(2005) FEBS Lett 579,2458-2462；Huai等人,(2001) J Biol Chem 276,38210-38216)。穩定的酮亞胺結構由AVG與PLP在ACC合成酶中相互作用而形成，且因此提供不利於容納SAM作為受質的催化位點(Capitani等人,(2002) J Biol Chem 277,49735-49742)。不同於AVG，化合物7303顯示非競爭性抑制，其中抑制劑與酶-受質(E-S)複合物而非單獨與酶(E)相互作用從而消除產物形成。酶之動力學參數(諸如Km及Vmax)在非競爭性抑制中均降低。由於Km為受質與酶之間親和力之度量，因此降低之Km相當於在非競爭性抑制劑存在下具有較高親和力。此有趣現象發生的緣由為平衡轉移而形成E-S複合物，因抑制劑(I)結合至E-S而形成非生產性E-S-I複合物，引起E-S複合物濃度降低。酶動力學研究結果表明，在0.1 μM化合物7303存在下，重組ACS5之Km及Vmax分別自54.8±7.8 μM降至37.1±2.9 μM及自95.1±5.0 μM降至50.5±1.2 μM(根據為圖6B所準備之資料)，證明例示性化合物根據林韋福-勃克圖(Lineweaver-Burk plot)分類為非競爭性抑制劑。由於AVG可與PLP相互作用而形成抑制性加合物，因此該AVG亦為PLP依賴性酶之抑制劑(Clausen等人,(1997) Biochemistry 36,12633-12643；Krupka等人,(2000) EMBO J 19,3168-3178)並不令人驚訝。然而，本文中所鑑別之例示性發明化合物不可能為PLP依賴性酶之一般性抑制劑。
本文中所發現的例示性發明化合物在活體外有效抑制ACC合成酶活性且抑制eto1-4 幼苗中之乙烯產生。例示性發明化合物之效能不同。為瞭解例示性發明化合物在基因表現層面的生理學影響，使用DNA微陣列方法檢驗例示性發明化合物(與AVG相比較)所調節的基因表現型態。eto1-4 及WT中表現有差異之1,446種基因中約43%至50%受個別例示性發明化合物調節，相比之下，將近39%受AVG調節。1,446種基因之表現型態之階層式叢集亦建議受例示性發明化合物會調節基因而不依賴於乙烯反應。例示性發明化合物具有除調節乙烯生物合成及反應之外的功能。乙烯反應性基因之上述轉錄組研究(transcriptome study)集中於短時間內受乙烯處理差異調節的彼等基因(Goda等人,(2008)Plant J 55 ,526-542；Nemhauser等人,(2006)Cell 126 ,467-475)，且彼等實驗中所鑑別的基因可能為乙烯誘導特異性即刻目標。然而，本文中藉由微陣列分析所鑑別，在WT及etol-4 突變體之3日齡黃化幼苗中差異表現之276種基因，可能不為即刻乙烯反應性基因，而是代表引起由內源性乙烯含量升高所誘導之三相反應的調節網路。276種基因中僅39種符合由乙烯短暫誘導所獲得的上述資料，表示持續乙烯反應與即刻乙烯反應中存在差異(Nemhauser等人,(2006)Cell 126 ,467-475)。由於受AVG及例示性發明化合物共調節的276種基因係選自WT及etol-4 中表現有差異的1,446種基因，因此研究此等基因之功能的進一步分析將提供剖析黃化生長期間乙烯如何引發三相反應表型的有用資訊。
在突變體篩選時，發現新鑑別的例示性發明化合物具有鑑別乙烯路徑中之新組分的潛力。由於生物學性質的遺傳學與生物化學方法組合可鑑定例示性發明化合物之特徵，此可證明該組合為適合乙烯研究中鑑別化學品的有效平台。
實例
實驗程序
植物材料及生長條件- 所有突變體及轉殖基因植物來源於野生型擬南芥哥倫比亞生態型(Arabidopsis thaliana Columbia ecotype)(Col-0)，且在長日照條件下(16小時光照/8小時黑暗，22℃，100-150 μE m-2 s-1 )栽培。將含有EIN3結合序列(EBS)與冷光素酶基因(luciferase gene)(LUC )融合體之5個複本的報導體構築體5xEBS::LUC (Drs. Hai Li及Anna N. Stepanova,Salk Institute,USA饋贈之禮物)轉形至eto1-4 中，且隨後用於篩選化學庫中之化合物。乙烯突變體eto1-4 、eto2-1 、ctr1-1 及EIN3 過度表現株系(35S::EIN3 )先前已有描述(Solano等人,(1998)Genes Dev 12 ,3703-3714)。種子用30%漂白劑滅菌6分鐘且播種於補充有0.8%瓊脂的半濃度Murashige及Skoog(0.5×MS)培養基中，且在黑暗中4℃下進行種子低溫處理(stratified)3-4天，隨後萌芽。為分析三相反應表型，低溫處理之種子在22℃下及黑暗中生長3天，隨後對表型進行評分。
化學品及篩選程序 -化學篩選使用含有10,000種小分子(含於DMSO中)的DIVERSet庫(ChemBridge Inc.)。在各孔中含有個別化學品及0.5×MS瓊脂培養基的96孔及24孔微量滴定板中執行3輪化學篩選。起始篩選如下執行：將10至15粒種子播種於含有50 μM小分子之微量滴定板之孔中，對長胚軸表型評分。第二次及第三次篩選時，使用25 μM自第一輪篩選選出之小分子，對表型進行評分及確認。使用連接至Zeiss立體顯微鏡(SteREO V8)的數位攝影機對幼苗表型進行評分，且使用NIH Image J軟體定量胚軸長度。AVG及硫代硫酸銀(STS，藉由在臨使用前將硝酸銀與硫代硫酸鈉以1:4莫耳比混合而得)獲自Sigma且分別用作抑制乙烯生物合成及感測的對照物。以補充有1-胺基環丙烷-1-羧酸(10 μM，Merck)的瓊脂培養基誘導黃化幼苗之三相反應。
為了對冷光素酶活性進行現場成像，植物首先在22℃下及黑暗中生長3天，接著移到長日照條件下再生長3天，隨後對幼苗之冷光(luciference)進行成像分析。用冷光素(luciferin)(2 μM，Biosynth International Inc.)噴灑六日齡幼苗且在黑暗中保持5分鐘，隨後藉由Xenogen IVIS系統(Caliper Life Sciences,Inc.)收集影像。為了對冷光素酶活性進行定量檢定，上述黃化幼苗轉移至微量多孔盤(Packard Optiplate-96,Perkin Elmer Inc.)中再於長日照條件下於0.5xMS溶液中生長3天。幼苗之冷光素酶活性在2 μM冷光素存在下使用微板讀取器(CHAMELEON,Hidex Inc.)進行定量分析。
蛋白質表現及純化 -將鼠耳芥屬ACS5(At5g65800)之全長cDNA選殖至pETDuet(Novagen)中以產生pETDuet-6His-ACS5，以供在大腸桿菌(E. coli )(BL21-CodonPlus，Stratagene)中表現及隨後純化之重組ACS5蛋白。在OD600 0.6時藉由添加0.4 mM IPTG誘導蛋白質表現，且細胞在16℃下培育18小時。藉由在4℃下以6000×g離心10分鐘來收穫細胞。洗滌細胞集結塊且懸浮於50 mL含有20 mM咪唑的磷酸鹽緩衝液(300 mM NaCl、20 mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.4)中。利用連續高壓細胞破碎儀(TS 2.2 KW，Constant System)在4℃下以30 KPsi將細胞溶解。用50 ml含有20 mM咪唑的磷酸鹽緩衝液洗滌細胞破碎儀兩次後，將最後150 ml懸浮液在4℃下以10000×g離心30分鐘。將上清液加至AKTA prime系統(GE Healthcare)中之5-mL HisTrap FF管柱上，且隨後用100 mL含有20 mM咪唑之緩衝液A(1 mM EDTA、5 mM DTT、250 mM HEPES緩衝液，pH 8.0)洗滌、接著用100 mL含有100 mM咪唑的緩衝液A逐步洗滌。結合之蛋白質藉由含有咪唑之0.1-1.0 M梯度的25 mL緩衝液A溶離，且在-80℃下儲存直至進一步分析。
酶活性及動力學檢定 -如所述(Lizada等人,(1979)Anal Biochem 100 ,140-145；Yamagami等人,(2003)J Biol Chem 278 ,49102-49112)(但有少量修改)進行活體外ACS活性檢定。將含於2 mL含有10 μM吡哆醛5'-磷酸鹽(PLP)之緩衝液A中的經純化ACS5蛋白與測試小分子(最終濃度為10 μM)，或與DMSO(作為對照物)於20 mL GC小瓶中於冰上混合10分鐘，隨後添加受質且使反應在25℃下持續30分鐘。於小瓶中添加強氧化劑HgCl2 (100 μL，20 mM)及NaOH：漂白劑(1:1，100 μL)以終止反應且使ACC氧化為乙烯，此過程於冰上持續10分鐘。使用配備有毛細管柱(19095P-U04，Agilent Technologies)及自動取樣器(HP 7694，Agilent Technologies)的氣相層析儀(HP 6890，Hewlett-Packard)量測乙烯含量。藉由將不同濃度之ACC來置換酶及受質以製備酶活性檢定的標準曲線(圖8)。所有ACS活性檢定均重複執行且重複至少3次。
對於酶動力學檢定而言，使用不同濃度之SAM(20、40、60、80、100、150及200 μM)來測定經純化之重組ACS5的Km及Vmax。另外，對兩種濃度(0.05 μM及0.1 μM)之AVG及化合物7303進行測試以測定抑制常數Ki。酶動力學檢定之反應如下進行：首先將化學抑制劑或DMSO與不同濃度之SAM在20 mL GC小瓶中一起培育，接著添加1.6 μg經純化之ACS5且在25℃下起始酶反應30分鐘。使用氣相層析如先前所述定量自ACC化學轉化而來之乙烯之含量。酶動力學檢定之資料分析及林韋福-勃克圖之製備係利用SIGMAPLOT(Systat Software Inc.)進行。
轉錄型態資料及分析 -對於化學處理，將種子播種於補充有10 μM化學品(AVG、化合物9393、9370及7303)或DMSO(作為對照物)之0.5×MS瓊脂培養基中。芥菜屬種子在4℃下及黑暗中層化4天，接著在22℃下及黑暗中萌芽3天。收集約2,000株之野生型或eto1-4 黃化幼苗，作為用於在利用鼠耳芥屬ATH1 GeneChip(Affymetrix)之各微陣列實驗中製備總RNA的組織。RNA之萃取係根據已建立之方法(Chang等人,(1993)Plant Mol. Biol. Rep. 11 ,113-117)。使用總RNA(10 μg)製備生物素化cRNA以便在本文所揭示之實驗中與ATH1 GeneChip雜交。實驗皆按照2次獨立生物學重複實驗進行重複，且選擇兩次實驗中均存在的候選基因進一步分析。使用MAS5方法分析資料且根據所有樣品培養基進行校正。依據以下準則選擇候選基因。首先，選擇野生型與eto1-4 之間有1.5倍差異表現的基因作為主基因池，其接著用於在AVG及個別例示性化合物之處理中進行比較。資料以階層式叢集及文氏圖(Venn diagram)格式呈現。使用Agilent GeneSpring GX及Bioconductor軟體分析表現型態資料。以GeneSpring GX產生基因本體描述且進一步稱為TAIR GO資料庫。原始資料可根據識別編號GSE20897在GEO資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲得。
實例1：以表型為基礎篩選干擾乙烯反應之化合物
在此研究中，化學篩選旨在鑑別干擾擬南芥之乙烯反應的小分子。設計以表型為基礎之篩選策略，其中鼠耳芥屬幼苗在個別孔中含有小分子的微量多孔盤中萌芽。該篩選可利用若干遺傳突變體，諸如eto1-4 、ctr1-1 及在黃化幼苗中顯示常發性三相反應的多種乙烯受體突變體(Guzman等人,(1990)Plant Cell 2 ,513-523；Kieber等人,(1993)Cell 72 ,427-441；Qu等人,(2007)BMC Plant Biol 7 ,3)。eto1-4 因其作用位點處於乙烯反應之早期步驟而用於化學篩選。因此，可篩選干擾處於ACC形成步驟之下游之任何步驟的小分子。在DIVERSet中利用3個連續循環篩選10,000種小分子之後，鑑別出74種對三相反應表現不同抑制程度的化合物(圖1A)。舉例而言，發現兩種化合物(稱為化合物9393及9370)(表1)在抑制eto1-4 表型方面顯示與硝酸銀(呈硫代硫酸銀STS形式；見實驗程序)類似的有效性(圖1B)。硝酸銀為阻斷乙烯結合以抑制乙烯反應的乙烯受體拮抗劑。化合物7303係稍後藉由搜尋結構類似物所得到發現者；該化合物在抑制eto1-4 表型方面顯示具有與化合物9393及9370類似的作用(圖1A及1B)。在其他例示性發明化合物中，化合物9393、9370及7303在表型檢定中顯示高度有效。
為證明抑制etol-4 表型係由干擾乙烯反應所引起，進行以下檢定。首先，在etol-4 背景下利用含有合成啟動子與冷光素酶基因(LUC )融合體之5個複本5xEBS::LUC 的轉殖基因報導體株系分析螢光素酶活性。EBS 代表EIN3結合序列，其中EBS 之啟動子活性由乙烯誘導(Solano等人,(1998)Genes Dev 12 ,3703-3714；Yanagisawa等人,(2003)Nature 425 ,521-525)。5xEBS::LUC 報導體之冷光素酶活性在eto1-4 中組成性活化，但在STS存在下被抑制，此說明所預期之乙烯反應性(圖1C)。AVG為ACC合成酶及多種其他需要PLP作為輔助因子之吡哆醛酶之抑制劑(Adams等人,(1979)Proc Natl Acad Sci USA 76 ,170-174；Eliot等人,(2004)Annu Rev Biochem 73 ,383-415)。已發現，如同STS，AVG亦抑制冷光素酶活性。在例示性發明化合物存在下，eto1-4 中原本活化之冷光素酶活性被抑制，說明例示性化合物干擾乙烯反應(圖1C)。第二檢定測定在例示性化合物存在下的乙烯含量。圖1D之結果顯示，eto1-4 突變體中之過量乙烯含量因例示性發明化合物而降至野生型(WT=Col)之乙烯含量，此說明乙烯生物合成被抑制。結果表明，以表型為基礎之化學篩選策略成功地鑑別抑制乙烯反應的小分子，此抑制很可能藉由抑制鼠耳芥屬之乙烯生物合成來達成。
實例2：確定例示性發明化合物是否在抑制乙烯反應方面具有不同有效性。
為確定例示性發明化合物(例如化合物9393、9370及7303)是否在抑制乙烯反應方面具有不同有效性，量測黃化eto1-4 幼苗之胚軸長度作為乙烯反應之定量檢定。黃化幼苗之胚軸縮短為三相反應表型之一(Guzman等人,(1990)Plant Cell 2 ,513-523；Wang等人,(2004)Nature 428 ,945-950)。將抑制乙烯反應的兩種化合物AVG及STS作為對照物用於比較。AVG與STS均有效抑制乙烯反應，如藉由黃化eto1-4 幼苗之胚軸延長來顯現(圖2)。AVG在低至0.1 μM時已可明顯的促進胚軸延長且在5 μM時達到最大作用。然而，STS僅在濃度高於1 mM時有效。化合物9393與STS類似之處為僅在濃度高於1 μM時顯示明顯作用。然而，9370與7303在0.1 μM下均開始抑制胚軸中之乙烯反應且在5 μM下作用達到幾乎飽和，此類似於AVG。因此，例示性發明化合物抑制黃化eto1-4 之胚軸表型，此類似於類似濃度下之AVG或STS。
實例3：例示性發明化合物及結構類似物之結構及功能分析
篩選DIVERSet庫中的74種化合物經鑑別對eto1-4 表型具有不同程度的抑制作用(圖1A)。在此等化合物中，2種有效化合物(化合物9393及9370)含有喹唑啉酮主鏈(表1)。第三種例示性化合物7303隨後藉由結構相似性而鑑別且最有效(表1及圖3)。由於化合物9379、9393及7303皆具相同骨架結構而側鏈上的部分不同，因此對具有喹唑啉酮主鏈的化合物進行結構及功能分析。根據與化合物9393或9370具有85%之相似度，自其他DIVERSet集合中選擇29種結構類似的小分子作為例示性發明化合物。在29種化合物中，14種引起黃化eto1-4 幼苗之胚軸延長，且該延長相對大於對照物(僅DMSO)(圖3A)。七種化合物(包括例示性化合物9393、9370及7303)拮抗乙烯反應從而使胚軸延長，範圍為AVG處理(定義為100%)的28%至77%。為確定乙烯含量是否為調節黃化eto1-4 幼苗之胚軸長度的關鍵因素，藉由氣相層析在例示性化合物存在下定量分析乙烯散發。選擇圖3A中對乙烯反應顯示不同抑制程度的14種例示性發明化合物用於乙烯量測。所有14種例示性化合物在10 μM下皆能夠降低黃化eto1-4 幼苗中之乙烯含量(圖3B)。與AVG處理(定義為100%)相比，14種例示性化合物中有9種能夠將黃化eto1-4 中之乙烯含量抑制大於60%。胚軸長度與乙烯含量之定量的結果良好吻合之處在於，兩種檢定中之最有效化合物均包括以下化合物之相同群組：9028、2305、9393、9370、8107、2616及7303(圖3)。
根據位於喹唑啉酮骨架之C7位置的側鏈，圖3A中所分析之29種化合物的例示性化學結構分類為2個群組(表1)。I型化合物在位置C7含有芳族部分，諸如苯基，而II型化合物在相同位置具有烷基，諸如甲基。7種最有效小分子中有4種屬於I型(化合物7303、9370、8107及2616)，而其餘3種化合物為II型(化合物9393、9028及2305)。
實例4：研究乙烯生物合成路徑中何步驟受到例示性發明化合物抑制及該等化合物是否影響乙烯受體下游之信號傳導。
已證明例示性發明化合物能減少黃化eto1-4 幼苗中之乙烯散發。然而，尚未知乙烯生物合成路徑中何步驟受到抑制且化合物是否影響乙烯受體下游之信號傳導。為釐清此問題，使用胚軸長度之定量檢定來分析例示性發明化合物在黃化鼠耳芥屬幼苗中的作用。使用展現常發性三相反應表型的兩個乙烯突變體(eto1-4 及ctr1-1 )及利用CaMV 35S啟動子使EIN3 過度表現的轉殖基因鼠耳芥屬(35S::EIN3 或EIN3OX )(chao等人，(1997)Cell 89 ,1133-1144)進行分析。eto1-4 及ctr1-1 突變體為分別在乙烯之生物合成及信號傳導路徑方面具有缺陷的代表性突變體且顯示常發性三相反應表型。EIN3及類-EIN3(EIN3 LIKE1,EIL)蛋白為對乙烯產生反應以活化細胞核中主要反應基因之表現的轉錄因子(Chao等人,(1997)Cell 89 ,1133-1144)。ACC為乙烯之即刻前驅物且例行用於誘導黃化幼苗中之三相反應。在不存在例示性發明化合物時，經ACC處理之WT黃化幼苗、eto1-4 、ctr1-1 及EIN3OX 黃化幼苗顯示曲型的三相反應，且量測胚軸長度用於定量分析(圖4)。黃化野生型幼苗經ACC誘導之胚軸縮短在用例示性發明化合物處理時保持不變，說明ACC氧化酶及乙烯受體可能不為目標且因此不受影響(圖4A)。然而，在例示性發明化合物存在下，僅黃化eto1-4 胚軸延長，而ctr1-1 或EIN3OX 之胚軸則未延長，此說明例示性發明化合物僅抑制eto1-4 中之常發性三相反應，而不抑制乙烯受體下游之信號傳導路徑(圖4B-D)。例示性發明化合物之濃度增加至高達50 μM時仍顯示相同結果(資料未顯示)。因此，該等資料強烈暗示例示性發明化合物參與抑制SAM經ACC合成酶催化轉化為ACC。
實例5：確定例示性化合物是否為ACC合成酶之抑制劑。
由於例示性發明化合物不抑制黃化WT幼苗中由ACC誘導的三相反應表型，此說明自ACC形成乙烯不受該化合物影響。因此，ACC氧化酶可排除在例示性發明化合物的主要目標的之外。為確定例示性發明化合物是否為ACC合成酶之抑制劑，使用以下分析檢定。首先，分析顯性eto2-1 突變體之胚軸長度及乙烯含量，該突變體在ACS5 之3'端具有誤義(missense)突變，從而產生已突變但有功能的蛋白質ACS5eto2-1 。因為ACS5eto2-1 不再與ETO1相互作用，因此擺脫ETO1之負調節及隨後泛素-蛋白酶體介導之蛋白質降解，所以ACS5eto2-1 所產生的乙烯含量高達WT之10倍至20倍而引起黃化幼苗之常發性三相反應(Chae等人,(2003)Plant Cell 15 ,545-559；Wang等人,(2004)Nature 428 ,945-950)。其次，藉由活體外ACS活性檢定分析例示性發明化合物對重組鼠耳芥屬ACS5蛋白之酶活性的影響(Chae等人,(2003)Plant Cell 15 ,545-559；Savaldi-Goldstein等人,(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105 ,15190-15195)。
eto 突變體之黃化幼苗之胚軸延長反映黃化幼苗中之乙烯含量降低。在10 μM例示性化合物存在下，黃化eto1-4 幼苗之胚軸長度自平均3.8 mm(無處理)增加至7.2至8 mm，且在相同濃度之AVG存在下增加至將近9 mm(圖5)。與胚軸表型一致，例示性發明化合物與AVG在10 μM下使eto1-4 中之乙烯含量降低的程度相似。於評估例示性發明化合物是否影響eto2-1 之相同表型及乙烯含量之實驗中，發現其中乙烯含量將近高達eto1-4 之五倍。在不同濃度之例示性發明化合物及AVG存在下，觀測到黃化eto2-1 幼苗之乙烯含量降低及同時發生胚軸延長(圖5)。藉由將濃度自10 μM增加至30 μM，例示性發明化合物在eto2-1 突變體中引起乙烯含量的降低呈現濃度依賴性的現象，此說明該等化合物可抑制高活性ACS5eto2-1 。此等結果暗示例示性發明化合物實際上可用作ACS酶之抑制劑。
為進一步測試此可能性，將獲自細菌細胞的純化重組鼠耳芥屬ACS5蛋白用來進行活體外酶活性檢定。活體外ACS活性檢定之組分包括受質SAM、輔助因子PLP及經純化之ACS5酶。ACC係由ACS自SAM轉化而來，且藉由化學反應氧化成乙烯，隨後藉由氣相層析分析乙烯含量(Lizada等人,(1979)Anal Biochem 100 ,140-145)。由重組ACS5轉化成乙烯之ACC量將作為ACS活性之讀數。化合物9370及7303對ACS5酶活性顯示明顯抑制，其中所估計半最大抑制濃度(IC50 )分別為1.4 μM及0.5 μM(圖6A)。雖然化合物9393顯示在抑制eto1-4 之乙烯含量及胚軸表型方面具有類似作用(圖1B及1D)，但其在活體外活性檢定中不太有效，其中IC50 估計值為3.2 μM。然而，AVG產生的IC50 為約0.7 μM，與化合物7303之IC50 幾乎相同(圖6A)，此說明7303在活體外活性檢定中與AVG同樣有效。此檢定之結果直接證明例示性發明化合物為ACS酶之抑制劑。
AVG及其類似物為ACC合成酶之競爭性抑制劑(Boller等人,(1979)Planta 145 ,293-303)。由於例示性發明化合物與AVG具有不同化學結構(表1)，因此其可能係利用不同機制來抑制ACC合成酶。為釐清此問題，選擇化合物7303作為例示性發明化合物之代表進行酶動力學檢定以確定其抑制機制。圖6B顯示經0.05 μM及0.1 μM之AVG或化合物7303處理之重組ACS5的林韋福-勃克圖。此等實驗所得到的抑制型態顯示AVG為競爭性抑制劑然化合物7303為非競爭性抑制劑。AVG之動力學參數(Km及Vmax)(Km=51.0 μM；Vmax=92.2 μmol h-1 mg-1 )與7303之動力學參數(Km及Vmax)(Km=49.6 μM；Vmax=92.4 μmol h-1 mg-1 )無明顯不同。然而，由酶動力學檢定所得到的AVG及化合物7303之抑制常數(Ki)計算值分別為25.6±2.1 nM及98.4±6.7 nM，此說明AVG相較於化合物7303，為更有效的ACS5抑制劑。由酶動力學檢定所得到的資料證明，例示性發明化合物為不同於AVG的新穎ACC合成酶抑制劑且對ACS活性顯示非競爭性抑制。
全面分析例示性發明化合物所調節的基因表現型態 。已顯示例示性發明化合物具有不同效能：例如，與化合物9370及7303相比，化合物9393有效性最低，其IC50 高達2至4倍(圖6A)。然而，此等化合物在10 μM下在抑制黃化etol-4 幼苗之三相反應及乙烯散發方面並無不同(圖4及5)。例示性發明化合物在進入植物細胞中後可被代謝為具有相同活性的產物，從而調節相同生物過程並產生相似表型。或者，濃度對於表型分析而言可能已經飽和，故與細胞之滲透性及結構修飾之潛在問題無關。為在基因表現層面解決此問題，在例示性發明化合物或AVG不存在及存在下自野生型(WT)及etol-4 之3日齡黃化幼苗中萃取總RNA，並利用微陣列實驗之鼠耳芥屬ATH1 GeneChip進行轉錄組分析。
將獲自ATH1 Genechip上之22810個探針的經過濾且經校正的表現資料組用於基因表現型態之階層式叢集，以比較在eto1-4 中之AVG與例示性發明化合物。現鑑別出，在野生型與eto1-4 之間，1,446種基因的表現顯示相差至少1.5倍，故使用該等基因作為叢集分析之主基因池(圖7A)。在1446種基因中，629種(43.5%)、728種(50.3%)、650種(45.0%)及561種(38.8%)分別受化合物9393、9370、7303及AVG調節；在eto1-4 中之表現量經由化學處理可恢復至接近野生型中之表現量。此等基因可能因對升高之內源性乙烯產生反應而促成eto1-4 之黃化表型。為確定例示性化合物特異性抑制eto1-4 表型抑或與AVG抑制eto1-4 表型的功能重疊，利用文氏圖分析受個別例示性發明化合物及AVG調節的基因叢集(圖7B)。表現與AVG相關之超過63%(化合物9393為356/561；化合物9370為389/561；化合物7303為399/561；圖7B)的基因受例示性發明化合物共調節，此說明在抑制eto1-4 之乙烯表型方面存在重疊功能。然而，表現與AVG處理不相關的約40%基因(對於化合物9393為273/629；對於化合物9370為3391728；對於化合物7303為251/650；圖7B)受個別例示性發明化合物特異性調節，說明例示性發明化合物亦可影響AVG非依賴性生物過程。藉由使用圖7B中所鑑別出之共調節基因：356種基因(化合物9393相對於AVG)、389種基因(化合物9370相對於AVG)及399種基因(化合物7303相對於AVG)進行叢集分析來檢驗受所有例示性發明化合物及AVG共調節的下一批基因。發現276種基因受所有例示性發明化合物及AVG共調節(圖7C及表2)。根據由GeneSpring GX及TAIR資料庫產生的GO描述，將276種基因分成與其生物功能相關的子群(表2)。若干基因參與植物激素(包括植物生長素(auxin)、乙烯、脫落酸(abscisic acid)及赤黴酸(gibberellic acid))之生物合成及反應，說明植物激素之間的交互影響(cross-talk)促成eto1-4 之三相反應表型。結果亦顯示不同類型之轉錄因子，諸如AP2/EREBP、bHLH、bZIP、鋅指(C2H2型及C3HC4型)、myb及WRKY基因家族之轉錄因子。另外，逆境及病原相關基因亦為共調節基因，可能因為乙烯亦與生物性與非生物性逆境有關。
選擇在eto1-4 與野生型之間具1.5倍差異表現之基因(1446個非冗餘基因位置)作為分析的母池。將此等基因用於比較以AVG與例示性發明化合物所進行的化學處理。最終顯示確定有276種基因受AVG及所有例示性發明化合物共調節。基因位置ID亦存在於Nemhauser等人(Nemhauser等人,(2006)Cell 126 ,467-475)中。編號以粗體顯示。
*資料為兩次微陣列實驗之平均值且針對所有樣品培養基進行校正。
I.　野生型(無處理)與eto1-4 (無處理)之比率。
II.　eto1-4 (經9393處理)與eto1-4 (無處理)之比率。
III.　eto1-4 (經9370處理)與eto1-4 (無處理)之比率。
IV.　eto1-4 (經7303處理)與eto1-4 (無處理)之比率。
V.　eto1-4 (經AVG處理)與eto1-4 (無處理)之比率。
雖然本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者顯而易知此等實施例僅為作為實例提供。在不背離本發明下，熟習此項技術者現可進行諸多變更、改變及取代。應瞭解可利用本文中所述之本發明實施例之各種替代形式來實施本發明。希望以下申請專利範圍界定本發明之範疇且藉此涵蓋此等技術方案及其等效物之範疇內的方法及結構。
圖1A-1D說明在黃化鼠耳芥屬幼苗中化學篩選乙烯反應之拮抗劑的過程及結果。(圖1A)化學篩選策略之示意圖。eto1-4 中具有5xEBS::LUC 之種子播種於含有50 μM或25 μM小分子的0.5×MS瓊脂培養基上。在黑暗中萌芽後3天，對三相反應表型之抑制進行評分，且指示3輪化學篩選所得到之候選化合物的數目。(圖1B)3種例示性發明化合物(9393、9370及7303)在10 μM下對eto1-4 表型之抑制。對表型進行評分之前，野生型(WT)及eto1-4 在例示性發明化合物或硫代硫酸銀(STS)存在下在黑暗中萌芽3天。(圖1C)例示性發明化合物對5xEBS::LUC (eto1-4 )幼苗中之冷光素酶活性的抑制。假色(pseudocolor)影像代表在存在例示性發明化合物、STS或胺基乙氧基乙烯基甘胺酸(AVG)時的冷光素酶活性。DMSO用作化學品溶劑及對照物。(圖1D)例示性發明化合物使黃化eto1-4 幼苗中之高乙烯含量降低。藉由氣相層析(GC)測定具有3日齡黃化幼苗之20 mL GC小瓶之頂部空間中的乙烯含量。數據為至少3次重複實驗(每個小瓶n>30)的平均值。誤差條形柱指示SE。
圖2顯示經篩選之例示性發明化合物以劑量依賴性方式抑制eto1-4 之胚軸表型。eto1-4 種子在黑暗中在不同濃度之例示性發明化合物、STS及AVG存在下萌芽3天。數據為藉由NIH Image J軟體所量測之黃化幼苗(n>30)之胚軸長度的平均值。誤差條形柱指示SE。
圖3A及3B提供例示性發明化合物之類似物的結構及功能分析之結果。定量在10 μM化合物存在下黃化eto1-4 幼苗之(3A)胚軸長度及(3B)乙烯含量。幼苗在黑暗中萌芽3天後，量測胚軸長度(n>40)或定量乙烯(各GC小瓶n>30)重複至少3次。圖3B中所用之14種例示性發明化合物係根據圖3A中之結果加以選擇。數據以平均值±SE表示，且實驗重複兩次並獲得相似結果。DMSO用作對照物。AVG指定為100%抑制，其用於化合物之間的比較。完整化學ID列於表1中。
圖4A-4D顯示所選例示性發明化合物特異性抑制eto1-4 之三相反應表型。(圖4A)野生型(WT+10 μM之ACC)、(圖4B)eto1-4 、(圖4C)EIN3OX 及(圖4D)ctr1-1 之種子在例示性發明化合物(條形柱2-4；10 μM)或DMSO(1；對照物)存在下萌芽。未經任何化學處理的野生型用黑色條形柱表示。定量黃化幼苗之胚軸長度且值以平均值±SE(n>40)表示。圖式為簡化乙烯路徑之示意圖。
圖5顯示所選例示性發明化合物在兩種eto 突變體中表現對胚軸及乙烯含量的表型抑制。eto1-4 及eto2-1 之種子在黑暗中在不存在(-)或存在(+)不同濃度(10 μM、20 μM或30 μM)之例示性發明化合物及AVG下萌芽。定量3日齡黃化幼苗的胚軸長度及乙烯含量。數據以平均值±SE(n 40)表示，且實驗重複3次並獲得相似結果。
圖6A及6B顯示所選發明化合物為ACC合成酶之新穎抑制劑。(圖6A)例示性發明化合物在活體外降低ACC合成酶之酶活性。經純化之重組ACS5於20 mL GC小瓶中與不同濃度之例示性發明化合物及AVG一起培育以進行活體外活性檢定(見實驗程序)。活性單位定義為在25℃下、在30分鐘內1 μg ACS5使1 μmol ACC發生轉化。(圖6B)顯示在AVG及作為抑制劑(I)之化合物7303存在下之ACS5動力學資料之林韋福-勃克圖。對於活體外活性檢定，不同濃度之SAM與0.05 μM及0.1 μM之AVG及化合物7303一起培育(實驗程序)。數據為至少3次重複實驗之平均值，且實驗重複兩次並獲得相似結果。代表性結果分別顯示於圖6A及圖6B中。誤差條形柱代表SE。
圖7A-7C提供在例示性發明化合物及AVG存在下eto1-4 之基因表現型態的全面分析。(圖7A)經或未經例示性發明化合物處理之野生型(Col-0)及eto1-4 之表現型態的階層式叢集。根據所有樣品培養基過濾及校正樣品的原始資料，且選擇其中表現量按照得自2次生物學重複實驗之出現呼頻(present calls)進行計數的基因用Bioconductor(微陣列套件中之例示性映射程式)進行分析。供叢集分析用的主基因池由1,446個來自完整基因組的基因組成，其中3日齡黃化野生型幼苗與eto1-4 幼苗之間的表現量相差至少1.5倍。文氏圖(Venn diagram)顯示由AVG及個別例示性發明化合物共調節之基因的數目(圖7B)；由AVG及所有例示性發明化合物共調節之基因的數目(圖7C)。圖7B中共調節基因之百分比表示為AVG依賴性(63.4%、69.3%及71.1%)及非依賴性(43.4%、46.5%及38.6%)群組。
圖8提供顯示ACC濃度與乙烯含量之間的相關性的標準曲線。在密封GC小瓶中，不同濃度之ACC用於化學轉化成乙烯。利用GC量測乙烯含量以建立圖5A中所示之酶活性的標準曲線。
(無元件符號說明)

Claims (12)

  1. 一種改良採收後植物之品質的方法，其包含向該等植物 提供有效量之式I化合物：，其中 R1 及R2 獨立地為H、C1 -C8 烷基或經取代或未經取代之芳基R3 為H；及R4 及R5 獨立地為H、C1 -C8 烷基、環烷基或芳基。
  2. 如請求項1之方法，其中R1 為H且R2 為經取代或未經取代之苯基。
  3. 如請求項2之方法，其中該苯基經烷氧基、鹵素或C1 -C8 烷基取代。
  4. 如請求項1之方法，其中R1 及R2 獨立地為視情況經取代之C1 -C8 烷基或H。
  5. 如請求項4之方法，其中R1 及R2 獨立地為CH3 或H。
  6. 如請求項5之方法，其中R1 為CH3 且R2 為CH3 。
  7. 如請求項1之方法，其中該化合物施用於該等植物之葉、芽、果實及/或花。
  8. 如請求項1之方法，其中該化合物施用於該等植物的根。
  9. 如請求項1之方法，其中採收後植物之該經改良品質為維持葉、芽、果實及/或花在收穫後之新鮮度及品質。
  10. 如請求項1之方法，其中採收後植物之該經改良品質為延長切花之瓶插壽命。
  11. 如請求項1之方法，其中在收穫該等植物之前，向該等植物提供該化合物。
  12. 如請求項1之方法，其中在收穫該等植物之後，向該等植物提供該化合物。
TW100120756A 2010-06-14 2011-06-14 乙烯生物合成之化學抑制劑 TWI411393B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35452810P 2010-06-14 2010-06-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201212819A TW201212819A (en) 2012-04-01
TWI411393B true TWI411393B (zh) 2013-10-11

Family

ID=45494666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100120756A TWI411393B (zh) 2010-06-14 2011-06-14 乙烯生物合成之化學抑制劑

Country Status (2)

Country Link
US (1) US8481459B2 (zh)
TW (1) TWI411393B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017189553A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Everon Biosciences, Inc. Removal of senescence-associated macrophages
CN110122334B (zh) * 2019-06-20 2023-03-28 运城学院 一种芦竹快速繁殖专用培养基及其培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040077667A1 (en) * 2000-12-11 2004-04-22 Nobuya Matsuoka Quinazolinone derivatives
WO2006113498A2 (en) * 2005-04-14 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. 2-amino-quinaz0lin-5-ones as hsp90 inhibitors useful in treating proliferation diseases
EP1789398B1 (en) * 2004-08-06 2010-09-29 Janssen Pharmaceutica NV 2-amino-quinazoline derivatives useful as inhibitors of b-secretase (bace)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207881B1 (en) 1990-09-10 2001-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Agriculture Control of fruit ripening through genetic control of ACC synthase synthesis
JP2011507910A (ja) * 2007-12-21 2011-03-10 ユニバーシティー オブ ロチェスター 真核生物の寿命を変更するための方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040077667A1 (en) * 2000-12-11 2004-04-22 Nobuya Matsuoka Quinazolinone derivatives
EP1789398B1 (en) * 2004-08-06 2010-09-29 Janssen Pharmaceutica NV 2-amino-quinazoline derivatives useful as inhibitors of b-secretase (bace)
WO2006113498A2 (en) * 2005-04-14 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. 2-amino-quinaz0lin-5-ones as hsp90 inhibitors useful in treating proliferation diseases

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. R. Bilbao et al., "Effcient synthesis of quinazolinones as intermediates of CNS agents via inverse-electron demand Diels-Alder reaction", Tetrahedron Letters, 2002, Vol. 43, p.3551~3554. *

Also Published As

Publication number Publication date
US8481459B2 (en) 2013-07-09
US20120023625A1 (en) 2012-01-26
TW201212819A (en) 2012-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cai et al. Evolutionary conservation of ABA signaling for stomatal closure
Yuan et al. Auxin response factor 6A regulates photosynthesis, sugar accumulation, and fruit development in tomato
Wang et al. Melatonin regulates root meristem by repressing auxin synthesis and polar auxin transport in Arabidopsis
Cheng et al. Antagonism between abscisic acid and ethylene in Arabidopsis acts in parallel with the reciprocal regulation of their metabolism and signaling pathways
Lin et al. Identification of novel inhibitors of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase by chemical screening in Arabidopsis thaliana
He et al. A small-molecule screen identifies L-kynurenine as a competitive inhibitor of TAA1/TAR activity in ethylene-directed auxin biosynthesis and root growth in Arabidopsis
Boden et al. EARLY FLOWERING3 regulates flowering in spring barley by mediating gibberellin production and FLOWERING LOCUS T expression
Yu et al. Arabidopsis WRKY71 regulates ethylene‐mediated leaf senescence by directly activating EIN2, ORE1 and ACS2 genes
Skirycz et al. Developmental stage specificity and the role of mitochondrial metabolism in the response of Arabidopsis leaves to prolonged mild osmotic stress
Linkies et al. Ethylene interacts with abscisic acid to regulate endosperm rupture during germination: a comparative approach using Lepidium sativum and Arabidopsis thaliana
Ogawa et al. Gibberellin biosynthesis and response during Arabidopsis seed germination
Kang et al. The putative glutamate receptor 1.1 (AtGLR1. 1) in Arabidopsis thaliana regulates abscisic acid biosynthesis and signaling to control development and water loss
Liao et al. Brassinosteroids antagonize jasmonate-activated plant defense responses through BRI1-EMS-SUPPRESSOR1 (BES1)
Huang et al. Structural analogs of ABA reveal novel features of ABA perception and signaling in Arabidopsis
Cui et al. The BUD2 mutation affects plant architecture through altering cytokinin and auxin responses in Arabidopsis
Ahmadizadeh et al. Insights into the genes involved in the ethylene biosynthesis pathway in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
Hong et al. Identification and molecular characterization of a Brachypodium distachyon GIGANTEA gene: functional conservation in monocot and dicot plants
Lee et al. Regulation of ethylene biosynthesis by phytohormones in etiolated rice (Oryza sativa L.) seedlings
Wang et al. Repressed gene expression of photosynthetic antenna proteins associated with yellow leaf variation as revealed by bulked segregant RNA-seq in tea plant Camellia sinensis
Ellison et al. XAP5 CIRCADIAN TIMEKEEPER regulates ethylene responses in aerial tissues of Arabidopsis
Charrier et al. Overexpression of a Medicago truncatula stress-associated protein gene (MtSAP1) leads to nitric oxide accumulation and confers osmotic and salt stress tolerance in transgenic tobacco
Tsourkas et al. Shedding light on health and disease using molecular beacons
Gómez‐Ocampo et al. BBX21 reduces abscisic acid sensitivity, mesophyll conductance and chloroplast electron transport capacity to increase photosynthesis and water use efficiency in potato plants cultivated under moderated drought
Hu et al. GmJAZ3 interacts with GmRR18a and GmMYC2a to regulate seed traits in soybean
TWI411393B (zh) 乙烯生物合成之化學抑制劑

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees