TWI399214B - 製備奈米多醣體複合粒子之方法及其用途 - Google Patents

製備奈米多醣體複合粒子之方法及其用途 Download PDF

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Chia Heng Yang
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Description

製備奈米多醣體複合粒子之方法及其用途
本發明係關於一種製備奈米多醣體複合粒子之方法及其用途，尤其係關於一種製備可用於誘發癌細胞凋亡(apoptosis)之奈米多醣體複合粒子的方法及其用途。
奈米技術是指在原子或分子層級下探討各種物質所出現的嶄新物化特性。一般而言，奈米材料係指粒徑介於約1奈米至約100奈米的材料，其優點為尺寸小、可控制的形狀、高表面/體積比、及高堆積密度。奈米技術業經廣泛應用於各種產業，包括傳統產業如化工、材料、能源等產業，以及高科技產業如電子、光電、生醫材料等領域。
在生醫材料領域，奈米技術主要係應用於發展奈米藥物載體。奈米藥物載體可改善藥物動力學特性，且可精確控制藥物的傳輸機制，例如，透過設計與控制藥物載體的尺寸與表面特性，可大幅降低某些藥物的毒性，減輕其副作用，甚至可提升生物可利用性。此外，由於部分藥物水溶性不佳，因此，藉由奈米藥物載體載覆藥物，可提升藥物水溶性，使其應用範圍變得更為廣泛。
目前製備奈米藥物載體的方法有很多種，例如奈米微粒、奈米脂質體、固體脂類奈米顆粒、及磁性奈米載藥微粒等，但習知之製備奈米藥物載體的步驟較為複雜或限制較多，載覆效果也常無法令人滿意。
舉例而言，Song H.等人藉由混合油相與水相二種溶液，再利用高壓均質機分散粒子而製成固體脂類奈米顆粒，其藥物包覆率可達到80%，但不適用於對剪切力敏感的藥物，且此製程中使用的乳化劑可能殘留而降低產物純度與品質，相關說明可參見Song H. et al.，Characterization andIn Vivo Evaluation of Novel Lipid-Chlorambucil Nanospheres Prepared Using a Mixture of Emulsifiers for Parenteral Administration，Int. J. Nanomedicine,2010，Nov 9；5：933-42。此外，亦有先前技術教導可將矽溶膠(silica sol)緩慢滴入替米考星(tilmicosin)抗生素溶液中，並在室溫下攪拌反應約20分鐘而製得奈米粒子，雖然製程較為簡單，但藥物包覆率最高僅約64%，載覆效果不佳，相關說明可參見Meirong Song et al.,The Controlled Release of Tilmicosin from Silica Nanoparticles，Drug Dev. Ind. Pharm.，2011 Jan. 5。
鑒於此，本發明提供一種新穎且簡單的方法來製備經多醣體載覆之抗癌藥物的奈米多醣體複合粒子，所得複合粒子展現包覆率佳、生物利用度高、應用廣泛等優點。
本發明之一目的在於提供一種製備奈米多醣體複合粒子之方法，包括：提供一第一溶液，包含一活性成分與一多醣體，其中該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽及酯、式(II)化合物及其醫藥上可接受鹽及酯、及前述之
添加一交聯劑至該第一溶液中，以提供一第二溶液；以及於約20℃至約80℃下，使該第二溶液進行反應，歷時約0.5小時至約6小時，以形成奈米多醣體複合粒子；其中，該活性成分、該多醣體與該交聯劑的莫耳比為約1：1.3至26：4.3至85。
本發明之另一目的在於提供一種奈米多醣體複合粒子，其包括一包含上述之活性成分之核心與衍生自一多醣體與一交聯劑之載體，且該載體係覆於該核心表面之至少一部分。
本發明之又一目的在於提供一種奈米多醣體複合粒子於藥劑製造之用途，其中該藥劑係用於誘發癌細胞凋亡。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之技術內容。
以下將具體地描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明之精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。此外，於本文中，所謂「包覆率」係指所製得之奈米多醣體複合粒子中活性成分的含量佔該活性成分之總添加量的百分比。
本發明係透過簡易的製備程序，藉由多醣體載覆具抗癌效果且水溶性低的活性成分，可增加該活性成分的水溶性，並提供令人滿意的包覆率，製得分散性佳、保存容易、具良好生物相容性及可使用性高的奈米多醣體複合粒子。
根據本發明之方法，係先提供包含一活性成分與一多醣體的第一溶液。該第一溶液可以如下方式製備：－　將活性成分溶於一第一溶劑以提供一活性成分溶液；該第一溶劑可為任何適宜溶解活性成分之溶劑，包含但不限於二甲亞碸、甲醇、乙醇、及前述之組合，較佳為二甲亞碸；－　將多醣體溶於一第二溶劑中以提供一多醣體溶液；該第二溶劑則可為任何合宜的酸性水溶液，包含但不限於醋酸、鹽酸、或前述之組合，較佳為醋酸；以及－混合該活性成分溶液與該多醣體溶液，此混合步驟通常可伴隨攪拌作用，例如使用旋轉式攪拌機。
其中，第一溶液中的活性成分可選自以下群組：式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽及酯、式(II)化合物及其醫藥上可接受鹽及酯、及前述之組合：
式(I)化合物(以下稱KCY-Tai 1)為台灣杉心材萃取出的成分之一，而式(II)化合物(以下稱KCY-Tai 2)為KCY-Tai 1經化學結構修飾後的衍生物；如式(I)與式(II)所示，KCY-Tai 1與KCY-Tai 2之結構係由多個芳香環所組成，故難溶於水，需使用有機溶劑才能將其溶解。
此外，已有文獻證實，KCY-Tai 1與KCY-Tai 2具有抗細菌、抗螨、抗白蟻、抗真菌之效果，且亦有實驗證實其對於肺癌、乳癌、直腸癌細胞具有顯著的毒殺效果。先前的研究係以人類肝癌細胞株HepG2/A2為細胞模組，探討KCY-Tai 1造成細胞凋亡之作用機制，其中，由細胞週期分析實驗顯示，KCY-Tai 1會造成細胞大量累積具有激酶活性的週期素B1/cdc2複合物，顯示細胞係停滯於G2/M期，且透過免疫螢光染色亦顯示KCY-Tai 1會干擾細胞紡錘體的形成。此外，細胞在經KCY-Tai 1處理後出現細胞核微小化(micronucleation)、DNA斷裂(fragmentation)、及硫胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活化的現象，顯示KCY-Tai 1係經由誘發細胞凋亡而引發細胞毒殺作用。另一方面，腫瘤抑制蛋白質p53是與調控細胞生長及凋亡相關的重要因子，實驗顯示，以KCY-Tai 1處理會造成HepG2/A2細胞中p53蛋白質的活化，以p53蛋白質抑制劑(PFT-a)處理細胞或是利用RNA干擾(RNA interference)抑制p53蛋白質表現均可抑制KCY-Tai 1的細胞毒性，此說明KCY-Tai 1所造成的細胞凋亡係透過p53蛋白質的調控。
本發明方法所製得之奈米多醣體複合粒子含有上述活性成分及/或其醫藥上可接受的鹽或酯，因此可用於誘發癌細胞(如肺癌細胞、乳癌細胞或直腸癌細胞等)凋亡。
根據本發明，活性成分的添加量通常會影響所製得之奈米多醣體複合粒子的粒徑與包覆率；舉例言之，當活性成分的添加量越高，所得奈米多醣體複合粒子的包覆率越高且粒徑越大。故於本發明之方法中，活性成分溶液中活性成分的濃度通常控制在約2重量/體積%至約21重量/體積%，較佳為約4重量/體積%至約16重量/體積%；於此，濃度單位「重量/體積%」係指每100毫升第一溶 劑所溶有的活性成分公克數。
本發明方法中之第一溶液除包含活性成分外，亦包含一多醣體，以供載覆該活性成分。可用於本發明中之多醣體係由選自以下群組之單體所構成：葡萄糖胺、N-乙醯葡萄糖胺、及前述之組合，例如選自幾丁質之衍生物。概言之，幾丁質為一種高分子物質，是由N-乙醯葡萄糖胺單體聚合而成，廣泛存在於昆蟲外殼，尤其在甲殼類動物之外殼。幾丁質去乙醯化後可形成幾丁聚醣，通常去乙醯化的程度愈高，所製得之幾丁聚醣的溶解性愈好。幾丁聚醣無毒性，且對於人體具有高生物相容性及生物降解性，一般認為其具有降膽固醇、降血壓、增加免疫、止血及抗菌等效果，且易於取得，廣泛應用於健康食品與抗菌材料當中。因此，於本發明方法中，較佳係使用幾丁聚醣作為多醣體載覆活性成分，黏度一般為約20 cP至2000 cP，較佳為約20 cP至800 cp，去乙醯度一般為約75%至約85%。
本發明方法另包含添加一交聯劑至上述之第一溶液中，以提供一第二溶液。可用於本發明中之交聯劑係選自以下群組：三聚磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、戊二醛、及前述之組合，較佳為三聚磷酸鹽，如三聚磷酸鈉。根據本發明之方法，可先將交聯劑溶於一第三溶劑(例如超純水)形成一交聯劑溶液後，再添加至該第一溶液中，較佳係以等速方式將交聯劑溶液滴入第一溶液中並伴隨攪拌作用，例如使用旋轉式攪拌機，利於均勻混合溶液中的活性成分、多醣體與交聯劑。
於提供上述第二溶液後，接著使該第二溶液進行反應，較佳係 伴隨攪拌作用(例如使用旋轉式攪拌機)，即，使溶液中的多醣體與交聯劑反應並載覆活性成分，以形成所欲得之奈米多醣體複合粒子。於不受理論限制下，以使用幾丁聚醣作為多醣體為例，當幾丁聚醣溶於如醋酸的溶劑中時，表面的NH2 基團質子化而形成帶正電的NH3 + 離子，與一交聯劑(如三聚磷酸鹽)混合後，NH3 + 離子會與交聯劑解離後之負電離子(如三聚磷酸根離子)產生靜電吸引力並發生錯合反應，生成幾丁聚醣微粒，所生成的微粒可載覆活性成分，提供所欲的奈米複合粒子。
由上可知，多醣體與交聯劑的用量亦可調整所製得之奈米多醣體複合粒子的產量與包覆率等。舉例言之，當多醣體或交聯劑的用量過低時，奈米多醣體複合粒子的產量會過低、甚至無法形成粒子，且包覆效果不佳，不符合經濟效益；反之若用量過高時，可能導致過度交聯，使所形成的奈米多醣體複合粒子的粒徑過大，且易產生聚集現象。故於本發明之方法中，第一溶液中多醣體的濃度通常控制為約0.05重量/體積%至約2.5重量/體積%，較佳係約0.5重量/體積%至約1.5重量/體積%，於此，濃度單位「重量/體積%」係指每100毫升第一溶液所溶有的多醣體公克數；交聯劑溶液中交聯劑的濃度則通常控制為約0.1重量/體積%至約1.5重量/體積%，較佳為約0.3重量/體積%至約0.9重量/體積%，於此，濃度單位「重量/體積%」係指每100毫升第三溶劑所溶有的交聯劑公克數。
此外，根據本發明之方法，係於約20℃至約80℃下，較佳約20℃至約40℃下，使第二溶液進行反應，反應時間一般為約0.5 小時至約6小時，較佳為約2小時至約4小時。若反應溫度太低或反應時間太短，可能致使反應速率太慢或反應不完全，導致奈米多醣體複合粒子產量過低且包覆效果差；若反應溫度過高，則可能對活性成分功效有不利的影響；又若反應時間太久，則會造成交聯劑過度反應，使奈米多醣體複合粒子之粒徑變大且易產生粒子聚集之現象。
於本發明中，考量製備成本及如前提有關活性成分、多醣體、交聯劑用量的影響(包含如所得粒子大小、交聯程度、包覆率等)，活性成分、多醣體與交聯劑三者間的莫耳比通常控制在約1：1.3至26：4.3至85的範圍；舉例言之，於使用式(I)化合物作為活性成分之情況下，活性成分、多醣體與交聯劑之莫耳比為約1：1.3至21：4.3至69的範圍，較佳為約1：1.8至6：6.2至20的範圍；於使用式(II)化合物作為活性成分之情況下，活性成分、多醣體與交聯劑的莫耳比為約1：1.6至26：5.3至85的範圍，較佳為約1：2.2至11.5：7.5至37.5的範圍。
上述之第二溶液反應完成後，本發明方法可視需要以任何合宜的方式去除溶劑與未反應的物質。舉例言之，可透過離心手段處理反應完成的第二溶液，例如以每分鐘約10,000轉至每分鐘約20,000轉的轉速，於低溫(約0℃至約10℃)下，離心處理約10分鐘至約60分鐘，去除第二溶液中的上清液並保留離心後的沉澱物(含有反應所得之奈米多醣體複合粒子)，接著，可以超純水沖洗沉澱物後並再次進行離心步驟，視需要重複二或多次，以盡可能提高所得粒子的純度。最後，亦可視需要使用水，較佳係超純水，沖散所得奈米多醣體複合粒子，以分散液形式予以保存備用。
本發明亦提供一種奈米多醣體複合粒子，其可由上述方法製得，該複合粒子包括一核心與一載體，且該載體係覆於該核心表面之至少一部分。根據本發明之奈米多醣體複合粒子，其核心與載體可以任何合宜的方式而併含於該奈米多醣體複合粒子中，例如該載體可完全或部分地覆於該核心表面，其中該載體表面亦可能沾附有活性成分。
於本發明中，該奈米多醣體複合粒子之核心係包含一選自以下群組之活性成分：上述式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽及酯、上述式(II)化合物及其醫藥上可接受鹽及酯、及前述之組合；且該奈米多醣體複合粒子之載體則係衍生自一多醣體與一交聯劑，於本文中，所謂「載體係衍生自一多醣體與一交聯劑」係指，所得奈米多醣體複合粒子的載體係經由多醣體與交聯劑反應而形成者。其中，該多醣體係由選自以下群組之單體所構成：葡萄糖胺、N-乙醯葡萄糖胺、及前述之組合，較佳係幾丁質之衍生物，如幾丁聚醣；該交聯劑係選自以下群組：三聚磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、戊二醛、及前述之組合，較佳係三聚磷酸鹽，如三聚磷酸鈉。
根據本發明之奈米多醣體複合粒子，其包覆率至少約65%，較佳至少約85%，更佳至少約95%，展現令人滿意的包覆效果，且透過使用多醣體更可提升本發明複合粒子的使用性，如改善其水溶性、賦予生物可相容性等等。
由於本發明所使用之活性成分KCY-Tai 1與KCY-Tai 2具有誘發癌細胞凋亡的功效，因此本發明亦提供一種使用如上述之方法所製備之奈米多醣體複合粒子於藥劑製造之用途，其中，該藥劑係用於誘發癌細胞凋亡，例如可提升癌細胞內p53蛋白質的表現量，且該藥劑尤其可用於誘發肺癌、乳癌、或直腸癌細胞內p53蛋白質的表現量。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明，其中，該等實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。所採用之試驗方法及量測儀器分別如下：
[活性成分之包覆率計算]
將活性成分(I)及活性成分(II)之原液分別稀釋成10、20、40、80、100、200 ppm，並使用紫外光-可見光光譜儀(UV-1700，SHIMADZU，日本)測定該等樣品於288奈米(活性成分(I))及276奈米(活性成分(II))波長之吸光值，計算出校正曲線後，接著測定奈米多醣體複合粒子之上清液於該等波長下的吸光值，以分析計算未被包覆之活性成分含量，並以下列公式計算活性成分之包覆率：
包覆率%=[(活性成分的總添加量－未被包覆的活性成分含量)/活性成分的總添加量]×100
[粒徑分析]
將樣品置入超音波震盪儀震盪2小時，使粒子均勻分散，接著取適量樣品滴於矽晶片上，並置入烘箱進行乾燥，再以場發射掃描式顯微鏡(Jsm-6700F Oxford Inca Energy 400，Jeol，日本)觀察樣品的表面型態。
[表面電位分析]
將樣品稀釋50倍後，使用超音波震盪儀將樣品震盪1小時，接著使用電位量測儀(Malvern ZS90)，藉由動態光散射(DLS)原理量測溶於水溶液中的樣品，觀測粒子之表面電位及粒徑分布情形。
[細胞毒性試驗]
將colo 205人類直腸腫瘤細胞接種於24孔培養盤中(1×104 細胞/盤)，置於37℃、5% CO2 培養箱中培養24小時後，分別投予不同濃度(0.39至12.5微克/毫升)之活性成分(KCY-Tai 1與KCY-Tai 2)或奈米多醣體複合粒子(KCY-Tai 1-CNPs與KCY-Tai 2-CNPs 2)，並培養24小時、72小時及120小時，以1X PBS清洗細胞二次，接著於避光下將0.5毫克/毫升MTT((3-(4,5-dimethyl thiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))加入盤養盤中(200微升/盤養孔)，置於37℃、5% CO2 培養箱中反應4小時後，將MTT吸出，再於每個盤養孔中加入500毫升二甲基亞碸(DMSO)，置於震盪器反應30分鐘後，於每個培養孔中分別吸出200微升樣本，置於96孔培養盤中，以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)測定570奈米波長的吸光值。
[紫外光-可見光圖譜分析]
以紫外光-可見光光譜儀(UV-1700，SHIMADZU，日本)測量活性成分KCY-Tai 1、KCY-Tai 2、及經多醣體載覆之活性成分於200至800奈米波長之吸光圖譜，並檢視樣品於288奈米(活性成分(I))及276奈米(活性成分(II))波長之吸光值。
實施例 [製備奈米多醣體複合粒子] [實施例1至實施例6]
(1)　以電子天秤量秤KCY-Tai 1粉末140毫克，溶解於14毫升二甲亞碸中，配製成10重量/體積%的KCY-Tai 1溶液備用。
(2)　以電子天秤量秤三聚磷酸鈉粉末，溶解於超純水中，配製成0.5重量/體積%的三聚磷酸鈉溶液備用。
(3)　以電子天秤量秤幾丁聚醣0.4克(去乙醯度：75至85%，黏度：20-200 cp)，溶解於醋酸水溶液(醋酸與超純水的用量列於表1中)，配置成幾丁聚醣溶液備用。
(4)　依表1所列用量將步驟(1)配製的KCY-Tai 1溶液加入步驟(3)配製的幾丁聚醣溶液，於旋轉式攪拌機中攪拌均勻後，接著等速滴入步驟(2)配製的三聚磷酸鈉溶液，於25℃下以旋轉式攪拌機攪拌約3小時。
(5)　在約4℃下，以每分鐘約15,500轉之轉速離心步驟(4)所得溶液，歷時約30分鐘，去除上清液後以超純水沖散沉澱物，再以相同條件離心約15分鐘，去除上清液後以超純水沖散沉澱物予以保存。
[實施例7至實施例9]
依照實施例1至6之方式製備奈米多醣體複合粒子，惟於步驟(1)中，係以電子天秤量秤KCY-Tai 2粉末56毫克，溶解於14毫升二甲亞碸中，配製成4重量/體積%的KCY-Tai 2溶液。所使用的成分與用量係列於下表2中。
根據上述方式，測量KCY-Tai 1、KCY-Tai 2與實施例1至9之奈米多醣體複合粒子之活性成分包覆率、含藥量、表面電位，結果係顯示於下表3中；掃瞄式電子顯微鏡之照片係顯示於第1圖(實施例1)；紫外光-可見光圖譜分析結果係顯示於第2圖及第3圖；細胞毒性試驗之結果係顯示於第4圖及第5圖。
如表3及第1圖所示，根據本發明之奈米多醣體複合粒子展現良好包覆率，最高更可達約96%的包覆率；且當活性成分之濃度提高時，包覆率亦呈現隨之升高之趨勢。此外，由於幾丁聚醣之分子表面帶有正電荷，而活性成分KCY-Tai 1與KCY-Tai 2之分子表面則帶有負電荷，當KCY-Tai 1與KCY-Tai 2與幾丁聚醣結合，會使粒子表面電位上升，因此，藉由測量奈米多醣體複合粒子之表面電位，可檢視活性成分是否受到包覆。由以上結果可知，根據本發明之方法所製備的奈米多醣體複合粒子，具有優良的包覆率，可降低藥物生產成本，且可大幅地簡化製備流程。
如第2圖及第3圖所示為活性成分KCY-Tai 1與KCY-Tai 2與根據本發明之奈米多醣體複合粒子(實施例1至5與7至9)之紫外光-可見光吸收光譜圖，結果顯示活性成分KCY-Tai 1與KCY-Tai 2分別在288奈米波長以及276奈米波長具有一明顯之吸收峰，當該等活性成分經包覆後，該吸收峰並未改變，顯示活性成分在經多醣體包覆後，其化學結構未發生改變，若該等活性成分之化學結構在受包覆後發生改變，將會影響藥物的功效。上述結果亦顯示隨著多醣體之包覆率增加，多醣體複合粒子在288奈米波長(活性成分KCY-Tai 1)與276奈米波長(活性成分KCY-Tai 2)之吸收值也會隨之上升。
如第4圖及第5圖所示為活性成分KCY-Tai 1與KCY-Tai 2與根據本發明之奈米多醣體複合粒子(實施例3與7)之細胞毒性試驗，結果顯示活性成分KCY-Tai 1與KCY-Tai 2在經多醣體包覆後，可明顯提升其抑制colo 205人類直腸腫瘤細胞之功效，其中，活性成分KCY-Tai 1在72小時的IC50(50% concentration of inhibition)由3微克提升至0.8微克，而活性成分KCY-Tai 2在72小時的IC50由0.7微克提升到0.25微克。以上結果顯示，當KCY-Tai 1與KCY-Tai 2經多醣體包覆後，由於該等活性成分受多醣體保護、水溶性增加、且尺寸均勻，因此活性成分經包覆後之抑癌功效明顯高於未經包覆之活性成分。
第1圖所示為實施例1所製備之奈米多醣體複合粒子的掃描式電子顯微鏡照片；
第2圖所示為KCY-Tai 1與實施例1至5所製備之奈米多醣體複合粒子的紫外光-可見光吸收光譜圖；以及
第3圖所示為KCY-Tai 2與實施例7至9所製備之奈米多醣體複合粒子的紫外光-可見光吸收光譜圖；
第4圖所示為KCY-Tai 1與實施例3所製備之奈米多醣體複合粒子之細胞毒性試驗的直條圖；以及
第5圖所示為KCY-Tai 2與實施例7所製備之奈米多醣體複合粒子之細胞毒性試驗的直條圖。

Claims (14)

  1. 一種製備奈米多醣體複合粒子之方法，包括：提供一第一溶液，包含一活性成分與一多醣體，其中該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽、式(II)化合物及其醫藥上可接受鹽、及前述之組合： 添加一交聯劑至該第一溶液中，以提供一第二溶液；以及於約20℃至約80℃下，使該第二溶液進行反應，歷時約0.5小時至約6小時，以形成奈米多醣體複合粒子；其中，該活性成分、該多醣體與該交聯劑的莫耳比為約1：1.3 至26：4.3至85。
  2. 如請求項1之方法，其中該第一溶液係經由以下方式製備：將該活性成分溶於一第一溶劑以提供一活性成分溶液，其中該第一溶劑係選自以下群組：二甲亞碸、甲醇、乙醇、及前述之組合；將該多醣體溶於一第二溶劑中以提供一多醣體溶液，其中該第二溶劑係選自以下群組：醋酸、鹽酸、或前述之組合；以及混合該活性成分溶液與該多醣體溶液。
  3. 如請求項2之方法，其中該第一溶劑係二甲亞碸，該第二溶劑係醋酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該多醣體係由選自以下群組之單體所構成：葡萄糖胺、N-乙醯葡萄糖胺、及前述之組合，該交聯劑係選自以下群組：三聚磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、戊二醛、及前述之組合。
  5. 如請求項4之方法，其中該多醣體係幾丁聚醣，該交聯劑係三聚磷酸鹽。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，於約20℃至約40℃下，使該第二溶液進行反應並伴隨攪拌作用，歷時約2小時至約4小時。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中當該活性成分為活性成分(I)時，活性成分(I)、多醣體與交聯劑的莫耳比為約1：1.8至6：6.2至20的範圍；當該活性成分為活性成分(II)時，活性成分(II)、多醣體與交聯劑的莫耳比為約1：2.2至11.5：7.5至37.5的範圍。
  8. 一種奈米多醣體複合粒子，包括：一核心，其係包含一活性成分，該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽、式(II)化合物及其醫藥上可接受鹽、及前述之組合： ；以及 一載體，其係衍生自一多醣體與一交聯劑；其中，該載體係覆於該核心表面之至少一部分。
  9. 如請求項8之奈米多醣體複合粒子，其中該多醣體係由選自以下群組之單體所構成：葡萄糖胺、N-乙醯葡萄糖胺、及前述之組合，該交聯劑係選自以下群組：三聚磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、戊二醛、及前述之組合。
  10. 如請求項9之奈米多醣體複合粒子，其中該多醣體係幾丁聚醣，該交聯劑係三聚磷酸鹽。
  11. 如請求項8至10中任一項之奈米多醣體複合粒子，其係由如請求項1至7中任一項之方法所製備。
  12. 一種使用如請求項1至7中任一項之方法所製備之奈米多醣體複合粒子於藥劑製造之用途，其中該藥劑係用於誘發癌細胞凋亡(apoptosis)。
  13. 如請求項12之用途，其中該藥劑係用於提升癌細胞內p53蛋白質的表現量。
  14. 如請求項13之用途，其中該癌細胞係肺癌細胞、乳癌細胞、或直腸癌細胞。
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