TWI394587B - 放射性標幟之核苷酸類似物、製備方法及其用途 - Google Patents

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Description

放射性標幟之核苷酸類似物、製備方法及其用途
本發明係關於一種放射性標幟之核苷酸類似物，尤指一種適用於腫瘤增生造影之核苷酸類似物。
癌症在這世界上已經成為十大死因的第一名。放射性標幟之核苷酸類似物結合正子斷層造影或單光子斷層掃描，可協助臨床偵測腫瘤病灶。
惡性腫瘤在增生時，必定經過細胞分裂的過程，而細胞在分裂時須產生大量的去氧核糖核酸(DNA)序列，構成DNA序列的前驅物即為核苷(nucleoside)。核苷在體內經磷酸激酶加上三個磷酸根後，即具崁入(incorporate)DNA序列的能力。此惡性組織會大量攝取核苷以提供分裂增生之所需。
DNA合成主要以兩種途徑進行，第一種途徑其胸腺嘧啶核苷酸(thymidine nucleotide,TMP)的合成是由胸線核苷鹽合成酶(thymidylate synthase，TS)將脫氧尿苷單磷酸酯(dUMP)甲基化後形成，此為新生成途徑(De novo pathway)；另一途徑為經直接攝取外在的胸腺嘧啶，由胸苷激酶1(thymidine kinsae 1，以下簡稱TK1)將其磷酸化後形成胸腺嘧啶核苷單磷酸(TMP)，此為回收合成途徑(Salvage pathway)。然重生途徑中所用的前驅物脫氧尿苷單磷酸酯(來自deoxyuridine,uridine,uracil)亦參與RNA的合成，較不適合監控DNA合成，因此，目前研究主要仍以經補救合成途徑的核苷類似物為對象，作為偵測DNA合成的示蹤劑。
在補救合成途徑中最關鍵的酵素是TK1，已有文獻指出，TK1的表現量與細胞週期有密切的關係，在G1-phase進入S-phase期間有高濃度的表現，但G0或G1期則TK1表現量下降(Sherley JL and Kelly TJ.Regulation of human thymidine kinase during the cell cycle.J Biol Chem 1988；263：8350-8.)。綜合以上所述，腫瘤細胞內的TK1含量也比一般正常細胞多(Schwartz JL,Tamura Y,Jordan R,Grierson JR,and Krohn KA.Monitoring tumor cell proliferation by targeting DNA synthetic processes with thymidine and thymidine analogs.J Nucl Med 2003；44：2027-32.)，目前已開發多種核苷類似物探針，亦是藉由以上機制作為核醫造影藥物，以下介紹幾種目前正子電腦斷層(Positron emission tomography,PET)與單光子電腦斷層(Single photon emission computed tomography,SPECT)造影核苷類似物，並比較其優缺點：
[ 11 C]thymidine([ 11 C]TdR)：
以放射性同位素碳-11標記的胸腺嘧啶[11 C]TdR為第一個作為腫瘤增生速率造影劑的核苷類放射藥物(Christman D,Crawford EJ,Friedkin M,and Wolf AP.Detection of DNA synthesis in intact organisms with positron-emitting(methyl-11 C)thymidine.Proc Natl Acad Sci USA 1972；69：988-92.)。由於[11 C]TdR與天然的胸腺嘧啶結構完全一樣，所以它崁入DNA的能力與胸腺嘧啶相同，且在細胞中的積聚程度與其DNA合成速率成正比，故可定量分析直接估算腫瘤及正常組織的增生速率(proliferation rate)(Eary JF,Mankoff DA,Spence AM,Berger MS,Olshen A,Link JM,et al. 2-[C-11]thymidine imaging of malignant brain tumors. Cancer Res 1999;59:615-21.)。但受限於碳-11的短物理半衰期(20分鐘)，使得C-11標幟的核醫藥物臨床應用性受到限制，且[11 C]TdR極易被生物體內的酵素分解，在生物體內的穩定性較差(Shields AF,Lim K,Grierson J,Link J,and Krohn KA. Utilization of labeled thymidine in DNA synthesis: studies for PET. J Nucl Med 1990;31:337-42.)。因此，[11 C]TdR較不適合作為腫瘤增生造影劑。
3'-deoxy-3'-[ 1 8 F]fluorothymidine([ 18 F]FLT):
[18 F]FLT也是TdR的類似物，在評估腫瘤及正常組織的增生速率方面最常使用的示蹤劑之一，其效用已在多種腫瘤模式上得到驗證，如：肺癌、大腸直腸癌以及淋巴癌等(Francis DL,Visvikis D,Costa DC,Arulampalam TH,Townsend C,Luthra SK,et al. Potential impact of [18 F]3'-deoxy-3'-fluorothymidine versus [18 F]fluoro-2-deoxy-D-glucose in positron emission tomography for colorectal cancer. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2003;30:988-94;Seitz U,Wagner M,Neumaier B,Wawra E,Glatting G,Leder G,et al. Evaluation of pyrimidine metabolising enzymes and in vitro uptake of 3'-[18 F]fluoro-3'-deoxythymidine([18 F]FLT) in pancreatic cancer cell lines. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002;29:1174-81;Vesselle H,Grierson J,Muzi M,Pugsley JM,Schmidt RA,Rabinowitz P,et al. In vivo validation of 3'deoxy-3'-[18 F] fluoro thymidine([18 F]FLT) as a proliferation imaging tracer in humans: correlation of[18 F]FLT uptake by positron emission tomography with Ki-67 immunohistochemistry and flow cytometry in human lung tumors. Clin Cancer Res 2002;8:3315-23;Buck AK,Schirrmeister H,Hetzel M,Von Der Heide M,Halter G,Glatting G,et al. 3-deoxy-3-[18 F]fluorothymidine-positron emission tomography for noninvasive assessment of proliferation in pulmonary nodules. Cancer Res 2002;62:3331-4;Dittmann H,Dohmen BM,Kehlbach R,Bartusek G,Pritzkow M,Sarbia M,et al. Early changes in[18 F]FLT uptake after chemotherapy: an experimental study. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002;29:1462-9;Vijayalakshmi D and Belt JA. Sodium-dependent nucleoside transport in mouse intestinal epithelial cells. Two transport systems with differing substrate specificities. J Biol Chem 1988;263:19419-23.)。氟-18是一種會放出正電子的核種，它的半衰期是110分鐘，由於凡得瓦爾半徑和氫原子類似可以模擬天然物的氫，且半衰期長短適中，因此它是一種適用於核醫分子影像的核種。由於氟-18原子取代原本在醣基3’碳上的OH基，使之可提供[18 F]FLT在細胞內抵抗nucleoside phosphorylase將N-glycosidic bond切斷的能力，不過也因為如此，原本DNA聚合酶辨認氫氧基以延長DNA序列的位置受改變，導致雖然FLT會被TK1磷酸化而滯留在細胞中，但無法進一步嵌入DNA序列中，故FLT在組織的積聚，生物意義上只代表該組織的TK1活性較高(若細胞處於S phase，則TK1的量也會相對較高)，並不完全與增生速率直接相關。因此，[18 F]FLT之PET造影，能反映腫瘤細胞對胸腺嘧啶的需求及TK1的活性，間接得知腫瘤細胞的增生速率。
2-[ 18 F]fluoro-5-methyl-1-β-D-arabinofuranosyluracil([ 18 F]FMAU)：
由於[11 C]thymidine及[18 F]FLT在應用上皆有些問題待釐清，也驅使專家找尋其他更具潛力的腫瘤增生速率造影劑。之前的研究指出，[18 F]FMAU的氟-18取代胸腺嘧啶在醣基2'位置的氫原子，如此亦可阻擋生物體內核苷磷酸化酶(nucleoside phosphorylase)打斷N-醣苷鍵的作用，故在生物體內的穩定性極高，且與TdR一樣，可在細胞的DNA合成期(S phase)經由體內酵素的作用而被崁入DNA序列中，故[18 F]FMAU在細胞中的積聚程度可被視為正比於DNA生成速率及細胞增生速率。然而，[18 F]FMAU的標幟所需合成的時間較長，放射化學產率也較低(Namavari M,Barrio JR,Toyokuni T,Gambhir SS,Cherry SR,Herschman HR,et al.Synthesis of 8-[18 F]fluoroguanine derivatives：in vivo probes for imaging gene expression with positron emission tomography.Nucl Med Biol 2000；27：157-62.)。
5-[ 124/131 I]iodo-2'-deoxyuridine([ 124/131 I]IUdR)：
[124/131 I]IUdR亦為TdR之類似物，在苯環5號位置由原本的甲基以碘取代，其化學結構設計的原理是利用碘和胸腺嘧啶之五號碳的甲基有類似的凡得瓦爾半徑。IUdR可在細胞行有絲分裂時崁入DNA內，所以IUdR在體內組織的積聚量直接與細胞增生速率呈正相關。以[125 I]IUdR進行惡性腫瘤治療研究近年來文獻上已有多篇報導，但由於IUdR在活體內的生理半衰期甚短(文獻指出在人體內僅為五分鐘，而在老鼠則為七分鐘)(Prusoff WH. A Review of Some Aspects of 5-Iododeoxyuridine and Azauridine. Cancer Res 1963;23:1246-59.)，如此一來，即使用了物理半衰期較長的放射性碘，也著實限制了[124/131 I]IUdR在腫瘤造影的應用。
基於上述之造影核苷類似物的缺失，開發新型的單光子斷層腫瘤造影的核苷類似物有其必要性。
本發明之一目的係在提供一種放射性標幟之核苷酸類似物，俾能具有較長之活體內的生理半衰期及較高之血漿中穩定性。
本發明之另一目的係在提供上述放射性標幟之核苷酸類似物之製造方法，其係較短的合成時間及高放射化學產率。
本發明之又一目的係在提供上述放射性標幟之核苷酸類似物之應用，其係用作放射性醫藥組合物，具有高專一性、較短的合成時間、高放射化學產率及較長半衰期，俾能應用於腫瘤增生診斷或治療預後評估之發展，更有助於觀察藥物在體內長時間的代謝情形。
為達成上述目的，本發明係提供一種放射性標幟之核苷酸類似物，包括如下列化學式所示之化合物：
A—B
其中，A為放射性碘，其中該放射性碘包含123 I、131 I及124 I，以及B為嘧啶衍生物，選自於由胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及其衍生物所組成之群。
上述之放射性標幟之核苷酸類似物，其中該嘧啶衍生物係為胞嘧啶或胸腺嘧啶。該嘧啶衍生物係為含1-(2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三丁基錫(1-(2-Deoxy-β-D-arabinofuranosyl)-5-tributylstannyl)之嘧啶衍生物。藉以利用腫瘤細胞內的TK1含量比一般正常細胞多之特性，加以監控腫瘤細胞DNA合成，進而由放射性標幟之核苷酸類似物在細胞中的積聚程度與其DNA合成速率定量分析直接或間接地估算腫瘤及正常組織的增生速率。
上述之放射性碘中，由於123 I的衰變方式為電子捕獲(electron capture)，產生γ射線及歐介電子(Auger electron)，半衰期約13.2小時，而131 I的衰變方式為β衰變，放出能量為γ射線及β粒子，半衰期約7-8天。因此可使用123 I所釋出之大量歐介電子，以有效地造成局部DNA雙鏈斷裂(double strand break)，導致腫瘤細胞死亡。而131 I對腫瘤細胞的破壞力雖不如以123 I，然而131 I能放出β max為606 keV的β粒子及γ射線，有效殺傷範圍較廣，同時兼具造影診斷功能，因此一方面可藉著放射性的示蹤性質精確掌握腫瘤的位置，另一方面可利用釋出的放射線殺死腫瘤細胞，放射性碘視情況亦可置換為其他核種，如99m Tc或111 In等，如需進行正子斷層造影(PET)，也可使用124 I核種。
本發明亦提供一種放射性標幟之核苷酸類似物之製備方法，包括步驟：
(a)製備一包括有5-三丁基錫-2'-嘧啶衍生物之標幟前驅物，其中該標幟前驅物中之嘧啶衍生物係選自於由胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及其衍生物所組成之群。
(b)該標幟前驅物於氧化條件下以放射性核種進行碘化去錫反應(iododestannylation)得經包含有123 I及131 I放射性碘標幟之粗產物。
(c)將該經放射性碘標幟之粗產物純化後上述之放射性標幟之核苷酸類似物。
上述之製備方法，其中步驟(a)之該嘧啶衍生物係為胞嘧啶或胸腺嘧啶。更具體地說，該標幟前驅物係為含1-(2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三丁基錫之嘧啶衍生物。
上述之製備方法，其中步驟(b)之該氧化條件係指以過氧化氫氧化。
上述之製備方法，其中步驟(c)之純化係以矽膠管柱層析法進行，經純化後的放射性標幟之核苷酸類似物亦可以凍晶粉末形式存在。
本發明又提供一種放射性醫藥組合物，係包含上述之放射性標幟之核苷酸類似物。該放射性標幟之核苷酸類似物，係包含有結構式Ⅰ之化合物：
亦可包含有結構式Ⅱ之化合物：
本發明之放射性醫藥組合物可應用腫瘤增生造影劑，有助於核子醫學造影於腫瘤偵測或治療預後評估之發展，亦可將放射性醫藥組合物所釋放放射線應用在惡性腫瘤，能有效抑制惡性腫瘤的再生，更可一併使用，達到核子醫學造影診斷與治療的雙重目的。
其後，本發明之實施例依下列例子詳細描述，但不限於此。
例子1：5-碘-2'-去氧胞嘧啶(5-iodo-2'-deoxycytidine，簡稱ICdR)標準品之合成
購買的起始物為去氧胞苷鹽酸鹽(Deoxycytidine hydrochloride)，對於甲醇(Methanol)的溶解度很差，在反應前先將去氧胞苷鹽酸鹽(1 g)溶在甲醇(2 mL)內，滴入數滴的三乙胺(triethylamine)中和，直到完全溶解為止，再將此溶液加入在裝有二氯甲烷(CH2 Cl2 )的sample瓶內，此時會有大量沉澱產生，過濾即得中和後的去氧胞苷(如式1所示)固體。
在25 mL圓底燒瓶中加入旋轉子、0.4 g去氧胞苷溶在30 mL甲醇攪拌數分鐘。依序先加入Iodine(670 mg，1.5 eq)及三氟醋酸銀(Trifluoroacetic acid,silver salt，583 mg，1.5 eq)，即產生碘化銀沉澱，在35℃下反應約二十小時。反應結束後，使用celite過濾，再用甲醇清洗後，將濾液抽乾。以矽膠管柱層析法純化產物(移動相為二氯甲烷/甲醇=4/1沖提)，可得如下所示之最終產物ICdR(如下式2所示，370 mg，產率約60%)。
以核磁共振光譜(NMR)鑑定其化學結構，數據如下：
1 H NMR(MeOH-d 4 ,200MHz):δ8.43(s,1H,H-6),6.08(dd,J =6.0,6.2 Hz,1H,H-1'),4.26(m,1H,H-3'),3.77(m,3H,H-4',H-5'),2.23(m,1H,H-2'α),2.05(m,1H,H-2'β)
LRESI(+): 376.0([M+Na]+ );Exact mass(HRMS) calcd for C9 H12 IN3 O4 ,352.9872;found 353.9959([M+H]+ );found 375.9780([M+Na]+ )
例子2：[ 131 I]ICdR標幟前驅物1-(2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三丁基錫胞嘧啶(1-(2-Deoxy-β-D-arabinofuranosyl)-5-tributylstanny lcytosine，簡稱為Bu 3 SnCdR，如式3所示)之合成
取200 mg(0.56 mmole)的標準品ICdR置於長頸瓶中，再加入15.5 mg的參(二亞苄基丙酮)鈀(0)(Tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0))(0.03 eq，0.00425 mmole)，先抽真空灌氬氣，使系統維持在氬氣系統下。加入700 μL雙(三丁基錫)(Bis(tributyltin))(3.5 eq 1.4 mmol，d=1.158，MW=580.08)後再加入2 mL乾燥DMF，並使用油浴鍋加熱至65℃隔夜反應。反應完後先用celite過濾，再用二氯甲烷溶解後抽乾，以矽膠管柱層析法純化產物(移動相為CH2 Cl2 /MeOH=10/1沖提)，可得最終產物Bu3 SnCdR，如式3所示(產率約40%)。分裝成試藥小品之方法為取1.6 mg純化後的Bu3 SnCdR溶於2 mL的除水二氯甲烷中，再分注於小瓶中(50 μL/kit)，經真空抽乾後加入氮氣封蓋即完成Bu3 SnCdR試藥小瓶(40 μg/kit)之製備，此試藥小瓶貯存於避光、無氧環境下。
1 H-NMR(CDCl3 ,400MHz):δ7.52(s,1H,H-6'),6.06(dd,J =6.0 Hz,6.4Hz,1H,H-1'),4.60(s,1H,H-3'),4.05(s,1H,H-4'),3.83(s,2H,H-5'),2.45(s,2H,H-2'),0.84~1.61(m,27H,SnBu3 )
LRESI(-): 516.5([M-H]- );Exact mass(HRMS) calcd for C21 H39 N3 O4 Sn,517.1963;found 518.2079([M+H]+ )
例 子3：合成放射性碘123及131標幟之[ 1 23/131 I]ICdR及[ 123/131 I]IUdR：
取一Bu3 SnUdR及Bu3 SnCdR試藥小瓶(40 μg)加入20 μL酒精使藥物溶解。依序加入適量的[123/131 I]NaI溶液以及100 μL的H2 O2 /HCl/H2 O=8/8/84溶液作為氧化劑，加蓋密封測放射活度，再劇烈震盪反應10分鐘。之後將反應混合液直接以液態氮冷卻固化，再架設活性碳管並置入已安裝活性碳吸附劑之真空系統進行冷凍乾燥，除去未反應之放射性碘、酸(HCl)、溶劑(EtOH,H2 O)及氧化劑(H2 O2 )，即得到僅含[123/131 I]ICdR和微量CdR之凍晶粉末，[123/131 I]IUdR亦是如此，再測放射活度，比較反應前後之放射活度可得到標幟產率(Labeling yield)。最後加入適量生理食鹽水溶解產物作逆相薄層分析。
綜合上述，關於ICdR標準品及標誌合成步驟如下所示：
而IUdR標準品及標誌合成步驟如下所示：
[123/131 I]ICdR及[123/131 I]IUdR之逆相薄層分析實驗結果請分別參見圖1及圖2所示。Radio TLC條件：逆相TLC，展開液10 mM acetic acid/EtOH=2/1，[123/131 I]ICdR和[123/131 I]NaI的Rf 值分別為0.78和0.99。正相TLC展開液條件為ethyl acetate/ethanol=5/1，[123/131 I]IUdR的Rf 值則為0.65。
而標準品ICdR及[131 I]ICdR之高效能液相層析圖請參考圖3所示(其中展開相為10%乙腈及90%的0.1%乙酸，流率：0.8 mL/min，分 析型C18管柱)。
以下將進行[123/131 I]ICdR及[123/131 I]IUdR之生物特性分析
例子4：細胞攝取實驗
兩百萬的細胞植於含有具10% FBS補充之14 mL培養基的15 cm2 的盤中。成長48小時後，該培養基置換為包含有放射性示蹤劑131 I-ICdR及131 I-IUdR(0.5~1 μCi/mL培養基)的無血清培養基。在指定的時間點(在1、2、4及8 h用I-131示蹤劑)，使用細胞刮除器獲得盤上的細胞。接著，細胞懸浮液轉置於15 mL離心管(cone tube)並離心(3500 rpm)2分鐘。離心後，100 μL收集到一預稱重的計數管並直接倒入維持之培養基。沉澱細胞(cell pellet)以乾冰冷凍且亦收集至另一預稱重之計數管。測量沉澱細胞及培養基之重量並使用γ閃爍計數器(1470 WIZARD Gamma Counter,Wallac,Finland)測定放射性並將重量標準化。放射示蹤劑之於體外細胞活性之累積以細胞對培養基之比率表示。
將二種放射性核苷類似物[131 I]IUdR及[131 I]ICdR於細胞攝取實驗結果請參見圖4((a)、(b))所示。顯示131 I-IUdR於NG4TL4與LL/2細胞的聚集量皆高於131 I-ICdR，但兩者的攝取值都是隨著時間過去持續向上攀升的。
例子5：DNA併入研究
DNA萃取由Genomic DNA Mini Kit(Geneaid Biotech Ltd,Taiwan)實行。收集NG4TL4細胞株並以2 x 106 種於10 cm的培養皿中。經過48小時的生長，將培養皿中的培養基置換為含有放射性示蹤劑131 I-ICdR或131 I-IUdR(1 μCi/mL培養基)的新鮮無血清培養基，並置於37℃恆溫培養箱內。當培養時間達0.5、1、2、4及8 h後，移除培養基，再用冰的PBS清洗細胞兩次，接著利用胰蛋白酶將細胞切下並收集於離心管中離心(34000 rpm持續1 min)。移除上清液，但需保留50 μL的殘餘緩衝液並使細胞呈懸浮狀態。添加300 μL細胞分解緩衝液至樣品中混合均勻後，在60℃水浴下培養數分鐘直到溶液呈現透明狀(每3分鐘倒置一次樣品)。添加2 μL RNAse(25 mg/mL)至樣品中並混合均勻，在室溫下培養5分鐘後，添加蛋白質移除緩衝液100 μL至樣品中並立即地混合均勻，在冰上培養5分鐘後，以全速(14000 rpm)離心3分鐘。將已完成步驟之溶液中轉置懸浮液至另一管中，並添加異丙醇徹底地混合。再以全速(14000 rpm)離心20分鐘後，移除懸浮液並添加1 ml dddH2 O後，在60℃水浴下溶解DNA 30分鐘。最後，以多功能微量盤式分析儀(Multimode microplate readers)(Infinite®200)定出DNA的濃度，且所有樣品的放射性活度使用γ計數器測定(1470 WIZARD Gamma Counter,Wallac,Finland)，並與DNA的重量進行標準化的動作。於實驗中，DNA的純度以吸收波長260及280 nm來決定，且兩吸收值之比率(OD260 /OD280 )約為1.7。DNA萃取實驗結果請參見圖5((a)、(b))發現，細胞與培養液的比值(C/M)與DNA的聚集活性(cpm/μg DNA)皆有甚高相關性(r2 >0.90)。
例子6：代謝物分析研究
正常母FVB/N老鼠透過尾部靜脈以9.25 MBq之131 I-ICdR及131 I-IUdR注射，並在施藥後的不同時間點(對131 I-ICdR經0.25、1及2 h；131 I-IUdR經5及15分鐘)以頸椎脫臼方式(cervical dislocation)犧牲。血液與尿液中的131 I-ICdR及131 I-IUdR放射性代謝物由正相TLC分析(展開條件131 I-ICdR：乙酸乙酯/乙醇=5/1；131 I-IUdR：甲醇/二氯甲烷=1/15)評估。血液樣本由心臟穿刺獲得，接著在13,000 rpm離心10分鐘。離心後，上清液(約300 μL)取出置於含有等量乙醇的1.5 ml離心管，且再次離心以取得血清。其實驗結果請參考下表1及表2。
表1　在 131 I-ICdR經尾靜脈注射至正常FVB/N老鼠(n=3)後血液及尿液中的代謝物分析，展開相條件為NP-TLC(EA/EtOH=5/1)。
表2　 131 I-IUdR經尾靜脈注射至正常FVB/N老鼠(n=3)後血液及尿液中的代謝物分析，展開相條件為NP-TLC(CH 2 Cl 2 /MeOH=15/1)。
例子7： 131 I-ICdR及 131 I-IUdR之藥物動力學研究
以正常母FVB/N老鼠模式，靜脈注射200 μCi之131 I-ICdR或131 I-IUdR後，在不同時間點(3、5、10、15、20及30min，及1、2、4、8、12、24、48、72 h)，於對側尾靜脈以定量微毛細管(Bluebrand intraEND,Germany)採集血液(體積為1 μL)。血液樣本的放射活度使用γ計數器測定(1470 WIZARD Gamma Counter,Wallac,Finland)並將血液的體積加以標準化。血液中之放射性濃度以每毫升注射劑量百分比表示(%ID/mL)。藥物動力學參數由電腦軟體WinNonlin 5.2(Pharsight,Mountain View,CA,USA)運算。使用二-隔室分析模式(Two-compartmental analysis model)，所計算的參數包含有α半衰期(t1/2 α)、β半衰期(t1/2 β)、Cmax 、總清除率(total body clearance)及曲線下面積(AUC)。在靜脈注射131 I-ICdR或131 I-IUdR進入正常FVB/N老鼠後，從血液活度濃度對時間的曲線符合藥物動力學的二-隔室分析模式。所有參數使用軟體WinNonlin計算且藥物動力學參數總結於表3。血液中131 I-ICdR及131 I-IUdR的最大放射性(Cmax)經測定為9.95±0.71% ID/mL及18.91±6.16% ID/mL，其亦為血液中的T max。靜脈注射後131 I-ICdR的t1/2 α及t1/2 β分別為1.54±0.47 h及56.36±9.38 h，表示131 I-ICdR的放射活度在血液中緩慢地降低，且其結果顯現131 I-ICdR在體內的循環時間較131 I-IudR(t1/2 α及t1/2 β為0.08±0.02 h及2.28±0.90 h)來的長。此外，131 I-ICdR之AUC(45.82±3.57 h×%ID/mL)比131 I-IudR(32.98±5.39 h×%ID/mL)來的高，且131 I-ICdR的總清除率(3.90±0.59 mL/h)比131 I-IudR(6.04±1.01 mL/h)低。其實驗結果如下表3及圖6((a)、(b))所示。
表3：在FVB/N正常母老鼠經尾靜脈注射 131 I-ICdR及 131 I-IUdR後之藥物動力學參數評估值
於代謝物分析與藥物動力實驗結果發現，施打131 I-ICdR於正常小鼠的血液和尿液中，131 I-ICdR仍為主要成分(打藥後一小時，血液與尿液個別為72.2%與71.0%)，而131 I-IUdR則在5分鐘後，大部分已代謝為free131 I-(血液與尿液個別為71.1%與88.0%)。另外，131 I-ICdR的血液滯留時間長，此結果證實131 I-ICdR於腫瘤的積聚更為有利。
例子8： 131 I-ICdR及 131 I-IUdR之生物分布研究
種植NG4TL4-WT腫瘤之FVB/N小鼠於尾靜脈注射放射性示蹤劑後，並在指定時間點後(經1、2、4及8 h後)以頸椎脫臼(cervical dislocation)犧牲。將腫瘤和十三個其他組織(血液、心、肺、肝、胃、小腸、大腸、脾臟、胰臟、腎臟、骨頭、骨髓及肌肉)取下、清洗、稱重並用γ閃爍計數器測定放射性。在組織(每分鐘的計數)中放射性示蹤劑的攝取隨衰變校正、對樣品重量標準化、並以組織中每克注射劑量之百分比(%ID/g)以及腫瘤對血液聚集比率表示。其結果請參見表4及表5所示。
表4　以80~90 μCi之 131 I-ICdR經尾靜脈注射至FVB/N老鼠後之生物分布。
表5以80~90 μCi之 131 I-IUdR經尾靜脈注射至FVB/N老鼠後之 1 31 I-IUdR生物分布。
例子9：平面γ及微動物SPECT/CT影像研究
平面γ影像使用裝設有針孔準直儀的雙頭γ-照相機(ECAM；Siemens)獲得。經尾靜脈注射7.4±0.1 MBq的131 I-ICdR及131 I-IUdR至小鼠後，於打藥後1、2、4及8 h進行15分鐘的靜態掃描造影。
SPECT影像及CT影像使用微動物SPECT/CT掃描儀(FLEX Triumph Regular FLEX X-O CT,SPECT CZT 3Head System,GE Healthcare,Northridge,CA,USA)來取得。經尾靜脈注射123 I-ICdR(18.5 MBq)於荷有NG4TL4-WT肉瘤之FVB/N小鼠與LL/2肺惡性瘤小鼠後2及4 h，動物以平行於掃描儀長軸的方式採俯姿(prone position)進行造影，吸入流量為2 L/min氧氣(掺有2%異氟烷)來進行麻醉。SPECT影像收集後再取得CT影像(能量：80 kVp，90 μA，512投影)，SPECT影像使用一低能量高解析度的平行孔準直儀。影像使用120 mm2 的FOV，旋轉半徑(radius of rotation, ROR)設定為120 mm，並使用具有漢明濾波器(hamming filter(0.54))的濾波反投影法(filtered back projection)來處理。微動物SPECT/CT的SPECT影像重建後產生80×80×80之影像尺寸(單位：畫素)，CT影像重建後產生512×512×512之影像尺寸，影像融合(co-registration)使用Amira軟體(版本4.1.1)將微動物SPECT影像及微動物CT影像融合。
為估計放射性濃度，感興趣的圈選區域涵蓋了腫瘤及參考組織(即：肌肉)，且利用低放射性之背景值加以校正，其係於遠離該動物體之較遠區域測量得到。腫瘤放射性濃度皆與肌肉之放射性濃度進行標準化，並以腫瘤-肌肉聚集比值(T/M值)表示。其實驗結果請參見圖7及圖8((a)、(b)及(c))所示。
生物分布與造影實驗結果顯示，131 I-ICdR與131 I-IUdR在增生快速的器官，像是腫瘤、骨髓或小腸等都有明顯的積聚，且生物分布實驗結果發現，T/M值也隨著時間而提升，於八小時時間點的T/M值分別為25.77與19.91。且這兩種藥物與代謝物主要排泄路徑為泌尿道系統。這結果與造影結果相互一致。
結論 ：綜合上述例子，本發明已成功建立放射性標幟之核苷酸類似物之方法及其標準品之合成與分析。由閃爍平面加馬造影及單光子電腦斷層攝影(SPECT/CT)結果及生物分布證明其適合作為腫瘤增生造影劑，將能有助於核子醫學造影於腫瘤偵測或治療預後評估之發展。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1係本發明一較佳實施例之例子3中[123/131 I]ICdR之逆相薄層分析實驗結果。
圖2係本發明一較佳實施例之例子3中[123/131 I]IUdR之逆相薄層分析實驗結果。
圖3係本發明一較佳實施例之例子3中標準品ICdR及[131 I]ICdR之高效能液相層析圖。
圖4係本發明一較佳實施例之例子4中將二種放射性核苷類似物[131 I]IUdR、[131 I]ICdR加入細胞之攝取實驗數據(a)及其迴歸分析結果(b)。
圖5係本發明一較佳實施例之例子5中DNA萃取實驗結果，其中131 I-ICdR(A)及131 I-IUdR(B)顯示隨時間呈現線性併入至NG4TL4肉瘤細胞，且在DNA部分發現放射性積聚的結果。
圖6係本發明一較佳實施例之例子7中將二種放射性核苷類似物[131 I]ICdR(a)及[131 I]IUdR(b)經由靜脈注射至小鼠後定時抽血測得之血液活性變化結果(每個時間點n=3)。
圖7係本發明一較佳實施例之例子9中平面收集造影及微動物SPECT/CT之影像結果，其係為具有NG4TL4肉瘤(箭頭)的老鼠分別以123 I-ICdR(A)、123 I-IUdR(B)、123 I-ICdR(C)注射獲得之結果(n=4)。
圖8係本發明一較佳實施例之例子9中平面收集造影及微動物SPECT/CT影像研究結果，其係為種植有LL/2肺惡性瘤(箭頭)的老鼠分別以131 ICdR(A)、131 I-IUdR(B)、123 I-ICdR(C)注射獲得之結果(n=4)。
(該圖為一數據圖表故無元件代表符號)

Claims (10)

  1. 一種放射性標幟之核苷酸類似物，其係包括如下列化學式所示之化合物： A-B其中，A為一放射性碘，其中該放射性碘包含123 I及131 I，以及B為一嘧啶衍生物，選自於由胞嘧啶、尿嘧啶及其衍生物所組成之群。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之放射性標幟之核苷酸類似物，其中該嘧啶衍生物係為胞嘧啶或尿嘧啶之衍生物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之放射性標幟之核苷酸類似物，其中該嘧啶衍生物係為含1-(2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三丁基錫(1-(2-Deoxy-β-D-arabinofuranosyl)-5-tributylstannyl)之嘧啶衍生物。
  4. 一種放射性標幟之核苷酸類似物之製備方法，包括步驟：(a)製備一包括有5-三丁基錫-2'-嘧啶衍生物之標幟前驅物，其中該標幟前驅物中之嘧啶衍生物係選自於由胞嘧啶、尿嘧啶及其衍生物所組成之群；(b)該標幟前驅物於氧化條件下以一放射性核種進行碘化去錫反應(iododestannylation)得一經放射性碘標幟之粗產物，其中該放射性碘包含123 I及131 I；以及(c)將該經放射性碘標幟之粗產物純化後得如申請專利第1至3項中任一項所述之放射性標幟之核苷酸類似物。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之製備方法，其中步驟(a)之該嘧啶衍生物係為胞嘧啶或尿嘧啶之衍生物。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之製備方法，其中步驟(a)之該標幟前驅物係為含1-(2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三丁基錫之嘧啶衍生物。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之製備方法，其中步驟(b)之該氧化條件係指以過氧化氫氧化。
  8. 如申請專利範圍第4項所述之製備方法，其中步驟(c)之純化係以矽膠管柱層析法進行。
  9. 一種放射性醫藥組合物，係包含如申請專利範圍第1項所述之放射性標幟之核苷酸類似物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之放射性醫藥組合物，其中該放射性標幟之核苷酸類似物，係包含有結構式I之化合物：
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