TWI375718B - Non-antibiotic selection marker genes - Google Patents

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TWI375718B
TWI375718B TW096102957A TW96102957A TWI375718B TW I375718 B TWI375718 B TW I375718B TW 096102957 A TW096102957 A TW 096102957A TW 96102957 A TW96102957 A TW 96102957A TW I375718 B TWI375718 B TW I375718B
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Description

1375718 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供一種DNA構築體，其包含啟動子、 聊1基因和基因修飾，其中前述观！基因和基因修飾 係由前述啟動子所啟動。此外，本發明提供一 DNA構築體所轉殖之植物，和一種用來篩選前述轉殖植 物的方法。 ❿ 【先前技術】 雖然近來植物轉型系統有所進步，但全能細胞 (totipotent cell)相較於非全能細胞的轉型成功比例仍 ，很低。因此，為了簡化選出預定轉型植物的痛測程 序，需要一個具有抗生素或除草劑抗性的基因來做為有 效而可筛選的標示（Leyman ei α/. , 2004 ; Mild and McHugh ’ 2004)。一般來說，既有的篩選系統主要可以 亡ί:群一是習知的篩選系統’這是目前的主流，係 耩篩選基因能夠解除抗生素或除草劑這些篩選劑的 籲毒害來進行篩選；另—種則包含陽性㈣系統，其中筛 選劑會被篩選基因的產物轉化成—簡單化合物，而使轉 型細胞具有代謝或發育上的優勢（Eriks〇n，扣β/ ，2004 :
Wenck and Hansen > 2005 ) 〇 近年來已提出了五十種以上的篩選系統，不過只 有幾種普及化並達到實際應用的層次，例如使用邮π、 和基因來培育出第一代轉基因作物，而不是組織 系統（Haldrup β/_，i998a ; Mild and McHugh，2004) ’ 因會賦予作物對抗生*的抗性。這紐術仍然 而精準的應用，以避免無意中轉人非目標基因’例 如過敏絲目、影響植物生長勢或是危害自然生態系統 5 1375718 的基因。然而，這些技術還是不夠精確，所以不小心送 入非所欲之基因的情形仍然無法避免，例如送入會引起 過敏的基因、或會使植物痩弱與會危害自然生態系統的 - 基因（Daniell ei a/·，2001b )。 . ^ 前不久，發展出了一些爭議性較低的篩選系統， 這些糸統不會讓抗性基因留在轉基因植物體内，而它們 是使用非毒性篩選化學物進行篩選程序，如分別以 叮/A、ga/T和办从基因來對木糖、半乳糖和絲胺酸 進^篩選，而得到比未轉殖植株更具有代謝優勢的轉基 攀 因芽（transgenic shoot) ( Haldrup ei a/.，1998a ; Erikson d 0人，2005)。雖然這些系統提供了一種便利的新型篩 選策略，但要取決於這些轉基因組織/芽的表現。此外， 這些標示基因大多是來自細菌，將這樣的基因引入作為 食物的生物體内會引起道德議題’而且會在一般民眾^ 間引起無法預見的憂慮（Leyman ei α/·，2004 ; Erikson， 0/. , 2005 )。能夠在不做有性雜交的情況下獲得無標 示的植物當然是一種優點，但是，如要完全移除標示， 這些方法是無法立即獲得採用的（Breitlereia/，2〇〇4 ; • Mild an£i McHugh，2004)。最近用馬鈴薯所進行的轉型 已經不採用可篩選的標示基因（de Vetten扣α/.，2003 )， 然而篩選的過程十分冗長，而且包含多次PCR反應。 現行的趨勢是要發展一種使用對環境無害的標示 與天然植物材料的篩選系統。在阿拉伯芬和煙草體内， 阿拉伯芥海藻糖-6-磷酸合成酶（心咖 trehalose-6-phosphate synthase)基因會過度表現，而顯 示出這類基因在植物轉型方面的潛力（Avonce打α/.， 2004 ; Leyman ei <2/.，2004 ; Leyman αΑ，2005 )。 色胺酸（typtophan，ΊΥρ)是一種存在於植物體内 6 K年12月切日修(f)正替換頁 的必須胺基酸，1¾體内無法合成色挺酸，而色胺酸是 生長素、硫代葡萄糖苷（g】ucosjno】ate)、於驗酸、植物 防紫素（phytoalexin )和生物驗合成過程中。引D朵環的主 要來源（Pruitt and Last，]993)。在植物體内，色胺酸 的生物合成並非持續進行，因此它只有在有需要的時候 才會被製造出來。色胺酸生物合成途徑一開始是從細菌 和黴菌得出，所以植物體内色胺酸合成的真正生物化學 和機制及其調控要等到阿拉伯芥變種 (Last et al. » 1991 , Pruitt and Last » 1993 ) ' yucca ( Zhao ei ，2001 )以及酵母菌 cDNA 篩選（Hul] d ，2000 ) 開發出來才付到详解。有兩個基因（A7^5] (Tryptophan Synthase Beta-Subunit 1)和 A7352)會轉譯阿拉伯芥之 色胺酸β次単元’亦即阿拉伯界（) 之色胺酸合成酶βΐ，雖然這兩個基因是高度相似的，不 過在葉片組織中，々7^51的mRNA較來得豐富 (Pruitt and Last ’ 1993 )。因此，在植物的色胺酸生物 合成途徑中，基因在將吲哚和絲胺酸轉化為色胺 酸的部分扮演重要角色（Last w α/.，199】）。目前已經 將一些在色胺酸生物合成途徑中扮演重要角色之酶的 基因加以鑑定，如在草料豆科植物紫雲英 幻mews )中的鄰胺苯曱酸合成酶基因（anthranilate synthase，)( Cho a/· ’ 2000 )以及米中的 和 ( Tozawa e/ 〇/.，2001 ; Kanno a/.，2004)。 近來的研究顯示，若大豆和煙草的煙草回饋不敏 感鄰胺苯甲酸合成酶基因過度表現’則會增加轉 基因植物中自由色胺酸的含量，而分別對毒性色胺酸類 似物5-曱基-色胺酸（5-ΜΤ)和ct-甲基色胺酸（α-ΜΤ) 表現出抗性（Cho ei α/· ’ 2004 ; Tsai 以 〇/.，2005 )。5-ΜΤ 會特異地結合在鄰胺苯曱酸合成酶（ASA)有分解作用 1375718 之α次單元的異位（allosteric site)上，並干擾細胞的色 胺酸合成（Zhaoeia/·，2001 ; Choeia厂，2004)。 【發明内容】 在本發明中，我們發展出沦Γ從1基因的實際應 用，亦即一種新穎的植物轉型篩選標示，以及一種簡單 有效之抗5-ΜΤ及/或抗重金屬的篩選程序。
本發明之第一實施態樣是一種DNA構築體，其包 含啟動子、7^51基因和基因修飾(genetic m〇dificati〇n)， 其中刖述7^51基因和基因修飾係由前述啟動子所啟動。 主在前述DNA構築體中的啟動子較佳為花椰菜嵌紋 病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S 啟動子。 而前述基因修飾可以是如Tnos(胭脂鹼合成酶(n〇paline synthase)終止子序列）。 本發明之第二實施態樣是一種植物，其係經前述 包含啟動子、7^81基因和基因修飾之dna構築體所轉
殖，其中前述7^51基因和基因修飾係由前述啟動子所 啟動。 ϋ明之第三實施態樣是一種_選轉殖植物的方 述植物係經包含啟動子、巧51基因和基因修 係由前ΐ Λ築體所轉殖，且前述咖基因和基因修飾 糸由刖述啟動子所啟動；該方法包括下列步驟： =二(:物曱基以色及胺酸)、，或其混合物的組 前述轉殖植物是否存活;b)與以相 瘦植物的=2型植物相較之下’前述經處理之轉 胺奴a成酶活性是否較高；c)前述轉殖植物 8 的自由色胺酸濃度是否比野生型植物高。 植物的色胺酸合成酶活性有别述轉殖 較之下，;：=== ㈡僅解意 【實施方式] 使色ίίΐϊϊ: ? fi選系統時親出卿1基因， 積。自：色二=ΐ ί植物體内過度生產並累 Ξ 產會紐物產生對色胺酸類似 屬的有/屬⑽2的H錯低麵似物和重金 Κίί莖ΐ Ϊ?是一種轉型後的有效非抗生 二士:不等同於效局黴素（hygromycin)筛選。献 的使用可能會在生態系統中對其他生： 所以使用具有抗生素之抗性的標示會 新二θ- ϋ焦點’且有需要在作物改良方面發展出 1375718 現已提出多種使用毒性篩選劑和取自其他生物體 之標示基因的陽性植物篩選系統（Haidrup ei α/.， 1998b ； Joersbo > 2001 ； Ebmeier et al * 2004 ； Leyman et a/. , 2004)。在這些系統中，逐漸衰亡的未轉型細胞可 能會分泌抑制物或阻斷必要的營養供給，來抑制存活的 轉型細胞生長。但是，將得自微生物的篩選標示基因插 入作為食物的生物體内會引起道德問題和安全顧慮。若 使用取自植物的無爭議性天然篩選標示基因，則^成功 地克服這些實施上的問題（Leyman ei d·，2004 )。我們 新近發展出來的7^51篩選系統有個特殊的特徵，那就 是不會在經5ΜΤ或CdCb篩選的植物上觀察到殘留效應 (carry over effect)。雖然以對抗生素的抗性來作為篩^ 標不通常可能會使轉型植物的生長受到篩選劑的 制，甚至在移植到土壤後會有生根困難及生長 題（Ebneier W α/·，2004 )。 ° 在我們的系統中，預定轉型體在5Μτ(75 CdCl2 ( 300 μΜ)的篩選中存活，但未轉型的植物在含 有最適濃度之篩選劑的培養基中則會惡質化。 通過篩選的植物，進一步以南方和北方墨點分確 轉基因的特性，並確認在轉基因植物之基因 基因插入及其轉錄表現（第五和六圖）。一 選系統的篩選效度和效率係取決於標示基因 = 度的表現（Tian，2006)。在本發明之一具體態樣^田矛王 5MT或CdCl2篩選出來的轉基因植物會表現 = Γ沾1 mRNA轉錄物。因此，筛選壓力主要是來自 標示基因的足量表現。然而，在以5MT篩選出 因植物中，Z^imRNA轉錄物的量並不均一（ 土 這些觀察清楚地指出選壓力與效高黴素是 ^， 所以可以排除轉基因植物在效高黴素筛選系統、現 10 出少量ATSW1轉錄物的可能性。 任何-種筛選系統最後的成功都是因為轉形體能 夠快速、清楚的鑑定出來。我們的實驗顯示，效高黴素 和統的Ιί選效率幾乎是相同的。然而，與習知陰 性篩選系統不同的是，我們的TSB篩選系統可以在曰常 轉型實驗中有效地使用。依照植物種類來選擇適當的培 養條件確實可能會大大增加_選效度。
以基因工程方式讓A乃万1基因過度生產色胺酸並 使之累積’而有更好的利用和多通量分布（ distribution)’是代謝學上一個重要的步驟。所有經5MT 或CdCl2筛選出來的轉基因植物均顯示出較野生型植物 更高的自由色胺酸含量。冶7^51過度表現的結果是，轉 基因植物會在細胞區隔中產生自由色胺酸，因而對5MT 或CdCh產生抗性。然而，這個機制在野生型對照組是 不存在的，因為它們體内與色胺酸生物合成有關的蛋白 會被破壞’所以會轉成淡綠色，之後死亡。經煙草回饋 不敏感鄰胺苯曱酸合成酶基因以2)轉型的草料豆科 植物和煙草會累積較高的自由色胺酸量，而對5MT產生 抗性，這進一步顯示出乂5^2基因作為篩選標示的重要 性’這和我們的觀察是一致的（Choda/·，2000; Tsai W α/·，2005)。 眾所周知’重金屬一般會藉由增加活性氧族來直 接改變膜的性質（Taulavuorieifl/.，2005)。篩選培養基 中過多的鎘（Cd2+) ( 300 μΜ)可能會誘使氧化壓力和 水的狀態產生改變，也會增加植物體内葉綠素a/b的比 例。我們的結果顯示，阿拉伯芥的ΑΓΜΙ過度表現會 增加色胺酸含量，並增強Cd2+的耐受性。 自由色胺酸含量的增加不會影響細胞層級的代 謝，也不會影響整體植物的生長，只有Cd2+的耐受度會 増加。基因除了作為篩選標示使用以外，也有助 於自由色胺酸含量提升之作物的生產、及其於重金屬污 染的土壤令培育的能力。而在冶7^51轉基因植物和野 生型植物+所觀察到的IAA含量並沒有明顯的差別，這 一點可能就是為什麼並沒有觀察到負面副作用（如異常 型態學表現型）的原因。 綜言之’沿7^51基因在阿拉伯芥中的過度表現會 増加自由色胺酸的生產。當將5MT或CdCL施用在植物 身上時，只有轉基因植物得以存活，而非轉型植物會因 為篩選劑的抑制作用而惡質化並死亡。TSB系統中的筛 選效度幾乎和效高黴素是相同的’且所篩選出來之轉基 因植物的型態學和生長情形是正常的。 土 質髏構築 士灯召1基因係如前述（Liao以α/., 2004 )，藉由反 轉錄酶-聚合酶連鎖反應（RT-PCR)從三週大的阿拉伯 芥葉片中分離出來。選擇兩個涵蓋整個7^51編碼區的 引子來放大一段1413 bp的DNA片段，其5’引子 (5’-GGATTC^mGCAGCCTCAGGCACCTCT-3，）和 3, 引子（5’-AGATCTI£AAACATCAAGATATTTAGC-3,） 分別位於万1編碼區的轉譯起始位置（4XQ)和停止 位置(TGA)。使用pfu DNA聚合酶（Promega)來放大 前述DNA片段，以將序列突變的機會降到最低。將該 1413 bp 的 PCR 產物選殖到 r7Blue(R)載體（Novagen) 當中，形成pT7Blue-7^1，並藉由ABI PRISM 373自動 DNA序列系統來測定DNA序列。包含CaMV 35S啟動 子的DNA序列係藉由和万·ΗΙ的消化作用從 1375718 pBI221中剪切下來，再選殖到pCAMBIA 1390 (Center for Application of Molecualr Biology of International Agriculture，Black Mountain，Australia)的 和 5awHI 位置内，形成 pCAMBIA 1390/35 5。pCAMBIA 1390載體包含一個可選擇的標示，也就是可用35S啟動 子來啟動的/φί基因。藉由和的消化作用 從ρΤ7Β1ι^-Γπΐ中剪切出土7^方7的cDNA片段，再選 殖到 pCAMBIA 1390/S5S 的 和 5g/II 位置内，形 成pTSB載體（第一圖）。使用電穿孔法（electroporation) 將質體送入1 iwme/ac/ew之GV3101株（ρΜΡ90)的 細胞中。 植物材料舆轉型 使阿拉伯芥的 Cohimbia 主態種（Arabic/opsis thaiiami (L.) Hyen. ecotype Columbia)在受到控制的環境室内，於 24°C、70%相對溼度和24小時光週期（約120 μηιοί ιηΎ1)下生長。我們使用先前描述的植物浸泡轉型法 (floral dip transformation) ( Clough and Bent，1988)來 進行阿拉伯芥植物的轉型。T〇轉基因植物會持續表現 ，是在帶有20 ppm效高黴素的MS培養基上進 行篩選（Murashige and Skoog，1962)。野生型和轉基因 之T2同型合子的種子（T3代）對不同濃度之5MT和 CdCl2的敏感度係以種子種下兩週後的發芽百分比為基 準來評估。將5MT和CdCl2的最適篩選濃度標準化以 後’再次使用植物浸泡轉型法來估算和習知效高 黴素篩選系統之間的篩選效率。 核酸分析 13 1375718 為了鑑定陽性轉型體，以先前所述的方法（Hsieh ei α/. ’ 2002a)柚取所有在帶有20 ppm效高黴素、75 μΜ 5ΜΤ或300 μΜ CdCl2的]VIS培養基上生根之幼芽的基因 體DNA。將基因體DNA進行所消化，並用办〆 作為探針來探查。所有RNA分離和DNA與RNA的墨 點分析的方法都如先前所述（Hsieh α/.，2002b )。藉 由隨機引子法（random primer method)，用（ot-32P)dCTP 來標不從pTSB分離出來的和/ζρί基因，並用作 探針 。選擇 5’ 引子 • (5’_ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTC-3，）和 3,引 子（5’_GCAAGTGCTGTGATTTCTTTGCTCA-3，）來放 大肌動蛋白（actin)的cDNA片段。將最終RT-PCR片 段選殖到pGEM-T載體内，形成pGEM/A-actin。藉由隨 機引子法，用（cx-32P)dCTP來標示pGEM/A-actin經消化 作用得出的肌動蛋白cDNA片段，並用作探針。 自由色胺酸含量分析 從帶有50 μΜ5ΜΤ或無5MT的發芽培養基中收取 兩週大的野生型植物和轉基因植物。内生性自由色胺酸 分析是將先前所述的方法（Edlundeia/.，1995)做些許 改良之後來進行的。從乾重大約50 mg的樣本製備細胞 萃取物，將冷凍組織與曱醇在4°C連續晃動24小時的條 件下一起研磨。離心後’將上清液用0.22 Mm的膜 (MilliporeMillexg)加以過遽，過滤後的溶液在Speed Vac濃縮機中將體積縮減到1 ml。最終溶液用SEP管柱 (Water Oasis HLB 6cc)進行萃取，並用1 ml甲醇沖提 該萃取物》用160 μΐ 0比咬和40 μΐ N-三甲基三甲基梦 院基-三氟乙酿胺（N-trimethyl-N-trimethylsilyl- 14 1375718 trifluoroacetamide)將各100 μΐ的樣本於7(rc進行甲基 化1小時。並以Edhrnd等人所述的條件（Edlund打 1995)進行GC-MS分析。 色胲酸合成酶（TS)活性
使用在正常條件下長到兩週大的汾rls51轉基因植 物（TM卜TM3和TM4)和野生型植物來決定Ts活性。 植物萃取物的製備，係在液態氮中研磨3至5克的全植 • 物組織’將研細的粉末在6 ml的0.1 Μ鱗酸舒緩衝液（pH 8,〇)中均質化，並離心（在4°C下12,000 g進行15分 鐘）使之澄清，所得部分係用作酶萃取物，而Ts (α和 β )活性的測疋則如先如所述的方法（Last以，1991) 來進行。 結果 轉基因植物在效高黴素上的產生與篩選 使用以土壤桿菌（）為媒介的植物 浸泡轉型法’將由CaMV 35S啟動子所啟動的 基，轉送到阿拉伯芥中。從5,4〇〇顆種子中得出七株抗 效向黴素的植物。所有轉基因植物都用基因體pCR和南 方墨點分析來確認（數據未顯示），並命名為ΤΗ1到 ΤΗ7°篩選出兩個轉基因之Τ2同型合子株ΤΗ1和ΤΗ2， ，進行進一步的分析。進行北方墨點分析定出mRNA的 1。知丨之mRNA轉錄物只能在轉基因植物中偵測到， 在野生型是偵測不到的（第二圖的第2和3行），而在 所有轉基因植物中都會觀察到之mRNA轉錄物 有較高的累積量。野生型和轉基因植物兩者之肌動蛋白 15 1375718 的mRNA轉錄物量是相似的。 ⑷轉基因阿拉伯芥幼苗對色胺酸的毒性類似物 5MT和重金屬CdCl2具有抗性 先前用效高黴素篩選出來之轉基因同型合子株 TH1/TH2的種子係用來闡明5MT或CdCl2是否能夠作 為篩選劑使用。為了要篩選出會持續表現汾:^51基因 的轉型體，估算不同濃度的5MT (0、25、50、75、100 和 200 μΜ)和 CdCl2 ( 0、50、100、200、300、400 和 500 μΜ)’在這些實驗中’係用未轉型的野生型作為陰 性對照組。讓野生型和轉基因的種子各六十個在含有^ 種濃度之5ΜΤ的培養基上生長兩週，並記錄存活植物的 數目（表1)。在所有測試條件之下，野生型和轉基因的 種子兩者發芽數目幾乎相等。然而，兩週後，在含有75 μΜ或更高濃度（100和200 μΜ)之5ΜΤ的培養基上， 野生型植物會轉為淡綠色，並停止生長。相反地，轉基 因的幼芽則對5ΜΤ所有的測試濃度（1〇〇和2〇〇 μΜ) 都顯現出抗性。不過，在75 μΜ記錄的存活率要比其他 測試（100和200 μΜ)來得高（1〇〇〇/0)，此外，即使是 在兩週後，相較於對照的野生型植物，這些幼芽表現出 來的生長情形也較佳（第三圖Α)。同時，在5ΜΤ含量 少於50 μίν[的培養基中，即便到了兩週以後，所有的幼 芽也都會存活下來。因此，要篩選預定轉型體所需的 5ΜΤ最適濃度是75 μΜ。 讓野生型和轉基因植物的種子各一百個在含有多 種濃度之CdCh的培養基上生長兩週’並記錄存活植物 的數目（表2)。直到培養基所含之cdCl2濃度高達3〇〇 μΜ，野生型和轉基因的種子兩者發芽數目幾乎相等。雖 16 1375718 然兩週後，轉基因植物在300 μΜ之CdCl2上的生長會 稍微受到抑制，但整體存活率高於400和500 μΜ之 CdCl2，且大多數（98%)轉基因的幼芽都比對照組來得 綠（第三圖B)。即使到了兩週以後，所有野生型和轉基 因的幼芽在含有少於100 μΜ之CdCl2的培養基上都會 存活。由這些觀察結果所得出的結論是，要篩選預定轉 型體所需的CdCl2最適濃度是300 μΜ。 表1，野生型和轉基因阿拉伯芥在各濃度之5ΜΤ下的幼芽 鲁 存活率變化
WT TH (μΜ) —週 兩週 一週 兩週 0255075100200 6 6 6 6 6 6 ////// 0 0 0 0 4 8 6 6 6 6 3 1 60/60 60/60 60/60 60/60 25/60 12/60 60/60 24/60 10/60 0/60 0/60 0/60 60/60 60/40 40/40 60/60 60/60 60/60 WT :野生型，ΤΗ :轉基因植物。 表2，野生型和轉基因阿拉伯芥在各濃度之CdCl2下的幼芽 存活率變化 """WT ~~ ΤΗ (μΜ) —週 兩週 一週 兩週 )ο ο ο ο 0^0000 5 12 3 4 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 30/100 80/100 0/100 12/100 0/100 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 95/100 100/100 98/100 100/100 80/100 500_8/100 0/100 100/100 62/100 WT :野生型，ΤΗ :轉基因植物。 17 1375718 由5MT和CdCl2篩選出來之轉基因阿拉伯芥植 物的分子分析 為了確認基因在轉基因植物的基因體中有 穩定的嵌合（integration)和表現，再次使用植物浸泡轉 型法將基因轉送入阿拉伯芥，並使預定轉型體 在補充有最適濃度之篩選劑（5ΜΤ和CdCl2)的發芽培 養基上進行篩選（第四圖）。在5MT篩選中，由5,200 個發芽的種子内得出6個預定轉型體，將之命名為TM1 到TM6 ;並隨機選出三株植物（TM1、TM3和TM4) 來進行進一步的分子及生化分析。在CdCl2篩選中，由 5,850個種子内得出大約8個預定轉型體，將之命名為 TC1到TC8 ;並隨機選出四株植物（Tc2、TC3、TC4 和TC5)來進行進一步分析。將所有選出的預定轉型體 送入土壤，使之持續正常生長及發育。 為了確認這些植物是轉基因植物，使所有預定轉 型體進一步進行南方墨點分析（第五圖人和3)。將所 有由轉基因植物和野生型植物之葉片分離出來的基因 ，DNA進行7/ζ·„ΛΙΙ消化作用，並用作為探針來探 ~。在ΤΜ1和ΤΜ4有觀察到轉入基因的多次插入（第 五圖Α的第2和4行）’在丁厘3則觀察到大小為35肋 之早一基因插入（第五圖A的第3行）。如第五圖6所 示’在四個耐CdCh的轉基因植物（TC2、TC3、TC4 =?5)令發現’在1^4和1^5中分別有41<:1)和18比 複本基因插入（第五圖B的第4和5行）。在另 =行實驗中，其卜個預定轉型體TC7無論是在pCR 或^在南方墨點分析中都未出現任何信號（數據未顯 因此’在CdCl2的篩選中，分離株基因逸失的機會 ^存在的。綜上述，這些結果係藉由使用5MT和cdcl2 ”仍51基因在轉基因阿拉伯芬植物基因體中的叙合 18 來確認所得之預定轉型體做出了有效的篩選。 經5MT和CdCl2篩選的轉基因植物會表現出高量的 轉錄物 在獨立實驗中，使經5MT和CdCl2篩選的轉基因 植物 T1VO、TM3、TM4、TC2、TC3、TC4 和 TC5 進行 以7X81和作為探針的北方墨點分析，來測試其 基因的表現。ΓΜ1之mRNA轉錄物在所有測試 的轉基因株中都有高度表現（第6圖A的第2-4行，第 6圖B的第2_5行）。野生型並未觀察到信號，然而，在 長時間曝光的X光片中，顯示其有内生性1^51之mRNA 轉錄物。轉基因植物TM1、TM3和TM4都可以彳貞測到 ~^之mRNA轉錄物（第六圖A的第2_4行），然而，在 接受測試的轉基因植物中所觀察到的表現量並不平 均。有趣的是，雖然在轉基因植物TC3、TC4和TC5 貞 測到之mRNA轉錄物（第六圖B的第3-5行），但 TC2 (第六圖B的第2行）和野生型都未偵測到轉錄物。 這些結果顯示轉入基因在所有轉基因植物中都 有足量的表現，而賦予該等植物對毒性物質5ΜΤ和 CdCl2的灰性。 習知系统舆7^51系统之間的篩選效度比較 在一平行實驗中’比較r*S51系統與習知使用效高 礙素之抗生素師選糸統之間的篩選效度。效高激去、 和CdCl2的篩選效度見於表3。效高素顆= 中篩選出7個預定轉型體；而在進行植物浸泡轉型法 後’ 5MT和CdC〗2分別從5,200和5,85〇顆種子中筛選 1375718 出6個和8個預定轉型體。所有預定轉型體都使用基因 體PCR和南方墨點分析來加以確認（數據未顯示）。因 此’rOTl的轉基因篩選效度是可與習知的陰性篩選系統 槐美的。 表3,效高黴素、5MT和cdCl2對轉基因阿拉伯芥的篩選效 度比較 篩選劑 轉型後種子 發芽的數目 在MS上的幼 芽存活數目 轉i因植 物數目 轉型效度 (%) 5-MT 5,200 6 6 0.12 CdCl2 5,850 8 7 0.12 HS 5,400 7 7 0.13 5-MT : 5-曱基-色胺酸，HS :效高黴素篩選。
舆野生型相較之下，轉基因植物累積了高量的 自由色胺酸 為了闡明自由色胺酸的累積與對5MT和CdCl2的 抗性之間可能的關係，測量轉基因植物中的自 由色胺酸含量。如表4所示，在有/無5MT/CdCl2的情況 下發現’ 轉基因型植物中的自由色胺酸含量是高 於野生型植物的。在轉基因植物ΤΜ1、ΤΜ3和ΤΜ4中， 其含量（5,900-8,900 pmole/g乾重）是野生型（587
Pmole/g乾重）的1〇至15倍。5mt在培養基中的存在 會大大降低（約五倍）自由色胺酸在野生型植物中的含 量（125 pmole/g乾重），但在轉基因植物中，其量維持 穩定（5，100-7,200 pmole/g乾重）。當在有/無CdCl2的情 况下測量TC3、TC4和TC5轉基因植物中色胺酸含量 時’也可觀察到同樣的趨勢。這些結果顯示，在1 轉基因阿拉伯芥植物中所累積的自由色胺酸量較對照 20 1375718
組植物來得高，其對5ΜΤ或CdCl2的抗性也較強。 表4，野生型和TSB轉基因植物在有或沒有5_曱基_色胺酸 的情況下的内生性色胺酸含量 色胺酸（pmole/g ·乾重） 野生型 587 ± 5 TM1 6，1〇〇 ± 4 TM3 5,900 土 12 TM4 8,900 ±21 野生型+5MT U25 ±6 TM1+5MT 15,200 ± 14 TM3+5MT 15,100 ± u TM4+5MT 17,200 ± 1〇 5-MT 濃度：50μΜ ~~- n基S植物巾色按酸合成^^和色胺酸合成蘇 -β的活性增加 我們測里在正常條件下生長到兩週大之ΑΓ5,51轉 基因植物（ΤΜ1、ΤΜ3和ΤΜ4)和野生型植物的色胺酸 合成酶-β (TS-β)活性。在所有々r<S51轉基因植物中， TS-β的活性幾乎是對照組植物的兩倍（第七圖A)。然 而，過度表現會輕微地增加轉基因植物的TS a 活性（第七圖B)。這些結果清楚地顯示’ r(S51基因在 阿拉伯芥中的過度表現會使TS-a和β的活性等比例增 21 加 因此’當本發明應用於一較 說明並指出其基本新穎特睹，樣=顯不、 不背_明:精神:情=領3 ΐ代ϋ舉例來說，係意圖將實質表現出相同功 ^或方法步驟的所有組合包括在本發明範圍内^此外， ，了解’本發明之任—揭露形式或實施態樣所顯示及/ ^描述㈣叙/或元件及/或綠步料鮮為設 ，之-，事項而被包含在任—其他揭露、描述或建議形 式、或實施態樣中。因此，本發明僅受後附之申請專 範圍所限制。 j 【圖式簡單說明】 第一圖為pTSB之示意圖。其中7^51為阿拉伯芥色 胺酸合成酶Μ的cDNA、//〆為效高黴素磷酸轉移酶 cDNA序列、P35S為CaMV35S啟動子、Tnos為胭脂驗 合成酶終止子序列、T35S為CaMV35S終止子、LB為 左邊界，RB為右邊界。 第二圖為ΑΓΜΙ基因在經效高黴素篩選之轉基因 植物中所表現出來的轉錄物。總量10 pg的RNA是取自 野生型WT (第1行）和轉基因植物TH1和TH2 (第2 和3行）’並使用經32p標示之7^*51、/ζρί和肌動蛋白片 段來作為探針。 第三圖為轉基因阿拉伯芥植物對5ΜΤ和
CdC12 有抗性。在含有 75 μΜ5ΜΤ(Α)或 300 pMCdCl2 (B)的培養基中，野生型（WT)無法生存，而轉基因 植物（TH)在同樣的培養基中則會生長。圖面（a)中 22 W5718 組是野生型和轉基因植物在不含5MT或CdCl2 。養基中生長的情形。培養盤的直徑100 mm ° 人第四圖為在進行植物浸泡轉型法後，收集種子在 :有 μΜ 5撾丁（A)或 300 μΜ CdCl2 (B)的培養基 進仃士灯51預定轉型體的篩選。在含有5MT或CdCl2 :培養基中，轉基因植物會發芽，且在兩週内的生長情 开> 較佳。
第五圖為野生型和經5MT或CdCl2篩選之沿7^51 轉基因植物的分子分析。（A)野生型和經5MT篩選之 轉基因植物的南方墨點分析；第i行是得自野生型（WT) 植物的DNA，第2至4行是得自轉基因植物（Tmi、tM3 和TM4)的DNA。（B)野生型和經CdCh篩選之轉基 因植物的南方墨點分析；第1行是得自野生型（WT ) 植物的DNA，第2至5行是得自轉基因植物（tc2、TC3、 TC4和TC5)的DNA。使用經32P標示之來作為探 針。
第六圖為在1轉基因植物中，mRNA轉錄物 含量升高。（A)野生型和經5MT篩選之轉基因植物的 北方墨點分析；總量1 〇 pg的RNA是取自野生型WT(第 1行）和轉基因植物TM卜TM3和TM4(第2至4行）。 (B)野生型和經CdCU篩選之轉基因植物的北方墨點 分析；總量5 pg的RNA是取自野生型WT (第1行） 和轉基因植物TC2、TC3、TC4和TC5 (第2至5行）。 使用經32P標示之ΓΜΙ、和肌動蛋白片段來作為探 針，並使用rRNA作為内部控制組。 第七圖為兩週大之轉基因（TM1、TM3和 ΤΜ4)和野生型（WT)植物的色胺酸合成酶（TS)活 性分析。（Α)在士7^51轉基因和野生型植物中的TS-β 活性。（Β)在沿ΓΜΙ轉基因和野生型植物中的^…活 23 1375718 性。由粗製的植物萃取物來測定酶活性。TS活性係以每 分鐘每毫克蛋白中吲哚被轉化的皮莫耳（picomole)數 來表示（實驗三次）。 【主要元件符號說明】 無 24

Claims (1)

1375718
、申請專利範園： __一 -----— Λ 公告本
1. 一種篩選轉殖植物的方法，其中前述植物係經包含啟動 子、7^51 (Tryptophan Synthase Beta-Subunit 1)基因及 Tnos (胭脂鹼合成酶終止子序列）之DNA構築體所轉 殖，且前述7^51基因及Tnos (胭脂鹼合成酶終止子序 列）係由前述啟動子所啟動；其中，前述7^51基因係 作為篩選前述轉殖是否成功之標記因子；該方法包括下 列步驟： 以包含5MT (5-甲基-色胺酸）、CdCl2或其混合物的組 成物來處理前述植物，以及 測定下列情形： a) 前述轉殖植物是否存活； b) 與以相同組成物處理之野生型植物相較之下，前述 經處理之轉殖植物的色胺酸合成酶活性是否較高； c) 前述轉殖植物的自由色胺酸濃度是否比野生型植 物高。 2·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述啟動子為 35S啟動子。 Φ 3. —種篩選轉殖植物的方法，其中前述植物係經包含啟動 子、7^51(Tryptophan Synthase Beta-Subunit 1)基因及 Tnos (胭脂驗合成酶終止子序列）之DNA構築體所轉 殖，且前述7^51基因及Tnos (胭脂鹼合成酶終止子序 列）係由前述啟動子所啟動；其中，前述7^51基因係 作為篩選前述轉殖是否成功之標記因子；該方法包括測 定下列情形： a) 與野生型植物的色胺酸合成酶活性相較之下，前述 轉殖植物的色胺酸合成酶活性有增高；或 b) 與野生型植物的自由色胺酸濃度相較之下，前述轉 25 1375718 殖植物的自由色胺酸;農度有增高。 4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其包括測定下列情 形：與野生型植物的色胺酸合成酶活性相較之下，前述 轉殖植物的色胺酸合成酶活性有增高。 5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其包括測定下列情 形：與野生型植物的自由色胺酸濃度相較之下，前述轉 殖植物的自由色胺酸濃度有增高。 26 1375718 七、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：第（一）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 益 4 ««、
八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 益 4 ««、 4
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