TWI361220B

TWI361220B - A plant shsp gene bi-directional promoter and uses thereof

Info

Publication number: TWI361220B
Application number: TW094126214A
Authority: TW
Inventors: Chu Yung Lin; Jiahn Chou Guan
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2005-08-02
Filing date: 2005-08-02
Publication date: 2012-04-01
Also published as: US20070033677A1; TW200706649A

Description

九、發明說明：，【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種摘選自水稻低分子量熱休克蛋白質基因之核苷酸序列，尤指一種具雙向啟動子功能之核苷酸序列。【先前技術】，熱休克反應(heat shock response)是指當生物或細胞突然暴露在高於生長溫度5〜10°C的環境時所產生的一種反應，此反應包括迅速且暫時性的大量表現HSPs。利用免疫顯微鏡技術，發現在高溫下，會聚集在細难質及細胞核因熱而受損害的區域，也會協助其恢復到正常狀況。也直、接證實當細胞有熱休克蛋白質的產生及累積，就可以抵抗 «高溫逆境。 HSPs已被認定是最具保留性(conservation)的生命現象之一（Southgate et al.，1983，Sch0ffel et al.， 1984，Boston et al·，1996)。HSPs依分子量的大小可以分為高分子量（high molecular mass，HMM，> 60 kDa) HSPs---ClpB/HSP100， HSP90， HSP70(dnaK)及 HSP60(GroEL-GroES)及小分子(small molecular mass， 15〜42 kDa) HSPs (sHSP或smHSP)。相較於其他真核生物，植物受熱休克後會表現數多且量豐的sHSPs (Waters and Vierling，1999)，其累積量可達總蛋白質的1%上（Hsieh et al· 1992)，這可能是由於植物無法如動物般移動來逃 *避熱逆境，因此需利用合成大量的sHSP來提高植物本身的耐熱性。許多生理及遺傳方面的研究顯示sHSP與植物耐熱性的獲得有密切關聯性(Linetal.，1984; Lavoieetal.， 1993 ; Maestri et al.， 2002 ; Iba et al.， 2002)。 sHSP最早是在果蠅中被發現，其四個SHSP中目前只確認一個存在於粒線體中（Morrow etal. 2000)，而人體，中已經確認的10個sHSP基因皆位在細胞質中，同時期表現的位置皆具有組織或器官的專一性（KaPP6 et al. 2003)。除少數特殊例子，SHSP基因中通常沒有intron的序列。在植物中sHSP基因的數目，因種類不同而有很大差異’已測試過的物種中至少都存有12個以上的SHSP基因 (Vierlingl991)，在阿拉伯芥中已確認的SHSP有13個， «尚有6個可能基因仍待確認（Scharf，etal.，2001 )。植物sHSP基因群依其在細胞中的分佈位置、抗體的父又反應性（i mrauno 1 〇g i ca 1 cross-r eac t i v i ty )與氨基酸序列的相似性’可分成五族（class) ( Waters and Vierling, 1999):第一、二族(Class I、Class II)分別存在於細胞質中，第三族(Class III)存在於葉綠體中，第四族 (Class IV)存在於内質網或内膜系統内、第五族(QassV；) 則存在於線體中。sHSP在細胞内分布的差異顯示出此基因群可能具有功能上的歧異性。綜合已發表有關結構方面的證據與其它生理功能分析結果均顯示sHSP確實具有 chaperone的功能，其結構上的保留性在其生理功能上（對抗逆境）具有相當大的重要性。除了熱休克反應外，近年來的研究陸續發現在沒有熱逆境的環境下’如減數分裂前期、microsporogenesis、胚發育期、種子成熟與發芽、果實成熟期、wateF stress、 cold storage、休眠期和光週期等，甚至一般營養生長期 (Lubaretz and Nieden，2002)，都能偵測到部分 class 工 sHSP 或其 mRMs 的表現（pr肋dl et al.，1995，Pr如dl and

Sch0ffl 1996 ’ Waters.，1996，Wehmeyeretal.，1996)，因此class I sHSP也可能參與植物的發育過程；ρΓδη(|ΐ (Prandl et al.，1996)等人將大豆(^她印丨了^^的 promoter接上GUS基因’轉殖到於草中’發現在轉殖於草的種子發育過程中HSEs (heat shock elements)會調節 GUS基因的表現，因此ciass i sHsp基因的調控，可能有許多 cis-acting elements 和 trans-acting factors 參與；

Wehmeyer等人將阿拉伯芥的Athspl7. 4基因的pr〇m〇ter 接上GUS基因，轉殖到阿拉伯芥的種子發育突變株abi3 中’發現Athspl7· 4基因的表現和逆境調控機制是經不同途徑，而且在發育的過程中ABI3基因可能參與活化 -Athspl7.4基因的轉錄；藉此結果他們推測Athspl7. 4基因與種子發育過程的耐旱性有相關（Wehmeyer and Vierling，2000)。除了熱逆境和發育過程的調節之外，砷、重金屬（例如鑛）（Lin et al. 1984, Edelman et al. 1988; Tseng et al· 1993)、低溫逆境（Sabehat et al. 1998)、氧化逆境（Pla et al. 2000)、酒精（Kuo et al. 2000)和氣基酸類似物（例如 azetidine-2-carboxylic acid ’ proline 的類似物）（Lee et al. 1996)等都發現會誘導部分sHSP的累積，如同其它HSP基因般，植物sHSP 基因受到轉錄層次的調節，誘導熱休克基因表現，需要基因5方向上游區域的cis-acting element亦即熱休克元素 (heat shock element，HSE )和辨認熱休克元素的 ⑧ trans-acting factor -熱休克因子（heat shock factor, HSF ) (Gurley et al·，1991)。熱休克元素為一組 2〜3 個對向重複（inverted repeats，5 -nGAAn-3 或 5 -nTTCn-3 ) (Gurley et al., 1991 ； Schoff 1 et al., 1998) ’在植物中，靠近TATA box的熱休克元素通常是前後重疊排列的’它們對誘導植物熱休克基因的轉錄扮演重 -要的角色（Czarnecka et al., 1989);以 chimeric gene 的建立t正明不同種生物的熱休克元素皆可在生物體内調節報導基因表現’熱休克基因的TATA box上游區域存在許多熱休克元素，由上述結果顯示熱休克基因轉錄活化的機制在真核生物間應具有很高的保留性(Gurley et al.， 1991 ’ Sch0ff 1 et al.，1998);此外HSE亦被證明與種子胚胎發育過程時sHSPs的累積有關（Almoguera et al.， 1998 ; Carranco et al. 1999)，HSE可因其距離轉錄點的遠近或序列的組成而被不同的HSF辨認，藉此機制進而選擇性地活化參與受發育調節的HSP基因（Rojas，et al.， 2002 ; Almoguera et al.，2002)。Haralampidis 等人利用 AtHsp90-l 基因的 promoter deletion analysis 發現顯示HSE會與其它的cis elements作用，調控影響基因的表現量和組織專一性與發育時期專一性的表現 (Haralampidis et al., 2002)。除熱休克元素外， CCAAT-box elements、AT-rich sequences 和 scaffold-attachment regions也已經被發現會調控植物 .中特定熱休克基因的表現量(Sch6ffl etal.，1998)。發明人之研究團隊從水稻臺農67號中，筛選到九個確定屬於第一族低分子量熱休克基因（class I sHSP) (Tseng et al.，1992 ; Tzeng et al.，1993 ; Lee et al. 1995 ; Chang et al.，2001 ;黃.2002);分別命名為

Oshspl6. 9A、Oshspl6. 9B、Oshspl6. 9C、Oshspl6. 9D、 Oshspl7. 9A、Oshspl7. 9B、0shspl7. 3 和 Oshspl8. 0。根據RFLP mapping以及水稻基因組定序的結果已知

Oshspl6. 9A、Oshspl6· 9B 和 Oshspl6· 9C 與 Oshspl6. 9D 及

Oshspl7.9B群集於第一號染色體上，其中〇shspl6 μ包含pTSl完整的cDNA片段’有趣的是〇shspl6. 9A和 Oshspl6. 9B 的 promoters 與 coding regions 幾乎完全相同而其 3’ -untranslated regions (3’ -UTRs)序列則有很大的差異’比較其表現則發現其轉譯速率與半衰期不同（林.，1998);而 Oshspl7. 3、Oshspl8. 0、Oshspl7. 7 和0shspl7. 9A則位於第三號染色體上，很有趣的是 0shspl7.3 和 0shspl8. 0 此兩基因以 head-to-head 的方式排列，其中0shspl7· 3和0shspl8. 0分別包含完整的pts3 和pYL cDNA片段(Guan et ai.，1998)，其轉錄起始點間僅相隔 356 bp (官.，1997)。0shspl6 9d 及〇shspl7. 9B 則是根據水稻基因體的定序結果，利用PCR的方式將此二個基因從丁3丨111111§1^〇.67水稻基因組中釣取出來。此外也篩選出一個具有獨特結構的gen〇mic cl〇ne (則.6 -clone) ’它含有兩個與〇shspl6. 9B的5，端編譯區幾乎完全相同的142 bp tandem r印eat，從這兩個repeats推導出來的ORFs分別編譯7· 6及8.4 kDa的蛋白質，分析其5，端序列並沒有發現TATA box或HSE等啟動子序列，另外利用RT PCR亦沒有偵測到任何訊號，因此我們推論此兩個 0RFs 可能為假基因（pseudogene )，利用 genome wa 1 ki ng 的方法鏗定出此片段位於0shspl6 9B基因的5，端的上游區域，此片段並不存在於Nipponbare品種中，推測可能是 TainungNo· 67水稻育種過程中DNA重組產生的現象(Guan et al· 2003)。在基因表現的調節上，分析九個基因的約6〇〇-bp的啟動子（promoter)顯示皆具有或多或少的熱休克基因典 &型的熱休克元素（heat shock element (HSE)，5， -nGAAn-3’）’其中〇shspl7. 9B的啟動子區域缺少交互重疊出現的特性。由於除了熱逆境之外，目前也已經知道種子發育及其它的環境逆境或化學藥劑亦會誘導sHSPs的表現’顯示sHSPs的功能似乎在這些逆境中也扮演重要的角色，於是首先以RT-PCR分析各個

水稻class I sHSP基因在熱逆境下的表現，在熱處理下幾乎所有的基因皆會被誘導表現，其中〇shspl7.9B 的誘導量非常少’大部份的基因於4i°c處理一小時内即達最大量，值得一提的是位於第三號染色體上的sHSPs 對溫度的增加及熱休克時間長短上皆比位於第一號染色體 w上的sHSPs敏感’此外’比較具有相同啟動子的〇shSpi6. 9A 與0shspl6. 9B的表現量，以〇shspi6· 9A的表現量較高約 25% ’推測可能與祝似的半衰期不同所造成（〇shspl6.9A 的半衰期較0shspl6. 9B長約30分鐘）。而比較0shspl7. 3 和0shspl8. 0此兩基因的表現量，則以〇shspi7· 3具有較兩的表現量，顯示其啟動子的強度可能因方向及HSE與 "TATA box的遠近不同而有差別。在鎮、石中、azetidine-2-carboxylie acid (Aze， -proline 的類似物）、canavanine (arginine 的類似物）及酒精處理之後mRNA的累積情形，在砷處理之後發現位於第一號染色體上的 sHSPs (除了〇shSpl6. 9D和0shspl7. 9B 之外）及位於第三號染色體上洲5巧皆會受到誘導表現， *但是以第三號染色體上sHSPs的表現量較多，其中又以 0shspl7. 3具有最高的表現量。在锅及Aze處理下則只觀察到第二號染色體上sHSPs被大量表現，而第一號染色體上的基因則無明顯表現。在酒精處理後則只偵測到 0shspl7. 3較大量的累積，但〇shspl7 9A和〇shspl8 〇也有微弱的表現。綜合上述表現的分析，可知水稻class ^ 〃sHSP基因群在化學毒害環境下具有選擇性的差異表現。【發明内容】本發明之目的為提供一距雙向啟動子功能之核苷酸序列。本發明之另一目的為提供一具雙向啟動功能之核苷酸序列’已於被子植物中同時轉錄二外源蛋白質。 ^ -目的為提供-具雙向啟動功能之核酸序列’其係受熱休克、碎、锅、氨基酸類似物、氣化納、酒精或H202處理而誘導其對外源基因之表現， s本發明係揭露一種源自於水稻低分子量熱休克蛋白質基因之雙向啟動子’此雙向啟動子可調節接在此啟動子相反方向之兩基因的表現，可使用於同時表現兩不同基因產物於同—細射’其巾，更可哺休克處理或化學藥劑誘導表現_£述該兩不同基因產物。 ,、【實施方式】 ·"本發明係揭露—啟動子之核魏賴，其具有一雙向啟動兩相異側基因之功能，本發明所揭露之雙向啟動子之兩端可畴接上兩相同或關之蛋自基因，並且可受熱休克、砷、鎘、氨基酸類似物、氣化鈉、酒精或臟處理之狀況下，同時誘導所接上之二蛋白基因之表現。〜為了使本發明之敘述更加詳盡與完備，係列舉較佳實 ,%例以說明本發明。請參考下列描述並配合以下之圖式。相信熟知本聽之人士根據下辑揭紅内容、圖示以及說明’將可無_地充分_本發簡行產#上之利用。下列實施例解說知技藝人士如何碰子働來源筛選、分離並進-步使財發明所揭露之啟動子，而非以任 —何方式轉細本發賴揭露之内容之紐部分。本發明所揭露之具雙向啟動子魏之核賊序列，係由水U 7號品種巾賴選萃取出來，以下將詳細介紹該㈣酸序列之詳細篩選步驟。另外，在篩選出本發明之核普酸序列後，發明人更進一步的將其構築至載體中並進一步的轉殖到植物内以觀察其表現。植物材料的準備本發明主要係由水稻中進行該具雙向啟動子功能之核¥酸序列的篩選。首先，水稻台農67號品種（〇啊 sat1Va Lev. Taimmg ηα67 )穀粒先以自來水沖浸約兩天’待種子萌發後，再以捲包法置於撕暗生長箱内，約

Claims

I36122P 公告本十、_請專範圍+ 〜 L —介於Oshspl7.3及〇shspi8.〇基因區間之單離 DMA片段，該DNA片段具有雙向啟動子活性且其係由序列識別號：5之核苷酸序列所組成。 - 2. —種重組DNA載體，其係將如申請專利範圍第1項 -— 之DNA片段結合至一載體中所製成。 3.如申睛專利範圍第2項所述之重組dna載體，更包 • 含二個編碼蛋白質之DNA片段分別連接至該DNA片段。 4·如申凊專利範圍第3項所述之重組dna載體，其中該編碼蛋白質之DNA片段係透過該DNA片段以調節轉錄之方式表現。 5. 如申請專利範圍第3項所述之重組DNA载體，其中該二個編碼蛋白質之DNA片段係為相同或不同編碼的 I MA序列。 6. 如申請專利範圍第3項所述之重組DNA載體，具雙向啟動子活性之該DM片段可同時啟動該二個編碼蛋白質之DNA序列進行轉錄。 7. 如申請專利範圍第2項所述之重組dm載體，其中該重組DNA載體更包含有一報導基因作為—選殖標記’以利於選殖被該重組DNA載體所轉殖之一被子植物細胞。 1 8.如申請專利範圍第7項所述之該重組1)]^載體，其中該報導基因為^葡雜酸酐dgluc_idase) 基因。 9. 一種轉形植物細胞，係包含申請專利範圍第1項之 DNA片段。、 10. 如申請專利範圍第9項所述之轉形植物細胞，其中該轉形植物細胞為一被子植物細胞。 11. 如申明專利範圍帛9項所述之轉形植物細胞，其中該轉形植物細胞為一水稻細胞。 12. 如ΐ請專利範圍第9項所述之轉形植物細胞，其中該DM 段係用以調節外來職於該轉形植物細胞中之轉錄。 13·如申請專利範圍第12項所述之轉形植物細胞其中該腿片段對於該轉形植物細胞之轉錄調節係可於 —熱休克之狀況下誘發。 ^如申請專利範圍第12項所述之轉形植物細胞，其 ~麵片段對於該轉形植物細胞之轉錄調節係可在 :休克銅石t、録、氨基酸類似物、氯化納、酒精、過氧化氫⑽2)處理之狀況下發生。 ^如申請專利範圍第14項所述之轉職物細胞，其中該=基酸類似物係為—脯胺酸（_喊類似物或一精胺酸類似物。 1361220 .辦句寻利範圍第14項所述之轉形植物細胞，1 中該氨基酸類似物可為-氮四環-2-㈣α_ azetldine-2-carboxylic 或刀豆氨酸 (canavanine) ° 17·-種於被子植物細胞内表現2所欲蛋白質的基因而獲得該二種所欲蛋白質之方法，其包括：

a) 構建一能於該被子植物細胞内表現之载體，其中該載體包括-選自水稻植物秘印17.3或 3制之雙向啟動子以及該二種所欲蛋白質之編碼基因； b) 將該载體轉移至該被子植物細胞；

C)培育該轉移載體後之該被子植物細胞； d)將該培育的該被子植物細胞引至熱休克、鋼、砷、鎘、氨基酸類似物、氯化鈉、酒精或過氧化氫 ⑽2)之條件下’以誘發該雙向啟動子同時控制該二種所欲蛋白質編碼基因之表現；其中該雙向啟動子係有序列識別號：5之核苷酸序列。 3 1361220 #i.· 1

1 CGTCGGAATA GCTGCGAATT TGGAGGTGGA ACGATCGGAC TTCTCTGAGT 51 TCTTACTCTG ATGTTTGCTT GGTTTGCTTT GCGTTTTCTT CGTGGTTCTG Oshspll. 3^-1 101 CCGGTGAAGG GGAGCGCGGT TTTATAGAGG GCAGCGAGAG GGCATCGTGG 151 AGCTTGGAAT AAGCTTCTAG AAACTTCCAG TTTGCCCCCG CATGGGCTAG 201 AACCTAGTAC GAGATAGCTT GGGCTAGAAG TTTACACCAC CGGTAGCGGG 251 GTGGGCTGTA GCCCATAGCG TCCAGGACTC TCCAGAATAA TCTAGGCCAT

301 AAGCAGGCCT AGAACAATCC AGAAGACCAC TTCCAATTTC GGCCCAAATT 351 AACGAACAAA CGAGAACTAT CCGGAAGCAA AACTTCCAGT AGAACCCATG 401 GACCATCACG AACTGCTATA TAAATTGTTG CCACCACGCA GCGACAGGTG Oshspll. 3 !—► 451 CCAAGGAAAT CAGCTCATCG ATCGAAAGAT CAACAAGCTC TCTTGAGAAT 501 TGAGATCACC CTCTTTCCAT CTAGAACACA AACCAGACAA CCAAAAAACA 551 GCAAGACACA ATACACA 圖一 28 1361220 ' « 19 p567(+) 1456 8 11 12 13 14 15 17 18 28 °C 41 °C

p567 (-) 2 4 5 7 8 12 17 28°C

41 °C

2() 1361220

relative GUS activity 0 20 40 60 80 100

〇shspl8.0 Oshspl7.3

17 x 17.1 x □ Aze □ 41 ( 口 28(_