TWI343264B - - Google Patents

Description

1343264 { t 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種生醫材料，尤其是關於一種可 黏附於軟組織，凝膠時間短且具有較強結合強度與生 物可降解性以及不會造成生物體產生發炎反應之生物 膠。 【先前技術】 可黏附於軟組織上之生物黏附性（bioadhesive)材 料係具有發展成醫療用品之潛力，其可用於控制器官 中血液或組織液的滲流、密封肺部缺口或修復因進行 手術而切開之大主動脈切口。理想之生物黏附性材料 需具有生物適應性(biocompatbile)，並必須可於高濕度 環境下與組織表面間形成穩固之化學鍵結，且此鍵結 不可損傷組織或改變組織之生物功能；此外，生物黏 附性材料應可生物降解，且降解後的產物不可具有毒 性、致突變性與致癌性，並可以自然方式由生物體移 除之。 目前可應用於醫療上之黏附性材料不多，僅有下 列少數幾種手術用黏附性材料： gelatin-resorcine-formol glue(GRF)、氰基丙稀酸酉旨 (cyanoacrylate)與纖維蛋白膠（fibrin glue)，然而由於該 些材料本身之特性，致使其於實際手術應用上仍備受 丨..：s 限制，例如GRF膠雖可與組織緊密結合，然而研究指 出其成分中所含曱搭具有細胞毒性（Bellotto，F.， Johnson, R.G., Weintraub, R.M., Foley, J. and Thurer, R.L. 1992. Pneumostasis of injured lung in rabbits with gelatin-resorcinol formaldehyde-glutaraldehyde tissue adhesive, Surgery. 174,221-224.);氰基丙稀酸醋主要被 用於栓塞(embolization)及控制屢管（fistula)上，治療用 之氰基丙烯酸酯固形物的質地堅硬而無法被生物體吸 收，因此會干擾正常傷口的癒合與組織的再生；纖維 蛋白膠可用以密封於手術過程中臟層肋膜（visceral pleura)上之通氣缺口，然而由於纖維蛋白膠具有機械張 力低之缺點，因此可能會引起源於人體血液所造成之 感染風險。 其他已研發之生物膠，包含明膠(gelatin)和不同交 聯劑（crosslinking agent)相交聯所組成之生物勝（Sung, H.W., Huang, D.M., Chang, W.H., Huang, R.N. and Hsu, J.C. 1999. Evaluation of gelatin hydrogel crosslinked with various crosslinking agents as bioadhesives: In vitro study. J. Biomed· Mater· Res, 46, 520-530.)、明膠與多聽 體(polysaccharide)組成之生物膠（Mo，X” Iwata，H. and Matsuda, S. 2000. Soft tissue adhesive composed of modified gelatin and polysaccharides. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 11 , 341-351.)以及明膠與檸檬酸衍生物 (citric acid derivative)組成之生物勝(Aoki, Η.，Taguchi， 1343264 T.，Saito，H，，Kobayashi，H” Kataoka，K, and Tanaka，J. 2004. Rheological evaluation of gelatin gels prepared with a citric acid derivative as a novel cross-linker. Mater. Sci. Eng. 24,787-790)，等，而在這些配方中’明 膠扮演著重要角色。明膠係為一種已變性且可生物降 解之蛋白質，其可藉由酸及鹼處理膠原蛋白（c〇丨丨agen) 而獲得，此處理過程會影響膠原蛋白之電性，並產生 帶有不同等電點（isoelectric point, IEP)之明膠，例如經 驗處理後可產生具有xlj密度竣基(carboxyl group)並帶 負電荷之B型明膠’而B型明膠所具有之等電點值為 5.0 ;酸處理方法係侵略性低且幾乎無修飾膠原蛋白之 電性，可產生帶正電荷之A型明膠，A型明膠所具有 之等電點值為9.0 ’而上述已研發之生物膠中所採用的 明膠種類大多為A型明膠。 另一方面，亦有研究發現一種由B型明膠與 聚麵胺酸（poly [ a -glutamic acid], a -PGA，又可稱 poly[L-glutamic acid])所混合組成之水膠（〇tani，γ， Tabata Υ. and Ikada Y. A new biological glue from gelatin and poly (L-glutamic acid). 1996. J. Biomed. Mater. Res. 31，158-166.)，此混合物係藉由一化學交聯 劑：1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-[3-dimethylaminopropyl]-3-eyhyl-carbodiimide

hydrochloride,EDC 7 1343264 )所交聯生成，並可穩固黏附於皮膚及其他軟組織，且 其結合強度係高於纖維蛋白膠。於此系統中，明膠與 α-聚麩胺酸（a-PGA)係藉由EDC交聯劑而行化學交 聯’且於聚麵胺酸與EDC交聯劑之存在下，明膠的 交聯作用可能為競爭及互補。

聚麩胺酸(poly[glutamic acid], PGA)係為一帶負電 荷之聚胺基酸’於學術研究中，其可與帶正電荷之A

型明穆形成聚電解複合物(polyelectrolyte complex)。γ -聚楚胺酸(poly[ 7-glutamic acid]，7-PGA)，係由微生 物自L型麩胺酸(L-glutamic acid)所產生之天然聚合 物’其性質係不同於合成之α _聚麩胺酸（a _PGA)。於 7-聚麩胺酸之結構中’ D型及L型麩胺酸單元係藉由 胺基而連接於α-胺基（a -amino)與^ -竣酸美 carboxylic group)間，故聚麵胺酸之黏彈性及生物降 解性係不同於α -聚麵胺酸。

明膠與聚麩胺酸(PGA)之種類及其分子量對於膠 體之流變學(rheology)及黏附性係具有顯著之影響，夕 上述由明膠與聚麩胺酸(PGA)所混合組成之水膠: >，其與 組織間之黏結性(cohesive)並不佳，原因可能為其使 B型明膠及分子量低至83 kDa之〇：-聚麩胺駿所&用 【發明内容】 為改善習知生物膠具有細胞毒性、影響偟 場口亵合 8 1343264 以及黏附性不佳等缺點’本發明將提供一種凝膠時間 較短、具有較佳黏附性及結合強度且不會引發生物體 產生強烈發炎反應之生物膠，其係由r -聚麩胺酸（7 -PGA)與明膠交聯組成’並可作為醫療上黏附軟組織之 用。 為達上述目的，本發明提供一種凝膠時間較短、 具有較強結合強度與生物可降解性以及無毒性且不會 引起發炎反應之生物膠，其係藉由不同類型之明膠、 濃度不同且分子量至少為300 kDa以上之7"-聚麵胺酸 以及不同濃度之1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺 鹽酸鹽（EDC)交聯劑，而搭配組合形成多種複合型生物 膠。其中，明膠可為濃度介於6 %〜15 %(w/v)膠強度 45〜85或300之A型明膠’或濃度介於9 %〜20 %(w/v) 膠強度75或225之B型明膠；τ-聚麩胺酸之濃度為 0.5 %〜4 %(w/v)，且其分子量可為300 kDa之低分子 量或880 kDa之高分子量；EDC交聯劑之濃度為1 % 〜2.5 %(w/v)。並將混合後之該些生物膠進行後續相關 測試，該些測試包括：藉由一液體流變儀（fluid rheometer)偵測該些生物膠之凝膠時間（gelation time)、測量該些生物膠之結合強度（bonding strength)、 以膨潤度（swelling ratio)與變性溫度（denaturation temperature)之測量來分析生物膠之交聯程度 (cross-linking degree)以及藉由生物體外（in vitro)及體 内（in vivo)實驗測試生物膠之生物適應性，進而界定出 9 1343264 可增進膠體黏附性且可適用於黏附軟組織之生物膠。 於凝膠時間測試方面，當生物膠中所含高分子量 (880 kDa)或低分子量（300 kDa)之τ-聚麩胺酸的濃度 介於0.5 %〜2 %(w/v)時，或A型明膠與B型明膠之 膠強度較高時，可有效縮短凝膠時間；此外，當生物 膠所含7 -聚麵胺酸之分子量為880 kDa時，其所需凝 膠時間係短於含有低分子量7 -聚麩胺酸之生物膠，而 當生物膠所含明膠為膠強度300之A型明膠時，其所 需凝膠時間係短於含有膠強度225之B型明膠的生物 膠。 於結合強度測試方面，生物膠之結合強度會隨著 生物膠中所含高分子量或低分子量T -聚麩胺酸濃度之 增加而提高，且含有濃度為2 %(w/v)之高分子量7 -聚麩胺酸的生物膠具有較佳之結合強度；此外，當生 物膠中所含EDC交聯劑之濃度增加時，生物膠之結合 強度亦會隨之提高。 於交聯程度分析上，在膨潤度測試中，交聯後之 生物膠的膨潤度會隨生物膠浸泡時間之增加而提高， 此外，生物膠之膨潤程度會隨EDC交聯劑之濃度增加 而減少；在變性溫度測試中，變性溫度（Td)會隨著 交聯後之生物膠中所含EDC交聯劑濃度增加而升高且 交聯程度愈高時，可增加生物膠之熱穩定性。 於生物適應性方面，在體外細胞毒性測試中，隨 10 1343264 著該些生物膠中所含EDC交聯劑之濃度增加，細胞數 目僅有極些微的減少，此顯示該些生物膠對細胞並不 具毒性；在體内之皮下植入測試中，相較於對照組纖 維蛋白膠植入後，會引起實驗鼠產生輕微之發炎反 應，本發明之生物膠的植入並不會造成實驗鼠產生嚴 重的發炎反應，此外，亦可觀察到植入皮下之生物膠 可穩固地黏附於其周邊組織，而植入皮下之纖維蛋白 膠卻與其周邊組織相隔有一段距離，此顯示本發明之 生物膠與生物體組織間之黏附性較優於纖維蛋白膠。 藉由本發明以10 %(w/v)膠強度為300之A型明 膠與2 %(w/v)分子量為88〇kDa的7_聚麩胺酸所混人 組成之生物膠，其係具有較強結合強度與生物可降^ 性以，無毒性且不會造成生物體產生發炎反應等優 點，藉由上述特性可縮短生物膠之製成時間，同時使 生物膠可緊密黏附於軟組織週邊，且其植入並不會造 成生物體有不良影響，並使傷口可快速癒合，而可廣 泛應用於醫療上。 、 以下將配合圖式進-步說明本創作的實施方式， 下述所列舉的實施例係用以_本創作，並非用以限 =本創作之範圍’任何熟習此技藝者，在不脫離本創 ，之精神和範_，當可做些許更動與潤飾，因此本 ^作之賴㈣當視後附0請相範圍所界定者為 11 1343264 【實施方式】 分別將10克之A型明膠（萃取自豬皮，由美國 Sigma公司製造）或10克之B型明膠（萃取自牛皮，由 美國Sigma公司製造），與0.5〜4克之高分子量（分子量 約為880 kDa，由台灣味丹公司製造）或低分子量（分子 量約為300 kDa，由台灣味丹公司製造）的聚麩胺酸 (7 -PGA)混合之，其中，A型明膠又可依其膠強度 (bloom)再區分為膠強度45〜85或300之A型明勝，B 型明膠又可依其膠強度再區分為膠強度75或225之B 型明膠，而此膠強度係藉由凝膠強度（gelometer)所測 得，膠強度之數值愈大，表示其膠強度愈強（Standard Methods for the Sampling and Testing of Gelatins, Gelatin Manufacturers Institute of America, Inc., 501 fifth Ave.，Room 1015, New York, NY)。再加入水至最 終體積為100毫升，而製備成含有濃度為10 %(w/v)A 型或B型明膠以及濃度為〇·5 %〜4 %(w/v)之高分子 量或低分子量T -聚麩胺酸之明膠聚麩胺酸 (gelatin-r -PGA)水溶液。此外，該A型明膠或B型明 膠之濃度以此僅係例示，並不以此為限，A型明勝之 濃度可介於6 %〜15 %(w/v)，而B型明膠之濃度可介 於 9 %〜20 %(w/v) 〇 接著，取1毫升之明膠/γ -聚楚胺酸水溶液，加入 12 1343264 0.1 毫升之鱗酸緩衝溶液（phosphate buffered saline， PBS)，且該磷酸緩衝溶液中係含有1 %〜2.5 %(w/v) 之交聯劑1-(3-二曱氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-[3-dimethylaminopropyl]-3-eyhyl-carbodiimide hydrochloride) (EDC，由英國 Lancaster 公司製造），進 而製得由不同濃度明膠、T-聚麩胺酸以及EDC交聯劑 所混合組成之生物膠。將製備好之該些生物膠進行凝 膠時間（gelation time)、結合強度(bonding strength)、膨 潤度（swelling ratio)與變性溫度（denaturation temperature)之交聯程度（cross-linking degree)分析以及 體外（in vitro)及體内（in vivo)之生物適應性等測試，藉 以找出具有適當黏附力之生物膠。茲對前述測試方法 詳盡說明如下： 實施例1 : 生物膠之凝膠時間測試 此凝膠時間測試係於37 °C下，當EDC交聯劑一 添加於明膠/7 ·聚麩胺酸水溶液中時，便快速地分別將 700 // 1之該些混合物置入流變儀中，而開始進行測 試，其係以SR5流變儀（SR5 rheometer,由美國 Rheometric Scientific 公司製造）並採用錐板(cone and plate)元件來偵測該膠體之流變學（rheology) 〇而動態頻 率掃猫試驗（Dynamic frequency sweep test)係於 2 % 之 13 1343264

贫切應變（shear strain)與！ Hz之頻率下進行。每個黏附 力之測試巾，制得減些生％狀赫餘(storage shear modulus，G’），其中模數係為應維腦)與應變 ⑽—之比值’而應力係施與椅料之力量，應變係材 料形變量，因此當所測得儲存镇數之數值愈大時，表 示生物膠所需凝膠時間愈短，㈣所測得儲存模數之 數值愈小時，則表不生物膠所需凝膠時間愈長，其結 果如第- A圖、第—BHa圖、第二B圖、表 一與表二所示。

凊參閱第一 A圖，該圖係A型明膠、EDc交聯劑 以及不同濃度之高分子量聚楚胺酸混合形成該些生 物膠之儲存模數發展的示意圖。其中，Α型明膠之膠 強度係為300，且其濃度係為1〇 %(w/v)，EDC交聯 劑之農度係為1.7 %(w/v)，而高分子量r -聚麩胺酸之 濃度係分別為1 %、2 %、3 %與4 %(w/v)。當儲存 模數值愈大時，生物膠所需凝膠時間便愈短，由圖中 了知，較鬲浪度之尚分子量聚楚胺酸會降低生物膠 之儲存模數’因此當高分子量聚麩胺酸之濃度高於 2 %(w/v)時，生物膠所需凝膠時間便愈長。 請參閱第一 B圖，該圖係a型明膠、EDC交聯劑 以及不同濃度之低分子量T -聚麩胺酸混合形成該些生 物膠之儲存模數發展的示意圖。其中，A型明膠之膠 14 1343264 強度係為300，且其濃度係為10 %(w/v)，EDC交聯 劑之濃度係為1.7 %(w/v)，而低分子量7-聚麵胺酸之 濃度係分別為0.5 %、1 %、2 %、3 %與4 %(w/v)。 由圖中可知，較高濃度之低分子量7 -聚麩胺酸會降低 生物膠之儲存模數，因此當低分子量聚麵胺酸之濃 度高於2 %(w/v)時，生物膠所需凝膠時間便愈長；此 外，比較第一 A圖與第一 B圖之結果，可觀察到含有 低分子量T -聚麩胺酸之該些生物膠的儲存模數之數 值，係低於含有高分子量7 -聚麩胺酸之該些生物膠的 儲存模數之數值，因此可知含有高分子量T -聚麵胺酸 之該些生物膠，其所需凝膠時間較短。另一方面，該 結果亦顯示於混合物形成生物膠之過程中，7-聚麩胺 酸的含量應有適當之濃度範圍，當T-聚麵胺酸之濃度 超過最適濃度範圍時，混合物中的羧基濃度便會過 量，而干擾生物膠的形成，因此，含有高濃度之7 -聚 麩胺酸之生物膠，其儲存模數降低可能係因混合物中 T -聚麵胺酸過量，尚有未反應之T -聚麩胺酸，進而干 擾凝膠過程所致。 請參閱第二A圖，該圖係具有不同膠強度之A型 明膠、EDC交聯劑以及7 -聚麩胺酸混合形成該些生物 膠之儲存模數發展的示意圖。其中，A型明膠之濃度 係為10 %(w/v)且其膠強度分別為45〜85與300, EDC 交聯劑之濃度係為1.7 % (w/v)，而高分子量7-聚麵胺 酸之濃度係為2 %(w/v)。由圖中可知，膠強度為300 15 A U里明膠的儲存模數數值係高於膠強度為45〜85之 為3(J膠的儲存模數數值，因此當A型明膠之膠強度 時’其所需凝料間係短於膠強度為45〜85之八 可开4此外’ A型明膠之濃度並不以此為限，凡是 此i目同性質生物膠之A型明膠濃度皆可應用於 其之濃度亦可介於6%〜9%(油）， =寺間仍應接近濃度為10 %A型明膠之凝膠時 二⑺或。八型明膠之濃度可增加幻〇 %(w/v)以上例 %〜15 %(w/v)，其凝膠時間仍應接近濃度為1〇 日㈣之凝料間’或可再進—步縮短生物 〆疑膠所需時間，並形成具相同性質之生物膝。 ㈣叫參閱第二B圖，該圖係具有不同膠強度之B型 膠，=EDC父聯劑以及7 _聚麵胺酸混合形成該些生物 ^儲。存模數發展的示意圖。其中，B型明膠之濃度係 :<(W/v)且其膠強度分別為75與225，EDC交聯 農度係為17 %(w/v)，而高分子量卜聚麵胺酸之 二日又係為2 % (w/v)。*目中可知，膠強度為225之B !月膠的儲存模數數值係高於膠強度為75之B型明膠 =儲存模數數值，因此當B型明膠之膠強度為225時， 其所需凝膠時間係短於膠強度為75之B型明膠，此 外B型明膠之濃度並不以此為限，凡是可形成相同性 質生物膠之B型明膠濃度皆可應用於此，意即B蜇明 膠之濃度亦可增加至10 %(w/v)以上，例如10 %〜20 %(w/v)較佳為1〇 %〜I，％(w/v)，其凝膠時間仍應 1343264 接近濃度為10 %(w/v)B型明膠之凝膠時間，或可再進 一步縮短生物膠凝膠所需時間，並形成具相同性質之 生物膠。另一方面，比較第二A圖與第二B圖之結果， 可觀察到含有A型明膠之該些生物膠所需的凝膠時間 係短於含有B型明膠之該些生物膠，此原因為A型明 膠係藉由酸處理過程所產生且富含胺基，故其係帶正 電荷，而B型明膠則藉由鹼處理過程所產生並富含羧 基，故其係帶負電荷，因此於生物膠形成之過程中， 帶正電之A型明膠可迅速與帶負電之γ -聚麩胺酸相結 合，而縮短凝膠所需時間，此外，EDC交聯劑係為一 可於胺基與叛基間形成醯胺鍵（amide bond)之偶合劑 (coupling agent)，故可藉由EDC交聯劑使富含胺基之 A型明膠與7-聚麩胺酸中所含羧基相結合，而縮短凝 膠所需時間。 請參閱表一，該表係A型明膠、EDC交聯劑以及 不同濃度之低分子量與高分子量T -聚麩胺酸混合形成 該些生物膠所需凝膠時間之結果。其中，A型明膠之 膠強度係為300，且其濃度係為10 %(w/v)，EDC交 聯劑之濃度係為1.7 %(w/v)，而高分子量聚麵胺與 低分子量Τ-聚麩胺酸之濃度係分別為〇.5 %、1 %、 2 %、3 %與4 %(w/v)。由表中可知，當高分子量7 -聚麩胺酸之濃度為0.5 %〜1 %(w/v)時，生物膠會迅 速凝膠（由於該凝膠時間極為快速，在未以儀器測量 時，便已凝膠，故其凝膠時間係以N.A.表示），而當低 17 1343264 分子量與高分子量r -聚麩胺酸之濃度增加時，形成生 物膠所需凝膠時間便隨之增加，且含有低分子量τ-聚 麩胺酸之混合物，其形成生物膠所需凝膠時間會延至 更長。 表一、10 %膠強度為300之A型明膠、1.7 %EDC交聯劑以 及不同濃度之低分子量與高分子量γ-聚趄胺酸混合形 成該些生物膠所需之凝膠時間。 凝膠時間（秒） γ-PGA濃度 0.5 % 1 % 2% 3 % 4% 低分子量 γ-PGA (Mw=300 kDa) 10.2 31.9 82.6 171.4 375 高分子量 γ-PGA (Mw=880 kDa) N.A. N.A. 13.0 28.7 50.9 請參閱表二，該表係不同類型且具有不同膠強度之明 膠與EDC交聯劑以及τ-聚麩胺酸混合形成該些生物膠所 需凝膠時間之結果。其中，Α型明膠之膠強度係分別為 45〜85與300，B型明膠之膠強度係分別為75與225，而 EDC交聯劑之濃度係為1.7 %(w/v)，τ-聚麵胺酸係為高 分子量且其濃度係為2 % (w/v)。由表中可知，含有A型 明膠之混合物具有較短的凝膠時間，此外，不論是含有A 型明膠或B型明膠之混合物，當明膠之膠強度越高，可相 18 1343264 對縮短形成生物膠所需之凝膠時間。 表二、10 %不同膠強度之A型明膠或b型明膠、丨.7 % EDC交聯劑以及2 %高分子量γ·-聚麩胺酸混 合形成該些生物膠所需之凝膠時間。 明交類型 膠強度 凝膠時間（秒） A 45 〜85 137.8 300 13.0 B 75 533.2 225 217.1 實施例2 : 生物膠之結合強度測試 生物膠之黏附特性可藉由設置於兩新鮮豬皮 (porcine skin)間之膠體的結合強度而測得，此測量方式 係依據文獻中所述方法而進行之（Otani，Y.，Tabata，Y. and Ikada, Y. 1996. A new biological glue from gelatin and poly (L-glutamic acid). J. Biomed. Mater. Res. 31, 158-166.)。將該些混合好之生物膠置於一大小約ix3 cm2之醏皮的皮膚面，再疊放上另一豬皮，藉以形成 一大小為1x1 cm2之結合區域，此時將兩豬皮相互黏 合’並於置入生物膠3〇分鐘後，以拉伸試驗機(tensile machine,由台灣宏達儀器公司製造）測量其結合強度， (5 ； 19 1343264 此測量試驗係於溫度為25 °C且相對濕度為60 %之環 境下，以10 mm/min之分離速度進行，直至兩豬皮分 離，最後所得結合強度結果係為六次測試之平均值， 其結果如第三圖與第四圖所示。 請參閱第三圖，該圖係為含有A型明膠、EDC交 聯劑以及不同濃度之低分子量與高分子量7 -聚麩胺酸 之該些生物膠之結合強度的示意圖。其中，A型明膠 之膠強度係為300，且其濃度係為10 %(w/v)，EDC 交聯劑之濃度係為1.7 %(w/v)，而低分子量與高分子 量T -聚麩胺酸之濃度係分別為0.5 %、1 %、2 %、 3 %與4 %(w/v)。由圖中可知，當生物膠中所含高分 子量r-聚麩胺酸之濃度為〇.5 %〜2 %(w/v)時，生物 膠之結合強度會隨著高分子量r -聚麩胺酸濃度之增加 而提高，而於含有低分子量7-聚麩胺酸之生物膠中， 亦可觀察到相似之結合強度的曲線變化，但當低分子 量r-聚麵胺酸之濃度為1 %(w/v)時，便已顯現其最大 結合強度；此外，由圖中結果亦可發現，當生物膠中 所含高分子量聚麩胺酸之濃度超過2 % (w/v)時，其 結合強度係高於含有2 %(w/v)以上濃度之低分子量r -聚麩胺酸的生物膠，而當生物膠中所含低分子量或高 分子量7 -聚麩胺酸之濃度較低時，其結合強度並無明 顯之差異。基於上述結果，含有濃度為2 %(w/v)之高 分子量T -聚麩胺酸的生物膝具有較佳之結合強度，且 此結果已先揭示於本發明實施例中用以評估生物膠凝 1343264 膠時間之儲存模數的結果中，儲存模數可表示兩分子 間之剪力移動（shear movement)，其亦可反應出拉伸狀 態時之表面剪力，意即流變學中之儲存模數亦可準確 預估出膠體之結合強度，因此本發明之另一特徵係證 明流變學亦可作為用以定義生物膠之凝膠時間與膠體 強度之簡便工具。 請參閱第四圖，該圖係為含有A型明膠、不同濃 度之EDC交聯劑以及高分子量τ-聚麩胺酸之該些生 物膠之結合強度的示意圖。其中，A型明膠之膠強度 係為300，且其濃度係為10 %(w/v)，EDC交聯劑之 濃度係界於1〜2.5 %(w/v)，而高分子量聚麩胺酸 之濃度係為2 %(w/v)。由圖中可知，當生物膠中所含 EDC交聯劑之濃度增加時，生物膠之結合強度便會隨 之提高。 實施例3 : 生物膠之膨潤度測試 由於明膠與聚麩胺酸經EDC交聯劑交聯生成 生物膠後，會於生物膠之交聯網絡中形成共價鍵，當 生物膠具有愈高交聯程度之結構，愈無法維持存於交 聯結構中的水份，所以當生物膠之交聯度愈高，其吸 水能力（water uptake ability)則愈低，意即其膨潤度愈 低，因此，此分析可作為EDC交聯劑最適化添加量選 21 1343264 擇的依據。 當凝膠完成後（混合後約12小時），便測試生物膠 之膨潤度，其中該生物膠係含有10 %(w/v)膠強度為 300之A型明膠、濃度分別為1.7 %、2.0 %、2.3 % 與2.5 %(w/v)之EDC交聯劑以及2 %(w/v)i高分子 量T -聚麵胺酸。將交聯後之生物膠予以秤重（W0)，此 係代表生物膠膨潤前之重量（g)，再於室溫下將生物膠 鲁 /又 /包於碌酸緩衝溶液（phosphate buffered saline, PBS) 中’使其膨潤之’並於固定之浸泡時間間隔，將該膨 湖後之生物膠以濾紙拭乾，吸除其表面過量液體，再 予以秤重（Wt)，此係代表生物膠膨潤後之重量（g)，並 利用公式計算生物膠之膨潤度，其結果如第五圖所 示。而膨潤度之計算公式如下：

Swelling Ratio(%)= ( Wt~mWQ ) xlOO%

WO 參 請參閱第五圖，該圖係為含有10 %(w/v)膠強度 為300之A型明膠、濃度為1.7 %〜2‘5 %(w/v)EDC 交聯劑以及2 %(w/v)高分子量r-聚麩胺酸（t-pga) 之該些生物膠之膨潤度的示意圖。由圖中膨潤度之變 化趨勢（swelling tendency)可知’生物膠之膨潤度會隨 生物膠浸泡時間之增加而提高’當浸泡時間為1800 h 時，該些含有濃度為1.7 %〜2.5%(w/v)EDC交聯劑生 物膠之膨潤度約界於12〇 %〜17〇 %之範圍内，而隨浸 22 1343264 泡時間的增長，生物膠之膨潤度增加趨勢有逐漸趨緩 的現象，表示此時該些生物膠所能吸收並產生膨脹效 . 應之液體量皆已趨於飽和，此外，生物膠之膨潤程度 • 會隨EDC交聯劑之濃度增加而減少。 實施例4: 生物膠之變性溫度測試 φ 通常交聯程度會影響高分子材料的特性，當材料 經過交聯處理後’會增強材料的熱穩定性（thermal stability)，而變性溫度（denaturation temperature，Td)主 要可作為交聯程度的指標，當交聯程度愈高時，則材 料的抗變性溫度愈高，因此，材料的交聯程度可間接 以變性溫度加以表示，一般可以差式掃描熱量測定法 (differential scanning calorimetry，DSC)進行測定。 分別將交聯有1.7 %、2 %、2.3 %與2.5 %(w/v) # 之EDC交聯劑以及10 %(w/v)膠強度為3〇〇之A型明

膠與2 %(w/v)之高分子量T-聚麩胺酸（T_PGA)的生 物膠，冷凍乾燥48小時，將處理後之樣品（約〇·3毫克） 置於差式掃描熱量裝置（DSC 2010,由美國TA

Instruments所製造）中，並以密封之DSC铭盤封住待測 樣品，測試溫度範圍為-30 2(^至1〇〇 QC’並以每分鐘 5 °C的加熱速度來加熱樣品’以進行樣品的變性溫度 (Td)測定，最後所得變性溫度結果係為3〜5次測試 23 1343264 之平均值，其結果如第六圖所示。 請參閱第六圖，該圖係為含有10 %(w/v)膠強度 為300之明膠、濃度為1.7 %〜2.5 %(w/v)EDC交聯劑 以及2 %(w/v)高分子量聚麩胺酸之該些生物膠之 變性溫度的示意圖。圖中結果顯示，當生物膠中所含 EDC交聯劑濃度為1.7 %(w/v)時，生物膠之變性溫度 (Td)約為68.5°C左右，而隨EDC交聯劑濃度增加， 生物膠變性溫度（Td)亦隨之升高，此結果顯示交聯 程度愈高時，可増加生物膠之熱穩定性，亦即生物膠 之熱穩定性將可藉由交聯程度的增加而提高。 實施例5 : 生物膠之體外細胞適應性測試 經化學修飾之生物膠最顯見的缺點係為其潛藏毒 性’由於生物體内測試需要較長的時間，因此利用體 外測試來初步檢測生物膠之毒性，此毒性評估測試係 藉由L929纖維母細胞（fibroblast)而於生物體外（in vitro) 進行之。分別將55 //1含有不同濃度EDC交聯劑之該 些生物膠’置於24孔細胞培養盤之孔槽内，其中該些 生物膠各含有10 %(w/v)膠強度為300之A型明膠、2 %(w/v)之高分子量r -聚鏠胺酸以及濃度分別為1.7 %、2 %、2‘3 %與 2.5 %(w/v)之 EDC 交聯劑，且該 些生物膠之重複測試次數皆為三次，而對照組(Tissue (:'s) 24 1343264 culture plates，TCPS)之孔槽中則不添加生物膠，再於該 些孔槽内加入含有2x105細胞數之細胞懸浮液，並置 入含有5%二氧化碳之溼度培養箱中於37 °C下培養 之，其中培養L929纖維母細胞之培養基為為添加有1〇 %胎牛血清（fetal calf serum，Biological Industries，Israel) 之細胞培養液(Dulbecco’ s Modified Eagle’ s Medium, DMEM, Gibico, U.S)。經24小時培養後，移除培養基 並使細胞懸浮，經離心再懸浮後，以細胞計數器 (hemacytometer)並配合顯微鏡計算細胞數目。本測試係 以trypan blue染色法進行存活測試，由於活細胞之細 胞膜完整，trypan blue染料便無法滲入，因此活細胞不 會呈色，而trypan blue染料可滲入死細胞中而使其呈 藍色，藉以觀察並計算細胞的存活數（viability cell number)，最後所得細胞的存活數結果係為3次測試之 平均值，其結果如第七圖所示。 請參閱第七圖’該圖係為含有10 %(w/v)膠強度 為300之A型明膠、濃度為1.7 %〜2.5 %(w/v)之EDC 交聯劑以及2 %之高分子量聚麵胺酸之該些生物 膠之毒性評估的示意圖。由圖中可知，相較於無添加 生物膠之對照組(TCPS)’隨著EDC交聯劑之濃度增 加，細胞數目僅有極些微的減少，且含有各濃度EDC 交聯劑之該些生物膠的細胞存活數目皆與無添加生物 膠之對照組近似，此結果顯示該些生物膠對細胞並不 具毒性。 25 1343264 實施例6 : ' 生物膠之體内組織適應性測試 -· 由於生醫材料在植入生物體内時，可能會釋放出 毒性或其他物質，使免疫系統引起發炎反應，而生醫 材料在生物體内的生物適應性良好與否，最快速且簡 易的方法便為利用皮下植入（subcutaneous implantation) _ 的方式來進行試驗，因皮下植入不但可以於短期間内 測試出組織對材料的排斥性、敏感性及親和性，同時 亦具有手術過程簡便及可靠性高等優點，其結果亦可 作為後續評估的指標。本發明中之生物膠係為新發展 的生醫材料，故皮下植入所呈現的評估結果，可作為 未來是否為臨床應用的重要佐證。 將 100 "1 分別含有 1.7 %(w/v)與 2.5 %(w/v) 之EDC交聯劑的生物膠以及纖維蛋白膠(fibringiue；Mi • 入SPrague_Dawley雄性大白鼠（體重約為300克)之背 部皮下，其中，該些生物膠尚含有1〇 %(w/v)膠強度 為300之A型明膠與2 %(w/v)之高分子量r _聚麵胺 酸。分別於生物膠植入皮下後之第3天及第7天，取 出皮下組織以進订組織切片。將所取出組織固定後， 進行包埋切片，切片時使用石臘包埋法ffin)，並以 蘇木、红（hematoxylin)及唾也， _ ’伊紅（eosin)予以染色，染色後 盍上蓋玻片，以光學顯微鏡進行觀察，以檢視生物膠 <：'S ) 26 1^43264 對生物體組織的影響程度（如引起發炎反應等），其結果 如第八A圖至第八F圖所示。 请參閱第八A圖至第八F圖’該些圖係為於實驗 鼠皮下植入不同膠體後第3天與第7天之皮下組織切 片圖。其中，白色箭頭所指處係為殘留之膠體。請同 時參閱第八A圖與第八D圖’該些圖係為於實驗鼠皮 下植入纖維蛋白膠後第3天與第7天之皮下組織切片 圖’由圖中可觀察到所植入之纖維蛋白膠幾乎消失殆 盡，而於第7天之組織切片結果顯示，膠體周邊組織 出現有由淋巴球及巨嗔細胞滲入所造成之輕微發炎反 應現象。 凊同時參閱第八C圖與第八F圖，該些圖係為於 貫驗鼠皮下植入含有1.7 %(w/v)EDC交聯劑之生物膠 後第3天與第7天之皮下組織切片圖。於此組織切片 圖中並無觀察到嚴重的發炎病理狀況，僅於膠體周邊 發現有膠原蛋白沉積（collagen deposition)。 請同時參閱第八B圖與第八E圖，該些圖係為於 實驗鼠皮下植入含有2.5 %(w/v)EDC交聯劑之生物膠 後第3天與第7天之皮下組織切片圖。於此組織切片 圖中並無觀察到嚴重的發炎病理狀況，僅發現有血管 穿透（vascular penetration)現象。 由上述組織切片結果可知，對照組纖維蛋白膠植 入後會引起實驗鼠產生輕微之發炎反應，而生物膠之 27 1343264 植入並不會造成實驗鼠產生嚴重的發炎反應，其原因 可能為形成生物膠時所需EDC交聯劑之濃度低，且 EDC交聯劑係已包含於混合物令，並未與細胞直接接 觸，因此其不具毒性，此外，當EDC交聯劑用作凝結 劑（condensation reagent)時，大部分的EDC交聯劑會立 即轉變為尿素衍生物，而可將其清洗去除，故不會對 細胞造成毒害。另一方面，亦可觀察到植入皮下之生 物膠可穩固地黏附於其周邊組織，而植入皮下之纖維 蛋白膠卻與其周邊組織相隔有一段距離，此顯示本發 明實施例之生物膠與生物體組織間之黏附性較優於纖 維蛋白膠。 【圖式簡單說明】 第一 A圖係本發明實施例由10 %(w/v)膠強度為300 之A型明膠、1.7 % (w/v)EDC交聯劑以及不同濃度 之高分子量T -聚麩胺酸混合形成該些生物膠之儲存 模數的示意圖。:含有1 %(w/v) 7 -聚麩胺酸之生 物膠；□:含有2 %(w/v)r-聚麩胺酸之生物膠；▲: 含有3 %(\ν/ν) γ·聚麩胺酸之生物膠；含有4 % (w/v)r -聚麩胺酸之生物膠° 第一 B圖係本發明實施例由10 % (w/v)膠強度為300 之A型明膠、1.7 % (w/v)EDC交聯劑以及不同濃度 之低分子量7 -聚链胺酸混合形成該些生物膠之儲存 28 1343264 模數的示意圖。:含有0.5 %(w/v)r-聚麩胺酸之 生物膠；□:含有1 %〇/v)7_聚麵胺酸之生物膠； ▲:含有2 %(w/v)r-聚麩胺酸之生物膠；△:含有 3 % (w/v) r -聚麵胺酸之生物膠；♦:含有4 % (w/v) r -聚麩胺酸之生物膠。 第二A圖係本發明實施例由不同膠強度之A型明膠、 1.7 %(w/v)EDC交聯劑以及τ-聚麩胺酸混合形成該 些生物膠之儲存模數的示意圖。▲:含有膠強度為 300之A型明膠的生物膠；△:含有膠強度為45〜85 之A型明膠的生物膠。 第二B圖係本發明實施例由不同膠強度之B型明膠、 1.7 %(w/v)EDC交聯劑以及r -聚麩胺酸混合形成該 些生物膠之儲存模數的示意圖。:含有膠強度為 75之B型明膠的生物膠；□:含有膠強度為225之 B型明膠的生物膠。 第三圖係本發明實施例含有10 %(w/v)膠強度為300 之A型明膠、1.7 %(w/v)EDC交聯劑以及濃度為1 %〜4 %(w/v)之低分子量與高分子量7-聚麩胺酸之 該些生物膠之結合強度的示意圖。♦:含有高分子量 7* -聚麩胺酸之生物膠；:含有低分子量7 -聚麩胺 酸之生物膠。垂直線代表六次獨立試驗之標準偏差 值。 第四圖係本發明實施例含有10 %(w/v)膠強度為300 29 1343264 之A型明勝、濃度為1 %〜2.5 %(w/v)之EDC交聯 劑以及2 %(w/v)高分子量T-聚麩胺酸之該些生物 膠之結合強度的示意圖。垂直線代表六次獨立試驗之 標準偏差值。 .· 第五圖係本發明實施例含有10 %(w/v)膠強度為300 之A型明膠、不同濃度EDC交聯劑以及2 %(w/v) 向分子量7* -聚麩胺酸之該些生物膠之膨潤度的示意 _ 圖。_ :含有1.7 %(w/v)EDC交聯劑之生物膠；▲: 含有2.〇 %(w/v)EDC交聯劑之生物膠；# :含有2.3 %(w/v)EDC交聯劑之生物膠；♦:含有2.5 % (w/v)EDC交聯劑之生物膠。 第六圖係本發明實施例含有10 %(w/v)膠強度為300 之A型明膠、濃度為1.7 %〜2.5 %(w/v) EDC交聯 齊11以及2 %(w/v)高分子量r-聚麵胺酸之該些生物 膠之變性溫度的示意圖。垂直線代表3〜5次獨立試 • 驗之標準偏差值。 第七圖係本發明實施例含有10 %(w/v)膠強度為300 之A型明膠、不同濃度edC交聯劑以及2 %(w/v) 高分子量7 -聚麩胺酸之該些生物膠之毒性評估的示 意圖。垂直線代表3次獨立試驗之標準偏差值。 第八A圖係本發明實施例於實驗鼠皮下植入纖維蛋白 膠後第3天之皮下組織切片圖。白色箭頭所指處係 為殘留之膠體，橫線表示100 V m。 30 1343264 第八B圖係本發明實施例於實驗鼠皮下植入含有2.5 %(w/v)EDC交聯劑、10 %(w/v)膠強度為300之A 型明膠以及2 %(w/v)高分子量聚麩胺酸之生物 膠後，第3天之皮下組織切片圖。白色箭頭所指處 係為殘留之膠體，橫線表示100/im。 第八C圖係本發明實施例於實驗鼠皮下植入含有1.7 %(w/v)EDC交聯劑、10 %(w/v)膠強度為300之A 型明膠以及2 %(w/v)高分子量7-聚麩胺酸之生物 膠後，第3天之皮下組織切片圖。白色箭頭所指處係 為殘留之膠體，橫線表示100# m。 第八D圖係本發明實施例於實驗鼠皮下植入纖維蛋白 膠後第7天之皮下組織切片圖。白色箭頭所指處係 為殘留之膠體，橫線表示100//m。 第八E圖係本發明實施例於實驗鼠皮下植入含有2.5 %(w/v)EDC交聯劑、10 %(w/v)膠強度為300之A 型明膠以及2 %(w/v)高分子量7-聚麵胺酸之生物 膠後，第7天之皮下組織切片圖。白色箭頭所指處 係為殘留之膠體，橫線表示ΙΟΟμιη。 第八F圖係本發明實施例於實驗鼠皮下植入含有1.7 %(w/v)EDC交聯劑、10 %(w/v)膠強度為300之A 型明膠以及2 %(w/v)高分子量聚麩胺酸之生物 膠後，第7天之皮下組織切片圖。白色箭頭所指處 係為殘留之膠體，橫線表示100# m。 31 1343264 【主要元件符號說明】 (無）

32

Claims (1)

1343264 10ft ~~ϊ； - § 年月日修正本丨 .公告本· 十、申請專利範圍： 一種生物膠，其係用以黏附軟組織，該生物膠係包含一 濃度為0.5 %〜4 %(w/v)且分子量至少為300 kDa以上 之 γ-聚麵胺酸(p〇ly[Y-glutamic acid]，γ-PGA)、一濃度為 6 %〜15 %(w/v)之A型明膠(A type gelatin)以及一有效量 之可鍵結A型明膠之胺基及γ_聚麵胺酸之羧基的交聯劑 (crosslinker)。

2、如申請專利範圍第1項所述之生物膠，其中該交聯劑係 為1-(3-二曱氨基丙基）_3·乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-[3-dimethylaminopropyl]-3-eyhyl-carbodiimide hydrochloride)。 3、如申請專利範圍第2項所述之生物膠，其中該ι_(3·二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽之濃度係為1 %〜2s %(w/v)。 4、 如申請專利範圍第1至3項任一項所述之生物膠，其中 該A型明膠之膠強度(bloom值)至少為300以上。 5、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中該a型明膠 之濃度為1〇 %(w/v) ’且該γ-聚麩胺酸之濃度為0.5 2 %(w/v) ’藉以縮短形成該生物膠時所需之凝膠時間。 6、 如申請專利範圍第5項所述之生物膠，其中該γ_聚麵賤 酸之分子量係為8 8 0 kD a ’藉以縮短形成該生物膠時所需 之凝膠時間。 7、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中該A型明膠 之濃度為1〇 %(w/v) ’且該γ-聚麵胺酸之濃度為1 %〜3 %(w/v)，藉以增強該生物膠之結合強度。 8、 如申請專利範圍第7項所述之生物膠，其中該γ-聚麩賤 33 1343264 酸之分子量係為880 kDa，藉以增強該生物膠之結合強 度。 9、 如申凊專利範圍第8項所述之生物膠，其中該卜(3_二曱 氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽之濃度係為17 %〜25 %(w/v) ’藉以增強該生物膠之結合強度。 10、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中當該a型明 膠之濃度為6 %〜15 %(w/v)’該γ-聚麩胺酸之濃度為〇.5 %〜4 %(w/v)，且該1-(3_二曱氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺 鹽酸鹽之濃度為1.7 %〜2.5 %(w/v)時，該生物膠對細胞 不具毒性。 11、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中當該a型明 膠之濃度為6 %〜15 %(w/v)’該γ-聚麩胺酸之濃度為〇.5 %〜4 %(w/v)，且該1-(3-二曱氦基丙基)-3_乙基碳二亞胺 鹽酸鹽之濃度為1.7〜2.5 %(w/v)時，該生物膠不會引起 嚴重之體内發炎反應。 12、 如申請專利範圍第11項所述之生物膠，其中該生物膠 與軟組織間之黏附性(adhesion)係優於纖維蛋白膠(fibrin glue)。 13、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中該a型明膠 之濃度為%〇/v) ’且該γ-聚麩胺酸之濃度為2 % (w/v)，藉以增強該生物膠之結合強度。 14、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中當該a型明 膠之濃度為10 %(w/v)，該γ-聚麩胺酸之濃度為2 % (w/v)，且該1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 之濃度為〗·7 %〜2.5 %(w/v)時，該生物膠對細胞不具秦 性0 34 1343264 15、 如申請專利範圍第4項所述之生物膠，其中當該A型明 膠之濃度為10 %(w/v)，該γ_聚麩胺酸之濃度為2 % (w/v) ’且該1_(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 之濃度為1.7〜2.5 %(w/v)時，該生物膠不會引起嚴重之 體内發炎反應。 16、 一種生物膠，其係用以黏附軟組織，該生物膠係包含一 濃度為0.5 %〜4 %(w/v)且分子量至少為3〇〇kDa以上之 γ-聚麩胺酸(polyh-glutamic acid]，γ-PGA)、一濃度為 9 % 〜2〇 %(w/v)之B型明膠(b type gelatin)以及一有效量之 可鍵結B型明膠之胺基及γ-聚麩胺酸之羧基的交聯劑 (crosslinker)。 17、 如申清專利範圍第16項所述之生物膠，其中該交聯劑 係為1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-[3-dimethylaminopropyI]-3-eyhyl-carbodiimide hydrochloride) ° 18、 如申請專利範圍第17項所述之生物膠，其中該1-(3-二 曱氨基丙基)-3·乙基碳二亞胺鹽酸鹽之濃度係為1 % 〜2.5 %(w/v)。 19、 如申請專利範圍第16至18項任一項所述之生物朦，其 中該B型明膠之膠強度(bl〇om值)至少為225以上。 20、 如申請專利範圍第19項所述之生物膠，其中該B型明 膠之濃度為10 %〜15 %(w/v)，該γ-聚麩胺酸之分子量 係為880kDa.且濃度為2 %(w/v) ’藉以縮短形成該生物 膠時所需之凝膠時間。 35