TWI307697B - Peptide having antimicrobial and/or biosurfactant property - Google Patents

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1307697 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種小分子胜肽。具體而言，本發明係關於 一種具有抗微生物及/或生物界面活性特性之胜肤。 【先前技術】 具有抗微生物特性之小分子胜肽普遍存在於微生物、植物 與動物中，屬於内生型免疫系統中一環。抗微生物胜肽通常 是由帶正電荷胺基酸所組成之陽離子。 目前已發現抗微生物胜肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性 菌、真菌及原生動物都有破壞之能力。其抗微生物機制據信 可分為兩大類：胜肽脂質交互作用（peptide_lipid interaction); 及受體傳達辨識過程（Recept〇r-mediated recognition processes) ° 胜肽脂質交互作用機制可細分為筒狀穿鑿模式（barrd_stave mode)和地毯狀覆蓋模式（carpet m〇(je)。筒狀穿鑿模式以兩性 α-螺抗微生物胜肽捲成筒狀插入微生物之細胞膜内，利用抗 微生物胜肽疏水性端與微生物之細胞膜接觸，另一親水性端 面向中心點，以聚合體的方式在微生物之細胞膜上形成孔 洞，造成微生物體内外滲透壓不平衡，導致微生物體死亡。 地毯狀覆盍模式則是帶正電之抗微生物胜肽與帶負電之微生 物細胞膜結合後，利用親水性端與膜上之磷脂質或水分子反 應，經過抗微生物胜肽翻轉後使疏水性部分包圍部分微生物 之細胞膜進而破壞微生物之細胞膜結構，使得微生物死亡。 受體傳達辨識機制則與抗微生物胜肽和微生物之去氧核醣 116059.doc 1307697 核酸、自溶素（autolysins)和細胞通透能力有關，例如部分抗微 生物胜肽可抑制真菌孢子的萌芽及菌絲的延長與分枝；部分 抗微生物胜肽與原核生物核酸結合後，可抑制蛋白質的產 生’並因此達到抗微生物之效果。 由於部分抗微生物胜肽可經由胜肽脂質交互作用機制達到 抗微生物效果，故亦可作為一生物界面活性劑 (biosurfactant)，促進油脂與水分子之交互相溶。與對環境具 有毒性之化學界面活性劑相比，生物界面活性劑及生物乳化 劑（bloemuisifier)廣受重視’有取代化學界面活性劑、化學乳 化劑之趨勢。 界面活性劑的作用機制為吸著於兩相之界面，使其表面或 界面張力降低，當於水中達—定濃度時會形成集合體，而可 溶解於水巾。界面活,_分子兼具有絲性之油性基及具極 性之親水基，由此二基之平衡而表現界面活性。易言之，界 面活性劑可促進油脂溶於水中，以降低兩相間之表面或界面 張力。 生物界面活性劑為生物體所產生之一群異質界面活性化分 刀子可以降低液體溶液與碳氫化合物混合之表面張 力微勝粒臨界濃度、界面張力。在微膠粒產生過程中，可 以使洛液#由微乳化作用，使碳氫化合物溶於水中，或使水 办於蚊氫化合物中。其分子構造包括親水性之原子團，（例如 =基酸、胜類、陽料、陰離子、_、雙酿或㈣等）與親 月曰（疏水）’j±之原刊⑽、不齡或祕絲酸，或疏 水性^胜㈣）°目前已有文獻指出枯草桿® (如m I16059.doc 1307697 subtilis)、熱帶念珠菌（Candida tropicalis)、泡嚢短波單胞菌 (Brevibacterium 、水生產黃桿菌（尸 、綠膿桿菌aewgbosa)、榮光假單胞桿 菌(Pseudomonas fluorescens、、球擬酵母（Tbrw/o；?·^ bombicoia)、假絲酵母菌屬（Candida sp.)、紫錐菊（Echinacea ；7ΜΓ；7ΜΓ⑽）等生物可生產生物界面活性劑。其中綠膿桿菌產生 之鼠李糖脂質（rhamnolipid)及球擬酵母產生之槐醣脂 (sophorolipid)可清除底泥中之重金屬污染，並對革蘭氏陽性細 菌及某些腸内微生物具有殺菌作用；螢光假單胞桿菌利用其 正-烷類之長短鍵’使遭脂肪族及芳香族石油碳氫化物污染之 土壤乳化而降解；綠膿桿菌產生之肽糖脂（peptidoglycolipid) 可乳化原油及煤油’假絲酵母菌產生之糖脂（glyC〇lipid)具有降 低水面表面張力’減少煤油界面張力之效能；由紫錐菊萃取 得菊苣酸（cichoric acid)等十種酚酸可製成錠劑，作為界面活 性劑之用，此外’枯草桿菌產生之脂胜類（iturin)具有殺真菌 之功能。 墻酸泛醯疏基乙胺基轉移酶（phosphopantetheinyl transferase ’ PPTase)可將輔酶A上的4f-填酸泛醯巯基乙胺轉移 到載體蛋白（carrier protein，CP)保守的絲胺酸殘基側鏈羥基 上’使載體蛋白由無活性的脫輔基(apo_)形式轉變為活性全蛋 白（holo-)形式。活性載體蛋白負責醯基的轉移，在脂肪酸、聚 酮和非核糖體多胜肽等物質的合成過程中發揮重要作用。 PPTase分為「AcpS」型、「Sfp」型和「架構域」型，其修飾 載體蛋白的機製有三個模型假說^ PPTase已在聚酮和非核糖 116059.doc .-5 1307697 體多胜肽基因工程研究中得到初步應用，但未有其於抗微生 物胜肽及界面活性劑之應用。 基於抗微生物胜肽及界面活性劑之應用廣泛，開發新穎之 -， 抗微生物胜肽及界面活性劑為業界所需。 、 【發明内容】 發明概述 本發明之一目的在於提供一種具有抗微生物及/或生物界面 活性特性之sfp胜肽，其具有如序列辨識編號丨所示之序列或其 .功能性片段。 本發明之另一目的在於提供一種核酸分子，其係編碼如前 述Sfp胜肽，亦提供包含該核酸分子之載體及包含該核酸分子 或載體之轉型微生物。 本發明之再一目的在於提供一種製造前述sfp胜肽之方法， 其係培養可產出該sfp胜肽之微生物，並自微生物之培養基中 分離該Sfp胜肽。 • 本發明之又一目的在於提供前述sfp胜肽於抗微生物組合 物、醫藥組合物、食品組合物、化妝品組合物、農藥組合 物、防腐組合物、界面活性組合物、清潔組合物、乳化組合 物、濕潤組合物、分散組合物、溶解組合物、抗靜電組合 物、抗混濁組合物、潤滑組合物之應用。 發明詳細說明 本發明係關於一種新穎之sfp胜肽，其具有抗微生物與生物 舌眭特娃，可應用於有效殺死（抑制）微生物，減少病原菌，達 療目的，亦可分解油脂為小油滴，使其溶解，具有清 H6059.doc 1307697 潔、乳化易濕等特性，達到清潔之目的。 上述sfp胜肽，具有如序列辨識編號1所示之序列或其功能性 片段。 本文中所言之「功能性片段」乙詞係指具有序列辨識編號1 所示之部分序列之胜肽，但仍具有抗菌及生物界面活性特 性。 根據本發明之sfp胜肽，係由枯草桿菌中分離而得，經測定 序列並與已知抗微生物胜肽之序列比對後，得知其係為一新 穎之蛋白質，屬於sfp磷酸泛醯毓基乙胺基轉移酶 (phosphopantetheinyl transferase)家族，該家族包含已知之抗 微生物之表面素（surfactin)，但其序列與根據本發明之sfp並不 相同，係為一新穎之蛋白質。 根據本發明之sfp胜肽，較佳係為一脂胜肽（lipopeptide)。胜 肽之脂化係為一後轉譯修飾（post-translation modification)作 用，於胺基酸上加入碳氫鏈，以脂化胜肽，較佳地，其係加 入12或13碳數之碳氫鏈，並與胺基酸形成環狀鏈。 根據本發明之sfp胜肽可為經純化之形式或未經純化之形 式；較佳地，該sfp胜肽係存於產出微生物之培養基中。該產 出微生物可為本身即具有編碼根據本發明sfp胜肽之微生物， 或係經轉型可產出根據本發明sfp胜肽之微生物。於本發明之 一較佳具體實施例中，該產出微生物係選自由桿菌屬⑽ 叹）、大腸桿菌co/i·)、酵母菌、熱帶念珠菌 (Candida tropicalis)、也棄妓也翠也崔（Brevibacterium casef)、 水生產黃桿菌、綠膿桿菌 116059.doc -9- 1307697 (p⑽而卿麵敵《細細）及螢光假單胞桿菌（p⑽而⑽_ //⑽所組成之群；更佳地；該桿菌屬係為枯草桿菌、 解澱粉芽孢桿菌（5· am少/(?%we/aci•⑶〇或環狀芽孢桿菌（反 *' cz_rCM/iW);尤佳地，該枯草桿菌係為土壤括草桿菌。 本發明之另一目的在於提供一種核酸分子，其係編碼如前 述之sfp胜肽；較佳地，該核酸分子具有如序列辨識編號2所示 之序列。 根據本發明之核酸分子可用以生產根據本發明之sfp胜肽， 並較佳地，該核酸分子係位於一載體中。該載體可用於保 存、生產該核酸分子，或用於將該核酸分子導入一宿主中。 較佳地，該載體包含可選擇之標記，該載體較佳亦包含可於 原核生物中複製之起始點（origin)及可用於基因操作之限制酵 素位置’·較佳地，根據本發明之核酸分子係受一啟動子控 制。在本發明之一具體實施例中，該啟動子為可誘導之啟動 子。 • 纟發明亦提供一轉型微生物，其包含根據本發明之核酸分 子或包含該核酸分子之載體。 本文中所使用之「轉型」一詞係指經由一核酸分子之導 入，而改變一細胞中之遺傳物質。本發明所屬技術領域中具 -通常知識者經由本發明之揭示及一般分子生物學之知識可完 成此轉型作用，如將載體導入一細菌時可採用熱休克或電穿 孔方式。 板據本發明之sfp胜肽可由其天然生物来源中萃取、經萃取 轉型微生物之培養基，或化學合成而得。於本發明之—具體 H6059.doc -10- 1307697 實施例巾，生產根據本發明sfp胜肽之方法，係培養可產出該 吻胜肽之微生物，並自產出微生物之培養基中分離該胜 肽。 、 1 交佳地，生產根據本發明兩胜肽之方法係培養經可編碼如 ” 彳列辨識編號1所示之序列或其功能性諸之核酸分子轉型之 產出微生物。 以大腸桿菌為例，選定載體及載體中適當的限制酶切位， 藝 以該限制酶剪切該載體’亦以該限制酶剪切含有可編碼本發 明之Sfp胜肽的核苦酸序列之核酸分子，將前述經限制酶剪切 後的載體及核酸分子進行接合反應。接著將含有可編碼本發 明之Sfp胜肽的核芽酸序列之載體轉型入大腸桿菌體中，轉型 可用電穿孔或熱休克等技術進行，轉型後以誘導物誘導大腸 桿菌表現本發明之sfp胜肽。 以酵母菌為例，選定載體及載體中適當的限制酶切位，以 該限制酶煎切該載體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發明 • 之sfp胜狀的核芽酸序列之核酸分子’將前述經限制酶剪切後 的載體及核酸分子進行接合反應。接著將含有可編碼本發明 之Sfp胜肽的核苦酸序列之載體轉型入酵母菌中，轉型技術例 如可先去除酵母菌的細胞壁，使酵母菌形成原生質球狀體 (spheroplast)再進行轉型，或是用鹼性陰離子（如^口或

RbCl)加上熱休克進行，轉形後用誘導物誘導酵母菌表現根 據本發明之sfp胜肽。 ，據本發明之方法可經由調整該sfp胜肽之培養條件以增加 產量’例如採用新培養基配方並檢測該產出微生物體内根據 116059.doc 1307697 本發明sfp胜肽的表現量。 於本發明之具體實施例中，不同培養基與鹽類所獲得生長 曲線不同；較佳地，該培養基包含二價陽離子或活性碳，菌 、數隨培養時間增加而增加；另-方面，可添加馬鈴薯、玉米 -Μ或甘藷等基貝於培養基中，添加發泡劑亦可增加胜肽產 ^;於培養溫度上，較佳料听至48。€;溶氧條件較佳為 前48小時之溶氧維持於30%和後48小時為6〇%。 • 根據本發明之sfp胜肽之表現可以蛋白質（例如膠體電泳、西 方墨點法、免疫反應）或恤财(例如北方墨點法)之檢測方法檢 視。 本發明提供一種抗微生物組合物，其包含上述sfp胜肽。 根據本發明之sfp胜肽，具有抗微生物之效果；由帶正電荷 的胺基酸組成’可依胜肽脂質交互作用機制，與微生物細胞 膜（鱗脂質）作用’進而產生孔洞達到殺菌之目的。根據本發明 之sfp胜肽可殺死革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原生 Φ 動物、具外套膜之病毒與腫瘤細胞。於本發明之具體實施例 中’根據本發明之sfp胜肽可殺死大腸桿菌（五c〇/z·)、哈威氏弧 菌（Κ Αβπ^ϊ·)、溶澡弧菌（K α/gi⑽/少说⑽）、鰻弧菌（K 、鮭弧菌（Κ ·ϊα/_ηί·(：ζ_ί/α)、產氣單胞菌 〇4· - 知办叩/π7ύ〇、表皮葡萄球菌（& 、虹彩病毒 (TWi/oWrwi·)、單純皰療病毒（Herpes simplex virus)、第一型豬 皰療病毒（suid herpes virus-1)、水性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus)及猴免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus)。 116059.doc -12- 1307697 本：明、供一種醫藥組合物’其包含上述啷胜 地，其另包含一醫藥上可接受之載體。於本發明之—較佳且 體實施例中’該醫藥組合物另包含一濕潤劑或賦形劑。-根據本發明之醫藥組合物可視需要以各式路徑投與需 之動物體。較佳地，該醫藥組合物係為一口服組合物或針， 組合物’其中該針劑組合物較佳為一靜脈針劑組合物。"

本發明亦關於如上述sfp胜肽之用途，其係用以製備抗微生 物。其中該微生物較佳係選自由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性 菌、真菌、原生動物與具外套膜之病毒所組成之群；尤佳 地，該微生物係選自由大腸桿菌、哈威氏弧菌、溶澡弧菌、 鰻弧菌、鮭弧菌、產氣單胞菌、表皮葡萄球菌、虹彩病毒、 單純皰疹病毒、第一型豬皰疹病毒、水性口炎病毒及猴免疫 缺陷病毒所組成之群。80%的病毒具有由「包膜」和「表面醣 蛋白穗」所組成之脂質外套膜，可便於感染宿主。根據本發

明之胜肽可破壞病毒脂質外套膜，使其無法附著並入侵宿主 細胞（動物、植物、細菌）。 根據本發明之Sfp胜肽具有生物界面活性之特性，並具有清 潔、乳化或濕潤之效果。根據本發明之sfp胜肽可分解油脂為 小油滴，使其溶解於水中，以達清潔之目的。 視需要，根據本發明之組合物可以各式劑型而存在，例如 溶液（solution)、凝膠（gel)、乳膠（emugel)、乳劑（cream)、油膏 (ointment)、乳液（lotion)、皮膚導入系統（transdermal system)、注射液(injection fluid)、懸浮液（suspension)或貼劑 (patch)。 116059.doc -13- 1307697 因此’根據本發明之sfp胜肽可應用於食品組合物、化妝品 組合物、農藥組合物、防腐組合物、界面活性組合物、清潔 組合物、乳化組合物、濕潤組合物、分散組合物、溶解組合 物、抗靜電組合物、抗混濁組合物、潤滑組合物中。 茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅 侷限於此等實例所揭示之内容。 【實施方式】 實例一：具抗菌及生物界面活性特性之sfp胜肽製備 從枯草桿菌取得總RNA，並合成CDNA，所使用為包含1 OjLtg 之總RNA、200U Molony鼠類血癌病毒反轉錄酶（Molony murine leukemia virus reverse transcriptase) ' ImM dNTP ' 160U RNase抑制劑（inhibitor)及 1.6|Ug隨機引子（random primer) 的IX反轉錄緩衝液，並在42。(3進行轉錄30分鐘。接著以聚合 酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增sfp基因，其 條件為包含20/xg反轉錄產物、〇.5u Taq DNA聚合酶、1/xg正向 引子與反向引子的80μΐ lx PCR緩衝液。所使用之擴增程式為 94°C1分鐘、55°C1分鐘3〇秒、72〇cl分鐘3〇秒，共35個循環。 經純化的PCR產物選殖入Mi3mpl8或pBluescript質體的Sma I位置，並經定序，得到如序列辨識編號2所示的序列，其序列 分析示於圖1。 另一方面’將純化的PCR產物選殖入pMK4表現載體中。 PMK4載體以fenC啟動子調控下游sfp基因表現。將接合反應後 所得含肴PCR產物的聖至表現宿主大腸桿菌厕3或括 草桿菌 168 中，在 、，ιλλ .-a μ. 十 l下以200rpm振盪培養0 116059.doc -14- 1307697 經8000xgl0分鐘離心去除菌體，所得上清液經0.2mm(；30kDa MWCO)超過濾膜過濾後，並獲得具生物界面活性特性之微脂 粒（micelles)，再以50%(V/V)甲醇破碎與收集。經HPLC分析 (Techsphere 5mm ODS C18(Merck，German)逆轉相管柱，管柱 溫度維持在30°C，移動相為3.8 mM三氟乙酸：乙睛 (trifluoracetic acid:acetonitrile)(l:4，v/v)，流速0.5ml/min，波 長210nm，樣本量為20 μΐ。標準品購自（Sigma, USA)，其結果 示於圖2 ’得知枯草桿菌168與pKM4載體所表現之sfp胜肽分子 量約為l.lkDa。 經轉型及未轉型之枯草桿菌抑菌效果示於圖3。 實例二：抗菌效果 以超過濾法所分離出sfp胜肽，純度經由高效能液相層析測 試後純度為90%以上。利用此Sfp胜肽進行最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration ; MIC )和最小殺菌濃度 (minimum bactericidal concentration ; MBC )測試0 菌液的製備 將大腸桿菌、哈威氏弧菌、溶澡弧菌、鰻弧菌、鮭弧菌、 產氣單胞菌、表皮葡萄球菌，將此七株菌株培養於LBA(大腸 桿菌DH5o〇或TSA(+1.5%NaCl)上，經過16小時37°C培養後， 刮下菌落溶於指定培養基。使〇D540為1時（濃度約為lxlO9菌 數），取500/xL菌液加入500pL的LB或TSB( + 1.5%NaCl)使菌液 濃度 lx104'5/c.c.菌數。 敏感性試驗(Susceptibility test) 使用96孔培養皿在每個孔中加入的菌液，菌液濃度為 £ 116059.doc -15- 1307697 1χι〇 /c.c.菌數，在加入20j[iL不同濃度的枯草桿菌之8印胜 肽。以37°C培養16小時，觀察沒有生長呈現澄清的菌液之最 低sfp肽濃度，為最小抑菌濃度。再將呈現澄清的菌液的組別 取凡全菌液塗抹在培養於LBA或TSA上，經過16小時37。。培養 後，觀察菌落則得知最小殺菌濃度。每個實驗組各有三重複 及對照組。 利用枯草桿菌之sfp胜肽，以不同濃度（〇 〇7恥μ_〇·67^μ)測 試大腸桿菌、哈威氏弧菌、溶澡弧菌、鰻弧菌、鮭弧菌、產 氣單胞菌、表皮葡萄球菌測試其最小抑菌濃度及最小殺菌濃 度。其結果示於表1。 表1 :

------- 最小抑菌濃度(jtiM) 格蘭氏陰性 最小殺菌濃度(μΜ) ---—----- 產氣單胞菌 37.5 67.5 鰻弧菌 15 45 鮭弧菌 15 30 哈威氏弧菌 15 22.5 溶澡弧菌 15 37.5 大腸桿菌 7.5 15 格蘭氏陽性 表皮葡萄球菌 7.5 52.5 本sfp胜肽可殺死格蘭氏陽性菌與格蘭氏陰性菌。憑此推論 可知’本sfp胜肽對不同微生物均有殺菌與抑菌效果。 -16- 116059.doc 1307697 實例三：Sfp胜肽之生產 本Λ例中利用不同之培養條件測試根據本發明胜肽之適宜 生產條件。 ·' 培養基 一 所使用之Ε培養基包含20 g/L之L-榖胺酸、12 g/L之檸檬

酸、80 g/L之甘油、7 g/L之NH4C1、〇·5心之尺出⑽、〇 5 g/L 之MgS04、0.04 g/L之Feci3.6H20、0.15 g/L之CaCl2.2H20及0.1 g/L之M11SO4.H2O，pH=6.5。 所使用之F培養基包含65 g/L之L-榖胺酸、22 g/L之檸檬 酸、Π0 g/L 之甘油、7 g/L 之 ΝΗ4α、〇 5 g/LiK2Hp〇4、〇 5 g/L 之 MgS04、〇.〇4 g/L 之 FeCl3.6H2〇 及 〇 15 g/L 之

CaCl2-2H20，pH=6_5 〇 一併使用LB培養基。 囷生長結果示於圖4,可知利用不同培養基與鹽類所獲得生 長曲線不同’其中以E培養基生長條件最佳，菌數隨培養時間 • 增加而增加；LB培養基則在24小時後菌數開始遞減；而F培養 基生長條件較差，菌生長緩慢。 本實施例一併探討利用農作物等非傳統碳源添加於培養基 中，其結果顯示添加8%馬鈴薯、12%玉米澱粉和16%甘藷等基 質，可得最高sfp胜肽產量分別達18〇 mg/L、1715 mg/I^a22〇〇 mg/L;使用試藥級基質8%玉米澱粉，sfp胜肽產量可達22〇5 mg/L。 培養溫度 使用枯草桿菌培養基如下· 5_〇 g/L消化蛋白質、3〇 Μ小 116059-doc -17- 1307697 麥萃取物、10 mg 之 MgS〇4、FeS04、ZnS04 及]vinS〇4， pH=7.5。分別測試45°C與37°C之培養溫度，其結果示於圖5， 可知45°C為較佳之培養溫度。 谷氧t调控 於培養時調整不同之溶氧條件，以獲得較佳之生產條件， 其結果顯示，最佳溶氧調控策略為前48小時之溶氧維持於3〇〇/0 和後48小時為60%，sfp胜肽之生產可達2730 mg/L。 醱酵製程放大 醱酵sfp胜肽之生產製程，可經由搖瓶放大至5L及20L醱酵 槽’其產量分別達3 g/L及4 g/L，可知醱酵製程在不同規模大 小之醱酵槽具有極佳之穩定性。 去泡沫劑及發泡劑之添加 添加去泡沫劑可減少sfp胜肽生產時間，且去泡沫劑不會干 擾以酸沈澱過程中sfp胜肽回收率。未添加去泡沫劑時48小時 之產量為0.9 g/L，經添加去泡沫劑可縮短生產時間至12至24 小時，產量為0.6 g/L ;但另一方面，添加發泡劑可增加胜肽 產量。 實例四：sfp胜肽之純化 上述枯草桿菌醱酵液中之粗脂胜肽係以甲醇萃取經6Mol/L HC1沈殿之沈澱物。粗萃取液可使用Sephadex LH-20管桎進行 膠質過遽（gel filtration)純化。 枯草桿菌醱酵液亦可使用30kDa MWC0膜超過濾，可獲得 生物界面活性齊]微脂粒（micelles)，再以50%(V/V)甲醇破碎與 收集，此法獲得sfp胜肽回收率大約為95%。

- B*V 116059.doc 1307697 實例五：sfp胜肽之抗病毒效果 本實例以石斑魚的鰭部組織取得的細胞作成Fin細胞株，並 以此細胞株作為培養病毒的寄主細胞。 細胞培養 將Fm細胞培養於L-15培養基中（含10%血清），據觀察，Fin 的生長速度約2至3天即達單層佈滿，並進行繼代培養。 或染病毒 細胞經繼代培養後，倒掉細胞之培養基，以PBS清洗後，接 種細胞於96孔培養盤，每孔具有5><104細胞數。 加入病毒液，並搖晃一小時，再加入不含血清之新鮮培養 基，觀察細胞型態的改變。 病毒力價測定 待細胞貼勻，以TCID50的方法，分別用10—1至1(T1G序列稀釋 之不同濃度的病毒液感染Fin細胞（每個濃度八重複），觀察第3 至7天，計算病毒的力價（PFU/ml)，並利用過濾細胞碎片及重 複TCID5〇，使力價達10_8以上。 病毒增殖放大 以Fin為寄主細胞，將M.O.I=0.1至0.01(PFU/細胞）的病毒感 染細胞，當細胞病變達九成以上時將細胞冷凍（-80°C)解凍 (25°C)反覆三次以打破細胞，使病毒釋出，接著收取病毒液。 病毒純化 離心收集（8000rpm，4°C，10分鐘）病毒液，取上清液加入 2.2%NaCl及7%PEG6000反應2至4小時。經離心lOKrpm， 4DC，1小時收集網狀結構及病毒，並以TNE緩衝液將碎片溶 116059.doc -19- 1307697 出。再以超高速氯化铯濃度梯度離心（35Krpm，4°C，17小時） 分層。取浮力密度在1.15至1.35 g/cm3的帶區域，並將病毒溶 於50mM Tris-HCl緩衝液，pH8.0，存於-70。(：。 添加根據本發明之s fp胜肽12 0 μ m可在15分鐘降低水產虹彩 病毒的力價>4.4 loglO CCID50/ml。顯示sfp胜肢不活化具外套 膜之水產虹彩病毒。 實例六：sfp胜肽抑制生物膜之生成 本實例測試根據本發明之sfp胜肽抑制沙門氏桿菌 ewierica)於PVC材質形成生物膜之效果。 每個PVC管先塗敷上不同量之sfp胜肽後，加入沙門氏桿菌 於30°C經隔夜培養。每個PVC經潤濕後以結晶紫染色，其結 果示於圖6，可知生物膜都集中在空氣與液體之介面處（箭頭 所指示處）。 上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本 發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍 不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專 利範圍所列。 【圖式簡單說明】 圖1為根據本發明之sfp胜肽基因全長之cDNA序列，共1177 核苷酸組成，包含148個核苷酸所組成的5'端未轉譯區（5’ UTR)、438核苷酸所組成的轉譯區域及591核苷酸所組成的3' 端未轉譯區域（3 ’UTR)。起始密碼以粗體表示，終止密碼以星 號表示。轉譯區域推測可以轉譯成145胺基酸。 圖2為枯草桿菌發酵液HPLC分析結果圖。 116059.doc • 20-

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圖3為經轉型之枯草桿菌抑菌圈結果圖。 圖4為各種培養基中枯草桿菌生長曲線圖。 圖5為不同培養溫度下枯草桿菌生長曲線圖。 圖6為根據本發明之胜肽抑制由沙門氏桿菌所生成之生物膜 形成結果圖。 V Η 116059.doc -21 - 1307697 序列表 <11 〇>優茂國際股份有限公司 < 120>具抗微生物及/或生物界面活性特性之胜肽 <130> 無 <160> 2 < 170> Patentln version 3.2

<210> 1 <211> 145 <212> PRT <213>枯草桿菌 <400> 1

Met Ser Phe lie Ala Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys Arg Arg Phe Tyr 15 10 15

His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Gly Val Leu Val Arg 20 25 30

Ser Val lie Ser Arg Gin Tyr Gin Leu Asp Lys Ser Asp lie Arg Phe 35 40 45

Ser Thr Gin Glu Tyr Gly Lys Pro Cys lie Pro Asp Leu Pro Αφ Ala 50 55 60

His Phe Asn lie Ser His Ser Gly Arg Trp Val lie Cys Ala Phe Asp 65 70 75 80

Ser Gin Pro lie Gly lie Asp lie Glu Lys Thr Lys Pro lie Ser Leu 85 90 95 116059.doc 1307697

Glu lie Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr Ser Asp Leu Leu 100 105 110

Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gin Thr Asp Tyr Phe Tyr His Leu Trp Ser 115 120 125

Met Lys Glu Ser Phe lie Lys Gin Gly Arg Gin Arg Leu lie Ala Ser 130 135 140

Ala 145 • <210> 2 <211> 1177 <212〉DNA <213> 枯草桿菌 <400> 2 ggtaatacga ctcactatag ggcgaattga atttagcggc cgcgaattcg cccttttatt tagagatttt gcagacggag gatctagaat gaagatttac ggaatttata tggaccgccc

gctttcacag gaagaaaatg aacggttcat gtctttcata gcacctgaaa aacgggagaa atgccggaga ttttatcata aagaagatgc tcaccgcacc ctgctgggag gtgtgctcgt tcgctcagtc ataagcaggc agtatcagtt ggacaaatcc gatatccgct ttagcacgca ggaatacggg aagccgtgca tccctgatct tcccgacgct catttcaaca tttctcactc cggacgctgg gtcatttgcg cgtttgattc acagccgatc ggcatagata tcgaaaaaac gaaaccgatc agccttgaga tcgccaagcg cttcttttca aaaacagagt acagcgacct tttagcaaaa gacaaggacg agcagacaga ctatttttat catctatggt caatgaaaga aagctttatc aaacaaggaa ggcaaaggct tatcgcttcc gcttgattcc ttttcagtgc gcctgcacca ggacggacaa gtatccattg agcttccgga cagccattcc ccatgctata 116059.doc -2- 1307697 tcaaaacgta tgaggtcgat cccggctaca aaatggctgt atgcgccgca caccctgatt 720 tccccgagga tatcacaatg gtctcgtacg aagagctttt ataaatggct catcaacagc 780 ttgacaccgc gctcaatatc ttccgttttc acattggaaa tattgatttt taatagattt 840 tctttctgat aatctgataa ataatgacgg tctatcgcct caaggatcac cccttgtttt 900 ttcagcctat gaattactct tgaggcgggc agatcctgag gaagcaccag atgggtgtgc 960 atacagggtg cctgcccgct ggagaacgta aagcggccgc ttcccagctg cctgtgtgtt 1020 tgatggcttg atgtagcctc agcgaccgct cttatagatc tctgattttc tcctatgcct 1080

gcgtacatac gcttttcagt aaatctcatg cgctgagaat catcgacttt gacataggcg 1140 attcgtttaa acctgcagga ctagtccctt tattgaa 1177

116059.doc v. ^

Claims (1)

1307697 十、申請專利範圍： 1. 一種胜肽，其具有如序列辨識編號1所示之序列。 2. 如請求項1之胜肽，其係為一脂胜肽。 3. 如請求項1之胜肽，其係存於產出微生物之培養基中。 4·如請求項3之胜肽，其中該產出微生物係選自由桿菌屬 (忍沉印）、大腸桿菌co/ϊ·)、酵母菌、熱帶念 珠菌（Candida tropicalis)、泡囊短波單胞菌（Brevibactefium 鲁 、水生產黃桿菌叫、綠膿桿菌 及螢光假單胞桿菌（^⑽而所⑽似 euorescens)所組成之群。 5. 如請求項4之胜肽’其中該桿菌屬係為枯草桿菌（eaci//M>s subtilis)。 6. 如請求項5之胜肽，其中該枯草桿菌係為土壤枯草桿菌。 7. 如請求項4之胜肽，其中該桿菌屬係為解澱粉芽孢桿菌（5_ amyloliquefaciens') 0 # 8·如請求項4之胜肽，其中該桿菌屬係為環狀芽孢桿菌（5. circulans)。 9. 一種核酸分子，其係編碼如請求項1之胜肽。 10. 如請求項9之核酸分子，其具有如序列辨識編號2所示之序 列。 11. 一種載體，其包含如請求項9或1〇之核酸分子。 12. —種轉型微生物，其包含如請求項9或10之核酸分子。 13. —種轉型微生物，其包含如請求項11之載體。 116059(971110 修正)-doc 1307697 公告本 9# if.夢)正· 14. 一種製造如請求項1或2之胜肽之方法，其係培養含係編碼具 有如序列辨識編號1所示之序列之核酸分子之產出微生物， 並自產出微生物之培養基中分離該胜肽。 15. 如請求項14之方法，其係培養經編碼如序列辨識編號1所示 之序列之核酸分子轉型之產出微生物。 16. 如請求項14之方法，其中該產出微生物係選自由桿菌屬、大 腸桿菌、酵母菌、熱帶念珠菌、泡囊短波單胞菌、水生產黃 • 桿菌、綠膿桿菌及螢光假單胞桿菌所組成之群。 17. 如請求項16之方法，其中該桿菌屬係為枯草桿菌。 18_如請求項17之方法，其中該枯草桿菌係為土壤枯草桿菌。 19. 如請求項16之方法，其中該桿菌屬係為解澱粉芽孢桿菌。 20. 如請求項16之方法，其中該桿菌屬係為環狀芽孢桿菌。 21. 如請求項14之方法，其中該培養基包含二價陽離子。 22. 如請求項14之方法，其中該培養基包含馬鈐薯、玉米澱粉和 或甘藷基質。 • 23.如請求項14之方法，其中該培養基包含發泡劑。 24. 如請求項14之方法，其中該培養基包含活性碳。 25. 如請求項14之方法，其中培養溫度為42°C至48°C。 26. 如請求項14之方法，其中培養前48小時之溶氧為30%及後48 小時為60%。 27. —種抗微生物組合物，其包含如請求項1至8任何一項之胜 肽。 28. 如請求項27之組合物，其中該微生物係選自由抗革蘭氏陽性 116059(971110 修正).doc 1307697 公告本 年J ig修(更)正替 菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原生動物與具外套膜之病毒所組 成之群。 29. 如請求項27之組合物，其中該微生物係選自由大腸桿菌、哈 威氏弧菌（K /zarve_y/)、溶澡弧菌（K 、緩弧菌 (K a«gM///arww)、鞋:弧菌（K 似/«7〇則’£^·^)、產氣單胞菌（J. /z_yi/rop/n7a)、表皮葡萄球菌（*S. epidermidis)反 L··彩病毒· 單純皰殄病毒（Herpes simplex virus)、第一型 豬皰療病毒（suid herpes virus-1)、水性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus)及猴免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus)所組成之群。 30. 如請求項27之組合物，其中該組合物係一醫藥組合物。 31. 如請求項30之組合物，另包含一醫藥上可接受之載體。 32. 如請求項30之組合物，其係為一 口服組合物。 33. 如請求項30之組合物，其係為一針劑組合物。 34. 如請求項33之組合物，其中該針劑組合物係為一靜脈針劑組 合物。 35. 如請求項27之組合物，其係一食品組合物。 36. 如請求項27之組合物，其係一化妝品組合物。 37. 如請求項27之組合物，其係一農藥組合物。 38. 如請求項27之組合物，其係一防腐組合物。 3 9. —種界面活性組合物，其包含如請求項1至8任何一項之胜 肽。 40.如請求項39之組合物，其係一清潔組合物。 116059(971110 修正).doc * 1307697 公告本I 丨9孑，-ί!)修⑻正识 41. 如請求項39之組合物，其係一乳化組合物。 42. 如請求項39之組合物，其係一濕潤組合物。 43. 如請求項39之組合物，其係一分散組合物。 44. 如請求項39之組合物，其係一溶解組合物。 45. 如請求項39之組合物，其係一抗靜電組合物。 46. 如請求項39之組合物，其係一抗混濁組合物。 47. 如請求項39之組合物，其係一潤滑組合物。 φ 48. —種如請求項1至8任何一項之胜肽之用途，其係用以製備抗 微生物之藥物。 49. 如請求項48之用途，其中該微生物係選自由革蘭氏陽性菌、 革蘭氏陰性菌、真菌、原生動物與具外套膜之病毒所組成之 群。 50. 如請求項49之用途，其中該微生物係選自由大腸桿菌、哈威 氏孤菌、溶澡弧菌、缓弧菌、鞋孤菌、產氣單胞菌、表皮葡 萄球菌、虹彩病毒、單純皰齋病毒、第一型豬皰療病毒、水 • 性口炎病毒及猴免疫缺陷病毒所組成之群。 51. —種如請求項1至8任何一項之胜肽之用途，其係作為界面活 性組合物。 52. —種如請求項1至8任何一項之胜肽之用途，其係用以製備界 面活性組合物。 116059(971110 修正).doc -4-