TWI306897B - - Google Patents

Description

1306897 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係屬於一種水生動物的細胞低溫保存方法，尤 指一種水生動物的配子細胞低溫保存方法。 【先前技術】

低溫生物學（Cryobiology)為探討生物系統於低溫狀態 下之反應與變化之基礎科學，由於此領域與農學、醫學與 食品工業等方面無論在學理與應用上，均有密切之關係。 近年來，由於生物技術與儀器量測技術之不斷開發，低溫 生物學的研究發展更«勃。現今冷^子及胚胎已經Z 功應用在人、畜上。而水產生物的精子保存也頗有成效。 可以使不同生殖期或 個體传以交配、反交、 冷凍配子具有超越時空的功效， 地理間隔的品系得以交配；性轉換的 雜交’並可進行種的純化和培育’使得優良品系得以保存 這些在育種上都極為重要。此外，冷㈣存技術不僅能應 用在基因庫的建立’且也能使得特有種及㈣滅絕的野生 種得以保存。 近幾年來’冷;東保存的技術己經有快速的發展，緩慢 的冷凍步驟己經慢慢的被簡化， 紐，快速冷凍的方法逐漸被發展 水產生物的配子均己冷凍保存成 同時冷凍時間也相對的縮 出來’國内有多種經濟性 功並能實際應用。 卵及胚胎 目前冷凍保存技術應用於水產生物的精子 1306897 大都使用以下幾種方式： 1. 液態氮蒸氣法或乾冰法：此方法是以液態氮蒸氣或 乾冰來冷凍細胞，將所保存的細胞依不同比例的稀釋液、 抗凍劑濃度混合並填充至麥管，置於液態氮液面一定的高 度或直接於置於乾冰上，配合不同的平衡時間進行冷凍保 存，方式簡便，所需時間及設備較少，適合於田間應用。 但此種方式若是在船上作業進行冷凍保種時，因船隻搖 晃，造成液態氮液面無法與麥管控制在一定的高度，故精 子的存活率及活力不高。 2. 可程式冷凍儀：可程式冷凍儀是一種可調整冷凍程 式的儀器，冷凍儀主機可由電腦控制相關程式，例如溫度 升降速率的控制、冷凍停留時間及溫度的設定等，並逐步 的找出最適合的停留時間及停留溫度。在冷象過程中細胞 的存活率與冷;東速率是相關的，4 了取得細胞經冷;東的最 佳存活率，㉟常細蚊冷康必需在一個it當的冷束速率下 進行，不同細胞由於滲透壓特性完全不同，所以最佳冷凍 方式亦不相同。此方式有助於細胞冷凍保存程序中最佳冷 康速率及時間的判斷。但是，此方法對於在船上作業的研 究者來說是不適用的。船上作業應以簡便為好，但此儀器 裝備繁多’造成研究上的不便。再者使用緩慢降溫的方式， 將細胞從預冷溫度降至零下某一溫度，在該溫度停留一段 l3〇6897 中保存，故冷凍保存 時間後’再急速地將細胞放入液態氮 耗費的時間相當長。 上述的冷束保存方式已普遍的運用於畜產界及水產 界。然’各冷康方法應用於田間試驗時，存在前述缺點， 因此’既有的細胞低溫保存方法不適於田間試驗使用而仍 有不足之處，有待進一步改良。 【發明内容】 本發明係相關於一種細胞低溫保存方法’由於既有之 細胞低溫保存方法若要應用於田間試驗，例如出海捕捉對 象魚（鮪魚、經魚等）’並進行人工繁瘦，仍有其限制， 因此當使用本發明水生動物的低溫保存方法可更簡便的於 田間試驗時進行。 本發明之方法，可配合不同的抗凍劑、醣類及平衡時 間來冷康保存細胞。 本發明係相關於一種水生動物的細胞低溫保存方法， 其係包含： 提供欲低溫保存的水生動物細胞； 將該水生動物細胞以抗凍劑與醣類加以處理，其中水 生動物細胞以抗凍劑與醣類處理時間約1至40分鐘； 將處理後的水生動物細胞連同抗康劑與稀釋液於PE 盤中形成小滴；及 將液態氮加入PE盤中使其與小滴接觸。 1306897 較佳地，抗凍劑之種類係一種選自包含由二甲基亞硼 (Dimethyl sulfoxid ; DMS0)、聚乙二醇（Polyethylene glycol ; PEG)、甘油（Glycerol ; GLY)、乙二醇（Ethylene glycol ; EG)、甲醇（Methanol ; METH )及二甲基乙醯胺 (Dimethylacetamide; DMA)所組成之族群中。 更佳地，抗凍劑濃度為2. 5至22_ 5% ( V/V)。 更佳地’抗凍劑為DMS0。

最佳地’ DMS0的濃度為5%(V/V)或10%(V/V)。 較佳地，醣類係一種或一種以上選自包含由葡萄糖、 Μ糖、果糖及PEG所組成之族群中。 更佳地’醣類濃度為2.5至15% (V/V)。 更佳地，醣類係為葡萄糖與蔗糖之組合或果糖與蔗糖 之組合。 最佳地，葡萄糖與蔗糖之組合濃度為5%(葡萄糖與蔗 糖）（v/v)或果糖與蔗糖之組合濃度為5%(果糖與蔗 糖）（v/v)。 較佳地，細胞置入抗凍劑與醣類之組合中處理約5至 25分鐘。 較佳地’水生動物係為魚類、軟體類、貝類、甲殼類、 兩棲類或攸蟲類。 更佳地’水生動物係為魚類。 也’水生動物細胞係選自包含由動物細胞、胚胎 及配子所組成之族群中。 更佳地，細胞為配子。 1306897 最佳地，細胞為精子。 藉由本發明可使細胞以快速、簡易的方法完成冷來， 並可簡易地於田間試驗中操作。更進一步，由於本發明利 用PE盤的特性，使含有細胞的抗凍劑與醣類之組合可於 盤上形成小滴，使小滴與液態氣接觸並進行冷束。藉由PE 盤形成細胞小滴後並以液態氮處理，具有下列之優點：（i) 可同時且大量形成小滴，而後使所有小滴幾乎可於同—甚 短時間範圍内接觸液態氮；（2)PE盤具有可盛裝液態氮之 功能’可直接作為盛裝容器而不需另外預備其他容器，因 此小滴經冷凍後可直接自PE盤中取出儲存於冷凍管中， 操作更為便利。 表 T、上所述，本發明之水生動物的細胞低溫保存方法， 其利用不同的抗凍劑與醣類組合，並針對水生動物細胞提 供不同抗凍劑與醣類的處理濃度，更進一步藉由PE盤的 特性以達到簡易且大量處理小滴的㈣，因而本發明之方 法具有更適於田間試驗使用的優點。 【實施方式】 本發明水生動物的細胞低溫保存方法，其原理是以極 快的降溫速率來冷P爽彳早在彡 曰％ ㈣存細胞’在這個條件下，細胞内冰 日曰雖然可成形，但是4古g热 H α 有足夠的時間使它變成大冰晶，或 者最後溶液可能變成玻璃化 ^^ 的匱形，所以，細胞能夠冷凍 保存成功。此方法所花費 買的時間紐，是—種相當有效率的 1306897 tn:式。本發明細胞低溫保存方法操作簡便且成效 ^也可解決目前船上作業的困難及缺點。 冷柬過程中水的變化最為重要，冷柬生物學即是研究 生物體内的水轉變為固體結晶冰的過程，及在低溫下以^ 換’谷劑而阻止冰晶形成之學問。以下就冷康過程中各因素 加以描述探討： 、 1.水的功能

冷束的過程中水的變化是最重要的，水在生物體内扮 廣著很重要的角色，在細胞内含量最多的物質通常佔70%， 疋細胞内最好的溶劑。水參與細胞内代謝的各種化學反 應’它對生物的生理機能非常重要；在生化反應上提供氯 離子及調節pH值，協助調節體溫並貯存代謝能，代謝產 物’也是細胞間的潤滑劑。 2.冷凍過程中細胞死亡的因素 以冷凍儀的冷凍方式來說，冷凍過程中其冷康速率是 緩慢下降的，當細胞發生皺縮且達到平衡皺縮時，細胞膜 對水分子具有高通透性，細胞可以快速地反應溫度下降所 造成的滲透壓改變，在這種情況下’細胞有可能會受到逐 漸下降的溫度影響而死亡，因為細胞膜脂肪的變性及脫 水’同時也會造成細胞外及細胞内冰晶的形成。細胞外冰 晶形成時，相伴的是產生濃縮的細胞外溶質，這種高濃度 的溶質會使細胞内水分子滲出致使細胞皺縮，而使細胞受 1306897 * . 到傷σ這時若沒有冷凍保護劑，則細胞因過度脫水而造 成傷害，故在慢速冷凍方面可添加抗凍劑，增加細胞存活 機會。 然而，大部份的抗凍劑對於細胞來說是有毒性的，因 此如何選擇抗;東劑的冑類及濃度並配合平衡日夺間來冷束保 存、-田胞為重要的課題。如果使用冷束儀的冷束方式，冷 凍保存的結果是由多種因素所組成的，例如抗凍劑的種類 ’及濃度、抗;東劑平衡時間與溫度的影響、不同種生物配子 的性質、冷凍及解凍的速率、植冰、抗凍劑的稀釋。 若以本發明水生動物的細胞低溫保存方法進行冷凍保 '存，則需要考慮的要件有三：細胞内的水份完全脫水、快 ，速的冷凍速率及解凍速率。由此，本發明實施的難度將小 於慢速冷凍的方式。 3_解凍過程中細胞死亡的因素 > A、慢速解凍法：在解凍的過程中，當慢速解凍的時 間延長，小冰晶會集合成大的冰晶，形成再結晶的現象。 再結晶的情況產生後，大冰晶對細胞内的胞器膜狀構造破 壞，就會造成細胞膜結構的機械性傷害。另外，在慢速解 束的過程中’冰晶在細胞外逐漸的溶解，使得細胞外的溶 液滲透壓逐漸的下降，使溶液滲入細胞内並使細胞體積增 大雁破而死’即所謂細胞質的濃縮產生溶液效應。

11 1306897 B '快速解凍法：快迷解爽 ^ , ^ a . ^ /果的方式可以減少冰晶的產 生及再結晶的現象’其原因是因為解;東的時間不足以讓脫 水過的細胞吸取和降溫時所損失的同等水量，一般來說快 速解康的方式都以水浴法或者是在室溫空氣下直接解减。 超極速冷’東法疋在已没定溫度的緩衝液下，解;東速率約 4000°C/分’將精子瞬間解凍。 4.比較 A、 抗凍劑種類、濃度及平衡時間所產生的毒性影響： 在冷凍儀慢速冷凍的過程中，抗凍劑毒性會產生較大 的影響。一方面要防止冷凍保存時細胞内形成冰晶，另一 方面要使抗束劑的濃度減到最低以減少細胞死亡，其難度 較本發明水生動物的細胞低溫保存方法高。 本發明水生動物的細胞低溫保存方法，係藉由毒性試 驗找出最適抗凍劑之濃度與種類後，即可逐一進行冷凍測 試。 B、 冷凍速率的影響： 在冷凍儀慢速冷凍過程中，所產生的冷凍傷害包含冷 刺激、酸鹼度、溶質及細胞體積變化等因素的影響，較本 發明水生動物的細胞低溫保存方法更大，且需使冷凍速率 慢到細胞不致在細胞内形成冰晶，但必須快到不使細胞過 度在高濃度溶質中而受到傷害，則細胞在解凍後可有存活 的機會’因此，難度亦較本發明水生動物的細胞低溫保存

12 1306897 方法高。 c、潛熱的散發與植冰： 在冷凍結保存細胞的過程中溫度逐漸下降，冰晶首先 在細胞外溶液中形成，此時液態變為固態物理狀態改變的 過程將釋放能量，所釋放的能量稱為潛熱。溶液需釋放足 夠的能量後，才能完成物理性狀的改變，使冰形成。這時 細胞因細胞外的溶液結冰，因潛熱釋放而產生溫度升高， ♦ ϋ成滲透壓的改變。因此，需在細胞外的溶液結冰後或潛 熱散發前的2-3t，對細胞進行植冰步驟，誘導細胞内外 都能同時結冰。植冰是以人工方式誘導冰晶的形成並且是 -在接近溶液之凝固點時為之。此步驟緩和了冷卻降溫時對 ， 細胞可能的傷害。 潛熱的影響有：（1 )細胞滲透壓的改變。（2 )瞬間 冷卻汉成傷害.接近真正的凝固點時，細胞溫度因散發潛 籲熱而迅速升高。此後細胞的冷卻非常快速，直到與冷凍容 器的溫度相同為止。這種自發性結晶的發生，當細胞解凍 時’其存活率非常的低。（3)潛熱可造成細胞的溫度差 異達約6 C以上的範圍。但是，藉由本發明水生動物的細 胞低《a保存方法形成高滲透壓而使細胞完全的脫水，並不 需要植冰步驟。 下列名詞對發明所屬技術領域中具有通常知識者而 "可以充分理解；下列定義係為避免在本發明的具體實 施例中任何意義不明確的解釋。 13 1306897 在本發明中所使用的專有名詞『水生動物』意指生活 於水的動物，這些動物大部分必須從水中獲得氧氣，而且 其新陳代謝也受到其他各種水質因子的影響。在本發明 中，包含但不限於’魚m、軟體類、貝類、甲殼類、兩棲 類、爬蟲類；在本發明中較佳地係指魚類。

在本發明中所使用的專有名詞『細胞』意指動物細胞、 胚胎、配子等。在本發明中較佳的係為配子，尤其是精子。 …在本發明中所使用的專有名㈤『低溫保存』意指以低 ;20C的，里度進行處理。在本發明中較佳係以—進行 在本發明中所使用的專有名詞『平衡時間』意指含有 細胞之液體（例如培養液、稀釋液）與抗耗混合後至開始 :凍的時間。在本發明中較佳的是，水生動物精液與抗凍 劑混合至開始冷凍的時間。 在本發明中所使用的專有名詞『醣類』意指可提供碳 :的物質，在本發明中，包含但不限於，賴，更佳係為 韌萄糖、果糖、蔗糖、PEG等。 在本發明中所使用的專有名肖『稀釋液』意指混合於 、’’田胞中理想的冷凍介質，有助於維持細胞的存活。 本發明其他的特徵及優點將可明顯見於下列較佳具體 事實及申請專利範圍。 本文中所引述之文獻均以參考資料的方式併入本案。 實例 I實例利用於示範說明本發明。這些實施例不以任 (? 14 1306897 * 何方式意欲限制本發明之範圍，但用於指示如何實施本發 明的材料及方法。 實施例一：冷凍方法之操作 1 · 1龍膽石斑及台灣石濱養殖 試驗所需的龍膽石斑養殖於私人養殖場，繁殖期時進 仃採精。台灣石濱種魚係蓄養於國立海洋生物博物館淡水 魚養殖區内，以水深1公尺，3〇噸的過濾循環水槽養殖， 以冰水機將水溫控制在16 _ 2〇，溶氧控制在3 · 5ppm以 上。以鏝粉和水搓成團狀再配合粒狀人工飼料餵食。 1 · 2龍膽石斑及台灣石濱精子的取得 所有精液係在繁殖盛期按摩種魚腹部擠壓取得，採集 後的精液暫時置於碎冰上，並以顯微鏡觀察確定採集的精 子具有旺盛的活動能力後，馬上進行精子冷凍保存。 1 · 3抗凍劑種類、濃度及平衡時間之毒性試驗 在4°C下，以六種抗凍劑二甲基亞硼（DMS〇)、聚乙二 醇（PEG)、甘油（GLY)、乙二醇（EG)、METH及二曱基乙醯胺 (dimethylacetamide ; DMA)，不同的抗凍劑濃度 1〇、2〇、 3〇(%，溶液總體積百分比；v/V)，以及平衡時間5、10、15、 20、25、30、35及40分鐘，將不同種類、濃度的抗凍劑 置於96微孔（wells)的培養盤中，再將精子置入。並依照 不同的時間計時，到達平衡時間後，立刻計算精子存活率。 1 · 4 細胞低溫保存操作方法 (A )根據上述實驗結果選取較佳之抗凍劑平衡時間及 濃度。抗凍劑分別為DMSO、DMA、GLY、METH較好，濃度

15 1306897 分別為5、10、15、2〇(%，v/v)，平衡時間分別為5、ι〇、 H 20分鐘為佳。在平衡時間内，以微量吸管吸取含有抗 凍劑的精液’以小滴(15’2〇μ1)的形態滴入方型Μ盤中， ㈣平衡㈣後’立刻加人液態氮’隨後將冷絲液置入 冷凍小管中冷凍保存。 (Β )將上述冷凍精液解凍後，立刻觀察精子的存活 =及活力。由存活率及活力的觀察結果，選取5%删做 糖m劑，1分別加入葡萄糖、薦糖、葡萄糖+嚴 ㈣： +錄、PEG，濃度分別為5、m%，溶液 、-體積百分比，V/V)，平衡時間分別為5、1〇、15、2〇、25 分鐘。在平衡時間内，以料吾萬 沾“ M微量及管吸取含有抗束劑及醣類 精液以小滴（15μ1)的形態先滴入方型PE盤中，到達平 Π間後’立刻加入液態氮，隨後將冷康精液置入冷珠小 =冷來保存。24小時後解;東並檢測精子的存活率及活 力。 實施例二：解凍方法之操作 2 · 1精子的解康方法 將50-70μ1的稀釋液（滲 处！依照淡海水魚條件的不 同）置入96微孔滅菌圓底培養 I 〒再將整個培養孤置 於30 °C的水浴槽中，進行、; 仃/覆度平衡，以鑷子置於液態氮預 冷後，爽取數粒冷康精液放入培養皿各別小孔中，解束1〇 秒鐘後’或直接將同比例的稀釋液加入冷; 東小管中後立 刻觀察其存活率及活力。 16 1306897 2 · 2 精子存活率及活力的檢測 存活率的計算是以SYBR-14和PI蝥光染劑（Invi tr〇gen Corporation/Carlsbad，California/USA)進行檢:則，取 PI原液及己稀釋的SYBR-14溶液各Ιμΐ，再加入精液2〇μ1 混合，以螢光顯微鏡於488nm波長條件下進行存活率的檢 測（Chalah et al.,1999);活力的鑑定是依精子的活動能 力分為0 — 5個等級（不動、非常微弱、微弱、中等、強 參 烈、非常強烈）。 2 · 3 統計分析 實驗據以單向變異分析（〇ne_way analysis of -variance )及鄧肯式多變量測驗（Duncan’s Multiple Range .Test ; α =〇.05)分析各測定項目之間是否有顯著差異。 實施例三：比較 3 _ 1 毒性試驗 鲁 I錢的目的在於希望了解精液及加抗㈣丨對於冷束 則精子存活率的影響，從而探究將實施冷凍保存時最適宜 之冷凍刖處理。在毒性試驗中，以抗凍劑DMS0、EG及PEG # Mi：弱’存活率較高’因而以此三種抗;東劑進行冷束保 驗： <旦在本次試驗中’所有試驗的抗凍劑在對於細胞 毒性的表現都在可接受的標準以上，其中，以刪效果 最佳本试驗所採用的抗凍劑DMS0、EG及PEG，在不同的 17 1306897

顯示 DMS0、EG 及 PEG 平衡時間及濃度，都有較高的存活率 對龍膽石斑精子的傷害較低。

Haw0983)認為精子报小，其頭部長短徑只有2~3 “左右，所需之平衡時間較胚胎短。本實驗中之毒性試 驗發現平衡時間延長時，精子的存活率明顯地下降。 A〇utage(1987)認為抗;東劑具有毒性或是造成滲透壓失 調，因此精子的存活率下降 分鐘後，精子的存活率除了 於50%以下，因此，平衡時 抗凍劑進行冷凍保存。

。在濃度增加至30%平衡20 PEG之外，其它抗凍劑甚至低 間不宜太久或改以較低濃度的 2冷束精液解;東後精子存活率及活力檢測 表帛不保存於_196 c液態氮中解;東後的龍膽石斑精 子的㈣率。就不同_的影響結果顯示，以…（葡萄 糖U糖）/(G+S)及5%㈣糖平衡5分鐘精子的存活率 ，间有30/6以上的存活率。在5%(葡萄糖+嚴糖）/(㈣) 、且中’平衡時間增加，存活率下降得並不明顯，此电 的存活率也顯著高於其他各餹類處理組。另外，5%葡萄 糖ί理組中，精子的存㈣隨著平衡時㈣增加而下降。 :、匕二種稀釋液在不同的平衡時間組中，精子冷凍保存的 存活率皆不佳，大都低於1 〇%。 表利用本發明之方法，在不同抗;東劑種類下對龍 膽石斑精子存活率之影響。 18 1306897 平衡時間 (分） 抗凍劑 (Cryoprotective Agents) (%) 5 10 15 20 25 30 10%DMSO + 5% 葡萄 糖(G) 31±3a 22±6b 14±3C 6±2d 6±3d 8±3cd 10%DMSO+ 5% 蔗糖 ⑸ 11 士3a 4 士 2b 3±2b 5±3b 5±3b 6±3b 10%DMSO+ 5%(G+S) 31±6a 21±6ab 17士6b 19士 6b 16±7b 22 士 6ab 10%DMSO + 5%PEG ll±5a 3 土 lb 0 土 0b 3±2b 3 土 4b l±2b 10%DMSO + 5% 果糖 (F) 7±3a 5±3b 10±2C 5±3d 3±3d 4士 3cd 表二顯示解凍後的精子的活力同樣以5 % (葡萄糠+廉 糖）/(G+S)及5%葡萄糖平衡5分鐘精子的活力最高，當平 衡時間增長至1〇分鐘後，活力下降’但也有在第三個等級’ 隨著平衡時間的增加，活力有下降的趨勢，其它三種醣類 在不同的平衡時間組中，活力皆不佳。 表二、在不同抗凍劑種類下對龍膽石斑精子活力之影 響0 19 1306897 L衡時間（分） 抗凍劑 (Cryoprotective Agents)(%) 5 10 15 20 25 30 10%DMSO+ 5% 葡萄 糖⑹ 4 3 2 0 0 2 10%DMSO+ 5% 蔗糖 (S) 2 0 0 0 0 1 10%DMSO+ 5%(G+S) 4 3 2 2 2 3 1〇%DMSO+ 5%PEG 2 1 0 0 0 0 0 1〇%DMSO+ 5% 果糖 (F) 0 0 1 0 0 0 *精子的活動能力分為〇— 5個等級（不動、非常微弱微弱、 中等、強烈、非常強烈）。

—顯不保存於_196〇c液態氮之中解凍後的台灣石斑 =子存活率。就*同㈣的影響結果顯*，以5%(果糖+ 庶糖）/(F + S)的存活率較高，平衡時間15分鐘時有 :的：：率。&組的存活率也顯著高於其他各醣類處适 :且。另外職G處理組中，平衡時間】 存活率。立它-接社* ^ ι^ο Μ 冷凍計二六— 在不同的平衡時間處理組中，精+ 冷東保存的存活率皆不佳，大都低於子 影響表—I不同抗凍劑種類下對台灣石濱精子存活率之 20 1306897 平衡時間（分） 抗凍劑 (Cryoprotective Agents) (%) 5 10 15 20 25 30 5%DMSO + 5% 葡萄 糖(G) 0±0a o±oa 2 士 3a 2 士 2a 9±5b 9±4b 5%DMSO + 5% 蔗糖 (S) o±oa 4 士 2b 4±2bc 2±2ab l±lac 0±0a 5%DMSO+ 5%(G+S) o±oa l±2a 0 土 0a 1 士 la o±oa 2 土 2a 5%DMSO+ 5%PEG o±oa 5±4a 17±7b 6±la 0 士 oa 0 士 0a 5%DMSO + 5% 果糖 (F) 0 士 oa 2 士 2a 8 土 5b l±2a o±oa o±oa 5%DMSO+ 5%(F+S) 3 士 2a ll±6b 24±6C 5±4ab 2 士 2a o±oa 表四顯示解凍後的精子的活力同樣以5 % (果糖+蔗 糖）/(F+S)及5% PEG平衡15分鐘精子的活力最高，其它 三種醣類在不同的平衡時間處理組中，活力皆不佳。 表四、在不同抗凍劑種類下對台灣石濱精子活力之影 21 1306897 L衡時間（分） 抗凍劑 (Cryoprotective Agents)(%) 5 10 15 20 25 30 5%DMSO + 5% 葡萄 糖(G) 0 0 0 0 1 1 5%DMSO + 5% 蔗糖 (S) 0 0 0 0 0 0 5%DMSO+ 5%(G+S) 0 0 0 0 0 0 5%DMSO+ 5%PEG 0 0 3 0 0 0 5%DMSO + 5% 果糖 (F) 0 0 0 0 0 0 5%DMSO+ 5%(F+S) 0 1 3 0 0 0 本實驗發現令人驚異地發現DMSO對於龍膽石斑及台 灣石濱的精子具有優良的保存效果，其它抗凍劑包括pEG、 GLY、EG、METH、DMA之抗凍效果則在可接受之標準上。 本實驗中發現，龍膽石斑及台灣石濱的精子以5及

DMSO配合適當醣類，平衡5及15分鐘後，經 的精子，在各組之間都有較高的存活率及活動能力，其它 各組平衡時間之抗束劑處理皆無法發揮作用防止〜東過程 I細胞内冰晶的形成及回溫時造成細胞的破裂以保護細 胞0 本實驗解凍的方式是利用快速解凍的方式 凌後龍膽石斑及台灣石濱精子的存活率介灯， 活力在第3個等級’甚至有些處理組的精子’％間： 級，表示使用本發明水生動物 彡到第4個’ 動物的細胞低溫保存方法來冷為 22 1306897 * 魚類的精子是可行的， 的低溫保存方法 膽石斑和台灣石濱精子在本發明 活率及活力不# X保存的過財，使用單-抗;東劑對存 才能增加精子計需加人聽類或複合㈣類等脫水性物質 頂于的存活率及活力。 根據本發明可作 者而士h齙姑 不同修正及變化對於熟悉該項技術 已敘述特定的較佳具與精神。雖然本發明 不當地限制於 _ ，’句貞瞭解的是本發明不應被 剌於該等特定具體事實上 明之已述槿，古二 實上’在實施本發 不同修正亦被涵筌π π t A 支術者而言顯而易知之 方破涵蓋於下列申請專利範圍之内。 【圖式簡單說明】 無 明 主要元件符號說 無

23 1306897 參考資料（請提供完整之參考資料） 1. Chalah, T., F. Seigneurin, E. Blesbois, J. P. Brillard. 1999. In vitro comparison of fowl sperm viability in ejaculates frozen by three different techniques and relationship with subsequent fertility in vivo. Cryobiology 39: 185-191. 2. Harvey B. 1983. Cryopreservation of Sarotherodon Mossambicus spermatozoa. Aquaculture 32: 313-320. 3. Armitage, W. J. 1987. Cryopreservation of animal cells. Society for Experimental Biology, p379-393

24

Claims (1)

1306897

十、申請專利範園： 1 ·一種水生動物的細胞低溫保存方法，其係包含： 提供欲低溫保存的水生動物細胞； 將該水生動物細胞以抗凍劑與醣類加以處理，其中水 生動物細胞以抗凍劑與醣類處理時間約1至40分鐘； 將處理後的水生動物細胞連同抗凍劑與稀釋液於pE 盤中形成小滴；及 將液態氮加入PE盤中使其與小滴接觸。 2 .如申請專利範圍第1項所述之方法，其中抗凍劑 之種類係一種選自包含由二甲基亞楓（DMS〇)、聚乙二醇 (Polyethylene glycol)、甘油（Glycerol)、乙二醇 (Ethylene glyC0l)、曱醇（Methan〇1)及二曱基乙醯胺 (Dimethylacetamide)所組成之族群中。 3 .如申請專利範圍第2項所述之方法，其中抗凍劑 濃度為 2. 5 至 22. 5% ( V/V)。 4.如申請專利範圍第2或3項所述之方法，其中抗 凍劑為DMS0 » ' & 其中DMS0的 5 .如申請專利範圍第4項所述之方法 濃度為 5%(V/V)或 10%(V/V)。 6.如申請專利範圍第4項所述之方达 万去，其中醣類係 一種或一種以上選自包含由葡萄糖、薜 從、糖、果糖及PEG所 組成之族群中。 其中醣類濃 7 .如申請專利範圍第6項所述之方法 度為 2. 5 至 15% ( V/V)。

25 1306897 传如中請專利範圍第6項所述之方法，纟中稀釋液 系為㈣糖錢糖之組合或果糖與餘之細人。 如1請專利範圍第8項所述之方二μ葡萄糖 播庶糖之組合濃度冑5%(㈣糖與驗）（ν/ν)或果糖與嚴 之組合濃度為5%(果糖與蔗糖）（ν/ν)。 .如巾請專利範圍第9項所述之方法，其中細胞 入几凍劑與稀釋液中處理約5至25分鐘。

丄1 .如申請專利範圍第丄項所述之方法，其中稀釋 '、種或一種以上選自包含由葡萄糖、蔗糖、果糖及pEG 所組成之族群中。 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中 置入抗康劑與畴類中處理約5至25分鐘。 、，胞 3如申凊專利範圍第1項所述之方法，其中水生 動物係為魚類、軟體類、貝類、甲殼類、兩棲類或爬蟲類。 如申睛專利範圍第1 3項所述之方法，苴中水 生動物係為魚類。 /、 1 5 .如申 動物細胞係選自 群中。 請專利範圍第1項所述之方法，其中水生 包含由動物細胞、胚胎及配子所組成之族 •如申請專利範圍第1 5項所述之方法，其中細 胞為配子。 1 7 •如申請專利範圍第1 6項所述之方法，其中細 胞為精子。 十一、固式：Μ 26