TWI305837B - Diagnosis method of endometriosis by detecting biochemical markers and usage of these biochemical markers - Google Patents

Description

1305837 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ' 本發明係有關於子宮内膜異位症的一種檢測方法，尤 指利用α 1-抗胰蛋白酵素或其片段為生化標記者，本發明 亦有關於此生化標記的使用。 9 、 【先前技術】 子宮内膜異位症是目前最常發於生殖年齡婦女的一種 ® 婦科疾病[Guarnaccia ei a/. 1997]，許多停經前的婦女 受到子宮内膜異位症長期的困擾，最常見的就是經痛的症 狀，而嚴重的子宮内膜異位症可能會造成婦女的不孕 * [Giudice ei a/.，2004]。醫學界不斷的努力，想要釐清 . 子宮内膜異位症的發生原因，即使其診斷與治療比過去來 得容易，但其致病機轉至今仍然尚未明確。在其盛行率方 面，對於完全無疾病症狀之婦女，其盛行率為2%-22%，而 有疾病症狀（如行經困難、經痛）之婦女，罹患子宮内膜異 位的機率則為 40%-60% [Farquhar，2000 ; Kyaraa e纟 5入， 2003]。而月經期間會發生經痛情形的婦女，又有13%-33°/〇 會有不孕的可能[D’ Hooghe，，2003]。子宮内膜異 . 位症顧名思義即是原本應該在子宮内生長的子宮内膜層的 腺體（Gland)與間質細胞（Stroma cel 1)在子宮之外的其他 部分生長，並且與正常之子宮内膜具有相同的生理型態稱 之。人體子宮壁可以分為三層，由内而外分別是：子宮内 膜層（Endometrium)、肌肉層（Myometrium)與漿膜層 1305837 (Serous 1 ayer )。異位的子宮内膜細胞同樣受到生理激素 的變化而受到影響，有週期性的改變，例如：增生 (Proliferation)、崩解（Degradation)、出血（Bleeding) 等等。若病灶發生在子宮肌層，則稱之為子宮肌腺症 (Adenomyosis);若發生在卵巢，則稱之為巧克力囊腫 (Chocolate cyst);若發生在骨盆腔，則稱為骨盆腔性子 宮内膜異位（Pelvic endometriosis) [Sampson et al., 1921]。 子宮内膜異位症的診斷方式，時常是依照病患行經期 時的疼痛，以及腹腔的生理學檢查而發現。經痛厲害時， 常是腹側且深層的痛，若侵犯胃腸，就會有直腸疼痛或” 裡急後重”，甚至發燒的情形。但是，如果只依據症狀，醫 生有時也會延誤察覺而使病情加重。整體而言，子宮内膜 異位症是必須综合許多觀察以及科學方法來檢查得知的， 包括：從症狀去篩檢，從病史去分析，從臨床資料去思考 患病的可能性，加上觸診及超音波等科學方法的協助，推 測腹腔與骨盆腔中的情形，但診斷的黃金指標，還是要以 腹腔鏡手術檢查，才能正確的了解腹腔與病灶的情形並診 斷。 不過，縱使腹腔鏡是診斷子宮内膜異位症的黃金標 準，但這種高侵入性的診斷方式，病患的接受度相當的低， 也因此成為臨床上與研究上的一大絆腳石。而且，這種利 用肉眼觀察子宮内膜異位症病灶的方法，也有其缺點存 在，有時腹腔鏡不容易發現某些部位的病灶，例如：後骨 1305837 \ .2腔部位的病灶，腸胃道與膽囊周圍的子宮内膜異位症病 _ * ^外也有人使用陰道超音波與核磁共振影像（MRI)造影 “硯察位於腹腔或㈣的子宮内膜異位症。這兩種方法對 =診斷子宮肌瘤或是2公分以上巧克力囊腫的敏感性較 ^回，對於子宮内媒異位症之敏感性依然很低。1986年 Barbieri首次提出子宮内膜異位症患者血清中以125會升 ’咼[Barblerl，1986]。但是必須注意到的是CA125值的升 高，常與幾種生理與病理情況有關；例如月經來臨、妊娠、 腹腔發炎、内膜癌、乳癌、肝癌、肺癌…等等。其敏感性 只有15%左右’尤其―些早期的子宮内臈異位症幾乎都不 升高’所以當筛檢工具，實用價值不大；但對於術前就已 升问的案例倒疋可以作為追縱的參考。對於㈤的有一 -點要注意的，即卵巢癌與子宮内膜異位症病人都有印巢腫 瘤’ CA125都會升高，就算做到特殊超音波都卜勒血流研 究’但仍然無法確實劃分，—般而言，在子宮内膜異位症 藝的患者’CA125通常都在1〇〇u/ral上下，而卵巢癌患者則 高好幾百甚至上千倍，但如果是500 U/ml以上的巧克力囊 腫病人開刀時’在進行腹腔鏡處理時，必須尤其小心，仔 細再仔細地翻尋’有無可疑的病灶疑似卵巢癌’腹水的細 ‘ 胞學檢查更不可遺露，剝下來的子宮内膜異位的病灶，需 送父病理化驗[Acien ei 5人，1989; Kennedy以沒7 1990]。實際上ca〗25的診斷應用，在於每個月的月經徵 兆初始時測定血清中CA〗25的值，有助於深層子宮内膜異 位症的診斷。若血液25值以25 u/ml為準，診斷子宮 1305837 、 内膜異位症的敏感度為67%、特異性為90%。因此目前臨床 上也有醫師以CA125來當一種診斷子宮内膜異位症的輔 助。目前，超音波與血液檢查都只能作為診斷的參考，最 終還是得依賴腹腔鏡這種高侵入性檢查，臨床醫師透過内 視鏡的影像，詳細檢查腹腔内子宮、輸卵管、卵巢、子宮 薦骨軔帶被入侵與黏連的嚴重度，並且當下可以利用電燒 ， 或切除來治療。但在腹腔鏡的肉眼目視下，仍然有許多經 驗的差別，子宮内膜異位症是可以從小病灶到大囊腫，囊 * 腫有暗棕色、黑色，甚至因為壁比較厚而呈白色或黃色， 嚴重的子宮内膜異位症，當囊腫破掉時，會有巧克力狀之 液體流出，並可在腹腔到處可見粘連、灰色疤痕組織、黑 • 色火藥粒狀，甚至泡狀，眼淚狀之囊腫，火燄狀的病灶也 * 常見。這需要具有相當經驗的醫師才能達到正確診斷並同 時治療。 目前有許多科學家利用蛋白質體技術來篩檢疾病或癌 Φ 症的生化指標，研究生化指標的蛋白質體學也越來越成 熟，從檢體處理，一維或二維電泳分析，影像分析，質譜 分析，關於這方面研究的文獻已有許多報導[Anderson, 2002 ； Adkin et al., 2002 ； Chan et al., 2004 ； Chen et aA， 2005， Zhou e广 5人，2004 ; Zhou e广 5人，2005]。 . 人類血清中α 1-抗胰蛋白酶（a 1-antitrypsin)，是 血清中一種含量顯著的蛋白質，其分子量約為52kDa，因 為其作用機制，又被稱為蛋白分解抑制劑（Protease inhibitor)，是絲氨酸蛋白酶抑制物（Serpin)超級家族中 1305837 的一員。其主要功能為抑制免疫系統中白血球所分泌出來 的一種嗜中性纖維彈性蛋白酶（Neutrophil elastase)，這 種蛋白酶會輔助人體免疫系統防禦外來的細菌以及外來的 有害物質。依結構而言，α 1 -ant i trypsiη具有三種同質 體（Isoform)，差異在於糖基化（Glycosylation)程度上的 不同’因其具有不同數置之券糖群（Oligosaccharide ， group)與唾液酸（Sialic acid)所形成主要三種不同結構 之同質體[Carrell，1982]。 參考資料：

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= Γ宮内膜異位症檢測方法中，血清中的 目私蛋白讀為生化標記可從血料 利用各種分離技術，例如利用離出來”叮 ..._ _ 难或一維電冰法，在電泳 法中，不同的分子係根據其不 成L併4J J貝里興书何而分離。再 用如貝5曰儀的裝置進行適當的辨識分析。 以下利用二維電泳法的分析結果來朗—個例子。 第-、第二圖係二維電泳法所得之代表性影像，所分 析的分別是取自對照組(contr〇l gr〇up)與子宮内膜異位症 組中一位子宮内膜異位症患者的血清對於對照組（第一圖） 與子呂内膜異位症組（第二圖）的灰清檢體，首先以的 TCA/丙酮進行沉澱處理。裝填（ioading)之蛋白質濃度為3〇〇 微克（Mg)。利用等電位聚焦電泳法(IEF)，係使用公分的 等電位3·1〇之非線性滯流條（non-linear immobi丨ized strip) 、18.5 公分χΐ8.5 公分的 12.5% SDS-PAGE 以及 SYPRO®

Ruby之蛋白質染料；再掃描出波長610奈米的螢光影像 (Typhoon™ 9200 Amersham Phamacia)。根據第一、第二圖 中影像之比較結果，第一、第二圖中的紅色圓圈表示具有 不同等電位點聚焦（X-軸）與不同分子量（Y-軸）的蛋白質。如 1305837 第二圖中以標準分子量所示之影像比對（ImageMaster™ Amersham Phamacia)所顯示的對照组與子宮内膜異位症組 間有差異之蛋白質點，質譜儀辨識出多種蛋白質。如上述 結果顯示，作為檢測子宮内膜異位症的生化標記之蛋白質 可以被辨識出來。 上述根據本發明之子宮内膜異位症的檢測方法中，該 生化標記包含αΐ-抗胰蛋白酵素、αΐ-抗胰蛋白酵素之片 段或此二者之組合。 1 上述本發明之一較佳實施樣態中，生化標記可為αΐ- 抗胰蛋白酵素之完整分子，或其具有分子量約為36kDa、 45kDa或52kDa之α 1-抗胰蛋白酵素片段。 [實例二：α 1-抗胰蛋白酵素之與子宮内膜異位症相關的表 現] 根據本發明中的檢測方法，係對血清中作為生化標記 > 的蛋白質進行定量分析，並決定生化標記於血清中的濃度。 用以測量生化標記濃度的方式並無特別限定。如第三 Α圖所示，底下的實例說明測量結果，係以免疫點狀墨點 法測量作為生化標記之α]-抗胰蛋白酵素之濃度，以量化 墨點方式決定血清中生化標記的表現。所檢測的血清檢體 取自分成四組的受試者：8位生殖年齡的健康女性（對照 組）、八位懷孕的女性（懷孕組）、16位患有子宮内膜異位症 且未經治療的女性（子宮内膜異位症組）、16位患有子宮内 膜異位症且經促腺性激素(gonadotropin)釋放贺爾蒙治療後 15 ⑧

Claims (1)

1. I305iSi4l573^4#'ltlt# 中文申請專利範圍替換本(97年9月） 十、申請專利範圍： )正本

   告本 斷-生化標記是否可作為診斷個體中子宮内膜— 異位症之輔助性標記的方法，其包含： 卜（1). ’則疋杳自α卜抗胰蛋白酵素（alpha 人=titrypsin)、α卜抗胰蛋⑽素片段或此二者之組 :士生化在該個體血清檢體中的含量，其中該片段 -、勺36 kDa、45 kDa或52 kDa之近似分子量；及 挪；(11)將該血清檢體中之該生化標記的含量與該生化 :己的基準含量比較，該生化標記的基準含量係經測量 “生化標記在患有子宮内膜異位症之患者的血清含量 而決定， 2. 其中該個體之年齡為18至4〇歲，且若該生化標記在 =個體血清檢體中的含量高於該生化標記的基準含 量’則表示該生化標記可作為診斷子宮_異位症之辅 助性標記且該基準含量為0.812 U/ml。 如申π專利圍第1項之方法，其中該生化標記係以電 泳法（electroph〇resis)檢測，其係根據分子的質量與 電何將分子分離。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該生化標記的含量 係以免疫分析法（i mmUn〇 aSSay )測量。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於步驟（Η)中，該 生化標記的基準含量係根據預設的敏感度 (sensitivity)與預設的特異性（specificity)分析受 式者操作特徵曲線（receiver operating 127124-970930.doc 1305837 characteristics curve)而決定。 5.如申請專利範圍第1項之方法，其中該生化標記可與 CA125併用。 127124-970930.doc -2-