TWI299735B - An immunomodulatory protein cloned from ganoderma microsporum - Google Patents

Description

1299735 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係一種免疫調節蛋白及其製備方法，特別指由小 孢子置之選瘦’具有比/以cz•办w分離之免疫調節蛋 白更佳免疫調節效率之免疫調節蛋白。 【先前技術】 莖之屬於真菌界（Kindom Fungi )、擔子菌門 參（Basidiomycota )、層菌綱（Hymenomycetes )、無蕈褶目 (Aphyllophorales )、靈芝科（Ganodermataceae )的靈芝屬 (G训oderma) (Alex〇poui〇s et al 1996)。目前靈芝屬在文獻 中雖然有300種左右，但在藥理和臨床的研究中只有靈芝 (Ganoderma lucidum)、铪衫靈芝（G tsugae)、薄樹隻芝 ^ g 、狹長孢靈芝（G. 以狀似,）、無柄靈芝（G raz·聽等紅色芝和紫芝（GjZ•狀似、曰本靈芝 知户⑽化腳〇等紫色靈芝與樹舌靈芝（G加㈣等少數 •特定的靈芝菌種被研究與利用（許，1993)。靈芝經過三十年 的樂理研究，發現其萃取物中具有鎮靜、鎮痛、鎮咳、強心、 保肝（Lin et al· 1993)、降血壓（Lee and Rhee 1990)、降血 脂（Kabir et al· 1988)、降膽固醇（K〇m〇da et al 1989)、抗 過敏（Chen et a1· 1992)、抗發炎（Lin et al. 1993)、抗病毒 (el-Mekkawy et al· 1998)、抗腫瘤與免疫調節功能（Chen et al 2004)等活性成分。

SaSakl等人於1971年發現樹舌靈芝（G叩;7/⑽扣而〇 的多醣體具抗腫瘤活性，使得多醣體成為靈芝第一項被證實 1299735 的活性成分（Sasaki et al. 1971)。其作用機制並非在於直接 殺死或抑制癌細胞，而是經由活化T細胞以及增強自然殺 手細胞的能力（Lei and Lin 1991)以提高免疫力來間接表現 其抗癌活性。此外，對於單核的巨嗤細胞可增強其吞嗟能 力，並促進抑制腫瘤生長的細胞激素如：介白質（IL-2、 IL-4)、干擾素（IFN-γ)及腫瘤壞死因子（TNF-α)等的合 成與釋放（Lieu et al. 1992);藉由強化自然殺手細胞和巨嘆 _細胞，直接攻擊不正常的腫瘤細胞，達到防癌、抗癌之效果。 靈芝的另一種活性物質，免疫調節蛋白 (immunomodulatory protein )，於 1989 年由曰本學者 Kino 等 人自 G. lucidum菌絲體中分離出來，命名為LZ-8 ( Ling Zhi-8)(Kinoetal.l989hLZ-8 由 110 個胺基酸所組成， 分子量為12,420 Da，並且與免疫球蛋白重鏈區之可變區域 的胺基酸序列及二級結構有某程度的相似性（了31^1^6〖31· 1989)。LZ-8原態是以同源雙體（homo dimer )的形式存在， 籲具有促進淋巴球增殖以及抑制全身性過敏反應（systemic anaphylaxis reaction)和局部過敏反應（Arthus reaction)的 作用。由於，LZ-8對於人類紅血球卻不發生任何凝集反應 (Kino et al· 1989)，顯示其在人體醫學上有其應用之潛力。因 此，日本明治集團同時在日本、歐洲以及美國申請關於LZ-8 的專利，分別為：以LZ-8作為抗愛滋藥劑以及核酸序列之 專利 JP2032026、JP3172184 以及 JP5068561 ; LZ-8 蛋白質 特性以及作為免疫抑制藥劑之專利 EP0288959B1， US5334704。另外，LZ-8 的-Leu-Ala-Trp-Asp-Val-Lys-和 1299735 -Asn-Leu-Gly-Val-Lys-Pro-Ser_Tyr-Ala-Val-兩段部分醣蛋白 (glycoprotein)序列亦享有專利保護（US5334704 )。 LZ-8與外源凝集素（lectin) —樣，具有凝集細胞以及 促進淋巴球增殖的能力。由於外源凝集素對醣類具有專一性 結合的能力，故又稱親醣蛋白。這種對醣類專一性結合的特 性，使其具有結合細胞表面特定醣基，進而刺激細胞引發後 續免疫反應之能力。自1989年Kino發現LZ-8可刺激 I鼠科脾臟細胞增殖以及避免局部性和全身性過敏反應，後續 更有研究指出 LZ-8可以有效抑制非肥胖性糖尿病鼠 (nonobese diabetic, NOD)的自體免疫性第一型糖尿病之發 生（Kino et al. 1990)。此外，LZ-8在胰臟異體移植方面可 以顯著延緩排斥的時間。相較於其他免疫調節藥物 (immunomodulatory drug) ·· CsA ( cyclosporin A，來自真菌 具有免疫抑制作用的胜肽）以及FK506 ( tacrolimus，由土 壤真菌所分泌具有免疫抑制作用的抗生素）對於胰臟皆有毒 •害的危險，LZ-8對於胰島則沒有發現有任何毒害作用（van der Hem et al. 1995)。LZ-8不論在活體外或是活體内的實 驗，都顯現出免疫調節活性，但其確切作用機制卻不清楚。 Kino等人於 1991年發現LZ-8可抑制老鼠抗體的產 生，推測LZ-8乃藉由阻斷抗體的產生而達到抑制全身性及 局部性過敏反應（Kino et al. 1991)。此後，更發現LZ-8是 透過調控細胞表面附著的分子來達到調節細胞間的交互作 用（Miyasaka et al. 1992)，而此交互作用正是自體免疫疾病患 者所缺乏。 1299735 至芝免疫调節蛋白LZ-8證實了單純之胜肽即具免疫調 ,節功能，而其他研究也發現，從松杉靈芝（G· Μ叹⑽）菌絲 體中純化出分子量約13kD #免疫調節蛋白叩㈣如糾 immunomodulatory protein-gts)，與 Lz_8 的序列完全相同。 FIP-gh可以促進人類周邊淋巴球細胞（human pedpherai lymphocytes)以及小鼠脾臟細胞增生，在濃度為5 μ§/ιη1 時，對人類周邊淋巴球細胞可達最高之增殖作用。除此之 _外，在一些非靈芝屬的菇類中也可純化出分子量約13 kD 的免疫調節蛋白，例如··金針蒜的FIP-/ve(KoetaL 1995)以 及草兹的 FIP-vvo (Hsu et al· 1997)。LZ-8、FIP-/ve 以及 FIP-vvo且均含有與免疫球蛋白重鏈的可變區域相當之相似 性。FIP-/ve和FIP-vvo不僅在序列以及結構上與lz-8類 似，在生理活性上也具有相似性。 藥用真菌之保健療效眾所周知，其有效成分也逐漸被純 化分離出，然而目前所確知的有效成分多為多醣體或是三一 •類化合物，但這些活性物質在純化上並無法排除其他活性物 質如肽多醣及醣蛋白等的干擾，因此對於生理活性上機制的 研究多有疑慮。此外，這些活性物質不是細胞壁組成份就是 二次代謝產物，很難透過異源表現系統進行大量生產。 【發明内容】 本發明的目的在提供一種由小孢子靈芝選殖出的免疫調 節蛋白質基因’其基因序列及所轉譯出的蛋白質序列與專利 的LZ-8不同，且具有較LZ_8更有效率的免疫調節能力。 1299735 . 依據本發明目的之一種免疫調節蛋白基因，係選殖自小 孢子靈芝 Gimoderma m/croworwm，具有序列表 SEQ ID NO 2 及SEQ ID NO 3之胺基酸序列。 本發明之具有上述免疫調節蛋白基因之一種免疫調節蛋 白’其分子量為15863.79 Da。 如上述的由小孢子靈芝選殖的免疫調節蛋白，因有與已 專利LZ-8不同的蛋白質序列，故產生了較LZ-8更有效率的 參免疫調節能力。 以下僅以較佳的實施例說明本發明的可實施性及其功 效特點： 【實施方式】 材料 本發明所用之菌株、質體與引子請參見表一、表二及表 二。其中本發明所用之小孢子靈芝 RSH 0821係以美國密西根州底特律市Difco公司的馬鈐薯 馨葡萄糖洋菜（Potato dextrose agar,PDA，Difco, Detroit，MI) 斜面培養基於25QC保存。異源表現系統則採用美國加州卡 爾斯貝市 Invitrogen 公司（Invitrogen，Carlsbad，CA，US)的嗜 曱醇酵母菌表達套組（expression kit)。大腸 桿菌五co/z‘ JM109為本發明進行分生操作及質體 保存之宿主細胞，一般培養是使用美國馬里蘭州巴爾的摩市 Alpha Bioscience 公司（Alpha Bioscience，Baltimore )的固態 平板培養基（LB，Luria-Bertani agar)或是液態培養基（LB broth)，其培養溫度為37°C ;液態培養則需以250 rpm震 1299735 盪處理。菌株長期保存於-80°C之含25%甘油之LB broth表^ _ 菌株 特性 來源

Ganoderma spp. G. microsporum RSH 0821 G. tsugae RSH 1109 E. coli JM109

Heterokaryote, gmi 基因源 Heterokaryote，/z-S 基因源 本實驗室 本實驗室 Φ

Rosetta origami B (DE3) 質體結構及儲存Mdl，sStratagene hsdRll，gyrA96, relAl，ihiA(lac-proAB)， (美國力口州 F1 [traD36, proAB\ laclq, lacZAU\5] 拉裘勒） 宿主表達 F·，οττφΓ, m/)，ga/, Novagen (美 dcm, lacYl, aphC,gor5 22: :Tnl 0, trxB, 國加州聖地 pRARE(CamR} KanR, TetR) 牙哥） P. pastoris KM71 宿主表達 Muts，ZnX,

Invitrogen (美國力17州 卡爾斯貝） 表， 質體 特性 來源

E. coli yT&A pGEM-T pGEX-4T-l pGEXL P. pastoris pPICZa A pPLZ pPGMI TA選瘦載體，ZacZ，Ampr TA選殖載體，/acZ，Ampr 表現載體，tac啟動子（promoter ) Amp1"，在 N 端接有 GST-tag pGEX-4T-l與/z-(5基因著生於 BamHI/EcoRI 位 1

Yeastern(台灣台北） Promega (美國威斯 康辛州麥迪遜） Amersham Pharmacia(瑞典阿普 塞） 本實驗 表現載體，啟動子（promoter ) ，Zec/，a-因子訊息胜肽，在C-端接有 c-wyc 抗原決定位（epitope)與 His-tag pPICZaA與/z-<S基因著生於 EcoRl/Xbai 位 1 pPICZaA與g/m·基因著生於 jEcoRUJCba'[位曼

Invitrogen (美國加州卡爾斯 貝） 本實驗 本實驗 10 C；. 1299735 表， 引子 引子序列（5’— 3’） 參照來源 本實驗 本實驗 本實驗 本實驗 本實驗 本實驗 本實驗 Kilstrup and Kristiansen, 2000 Kilstrup and Kristiansen, 2000 Kilstrup and Kristiansen, 2000 本實驗 本實驗 本實驗

LZ8-F LZ8-R LZ8-BF LZ8-ER LZ8-EF LZ8-XR 3，GW-F MKP22 MKP23 MKP24 0821GW-R1 0821GW-R2 GMI-XR

TCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG

GTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC

GGATCCATGTCCGACACTGCCT

GAATTCCTAGTTCCACTGGGCGA

GAATTCATGTCCGACACTGCC

TCTAGATAGTTCCACTGGGCG

CGTTCGACTACACCCCGAACTGGGGC

GCGCTGCAGGCATGCGAGCTCCCAAGCTTGATCG

AATTCGATCAAGCTTGGGAGCTCGCATGCCTGCAGCGC

GCGCTGCAGGCATGCGAGCTG

GAATTCGATGGCCCGCCGAGC

CCCTTCTAGTTCCACTGGGCAAC

TCTAGATAGTTCCACTGGGCA

引子中之限制酶切點以粗體標示，万amH I : GGATCC， EcoR I ： GAATTC ^ Hindm ： AAGCTT ^ Xba I ： TCTAGA 小孢子靈芝免疫調節蛋白基因之選殖 小孢子靈芝染色體DN A之萃取： 參照 AI-Samarrai and Schmid (Al-Samarrai and Schmid 2000)之方法。將小孢子靈芝菌絲體以菌塊接種方式置入 PDB液態培養基中，以25°C培養一至數週後，採抽氣過 濾法收集菌絲體並以蒸餾水清洗數次、去除水分。以液態氮 研磨成粉狀，放置於-20°C冰箱保存。

11 1299735 聚合酶連鎖反應（PCR)分析： 以小孢子靈芝之染色體DNA為模板，LZ8-F/LZ8-R為 引子（表二）’進行PCR擴增’其黏合溫度Ta ( annealing temperature )為 48〜6(TC、延伸時間 te ( el〇ngati〇]n time )為 30 sec·(表四），所得核酸片段經純化，以ΤΑ連接（ΤΑ ligation)方式接入保存質體yT&A並轉形至五.eo" JM109 (表一）後，進行核酸定序分析。 _ Genome Walking (基因組步）·· 參考 Kilstrup and Kristiansen (Kilstrup and Kristiansen 2000)之方法，利用限制酶將染色體DNA截切成小片段， 並於片段兩端接上已知序列的轉接子（adaptor )成為模板 DNA ’之後以基因專一性引子及轉接子上的專一性引子進行 PCR擴增反應，最後可得大量的目標基因片段。 結果· 於 PCR 分析中利用 LZ-8引子選殖出 G· 春m/cro印orwm免疫調節蛋白新基因之部分序列約330 bp (第 一圖）。針對此新基因已知序列另設計專一性引子3’GW-F 進行3 ’ genome walking，可得此新基因之三端未知序列（第 一圖）。為了將新免疫调卽蛋白全基因一次選殖出來，於三 端已知序列再設計兩條專一性引子 0821GW-R1和 0821 GW-R2(表三）進行 5’ genome walking，可得長約 450 bp的基因片段（第三圖A)。合併之前所選殖出來的三端序 列基因片段，則G· 免疫調節蛋白新基因全長共 666 bp並命名為gwz·(第三B圖）。 12 < S)- 1299735 表四 DNAa模板 引子b PCR 條； ~ Ta ( °C ) c te ( min. ) d 3▼端部分基因组步 0821/^coR I ? 0821/i7zndHI 3rGW-R/MKP24 54,56,58, 60 2 5’端完整基因组步 0821/£coR I , 第 1 PCR 0821GW-R1/MKP24 60 3 0821/^/^(1111 第 2 PCR 0821GW-R2/MKP24 56 2 a :經限制酶截切之染色體DNA。 b :請參表三。 • cTa :黏合溫度（annealing temperature ) 〇 d te :延伸時間（elongation time )。 靈芝免疫調節蛋白LZ-8於五之異源表現 pGEXL表現載體之建構： 以PCR分析所得並保存於yT&A之/ζ-δ基因做為 模板，分別帶有限制酶心mHIII、EmRIV (表三）切位的 LZ8-BF、LZ8-ER 為弓1 子，進行 PCR 放大（Ta 二 60〇C te 二 _ 30sec·)，所得片段保存於yT&A並依一般分生操作剪接入 PGEX-4T-1相對位置，可得表現載體pGEXL。接著轉形至 五· co/z’Rosetta-gamiB (RGB)進行表現。 jE. 融合蛋白之表現：

將1%隔夜培養的種菌接種至900 mi含1〇〇 gg/ml ampicillin (安比西林）之LB液態培養基，於37。〇震盡 培養至 〇D6〇〇 = 0.6 ，以 0.5 mM iPTG (isopropyl_D-thiogalactopyranoside 異丙基—d一硫代半乳糖 苷）於30C誘導隔仪。離心（3000^^10]^^ 4。〇)收隹 (g. }. 13 1299735 菌體，懸浮於5 ml磷酸缓衝液PBS (140m M NaCl，2.7 mM KC1，10 mM Na2HP04, 1·8 mM KH2P04, pH 7·3 )後，進行超 音波震盪破菌。離心（14000 g，20 min.，4°C )前加入最終濃 度1%的Triton X-100以增加融合蛋白之可溶性，取離心後 上清液進行Glutathione Sepharose 4B管柱（谷胱甘肽 Sepharose-4B親合性層析柱）純化，所得融合蛋白進行兔子 多株抗體之製備。 靈芝屬免疫調節蛋白於之異源表現 pPLZ及pPGMI表現載體之建構： 及來自（7. 的免疫調節蛋白基因g而· 基因分別以帶有五coR I I等限制酶切位的引子 LZ8-EF/LZ8-XR 及 LZ8-EF/GMI-XR (表三） 進行 PCR 擴增放大後’所得片段保存於pGEM-T並依一般分生操作 剪接入pPICZaA相對位置，可得表現載體pPLZ及 籲pPGMI，此表現載體可使目標蛋白之N端帶有a因子訊息 胜肽（a_factor signal pepetide)，C 端接有 c-myc 抗原決 定位（epitope)與His-tag。重組蛋白被送至胞外的同時， 訊息胜肽將被切除成為reGMI(第六圖）。 P· 電穿孔轉形法： 參考Invitrogen公司的尸/c/ni表達套組（expression kit)說明書以及 Wu and Letchworth (Wu and Letchworth 2004)發表之轉形方法，將尸KM71於200 mL YPD ( Yeast Peptone Dextrose，酵母膏腺葡萄糖璦脂）液態培 14 1299735 養基，以30°C培養至0D_ (吸光值）約ΐ·〇-2·0 ( 1單 位OD600約相當5 X 107 cells/mL)後離心收菌。懸浮於 100-200 mL前處理緩衝液（1〇〇 mM CH3COOLi (醋酸鋰）， 10 mM DTT (dithiothreitol 二硫代蘇糖醇），0.6 M sorbitol (山梨糖醇），10 mM Tris-HCl (三羥甲基氨基曱烷鹽-酸鹽） pH 7.5)，於室溫下靜置30分鐘後離心收菌。將菌體以1 mL冰的1 M sorbitol清洗三次，懸浮於1 mL冰的1 Μ _ sorbitol (〜1010cells/mL)，即為電穿孔（electroporation)使 用之勝任細胞（competent cells)。抽取表現質體並以SacI將 質體截切為線狀且純化後，取l//gDNA(10//L)與80// L之勝任細胞混合，移至之電穿孔玻璃管（cuvette，0.2 cm, BTX)冰浴5分鐘，以加州聖地牙哥BTX公司（BTX，San Diego, CA)的 ECM 630 電穿孔系統（Electro Cell Manipulator Electroporation System)進行電穿孔，設定條件為1.5 kV、 25μF、200 Ω。電穿孔後馬上加入於lmL冰的YPDS液態 籲培養基（1% yeast extract (酵母萃取物）；2%peptone (腺）； 2%dextrose (葡萄糖）及 1M sorbitol (山梨糖醇）），於 30 °C靜置1-2小時後將菌液塗佈於含1〇〇 pg/ml zeocin (抗 生素）的YPDS平板培養基，於30°C培養篩選；一般而 言抗性越高的轉形株其插入的表現載體數目越多，重組蛋白 的表現量也有較高之趨勢（Baneyx 2004)。 P· 以融合蛋白之表現： 轉形株以含有l〇〇gg/mlzeocin的BMGY液態培養基 (l%yeast extract (酵母萃取物）；2%peptone (腺）；pH 6 的

15 < S 1299735 potassium phosphate(鱗酸鉀）100 mM; 1.34% ΥΝΒ ; 4χ 10-5% biotin (生長素）及l%glycerol (甘油））於30°C培養活化 兩次後，將到達靜止狀態（stationary phase)的種菌接至500 mlBMGY使最終OD_為0.1。培養24小時後，將培養 基置換成100 ml BMMY液態培養基（1% yeast extract (酵 母萃取物）；2%peptone (脒）；pH 6 的 potassium phosphate (磷酸鉀）100 mM ; 1.34% YNB ; 4χ 1(T5% biotin (生長素） 0及0.5%MeOH (曱醇））誘導融合蛋白表現，其後每24小 時添加曱醇使最終濃度為0.5%，共連續誘導二天，收集胞 外上清液。結果如第四圖所示，重組蛋白reGMI在0.5% 曱醇誘導下，蛋白質濃度隨著誘導天數增加而增加。 P· 融合蛋白之純化： 以十倍膠體體積pH 7.4的wash buffer (流洗液，50 mM NaH2P04 (磷酸二氫鈉），300 mMNaCl (氯化鈉），10 mM imidazole (異吡唑））流洗Ni-NTA (鎳-次氨基三乙酸）管 鲁柱，重組蛋白reLZ-8及reGMI皆可完全吸附於管柱内。 通入樣品後再以十倍膠體體積的wash buffer洗去非專一性 吸附之雜蛋白；最後以含有不同imidazole濃度的磷酸緩衝 液將融合蛋白流洗下來，分別為：reLZ-8在40〜100 mM ; reGMI在1〇〇〜250 mM (第五圖）。純化所得之融合蛋白對 PBS磷酸緩衝液透析後，以溶液狀態或是以乾燥粉末方式於 4 C保存。雖然户户似纟⑽以胞外上清液除了目標蛋白之外 幾乎不見其他雜蛋白，但是唯有透過親和詹柱純化才能將胞 外液中的色素去除，降低重組蛋白進行免疫活性測定之干擾 16 < S > 1299735 因子。 Λ 融合蛋白之特性分析 分子量與_基修飾分析： 不論是重組蛋白reLZ-8及reGMI，個別的理論分子量皆 可由已知序列推知，但是這些重組蛋白在電泳膠片上所顯現 出來的分子量皆大於理論分子量。為求得更準確之分子量， 参將 reGMI 進行 MALDI-TOF ( Matrix Assisted Laser

Desorption /Ionization- Time Of Flight，基質輔助鐳射解析電 離飛行時間質譜）質譜儀分析’結果如第七圖所示。reGMI的 測量值為15863.79 Da，和理論值15847.47 Da幾乎相同， 顯示SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳） 在Tris buffer系統下會高估reGMI的分子量。此外也可由 MALDI-TOF結果推知並不會對reGMI進行黯 基化的修飾。 ♦同源雙體分析： 原態LZ-8是以同源雙體的形式存在（Tanaka，i989)， 而胺基酸序列與LZ-8相同的Flp-gb之生理活性與能否 形成同源雙體有絕對關係（Lin，1997 )。為初步判斷由 以所表現的重組蛋白reGMI在原態是否也是以同源 雙體的形式存在，將此蛋白質溶液以不同濃度之戊二藤 (glutaraldehyde)進行化學性的交聯鍵結（cr〇sslinking)。 其原理在於戊二搭可以使蛋白質表面的lySine(離胺酸）彼 此間透過胺基形成共價性建結，而空間位置相近的不同蛋白 17 < S > 1299735 質則有機會因此而相互結合固定。實驗結果如第八圖所示， 在濃度為0.01%的戊二醛作用下，reGMI同源雙體的訊號 開始出現，隨著戊二醛濃度增加，同源雙體的比例也逐漸增 加，顯示reGMI在原態是以同源雙體的形式存在。 蛋白質構形分析： 如第六圖中的方框所示，LZ-8請求專利的兩段胺基酸序 列分別為： (1) -Leu-Ala-Trp-Asp-Val-Lys- ( LAWDVK ) 及 (2) -Asn-Leu-Gly-Val-Lys-Pro-Ser-Tyr-Ala-Val-(NLGVKPSYAV)； 而來自 G. microsporum的GMI與LZ-8請求專利相同區 段的胺基酸序列為· (1) -Leu-Ala-Trp-Asn-Val-Lys- (LAWNVK)及 (2) -Asp-Leu-Gly-Val-Arg-Pro-Ser-Tyr-Ala-Val-(DLGVRPSYAV)。 GMI在與LZ-8的已專利胺基酸序列上的差異明顯不 同，而這些胺基酸上的差異或許會導致蛋白質構形上的改 變，進而造成彼此間生理活性上的差異。為探討reGMI與 reLZ-8在構形上的差異，兩者進行西方式雜合分析（Western hybridization analysis)，結果發現 reGMI 可以被 LZ-8 的抗 體所辨識但訊號很弱（第九圖），顯示reGMI的確與reLZ-8 雖具有相似之構形’但因序列上的差異使得reGMI在構形 上與reLZ-8呈現一定的差異，此差異將可能影響到免疫調 節之活性。因此，透過以下的免疫調節活性測試，以了解胺 18 1299735 基酸上的差異對兩者免疫調節活性之影響。 免疫調節活性測試 將純化後之reGMI以樹突細胞（Dendritic cell)進行免 疫調節活性測定，流程如下： 取5〜6週大BALB/c老鼠之骨髓細胞，以含10% FCS (小牛血清）之RPMI-1640培養基進行培養；於第二 •天添力口 IL-4 和 GMCSF ( granulocyte/macrophage colony stimulating factor，粒細胞/巨嗟細胞集落刺激因子）促使細 胞分化；第四天更換至新培養盤繼續培養以去除巨噬細胞 (Macrophage );第六天之未成熟的樹突細胞（immature dentritic cells)中加入不同濃度之蛋白質樣品，二十小時後 蒐集上清液進行 IL-12 之 ELISA 測定（ELISA， Enzyme-linked immunosobent assay 酵素結合免疫吸附法）。 將純化後之reGMI以巨噬細胞與T細胞進行免疫調節 _活性測定，流程如下： 巨嗟細胞株J774A.1和人類T細胞株Jurkat cells (人類淋巴母細胞）各以RPMI-1640含l〇%FCS之培養 基進行培養，加入不同濃度之蛋白質樣品，六小時後蒐集上 清液分別進行TNF-α和IL-2之ELISA測定。 結果· 為排除 P· paWorzi細胞壁組成份干擾之可能性 (Muller et al. 1997)，將 pPICZaA 之 P· KM71 轉 形株進行相同條件之表現、純化與透析後不含表現基因之

19 < S 1299735 vector (載體）為負控制組；LPS為正控制組（第十〜十二 圖），不論於BALB/c老鼠骨髓樹突細胞、巨噬細胞株 J447A.1或 Jurkat cells皆不引發免疫反應。純化後之 reLZ-8 及 reGMI 以 0、0.625、1.25 和 2.5 pg/ml 等四種 重組蛋白濃度施用於 BALB/c老鼠之骨髓樹突細胞 (BALB/c mice bone marrow dendritic cells )，皆可刺激細胞

分泌IL-12 p40，其中reGMI於2.5 pg/ml下刺激樹突細 胞分泌IL-12p40的量為相同濃度reLZ-8之六倍（第十 圖>IL-12p40為IL-12其中一個單體，IL-12p40表現量 增加意味著IL-12表現量也可能增加，而IL-12乃樹突細 胞啟動甚至維持TH1免疫細胞群之重要細胞激素，IL-12 的存在也會抑制 TH2細胞生長分化 （Park and Scott 2001)。靈芝屬免疫調節蛋白也可直接作用於T細胞，如第 十二圖為將10 pg/ml的reLZ-8與reGMI施用於人類丁 細胞株Jurkat cells，皆可活化細胞分泌IL-2 (介白質）。 鲁可促未分化的T細胞增疫與分化。此外，IL-2也是τΗΐ 細胞分泌的細胞激素之一。TNF-α (腫瘤壞死因子）為巨嗟細 胞引發發炎反應的細胞激素之一，也是判斷巨嗟細胞是否序皮 活化的一個指標。第十一圖顯示reLZ-8和reGMl在5〇 gg/ml濃度下皆可活化老鼠巨噬細胞株 j774a 1 八 1 分泌 TNF-a 〇 由上述的免疫活行測試得知，本發明之免疫調節蛋白 reGMI不但具有促使各種細胞活化的能力，且具有較reLz ^ 更高的免疫效率。 < S >- 20 1299735 以上已透過各種實施方式充分說明本發明的可實施性及 其實施後結果。惟，這些只是本發明的其中較佳實施例，不 能視為本發明的限制條件，本發明的具體權利範圍以本發明 的申請專利範圍中所記載者為依歸。

21 < S > 1299735 【圖式簡單說明】 第一圖係以 LZ-8 引子（LZ8-F/LZ8-R)對 G· 和 G· 進行PCR擴增的結果；其中第一 A圖 為擴增片段之電泳結果，第一 B圖為擴增片段之定序 結果；第一 A圖中箭頭所示為所用引子，其中3’GW-F 用於 3’ genome walking 〇 第二圖係G· 免疫調節蛋白基因之3’ genome walking結果；其中第二A圖係以3’GW-F/MKP24等 0 引子對模板DNA進行PCR擴增的片段之定序結 果；而第二B圖為擴增後之電泳結果；第二A圖中箭頭 所示為所用引子，0821GW-R1及0821GW-R2用於 5’ genome walking 〇 第三圖係G· mkro印orz/m免疫調節蛋白基因之5’ genome walking結果；係以 5，GW_R1/MKP24進行第一次 PCR擴增後，再以5’GW-R2/MKP24進行第二次 # PCR擴增；其中第三A圖為擴增片段之定序結果，亦 是 G. 免疫調節蛋白基因 g船·全序 列；第三B圖為擴增後之電泳結果；第三A圖中方框所 示為LZ-8序列的專利區段。 第四圖係 G. microsporum 免疫調節蛋白 GMI 以 ?lCZaA/Pichia pastoris KM71 進行異源表現。 第五圖係重組蛋白reLZ-8與reGMI以不同濃度之異吡唑 流洗液進行親和管柱純化之結果；其中第五A圖為 reLZ-8 ;第五 B 圖為 reGMI。 22 1299735 第六圖係LZ-8與GMI重組蛋白reLZ-8、reGMI之胺基 酸序列’其中方框所不為LZ-8序列的專利區段。 第七圖係reGMI之MALDI-TOF分析結果。 第八圖係reGMI以不同濃度之戊二醛進行交聯鍵結圖。 第九圖係等量reLZ-8與reGMI進行西方雜合反應之結 果。 第十圖係reGMI促進BALB/c老鼠骨髓樹突細胞株分泌 IL-12p40之結果。 P第十一圖係reGMI促進老鼠巨噬細胞株 J774A.1分泌 TNF-α之結果。 第十二圖係reGMI促進人類T細胞株Jurkat cells分泌 IL-2之結果。 【主要元件符號說明】 無

23 1299735 序列表 <110>沃百特科技有限公司 /-World Bio-Tech Alliance Corp. <120>由小孢子靈芝選殖之免疫調節蛋白質 <160 3

<210> 1 <211>666 <212〉DNA <213> Ganoderma microsporum

<400〉1 cttccgcggc aatcccatac agcttatccg tactgcgctg agcattatgt ttcgactaca ttcccgacgg ctcggcgtgc gaatacaact cccgacaccg cccagacggc cagcgc 666 aggttgtcgc gcgatgttga gcatggcata caggcatgcg ccgacactgc ctccaaactg tcctgactga gcccctcata ccggctacgg gcaacaattt ctgctcggcg ggcgctcggc aggcgccata gggtccttgg agctcccaag cttgatcttc gggccgcggg caaggcgtac cgcggtcgag catcgcggac cattgttgcc ggccatcgaa gggccatcga cacgtgtcca agctccgcaa cttgatcgaa acgctcgcct cgtcccagca acgtaccgcg agcgacggct acgaacacga cagtggaact ttcgatcaag attcacgaac tctacgccaa cttacaccca ttccctgacc ggaatgtgaa gctttatcga tcgtcgtttc cgcagaaaat tccaagtgta agaagggagg cttgggagct ctgcagaacc tggacgcgtc acgccctcca tctgccccgc gcagctcgcg caccgtcacc cggaaaggac caacttcctc cgtcattgac agtgatcgcc cgcatgcctg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

<210>2 <211>6 <212> PRT <213> Ganoderma microsporum <400〉2

Leu Ala Trp Asn Val Lys 1 5 1299735

<210〉3 <211>10 <212> PRT <213> Ganoderma microsporum <400>3

Asp Leu Gly Val Arg Pro Ser Tyr Ala Val 1 5 10

Claims (1)

1299735 公告本 十、申請專利範圍： • 1.一種選殖自小孢子靈芝的免疫調節蛋白質，其胺基酸 序列係由序列表SEQ ID NO 1之核苷酸序列所演繹 生成。 2.如申請專利範圍第1項的免疫調節蛋白質，係選殖自 小抱子靈芝 RSH 0821 〇 # 3.如申請專利範圍第1項的免疫調節蛋白質，其 MALDI-TOF分析之分子量為 15863.79 Da 。 4. 如申請專利範圍第1項的免疫調節蛋白質，係以同源 雙體形式存在。 5. 如申請專利範圍第1項的免疫調節蛋白質，包括序列 表SEQ ID NO 2及SEQ ID NO 3之胺基酸序歹，J。 φ 6. —種核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO 1所示。 hX3S^ -- 1