CN115925927A - 一种抗il-10单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗il-10单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115925927A CN115925927A CN202210906082.0A CN202210906082A CN115925927A CN 115925927 A CN115925927 A CN 115925927A CN 202210906082 A CN202210906082 A CN 202210906082A CN 115925927 A CN115925927 A CN 115925927A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- variable region
- monoclonal antibody
- chain variable
- seq
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗IL‑10单克隆抗体及其制备方法和应用，公开了抗IL‑10单克隆抗体、抗体的制备方法、抗体在制备用于多种疾病中药物的应用，还公开了本发明提供的抗体可配对使用检测抗原的应用。本发明抗IL‑10单克隆抗体能特异性地与IL‑10抗原或sIL‑10抗原结合，为通过基因工程方法诊断或治疗或预防病毒感染、肿瘤或炎性疾病建立基础；本发明抗体还可配对使用，精准测量检测血清中的sIL‑10浓度；此外本发明所述的抗IL‑10单克隆抗体具有特异性抗原结合结构域，可靶向结合IL‑10蛋白，也能够用于免疫组化、ELISA等试验。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和基因工程技术领域，具体涉及一种抗IL-10单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)是一种多功能负性II类细胞因子，属于同源二聚体分泌物，由两个亚基组成，分子量大小为18kd。IL-10是一种多细胞源、多功能的调节因子，能够调节细胞的生长分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。几乎所有淋巴细胞均能合成IL-10，体内最重要的来源是单核巨噬细胞和T淋巴细胞。此外，B细胞、树突状细胞、NK细胞和肥大细胞等也能合成IL-10。
IL-10在先天免疫和适应性免疫中均发挥免疫抑制和免疫刺激作用，从而调节多种免疫细胞类型的反应。IL-10可以调控抗原呈递细胞(APC)如树突状细胞(DC)、朗格汉斯细胞和巨噬细胞的功能。IL-10可通过增加各种受体表达，以增强单核巨噬细胞的吞噬作用，这些受体能够与调理素或非调理素结合的病原微生物相结合并摄取入胞，IL-10刺激的单核细胞还能够增强IgG-Fc受体表达(如CD64、CD32和CD16)，CD14样的分子的表达。IL-10能够有效地抑制前炎症细胞因子的表达，也可以抑制MHC-II类分子的表达，对T细胞合成IL-2等因子也有明显的抑制作用。调节性B细胞可通过产生IL-10抑制机体的免疫炎症反应。（Bibby JA等，Cholesterol metabolism drives regulatory B cell IL-10.NatCommun. 2020 Jul 8）。另一方面，IL-10能增强B细胞存活、增殖和抗体产生。此外，IL-10和CD4+T细胞介导的轴突切断后神经保护机制的相互依赖性，CD4+T细胞可能会增强对IL-10的中枢反应，而CD4+T细胞内的IL-10信号传导对于它们拯救轴突运动神经元存活的能力是必要的(Runge EM等，CD4+T cell expression of the IL-10 receptor.JNeuroinflammation. 2020 Apr 17)。
IL-10表达异常均可引起炎症相关的疾病。肿瘤生长、红斑狼疮、淋巴瘤、皮肤癌等都属于IL-10表达过多的疾病，而克罗恩病、银屑病、类风湿关节炎、器官移植反应等属于IL-10表达缺乏的疾病。因此，血清中IL-10水平对控制炎症等某些疾病的进展至关重要，需开发其在临床诊断和治疗上的应用方式。
发明内容
有鉴于此，本发明期望提供一种抗IL-10单克隆抗体及其制备方法和应用，所提供的抗IL-10单克隆抗体可配对使用，可通过双抗体夹心ELISA法实现对重组IL-10抗原和临床样本中sIL-10的精确检测。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种抗IL-10单克隆抗体，包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，编码上述抗IL-10单克隆抗体，其DNA序列包括重链可变区和轻链可变区的编码DNA序列；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，另外一种抗IL-10单克隆抗体，包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步地，编码上述抗IL-10单克隆抗体，其DNA序列包括重链可变区和轻链可变区的编码DNA序列；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
这里，上述抗IL-10单克隆抗体，能特异性地与IL-10抗原或sIL-10抗原结合，为通过基因工程方法诊断或治疗或预防病毒感染、肿瘤或炎性疾病建立基础；且上述抗IL-10单克隆抗体可配对使用，精准测量检测血清中的sIL-10浓度，可快速帮助医生判断患者的免疫状态。
本发明还另外提供一种抗IL-10单克隆抗体的制备方法，制备上述抗IL-10单克隆抗体，包括以下步骤：
1）用人IL-10胞外免疫兔，作出免疫反应后，处死，取脾脏，分离获得脾脏细胞；
2）筛选获得能特异性结合人IL-10的B细胞；
3）将B细胞进行亚克隆，获得抗体重链和轻链的可变区编码序列；
4）获得的可变区编码序列进行重组、转染、纯化后获得抗IL-10单克隆抗体。
这里，上述可变区编码序列为RNA序列；此外，本发明方法提供了两株IL-10兔来源单克隆抗体，丰富了抗体的类型。
进一步地，本发明还提供药物组合物，包括上述抗IL-10单克隆抗体和药学上可接受的载体。
这里，所述药物组合物包括抗IL-10药物、干扰素、抗IL-10单克隆抗体、抗IL-10多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA药物或治疗性疫苗等。
进一步地，本发明还提供一种表达载体，包含上述抗IL-10单克隆抗体的编码DNA，分别用于表达上述抗IL-10单克隆抗体。
进一步地，本发明还提供一种原核或真核宿主细胞，包含上述表达载体。
进一步地，本发明还提供抗IL-10单克隆抗体在制备治疗或预防人病毒感染、肿瘤及炎性疾病药物中的用途。
进一步地，本发明还提供一种用于检测IL-10抗原或sIL-10抗原的试剂盒，包括上述抗IL-10单克隆抗体。
这里，上述抗IL-10单克隆抗体具有特异性抗原结合结构域，可靶向结合IL-10蛋白，也能够用于免疫组化、ELISA等试验。
进一步地，本发明还提供一种检测IL-10抗原或sIL-10抗原的方法，使用上述用于检测IL-10抗原或sIL-10抗原的试剂盒，通过双抗体夹心ELISA法进行检测。
本发明有益效果如下：1）本发明提供一种抗IL-10单克隆抗体及其制备方法和应用，能特异性地与IL-10抗原或sIL-10抗原结合，为通过基因工程方法诊断或治疗或预防病毒感染、肿瘤或炎性疾病建立基础；2）本发明提供的抗IL-10单克隆抗体可配对使用，精准检测血清中的sIL-10浓度，可帮助医生快速判断患者的免疫状态；3）本发明提供了两株IL-10兔来源单克隆抗体，丰富了抗体的类型；4）本发明所述的抗IL-10单克隆抗体具有特异性抗原结合结构域，可靶向结合IL-10蛋白，也能够用于免疫组化、ELISA等试验。
附图说明
图1为本发明实施例1中免疫后的新西兰白兔血清效价检测结果图；
图2为本发明实施例3中纯化的单克隆抗体特异性结合IL-10结果图；
图3为本发明实施例4中双抗体夹心法检测不同浓度IL-10的OD结果图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：IL-10特异性单克隆抗体的制备
1）用重组表达的人IL-10胞外区免疫新西兰大白兔，获得针对人IL-10的免疫反应。
抗原采用人IL-10胞外结构域的重组蛋白（IL-10）。第0天用含有400μg IL-10蛋白的400 μl的弗式完全佐剂（Sigma-Aldrich）的1：1乳液皮下免疫新西兰白兔。随后，第7，21和42天皮下注射含有200μg IL-10蛋白的弗式不完全佐剂（Sigma-Aldrich）的1：1乳液，从而对新西兰白兔（#R1、#R2）进行加强免疫。免疫后的新西兰白兔血清效价在三次免疫后达到104后以上。图1为本发明实施例1中免疫后的新西兰白兔血清效价检测结果图，如图1所示，表现最高抗体滴度的兔子（#R1）接受了200μg IL-10（不含佐剂）静脉注射加强免疫。
2）筛选得特异性结合人IL-10的淋巴B细胞，并进行亚克隆。
使用Lighting-Link R-Phycoerythrin（R-PE） Conjugation Kit（InnovaBiosciences公司）标记IL-10。将IL-10浓度调整至不超过1mg/ml；加1ul的LL-modifier试剂至10μl IL-10中混匀；将混合物加入Lighting-Link mix中的干粉状物中，重悬粉状物；室温放置至少3小时或者过夜；向混合物中加入1μl的LL-quencher试剂，30分钟后R-PE标记的IL-10即可使用。
提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，并加入荧光标记抗体：①PE-Cy7标记抗兔IgG抗体5μl；②APC标记抗兔MHCII抗体5μl；③R-PE标记IL-10 2ul。振荡混匀；用流式细胞仪分选收集MHCII-IgG+细胞，即为分泌IL-10抗体的B细胞。
3）IL-10特异性B细胞亚克隆。
使用RNA提取试剂盒Neasy mini Kit（Qiagen）提取分泌IL-10抗体的B细胞的RNA。采用SuperScript Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase(Invitrogen公司)进行RT-PCR反应，使用PrimerPremier5软件分别设计扩增兔单克隆抗体的重链和轻链全长基因的RT-PCR引物，重链引物序列分别为：RHC1、RHC2；轻链引物序列分别为：RLC1、RLC2，将特异性B细胞的RNA逆转录为cDNA，分别扩增编码抗体重链和轻链的全长片段。
其中，RT-PCR引物序列分别如下：
RHC1：5’-CCGTCCAAGCTTATGGAGACTGGGCTGCGCTGGC-3’
RHC2：5’-CAACAAGGATCCCTATTTACCCGGAGAGCGGGAG-3’
RLC1：5’-CCGTCCAAGCTTATGGACACGAGGGCCCCCACTC-3’
RLC2：5’-CAACAAGGATCCCTAACAGTCACCCCTATTGAAGC-3’
反应条件为50℃ 30min，94℃ 2min，随后进行（94℃ 30s，57℃ 30s，68℃ 1min）35次循环，68℃延伸5min，4℃ 5min。PCR扩增后，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。
实施例2：编码IL-10单克隆抗体重链和轻链全长基因测序及抗体重组生产
（1）编码IL-10单克隆抗体重链和轻链全长基因测序
将克隆获得的编码全长重链与轻链基因的PCR产物连接到pcDNA3.1(ThermoFisher Scientific)表达载体上，并将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，随机挑取10个单菌落用RT-PCR引物进行扩增，RT-PCR引物序列参照实施例中RHC1、RHC2、RLC1、RLC2，反应条件为：94℃预变性30s，（94℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸1min）30次循环，最后68℃延伸5min。取5ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出还有抗体重链和轻链的转化子。同时将阳性转化子送至南京擎科公司测序，最终获得20G3和17E9的独特核苷酸/蛋白序列，序列信息分别如下：
20G3重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.1
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTISSYGVSWVRQAPGKGLEWIGIIGSSGDTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCVRGIITAGIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
20G3重链可变区DNA序列：SEQ ID NO.2
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTTACCATCAGTAGCTATGGAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGTATCATTGGTAGTAGTGGTGACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATTACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGTCAGAGGGATTATTACTGCCGGGATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG
20G3轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.3
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTASSVSAAVGGTVTISCQSSQSVYMETWLSWYQQKLGQPPKLLIYEASKLASGVPPRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCVGDYISNIVTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDW
20G3轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO.4
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCGCAAGTGCTGACCCAGACTGCATCGTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATATGGAGACCTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAATTAGGGCAGCCTCCCAAGCTCTTGATCTACGAAGCATCCAAATTGGCATCTGGGGTCCCGCCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGTAGGCGATTATATTAGTAATATTGTTACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGGTAG
17E9重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.5
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYSMSWVRQAPGKGLEWIGIISSSGTTIYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGDFYAGISHPYYFNIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
17E9重链可变区DNA序列：SEQ ID NO.6
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTATTCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTAGTAGTAGTGGTACCACAATCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGATTTTTATGCTGGTATTAGCCATCCTTACTACTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG
17E9轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.7
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSLYNNKNLAWYQQKPGQPPKLLIYDASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQGEFSCSSADCTAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
17E9轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO.8
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGGCCAGTCAGAGTCTTTATAATAACAAAAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGAATTTAGTTGTAGTAGTGCTGATTGTACTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG
（2）生产和纯化IL-10抗体
将表达单克隆抗体重链和轻链的质粒共转染293F细胞，并在37℃摇瓶中培养4天，采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的抗体。
实施例3:ELISA检测单克隆抗体20G3和17E9对IL-10蛋白的结合能力
在96孔板（Costar，42592）中包被100μl IL-10蛋白（1μg/mL）4℃冰箱过夜。次日用200μl 0.1％Triton-X的PBS洗涤液洗涤5遍，在200μl含有5％奶粉的PBS-T（0.05%吐温）中室温封闭1小时，洗涤5遍，加入倍比稀释的IL-10抗体20G3或17E9分别100μl室温孵育1小时，洗涤5遍，每孔中加入100μl耦合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG于室温孵育1小时。将板用0.1％Triton-X的PBS洗涤液洗涤五次，然后每孔中依次加入TMB显色液，显色3分钟，加入25ul终止液使反应停止，轻轻振荡混匀。设定全自动多功能酶标仪双波长为450nm/610nm，用空白孔调零点后测定各孔OD值。图2为本发明实施例3中纯化的单克隆抗体特异性结合IL-10结果图，如图2所示，纯化后的单克隆抗体能够特异性结合IL-10蛋白。随着抗体浓度的增加，OD读数也呈显著增加的趋势。
实施例4:双抗体夹心法ELISA检测IL-10浓度
（1）生物素标记抗体的制备
利用EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒（Thermo Scientific）标记检测抗体17E9。具体方法如下：将sulfo-NHS-LC-biotin从冰箱中取出，并平衡至室温。每1mg IgG抗体加入26.6μl生物素标记试剂，置于冰上2小时。标记结束后，通过透析方法除去多余的未标记上的生物素试剂。
（2）双抗体夹心ELISA试验
在96孔板（Costar）中加入100μl用碳酸盐缓冲溶液（PH=9.4）稀释后的捕获的抗体20G3（2μg/mL）铺板，在4℃孵育过夜。次日用200μl 0.1％Triton-X的PBS洗涤液洗涤5遍；并在200μl含有5％奶粉的PBS-T（0.05%吐温）中室温封闭1小时，洗涤5遍；加入100μl等比稀释的重组蛋白IL-10，室温孵育1小时；随后用洗涤液洗板5遍，每孔中加入在（1）中生物素标记的检测抗体17E9（1μg/mL），室温孵育1小时；随后用洗涤液洗板5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶－链霉亲和素（HRP-streptavidin，Jackson Immuno Lab），并在室温孵育1小时。将板用洗涤液清洗五次，然后每孔中依次加入TMB显色液，显色3分钟，加入25ul终止液使反应停止，轻轻振荡混匀。设定全自动多功能酶标仪双波长为450nm/610nm，用空白孔调零点后测定各孔OD值。
图3为本发明实施例4中双抗体夹心法检测不同浓度IL-10的OD结果图，从图3可知，本发明提供的可配对使用的抗IL-10单克隆抗体利用双抗体夹心法检测重组蛋白IL-10的浓度可低至2.1ng/ml，检测精度高。
以上所涉及试剂、仪器的具体货号及型号不作限制及详细描述，作为公知常识，本领域的技术人员能够理解。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗IL-10单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种抗IL-10单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，编码如权利要求1所述的抗IL-10单克隆抗体，其DNA序列包括重链可变区和轻链可变区的编码DNA序列；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种抗IL-10单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.一种抗IL-10单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，编码如权利要求3所述的抗IL-10单克隆抗体，其DNA序列包括重链可变区和轻链可变区的编码DNA序列；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
5.一种抗IL-10单克隆抗体的制备方法，其特征在于，如权利要求1或3所述的抗IL-10单克隆抗体，其制备方法包括以下步骤：
1）用人IL-10胞外免疫兔，作出免疫反应后，处死，取脾脏，分离获得脾脏细胞；
2）筛选获得能特异性结合人IL-10的B细胞；
3）将B细胞进行亚克隆，获得抗体重链和轻链的可变区编码序列；
4）获得的可变区编码序列进行重组、转染、纯化后获得抗IL-10单克隆抗体。
6.药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的抗IL-10单克隆抗体和药学上可接受的载体。
7.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2或4所述的抗IL-10单克隆抗体的编码DNA，分别用于表达如权利要求1或3所述的抗IL-10单克隆抗体。
8.一种原核或真核宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求7所述的表达载体。
9.一种如权利要求1或3所述的抗IL-10单克隆抗体在制备治疗或预防人病毒感染、肿瘤及炎性疾病药物中的用途。
10.一种用于检测IL-10抗原或sIL-10抗原的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的抗IL-10单克隆抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210906082.0A CN115925927A (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 一种抗il-10单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210906082.0A CN115925927A (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 一种抗il-10单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115925927A true CN115925927A (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=86549353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210906082.0A Pending CN115925927A (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 一种抗il-10单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115925927A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117003869A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-11-07 | 南京佰抗生物科技有限公司 | 抗il-10蛋白的单克隆抗体组合物及应用 |
-
2022
- 2022-07-29 CN CN202210906082.0A patent/CN115925927A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117003869A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-11-07 | 南京佰抗生物科技有限公司 | 抗il-10蛋白的单克隆抗体组合物及应用 |
| CN117003869B (zh) * | 2023-09-28 | 2023-12-26 | 南京佰抗生物科技有限公司 | 抗il-10蛋白的单克隆抗体组合物及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2015109931A1 (zh) | 一种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3融合蛋白 | |
| US8404803B2 (en) | Cancer-associated antigen analogue peptides and uses thereof | |
| CN113286604B (zh) | 治疗炎症性疾病的蛋白质 | |
| WO2020082130A1 (en) | T-cell receptors and uses thereof | |
| Richardson et al. | Candidalysins are a new family of cytolytic fungal peptide toxins | |
| EP3624834A1 (en) | Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods | |
| CN115925927A (zh) | 一种抗il-10单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN112375147A (zh) | 一种抗人ykl-40中和性单克隆抗体及其制备与应用 | |
| Zhu et al. | Bone morphogenetic protein 1 targeting COL1A1 and COL1A2 to regulate the epithelial-mesenchymal transition process of colon cancer SW620 cells | |
| CN117069842B (zh) | 具有特定等电点的抗人bcma纳米抗体及car-t和应用 | |
| Lin et al. | CD200R signaling contributes to unfavorable tumor microenvironment through regulating production of chemokines by tumor-associated myeloid cells | |
| CN116693626A (zh) | 订书肽及其用途和在体外扩增干细胞的方法 | |
| WO2023065700A1 (en) | A growth hormone fusion protein and itsuse thereof | |
| CN115960227A (zh) | 一种抗人msh2的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| Shukla et al. | Multiple antibodies targeting tumor-specific mutations redirect immune cells to inhibit tumor growth and increase survival in experimental animal models | |
| CN114656561B (zh) | 一种抗ip-10单克隆抗体 | |
| CN112111496A (zh) | 稀有鮈鲫载脂蛋白ApoE基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用 | |
| Kim et al. | Species specific antiviral activity of porcine interferon-α8 (IFNα8) | |
| EP2128172B1 (en) | Preparation process of recombinant human p43 protein | |
| US20230270787A1 (en) | Cell surface antigen of activated immune cell and various uses thereof | |
| CN116621946B (zh) | 多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用 | |
| CN114573712B (zh) | 一种嵌合抗原受体、car-t细胞及其应用 | |
| CN116333172B (zh) | 融合蛋白及其应用 | |
| CN116813783B (zh) | 一种抗人cd28工程抗体及应用 | |
| WO2023074713A1 (ja) | Ｔ細胞の品質評価方法、および当該方法に用いる試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |