TWI296929B - - Google Patents

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1296929 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關僅生長於台灣的特有物種牛樟樹 hnehirae)樹心内的菇類—樟芝⑷^〇(細camphorata或Antrodia ⑽似)一之菌絲體，將其用以預防及治療b型肝炎、酒精性肝 損傷及四氯化碳肝損傷之製劑，其包括該菌絲體作為活性成分。 【先前技術】 棟芝的型態 樟芝又名牛樟藉、樟|底、樟窟内蔬，台灣有稱陰陽對口益。掉芝 子實體屬夕年生’具有強烈沖鼻的樟樹香氣，此與—般靈芝類有很大 的差異’其外型呈板狀或鐘狀。板狀型態者，面為橘紅(黃)色，整面 全有菌孔，板底層錢黃自㈣木栓f，藉此木栓_著在牛樟樹中 空心材内壁上生長。鐘狀型態者，子實層(鐘面)亦呈橘(黃)色，充滿菌 孔(4〜5個菌孔/毫米），内有孢子味極苦，新鮮時為橘紅色，之後會成 為橘褐色或褐色’鐘咖呈暗綠褐色的皮殼。㈣微馳察其擔抱 子，其型態為平滑無色之透明微彎柱形。 樟芝的生物特性 、知芝是生長在牛樟樹幹中空内壁上，因為這個特性，3 很多牛樟樹倒伏。文獻記载，樟芝是在牛樟樹上目前唯一發現料 腐杉菌，雜她助，_蝴。但術蝴性細 因此牛掉樹好目級，物__袍賴，但因 1296929 芝償_，超過牛樟樹的經濟舰，因此是不是牛樟樹的病原菌已 經不重要了。 樺芝的培養技術 樟芝的培養，人工裁培技術方面，仍有待努力。所以，目前仍是 以_集的方式來獲得。但是採集樟芝不是件容易的事，因為首先 要谢細舰。f細崎_娜，咖為相似， 不易刀辨。目别最直接的方法已由藤田安二提出，冇掉幹油是以黃掉 油㈣〇le)與十五祕為主，因而有沙士中黃樟素的味道。牛樟幹油 則以松卿均inenol)為主，而有樟腦油的味道，藉此即可區別牛 禅與冇樟。第二個晴要從大姆蝴有中酬樹幹才行， 此相當不易。空财若有樟芝，射定期採集。 由於找哥中空洞的牛樟樹幹不易，不肖商人乾脆將牛掉樹砍倒， 以期日後能長轉芝，進而收集販㈣此，為環保及經濟上的考量， 發展人工栽培樟芝是鮮進行的方向。可惜岐人讀培樟芝技術一 f無法突破。樟芝在牛樟柄上生長極為緩慢，甚至停滯。因此，若 此改以現代錄触’來培養料_體，肢躲濟、最符合環保 的人工培育法。 樟芝之藥效及其活性成分 早』的似疋台灣原住民在採伐時，無意間發現了牛樟樹上的樟 芝原住民因生活型態之故，體能消耗量較大，肝的病變對原住民來 兒疋最大的威脅，民族性使然，原住民較喜歡喝酒、宿醉在所難免， 1296929 因喝酒過多導致肝病變的比率亦是居高不下。但在喝過樟芝的烹煮 液’竟可不藥讀、強身麵、觸效力更是—流，至此原住民便將 樟芝奉為上品，成為原住民的傳統珍責藥材。民間傳說對肝癌及子宮 癌特別有效，也有人認為可治急性腹痛。 因此有鑑於： L樟芝唯-寄生物種-牛樟樹，屬鄕育類—級木樹種，且為有空心 的牛樟樹之不易取得； 2. 樟芝子實體的試管内(in vitro)及離牛樟樹心空洞外的培育之困難 性； 3. 樟芝_體亦有相似生物功能，且__培養和擴大生產較可 行；及 而要對此口4獨有的樟樹所具保肝功能予以科學性研究以確定 其臨床功效； ”本案發明人乃經精深研究，發現樟芝子實體與菌絲體，其中特別 疋^體培養所得菌絲體皆具有針對酒精誘發肝炎的保肝功能，因而據 以完成本發明。 如上所述’本發明提出一種用以預防及治療B型肝炎、酒精性肝 =及四減侧叙#彻，細細猶輪成分。 【發明内容】

本發明所用樟芝菌絲體係得自寄存於中華民國台灣省新竹市食 品工業研究所菌種保存中心的樟芝菌絲體ccrc 3测和CCRC 1296929 掉芝菌絲體聽體培養，基本上係採㈣技術來進行。其中包括 將菌絲體接種於平板上，於猶溫度如⑽t，（雜賴溫約^ 。0下培養約2週後，刮取菌絲接種於燒瓶内，用實施例中所列培養 基’在約3(TC，PH2-8，較歸ρΗ4·7，更佳者約pH4 5，及振盡速 率50-250 rpm之下振盪培養到1〇g期初期，亦即，約5 7天；最後， 將燒瓶培養物接種於轉槽培養基(同燒瓶培養基)内，在15賓c，(較 佳者周溫約坑），槽壓〇.⑴公斤/平方公分，及pH約4.5下，以 〇.5-h™通氣速率通入域，或找與氧氣，二氧化碳或氮氣的混合 物’較佳者空亂，在50-300 rpm挽拌速率下培養約816天。即得掉 <菌絲體液體培養懸浮液，包括菌絲體與澄清液。 將菌絲體與液體分開之方法可採用習知技術，例如離心，過渡， 沉著(settling)，傾析(decantation)，等。於本發明一較佳實施例中，係 採用離心法，使用制的離心機，例如歐式離心脫水機，如可得自瑞 典 ALFA LAVAL 公司之 Decater NX418 s ;以 32〇〇 卿(4〇〇〇 χ 幻離心 即分離出菌絲體和澄清液。 於本發明保肝製劑包括樟芝子實體與_絲體與視需要的賦形 Μ稀釋劑’或載劑混合而製成各種形式的劑型，例如，乾粉，氣霧 劑，懸浮液，或固體填充膠囊，及錠劑。 任何醫藥可接受的賦形劑都可用來調配錠劑。錠劑典型地含有約 0·1至約1克的樟芝子實體與菌絲體。因此，例如，可將樟芝子實體 與菌絲體與公涊為安全的醫藥賦形劑，包括液體稀釋劑，固體稀釋 劑，濕潤劑，黏合劑，崩解劑，和潤滑劑混合。參看，例如，丑⑽肋⑽Α 1296929 〇f Pharmaceutical Excipients 2nd Edition, Amer. Phann. Assoc. (1994) 〇 較佳的固體賦形劑包括乳糖，經丙基纖維素，月桂基硫酸銅，微晶纖 維素，滑石，膠體二氧化石夕，澱粉，硬脂酸鎂，硬脂酸，和聯致甲 基纖維素鈉。液體賦形劑包括，例如，丙二醇，甘油，和乙醇。該醫 藥組合物係用標準醫藥製造技術製備的，如在 Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990)5 Mack Publishing Co.? Easton, PA。彼等技術包括，例如，濕式造粒接著乾燥，研磨和壓製成有或無 薄膜塗覆的錠劑；乾式造粒接著研磨，㈣成有或無_塗覆驗 劑，乾摻合接著壓製成有或無薄膜塗覆的錠劑；模製键劑；藥包；懸 子，濕式造粒，乾燥和填充到明膠膠囊内；乾摻合填充到明膠膠囊内； 或將懸浮液填充_膠膠囊内。於鮮醫藥組合物中_活性成分構 成組合物重量的〇·1至99.9%，特別者約1至1〇%。 本發明保肝製劑係經由在大鼠體内一次酒精誘導模式下經由血 清生化值GOT、GPT、ALP、Glu、BUN和CRE與抗氧化酵素S0D、 過氧化氫酶(catalase)、GSH-Px等評估其保肝效果。另外，以活體内(in vivo)試驗…小鼠餵食試驗探討本發明保肝製劑對小鼠的致死率及毒 性。 此外，也檢測本發明保肝製劑之抗B型肝炎病毒活性，其中係分 別使用樟芝目賴的胁，帽和水的萃取物棚酵素雜免疫吸附

刀析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)使用抗人類 B 型肝炎病絲Φ抗原之科抗體及抗人類B浙炎病毒_/e抗原之 夕源抗體的酵素免疫檢驗試劑進行檢測。另外，使用pCR (聚合酶鏈 1296929 反應）之方法；比較服用前與服用樟芝菌絲體(每人每日約Μ克)三個 月後之數值進行活體内扣vivo) B肝病毒之檢測以測試樟芝菌絲體是 否具有抑制B肝病毒之效果。 【實施方式] 本發明要以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受彼等實施 例所限制。 實施例1 樟芝菌絲體之培養 菌、糸體菌株·為寄存於食品工業研究所的CCRC:35398菌株。 平板培養·將菌絲體接種於平板上，於30°C下培養約2週。 " 引取平板上的菌絲接種於燒瓶内，用下列培養基，在約30 、PH 4·5下’於搖動機上以振蘯速率5〇_25〇哪振盪培養到1〇g期 初期，亦即，約5_7天； 培養基配方 含量（會吾 1 0.1 0.05 0.05 0.05 2 0.5 0.2 毅類(如麥粉類） 蛋白 硫酸鎂 磷酸氫二鉀 硫酸鐵 庶、糖

酵母抽出物、粉、I 豆類(如黃豆粉、蛘-从' 碌旦粉、大豆粉等） 1296929 醋酵槽培養： 培養基同上，將燒瓶培養物接種於酸酵槽培養基内，在坑，槽 壓από公斤/平方公分’及pH約45下，以1料/分通氣速率通 入空氣，在綱ΦΓΠ辦速率下培養約1G天，即得棒芝菌絲體液體 培養懸浮液，包括菌絲體與澄清液。 結果：卿升_液_完畢可得2奸_ _(乾重)及9G升之渡液。 實施例2 -、酒精誘發急性肝炎之活ttminvivo)試驗： 1. 方法： m #之子實體與菌絲體九天，於第九天管餵後6小時 /主射/酉精18小時後從頸動脈取血，測生化值，並取肝、腎，置 於液態氮中冷凍後再存放於箱中。 2. 流程： 〇h 24h 48h............第九天第十天 (9:00am) (9:00am) (9:00am)....(3:00pm) (9:〇〇am)

3.組別： A. 組·正吊對知組一·生理鹽水(N〇rmai sa]ine)(p〇. i〇毫升/公斤)+生理 鹽水(i.p· 10毫升/公斤） B. 組：負對照組(肝損傷組)一生理鹽水(R〇· 10毫升/公斤)+酒精(i p, 5 1296929 克/公斤） c.組：正對照組(水飛薊素㈣ymar㈣治療對照組)一水飛薊素(p〇 2〇〇 毫克/公斤)+酒精(i.p· 5克/公斤） 、、且實驗組一掉之菌絲體(Ρ·〇· 〇·5克/公斤)+酒精(ί·ρ· 5克/公斤） Ε•組·實驗組一樟芝菌絲體(ρ·〇· 1克/公斤)+酒精(i.p· 5克/公斤） F·組：實驗組一樟芝子實體(ρ〇· 〇·5克/公斤)+酒精(ip· 5克/公斤） G·組：實驗組—樟芝子實體(Ρ.〇· 1克/公斤)+酒精(i.p· 5克/公斤） Η·組：實驗組一樟芝菌絲體(RO· i克/公斤） 注:H組不注射酒精，僅作為對照之用 結果： 一 ·血清生化值 血清生化值的結果顯示於圖1至6之中。 由生化值的觀察可知，酒精的投予會造成肝損傷組(；6組)(3〇丁與 GPT指數顯著地上升，表補精確實造成了肝損傷。同時，水飛莉素 、，且(C組’肝治療組)與各劑量之樟芝菌絲體與子實體則發揮了治療的 效果，在GOT與GPT指數上與肝損傷組有顯著性差異(p<〇 〇5)。這 些結果說日轉芝具有減少轉紐肝傷害之效果。 另外，在Μ糖含量方面，肝損傷組中有顯著性上升，而掉芝菌 絲體與子麵之各織組職㈣抑雜之上升。此項結果證明 珊會構成營養需求上的蒼亂，干擾葡萄糖的利用，而掉芝菌絲體與 子實體則有防止_所帶來㈣杨亂_。至於bun與咖這兩、 1296929 項腎傷害生化指標方面，本研究發現各組間皆無顯著性的差異(p> 0·05>，表示不論酒精的注射或樟芝的投予均不會造成腎的傷害。 二·桦芝對肝臟中GSH含量之影饗： ，下表列出大鼠肝中GSH含量的測量結果。

GSH是重要的抗氧化物質及許多酵素之輔基，其為肝細胞中主要 的非蛋白硫醇基(non-protein thiol groups)來源，約佔肝中非蛋白質硫 醇基含量的95%，其含量代表細胞處於危機下之反應，而為重要抗氧 化物質。本次實驗結果顯示在急性酒精肝損傷的狀況下，不論是在餵 食水飛薊素或樟芝菌絲體或子實體9日之久，對肝中GSH含量並無 顯著影響办>〇.〇5)。 … 大鼠肝中GSH含量 ------— ______ 組別 GSH (微莫耳/券旰) ___ A 〇.65±〇.i9a 一__ B 〇.66±〇.〇9a ___ C 〇.76±〇.34a ___ D 0·90±〇·45a ——~_ E 〇.75±〇.ip ——F 〇.74±〇J4a ——-_ G 〇.51±〇.〇4a ——_ Η 〇.6±0.15a 數據為乎均隹土標準偏差，n=6-8隻老鼠

三·抗氧化酵素 抗氧化酵素方面的結果示於圖7至9之中。其結果摘要如下： 13 1296929 1· GSH-Px於正常組、肝損傷組、水飛薊素組與樟芝(菌絲體與子實 體)治療組之間並無顯著差異，此結果與的結果一致， 推測其原因為酒精代謝時會產生大量的η2〇2，此時則由Km值較 大的過氧化氫酶來負責H2〇2的清除，所以對GSH-Px影響較小， 這也解釋著TSH與NPSH於各組之間並無顯著差異(ρ>0β05)。 2.過氧化氫酶（catalase)的結果顯示肝損傷組的活性最高，可能是 肝細胞文氧化壓力下的一種代償反應，促使過氧化氫酶基因之表 現。菌絲體低劑量與高劑量組；子實體低劑量與高劑量組則與正 常組的差異不大(ρ>0·05)，代表樟芝之菌絲體與子實體的投予與 正常組一致，因此可推測樟芝之菌絲體與子實體皆具有保肝之能 力。 3· SOD的結果亦顯示肝損傷組的活性最高，此結果與Baskaretal.(2, )的結果一致，與其他組別有顯著性差異(p<〇 〇5)，推測酒精的投 予可促使SOD的基因表現，當s0D活性大量表現下將會產生許 多压〇2，附帶使過氧化氫酶活性大量表現，所以此二種抗氧化酵 素的活性皆上升。而菌絲體低劑量與高劑量組；子實體低劑量與 兩劑虿組皆與正常組無顯著差異(p>〇〇5)，因此同上原理推測樟 芝菌絲體與子實體皆有不錯的保肝能力。 四.TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) (MDA 含量)： 組別： A組：正常對照組； ^296929 組··肝損傷組； C組:水飛莉素(2。。毫克/公斤)組； …且:低劑量樟芝(〇.5克/公斤)； E^·· ( 1.〇 ^)； ^且：低缝子㈣⑷克/公斤）； G組··高劑量子實體（1.G克/公斤）； ⑴樟芝對照組…克/公斤）；

、中’ Η組不注射酒精；D、E兩組之掉芝即掉芝菌絲體

TBARS值_試主要麵心旨魏氧化二級雜韻^含量 實驗果示於圖1G中，圖中的數據為平均值±標準偏差，㈣。、㈣ 顯不管靖芝菌_與子實_ ΤΒ·值，不論在低舰與高綱 組、甚至僅^高繼樟芝㈣注翻精的_，都與肝損傷組（E 組）呈現顯者性的差異（p<〇()5)，因此推斷此模式下，棒芝菌絲體 與子實體具有抑獅f過氧化的能力，輯保肝效果。 實施例3 小鼠餵食量之探討 劑量選定試#; 試藥之處理及投予法·· 將試藥（樟芝L粉末，樟$菌絲體粉末）溶於生理食鹽水中，以 管餵法投予。 15 1296929 組別：每組十隻小白鼠 ⑴控制組：以生理食鹽水（每100克體重1毫升）代替樟芝王 ⑵低劑量樟芝王組：每公斤體重投予〇·5克樟芝王 ⑶高劑量組：每公斤體重投予1克樟芝王 劑董範®之選定·· 依照「葡萄王生物中心之建議量」：每人每日6顆，每顆042克， 共2·5克。以此劑量換算成小鼠（25g)之攝取量如下： 人體每日建議樟芝王服用量：25g 以人體每日食物攝取量（乾重）為500§ 所佔的食物比例為·· 2.5g/500g = 0.5% 小氣（體重25g)每日食物攝取量為5g 5gx〇.5% = 〇.〇25g 樟芝王 以此劑量為適中量。 配製及餵食法·· (1) 將樟芝王配在生理食鹽水 (2) 每l〇〇g體重以管餵投予1^之食鹽水 (3) 25S之小鼠需餵以〇·25 ml食鹽水 (4) 此〇.25ml中應含〇.〇25g樟芝王，亦即：〇.lg/m卜此為高劑量 (5) 低劑量則取中劑量之半：〇.5g/kg體重=〇.〇5g/100g體重=0.05 克/毫升 16 1296929 實施你Li 抗8型肝炎病毒活性 材料與方法 一、 供試樣品之製備 每一單味藥材樟芝菌絲10公克，放入50毫升三角燒瓶中，依序 以氯仿、甲醇及水萃取兩次。每次均以超音波振動萃取約15分 知’則可得氯仿、甲醇及水等三種抽出液，氣仿及曱醇抽出液分別 濃縮後可得氣仿抽出物及曱醇抽出物。水抽出液則以冷絲燥處理 可得水抽出物，上述三種抽出物分別進行活性檢測。 各樣品之代號如下： PT-A-1樟芝(CCRC353%)菌絲氣仿抽出物 PT-A-2樟芝(CCRC353%)菌絲曱醇抽出物 ΡΤ_Α·θ樟芝(CCRC35396)菌絲水抽出物 ΡΤ-Β-1樟芝(CCRC3539S)菌絲氣仿抽出物 PT-B-2樟芝(CCRC35398)菌絲甲醇抽出物 PT-B-3樟芝(CCRC35398)菌絲水抽出物 二、 抗B型肝炎病毒活性之檢測 (一）試管内(in vitro)抗B型肝炎病毒活性之檢測 1、細胞培養 以人類肝癌細麟MS_G2作為試驗對象，倾該細胞株的染 色體上有B型肝炎病毒_V)DNA崁入(inte㈣ed)，可持續高$ 17 1296929 地分泌B型肝炎病毒顆粒體，為極隹之研究b型肝炎病毒複 製，及探討藥物活性的體外模式(InVitr〇CdlModel)。 人類肝癌細胞株MS-G2，培養於含1〇。/。胎牛血清(fetai b〇vine serum，FBS)的 RPMI-1640 培養基(Gibco Lab〇rat〇rieS3 Grand Island， NY)中，每毫升的培養基内添加1〇〇IU青黴素(penicimn)、1〇〇微 克鏈黴素(streptomycin)、2·5微克防治黴(fimgiz〇ne)、2 mM榖胺 酿胺(L-glutamine)及1〇〇 —之非必需性氨基酸(n〇nessential amino acid，包括14.7微克榖胺酸，7·5微克甘胺酸，8·9微克丙 胺酸，13.3微克天冬胺酸，lu微克脯胺酸，15微克天冬胺醯胺 及10.5微克絲胺酸），以上稱完全培養基，置於含5%二氧化碳的 37%培養箱中。 2、抗病毒藥物之處理 在24洞的細胞培養皿，每洞種入3 〇χ 1〇5MS_G2細胞，待 一天後細胞充分附著於細胞培養皿底部，更新培養基，同時給予 三種（200, 150及100微克/毫升）不同劑量之供試藥物，每個劑 量三重覆。第三天更換-:域的培養基並給予測賴物。給藥處 理第二及六天，收集上層培養液，進行抗病毒活性測定。供試藥 物>谷於二次蒸餾之無菌水者，其對照組亦加入等體積之三次蒸餚 之無菌水’若供試藥物溶於二甲亞互凰(DMS〇)者，其對照組亦 加入等體積之DMSO，DMSO之劑量最高為2·5微升/毫升。 1296929 3、 天冬胺酸轉胺_(Aspartate Aminotransferase (AST))之測定 給樂處理後，收集上層培養液，以Abbott Vision II AST assay kit測疋AST值’其早位為國際早位/升(intemati〇nai Unit per Liter (LLL/L)) ’用以作為樂物疋否具細胞毒性（Cy^〇t〇xicity)之指標。 4、 B型肝炎病毒表面抗原及e抗原之酵素免疫測定 利用酵素連結免疫吸附分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，使用抗人類b型肝炎病毒表面抗 原之單株抗體及抗人類B型肝炎病毒core/e抗原之多源抗體的酵 素免疫檢驗試劑〔普生生物科技公司，新竹，台灣〕，利用抗體 一抗原一抗體酵素接合體之三明治複合體，以含過氧化氫的燐苯 一氨（OPD)溶液呈色之，再以分光比色計DYNATECHMR7〇〇〇 型ELISA reader在490 nm測定之，所得的吸光值（〇 D vahie)反 應出抗原的多募。並以對照組的吸光值當1〇〇，依以下公式計算 其抑制百分比（Inhibition %): 對照組吸光值-給藥組吸光值 抑制百分比=______________ . χ100ο/〇 對照組吸光值 朴制百分比在20—35為輕度抑制，抑制百分比在35一45為中度 抑制，抑制百分比在45以上為強度抑制。 下表為服用樟芝菌絲體對Β肝病毒之抑制情形： 結果與討論： 19 1296929 表 1.樟芝萃取物 PT-A1，PT-A2, PT-A3, PT-B1，PT-B2,和 PT-B3 的抗 HbsAg 和 HbeAg 效應 處理3天 劑量(微克/毫升） HBsAg (百分抑制率％) HbeAg (百分抑制率％) AST (I.U./L) DMSO 2.5 0 0 14-25 PT-A1 240 Lyse Lyse 30.6 200 Lyse Lyse 26.2 150 Lyse Lyse 29.6 100 Lyse Lyse 26.0 75 59.0 60.5 24.3 PT-A2 240 64.9 60.9 23.9 200 53.7 55.2 22.2 150 50.6 51.9 19.8 100 41.0 29.1 17.2 75 36.6 27.0 17.3 PT-A3 240 0.3 10.6 15.9 200 9.4 10.5 15.2 150 13/7 7.9 19.2 100 11.7 7.1 19.7 75 -2.6 0.5 20.8 PT-B1 240 Lyse Lyse 27.1 200 Lyse Lyse 28.9 150 Lyse Lyse 25.6 100 Lyse Lyse 26.8 75 69.4 69.5 24.0 PT-B2 240 68.1 61.8 17.7 200 68.9 59.8 23.4 150 66.9 57.7 22.0 100 51.4 37.6 22.4 75 40.3 27.6 23.3 PT-B3 240 -0.6 13.6 21.9 200 14.9 16.5 20.7 150 16.0 12.9 21.1 100 -7,7 7.0 18.5 75 -15.4 0.7 18.9 百分抑制率：介於25%-35°/。為輕度抑制 介於35% - 45%為中度抑制 大於45%為強度抑制 結果顯不· 1. PT-B3及PT-A3在劑量240微克/毫升内，對HBV的表面抗原及e 20 1296929 抗原均無抑制作用亦無細胞毒害作用。 2· PT-A1及ΡΤ-Bl在高測試劑量1〇〇，150，200和240微克/毫升， 均呈現細胞毒害作用，但在75微克/毫升劑量則無明顯細胞毒害作 用’對HBV之表面抗原及e抗原均具強度抑制作用，百分抑制率 分別為 59%及 60.5% ; 69.4%及 69.5%。 3· PT_A3及PT-B3在五個測試劑量75，100，150，200，和240微克 /毫升’皆無細胞毒害作用，對HBV之表面抗原及e抗原均不具抑 制作用。 4· PT-A2及PT-B2在五個測試劑量75，100，150，200，和240微克 /毫升，皆無明顯細胞毒害作用，對HBV之表面抗原及e抗原均具 中度或強度抑制作用，抑制作用隨劑量增加而加大，最高抑制百分 比分別為 64.9%及 60.9°/。； 68.9%及 61.8%。 結論： !· Bs抗原與HBe抗原為臨床上檢驗血中b型肝炎病毒(HBV)感染的 標幟，分別表示正受到病毒感染及肝炎持續發生且病毒增殖。實驗 結果可知樟芝菌絲甲醇萃取物PT-A2及PT七2在最高測試劑量240 微克/毫升仍無細胞毒害作用，對HBV之表面抗原及e抗原均具強 度抑制作用，且與劑量有正相關性；且樟芝菌絲氣仿萃取物卩丁^^ 及PT-B1在最高測試劑量75微克/毫升仍無細胞毒害作用，對HgV 之表面抗原及e抗原均具強度抑制作用。 2·由本實驗結果顯示，所使用的兩株樟芝菌株(CCRC35396及 21 1296929 CCRC35398)結果相似，推測不同菌株的樟芝菌絲中，抗HBV有 效成分可能相同。 (二）活體内(in vivo) B肝病毒之檢測 活體内(in vivo) B肝病毒之檢測為使用pCR (聚合酶鏈反應）之 方法；比較志願者服用前與服用樟芝菌絲體(每人每日約4·5克)三個 月後之數值，發現樟芝菌絲體具有抑制3肝病毒之效果，，亦即具有治 療Β肝之功效。pCR檢測操作程序如下： 1·病毒DNA的製備 首先’利用 High pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche，Germany)進行 病毒DNA的製備。自每一志願者身上取25〇μ1血清，加入25〇 μ1新 鮮配製的 working solution (250 μι binding bufferf5 μ1 pdyA eaniel· RNA) ’接著加入50 μΐ的proteinase K，於72°C下反應10分鐘，然後 加入125 μΐ的isopropanol混合均勻，之後將溶液移入High pure filter tubes，以8000xg離心1分鐘，移除濾液，將mtertube與新的收集管 接合，加入 500 μΐ 的 inhibitor removal buffer 沖洗一次，以 8000 rpm 離心1分鐘，移除濾液，將filter tube與新的收集管接合，以450 μΐ 的wash buffer沖洗，8000xg離心1分鐘(此步驟重複二次），再以高速 離心(13000 rpm)10秒鐘，以去除殘留的wash buffer，最後加入4〇 μ1 的elution buffer，以8000 rpm離心1分鐘，所得到之濾液即為DNA。 2.HBVDNA定量測定 利用 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I 進行 PCR 擴 增取5 plHBVDNA為模板，力α入毛細管(capmary)内，再加入總體積 15 01的反應物（1卜1濃度為1〇卜]\/1的正向弓丨子(?1<丨11161：)及反向引子、24 1296929 μΐ 濃度為 25 mM 的 MgCL、2 μΐ 濃度 10 倍的 LightCycler FastStart 反 應混合液 SYBRGreenI、8 μΐ 的無菌水以及 〇·6 WLightCyclerFastStart

Eneyme混合液），將毛細管蓋上蓋子，以1500 φΠ1離心一秒鐘，接著 將毛細管放入旋筒(rotor)中以LightCycler的儀器進行PCR擴增。 Pe-incubation 反應條件為：95°C 3 分鐘，1 個循環。Amplification 反 應條件為：95°C 15秒、62°C 5秒、72°C 12秒，50個循環。而偵測 螢光的點是在72 C ’最後以LightCycler version 3.5分析軟體進行定量 分析。 姓名 食用情形 曰期 B 肝(PCR) (pg/ml) GOT (U/L) GPT (U/L)

志願者甲食用前........................................................................mm 8/28 16.80绿 27 37 m

志願者乙食用前................................................細I 8/28mm 2859 51 88 志願者丙食用前 8/28 麵 27.14 m 55 86 志願者丁食用前 *-··未檢測 正常標準值： 8/28 7.78 36 39

B 肝(PCR): <0·5 毫微克/毫升(pg/mi) GOT : 0-40 單位/升(u/L) GPT: 0-40單位/升 棟芝封四氣化碳所誘發大白鼠慢性肝損傷之保肝研究 23 1296929 一、 實驗動物： 動物品種· ICR小鼠、Wistar品系雄姓大白鼠（Wistar albino rats )。 動物來源：國家實驗動物繁殖及研究中心。. · 動物體重：ICR小鼠:20-25g;Wistar品系雄姓大白鼠:140_160g。 ” 飼養環境：本系之附設動物房，以Lab 5001之動物飼料餵食，房 内溫度控制在22±2°C、濕度65±5%，光照與黑暗各12小時。 二、 樟芝菌絲體： d咐rati/α campCCRC 35398購自於食品工業發展研究所， · 經葡萄王生物技術中心以PDA ( potato dextrose agar )斜面培養基培 養後，再經由深層發酵法培養所得。 三、 實驗設計： 48隻Wistar品係之雄姓大鼠，亂數分為四大組，每組12隻，其 分組方式如下： __ · 組別 皮下注射（S.C·) 口服管餵（Ρ·0·) Α·組··正常對照組 olive oil Normal saline B.組：CC14 組 40% CCl4/olive oil Normal saline C組：Silymarin治療組 40% CCU/olive oil Silymarin ( 25 mg/kg b.w.) D組：樟芝菌絲體組 40% CCU/olive oil 樟芝 0.5 g/kgb.w. A 組皮下注射 Olive oil (〇·3 ml/100g b.w·)，B-D 組皮下注射 40% CCl4/01ive oil (〇·3 ml/100g b.w)每週兩次（星期一與星期四），並於星 期二、三、五、六，於A與B組以胃管管餵Normal saline (1 ml/100g)， 24 1296929 C組管飯silymain (25 mg/kg b.w·)，在D組管餵樟芝菌絲體（0.5 g/kg b.w·)，於第一週尾部採血測肝臟生化值（SG0T與sGPT)。 四、實驗流程： CC14組+藥物投予組 空白對照組（A組） CC14組（B組）

V 每週一及週四背部 皮下注射Olive Oil (0.3 ml/l〇〇g b.w.) 每週一及週四背部 皮下注射40%CC14 (0.3 ml/100g b.w.) (C、D 組） 每週一及週四背部 皮下注射40%CC14 (0.3 ml/100g b.w.) 每週二、三、五、 六管餵 Normal saline (1 ml/l〇〇g b.w.) 每週二、三、五、 六管飯 Normal saline (1 ml/100g b.w,) 每週二、三、五、 六分別管餵 silymarin 與 0.5 g/kg b.w·樟芝 王(樟芝菌絲體） 於第一週投藥2小時後，尾部採血測肝臟生化值（sGOT與SGPT) 結果： 當肝細胞受到傷害時，肝中的G0T、GPT會從肝中脫逸到血清 中因此為#估肝損傷最常用的生化指標，其中以证丁較具專一性； GOT則廣泛存在於腎臟、胰臟、錄肌、腦部料，而以心臟與肝 臟最多，故其專—性較差。由圖11結果可知B組於-週後sG0T、 SGPT即有顯著性增高’顯示⑽所誘導的慢性肝炎模式，是成功 的，C與D組於所測得之sG〇T、sGPT與A組並無顯著差異，但 比B組都來得低，此結果顯示在一週之試驗週期，c組㈣_ 25 1296929 。組（G，5g/kg b.w·)能有效的降低 sG〇T、sGpT 值。 因此，在本試驗週期中，樟芝菌絲體對於四氣化碳所誘發之大白鼠 m肝損傷(化學性賴傷)具有倾妓。 總結： L綜合生化值GOT、GPT、Glu與抗氧化酵素㈣、過氧化氮酶、 GSHPx等的結果，證實—次酒精誘導模式下，樟芝菌絲體與子 實體確實具有保肝之效果。而樟芝菌絲體對於四氣化碳所誘發之 大白鼠慢性肝損傷(化學性肝損傷)亦具有保護效果。 2·樟芝菌絲甲醇萃取物心2及ρτ·Β2在最高測試劑量測微克/ 毫升仍無細胞作用，對pjgV之表面抗原及e抗原均具強度 抑制作用，且與劑量有正相關性；且樟芝菌絲氣仿萃取物叩^ 及PTB1在最尚測斌劑量75微克/毫升仍無細胞毒害作用，對 HBV之表面抗原及e抗原均具強度抑制作用。 3.樟芝菌絲體具有抑制b肝病毒之效果，亦即具有治療B肝之功 效。 【圖式簡單說明】 圖1至6為酒精誘發急性肝炎之活體内(in vivo)試驗中血清生化 值的結果，分別為圖1 : GOT ;圖2 ·· GPT ;圖3 : ALP ;圖4 : Glu ; 圖5 ·· BUN和圖6 : CRE ;其中A:正常對照組；B:肝損傷組；c:水飛 薊素(200毫克/公斤)組；D··樟芝菌絲體低劑量組(〇·5克/公斤）；於樟 芝菌絲體高劑量組(1·0克/公斤）；F:子實體低劑量組(〇·5克/公斤）；g·· 26 1296929 註:Η組 子實體高舰_級斤）；_芝触_克/ 。 不注射酒精。 數據為平均值土標準偏差；η=6_8大鼠。 圖7至9為酒精誘發急性肝炎之活體_ 素SOD、過氧化氫酶細㈣、Gs略等的評估結& ^乳化酵 S〇D ;圖8 :過氧化氫酶：和圖9 :咖办。其中1正二日=圖7 : 肝損傷組心侧_咖·；概^^ ; B:

公斤);E··樟芝高劑量組(1.〇克/公斤);F:子實體低劑量組(〇 5克&^ G:子實體高球〇克/公斤）；_芝龍組⑽克/公斤）。\主丑 組不注射騎。麟辭均值±標麵差；η#8戏。 °主况

圖1〇為TBARS _Α含量)試驗結果的圖式；其中A組··正常 對照組；B組：肝損傷組；C組：水賴素⑽毫克/公斤）組^ 組：低劑量樟芝（0.5克/公斤）；E組：高劑量掉芝（】〇克/公斤^ F 組：低劑量子實體（0.5線斤）；G t高劑量子實體（1()克/公斤 η :樟芝對驗（1.〇克/公斤）；其中，H組不注射酒精;d、£兩組 之樟芝即樟芝_體；數據為平均值±標準偏差；n=5小鼠。' 圖11為官儀樟芝菌絲體對皮下注射四氣化碳誘發慢性肝損傷之 第-週血清GOT、GPT含量的影響；數據為平均值士標準偏差；n=6 8 大鼠，數值之上方有相同之英文符號表示不具顯著性差異（p>〇〇5); A .正常對照組（Ohveoil); B : 40%四氣化碳組(〇·3 mi/kg); c :水飛 薊素(25毫克/公斤)組，· D ··樟芝菌絲體組(〇·5克/公斤）。 27 1296929 【主要元件符號說明】 無 【參考文獻】 1 · Ohta Y·，Sasak E·，Nishida K·，Kobayashi T·，Nagata M·，Ishiguro I· Preventive effect of Dai-saiko-to(Da-Chai-Hu-Tang) extract on disrupted hepatic active oxygen metabolism in rats with carbon tetrachloride- induced liver injury. Am. J. Chin. Med·， XXIII(l):53-645 1995. 2· Baskar R·，Malini MM” Varalakshmi P·，Balakrishna K” Rao RB· E ffect of lupeol isolated from Crataeva nurvala stem bark against free radical-induced toxicity in experimental urolithiasis.Fitotherapia，LXVII(2): 121-125, 1996. 3·蔡金川，中醫四方劑對實驗性肝損傷療效評估與抗氧化活性之 關係探討，中國醫藥學院，台中，1997。 28

Claims (1)

1296929 十、申請專利範圍： 1· 一種用以預防及治療B型肝炎、酒精性肝損傷及四氣化碳肝損傷之樟 之(如ira出a camp/zorate或也的d/wa胤)舰α)製劑，其包括樟芝子 實體及/或菌絲體作為活性成分，及視需要的恰當稀釋劑，賦形劑或栽 體。 2·如巾4專利範圍第1項之用以預防及治療β型肝炎、酒精性肝損傷及 四氯化碳肝損傷之樟芝製劑，其中該菌絲體為寄存於新竹食品工業發 展研究所菌種保存中心，登錄號石馬：CCRC 35398之棒芝菌絲體。 3. 如中請專利翻第丨項之㈣獅及治浙炎、酒精性肝損傷及_ 四亂化碳肝損傷之樟芝製劑，其中該菌絲體為寄存於新竹食品工業發 展研究所菌種保存中心，登錄號碼：CCRC36396之掉芝菌絲 4. 如申請專利範圍第！，2或3項中任—項之用以預防及治細型肝炎、， 酒精性肝損傷及四氣化碳肝損傷之樟芝製劑，其中該菌絲體係經液體， 醱酵培養生產而得者。 如申請專利瓣1，2或3項中任1之用以預防及治療3型肝炎、 酒精性肝祕及四魏碳賴叙财㈣，射龜性成分為子實 體及/或菌絲體的萃取物。 如申請專利侧第丨，2或3項作―奴用以預防及治療B型肝炎、 酒精性賴敍四統碳賴叙，其概在賊對册v 之表面抗原及6抗原織抑制_，可㈣獅及治療3型肝炎。 29