TWI293246B - - Google Patents

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1293246 A7 五、發明說明（1 ) 本申請案請求主張於1999年7月6日提出專利申請之美 國臨時專利申請案第60/142,407號之優先權。 發明之韻1 本發明係有關於一種用於對易罹患之溫血動物（包括 人颏）來治療及/或制止肥胖（尤其是腹部肥胖）以及治療或 抑制不正常胰島素抗性之發生之新穎方法。該等方法涉及 投樂以具有下列通式1之化合物或其等之藥學組成物。於其 他之具體例中，本案方法涉及投藥以一種選擇性肚隹激素受 體調節劑（“SERM”）與一種性類固醇前驅物之組合。 相關技藝之背i 肥胖，亦即一種以過多之體脂肪為特徵之病狀，對於許多 疾病（例如心血官疾病、高血壓、糖尿病和乳癌）而言係為一熟 知之危險因子。更甚者，個人之外貌在大多數人的整體幸福上 扮演一個重要之部份。 肥胖之常見治療[例如各種減肥餐（包含食物限定飲食） 、體重減輕程序和運動]對於許多人提供了各種不同程度之 減肥成功。然而，對那些利用習知技術而經驗到不足夠結 果之人而言，對於其他技術或是將之用作為習知技術之補 助，仍存在有一需求。 近來’一些雌激素同效劑/拮抗劑被揭露供用於治療或 制止肥胖··歐洲專利申請案編號Ep 〇 659 423 A1中之雷洛 赛芬（Raloxifene)和相關之化合物；歐洲專利申請案編號Ep 0 659 423 A2中之具有一苯並噻吩核心的雌激素同效劑； 國際專利申請案編號PCT/DK96/0011中之3,4-二苯基苯並 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 • ϋ ϋ n ----訂-------· it齊Sr 1曰i时t苟歐11肖—¥乍土沪sei 1293246 A7 __B7__ 五、發明說明（2 ) 二氫哌喃；國際專利申請案編號PCT/IB95/00286中之萘基 雌激素同效劑/拮抗劑。 亦曾有報導指出，檀莫賽芬（Tamoxifen)，亦即另一個 雌激素同效劑/拮抗劑，會制止雌性大鼠體内之止嘔靈 (sulpiride)-誘發的體重增加（Baptista et al.，Pharmacol·， Biochem· Behav· (1997)，57(1/2)，215-222)。亦曾有報導指 出，檀莫賽芬會模擬雌二醇（estradiol)對大鼠的食物攝取、 體重和身體組成之作用（Wade et al·，American Journal of Physiology 1993, 3(6)，R1219-1223)。 脫氫異雄固酮（DHEA)於治療及/或制止肥胖上也具有 有利之效用。於老化之司培瑞格-多利（Sprague-Dawley)大 鼠身上，史瓦茲（Schwartz)(於Kent，Geriatrics 37:157-160， 1982)觀察到藉由DHEA而使體重由600公克減低至500公 克且不影響食物的攝取。史瓦茲（Cancer 39:1129-1132, 1979)觀察到被給予DHEA (450毫克/公斤，一週3次）之C3H 小鼠相較於對照組動物得到顯著較輕之體重且活得更久、、 具有較少的體脂肪和更好的活動力。體重之減少被達成而 沒有失去胃口或是食物限制。更甚者，DHEA能夠制止被 培育成在成年期會變成肥胖之動物的體重增加（於Kent， Geriatrics 37:157-160，1982) 〇 DHEA投藥對於苗條之盧丘（Zuche〇大鼠雖有增力〇食 物攝取但是減少了體重增加。接受處理之之動物具有較小 之脂肪塊而因此，整體而言，暗示了 DHEA會增加食物代 謝，而造成較低之體重增加和脂肪積聚（Svec et al·，2nd Int_ Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 5 ----------#-裝--------訂--------t (請先閱讀背面之注咅2事項再填寫本頁) 1293246 五、發明說明（3) p56? abst? 1997) ° 肥胖被發現於Avy突變株小鼠（Yen et al.，Lipids 12:409-413，1977)和盧克（Zucker)大鼠（Cleary and Zisk， Fed· Proc· 42: 536, 1983)身上有被改善。DHEA治療之C3H 小鼠相較於對照組具有一較年輕之外貌（Schwartz，Cancer Res. 39: 1129-1132· 1979)。 腹部脂肪與有關於心血管胸部疾病之代謝性危險性因 子相關聯（Imbault et al·，Metabolism 1999，48 (3)，355-62 ; Ledoux et al· (CMAJ 1997, 157 Suppl.l，46-53)。 發明之摘要說明 於是，本發明之一個目的是減少脂肪組織，尤其是腹 部脂肪。 本發明之另一個目的是降低心血管疾病以及肥胖或過 多脂肪組織對之係為危險因子的其他疾病或病狀之風險。 於一個具體例中，本發明係要提供一種用於治療或抑 制易罹患之溫血動物（包括人類）之體重增加的新穎方法’ 該方法包含對一需要該治療或抑制之個體投藥以，含有戒 不含有一藥學稀釋賦形劑或載劑，一治療有效量之至少一 個具有通式I之化合物：

1293246 五、發明說明（4) 5,

化學式1 其中1和112是各自選自於下列群組：氫、羥基、-OM (M 係選自於由直鏈或支鏈(^-€4烷基、直鏈或支鏈C3-C4烯基 、直鏈或支鏈C3-C4炔基所構成之群組中）和一個可於活體 内轉化為羥基之部分； 其中G是-H或-CH3 ;以及 其中R3是一個選自於下列群組中之物種：吡咯啶基、 。辰啶並基、嗎啉並基和NRaRb (Ra和Rb分別是氫、直鏈或 支鏈CrC6烷基、直鏈或支鏈c3-C6烯基、直鏈或支鏈C3-C6 块基）。 於另一個具體例中，選擇性雌激素受體調節劑或其藥 學上可接受鹽被投藥以供減低腹部脂肪或減低腹部脂肪之 積聚。 於另一個具體例中，除了 一個選擇性雌激素受體調節 劑（SERM)之外，性類固醇前驅物（例如脫氫異雄固酮、脫 氫異雄固酮硫酸鹽、雄-5-烯-3b，17b-二醇）被投藥以供治療 肥胖或抑制體重增加。處於50歲或超過50歲的年齡之人類

I293246 五、發明說明（5 ) 被相#為對該組合治療有良好反應，有可能是因為前驅物 的含量傾向於會非所欲地隨年齡而減低。 因此，在那方面，本發明提供一種用於治療肥胖或抑 制體重增加之方法，其包含對一需要該治療或抑制之個體 投藥以，含有或不含有一藥學稀釋賦形物或載劑，一治療 有效置之至少一個SERM和一有效量之至少一個選自於下 列群組中之性類固醇前驅物：脫氫異雄固酮、脫氫異雄固 酉同硫酸鹽、雄-5-烯-3b，17b-二醇，以及可於活體内被轉化 成前述前驅物之任一者的化合物。 於另一方面，本發明提供一種用於治療或減低發展出 胰島素抗性之危險的方法，其包含一需要該治療或減低之 個體投藥以一治療有效量之至少一個Serm。於某些具體 例中，一有效1之至少一種選自於由脫氫異雄固_、脫氫 異雄固酮硫酸鹽、雄-5烯-3b，17b-二醇以及可於活體内被轉 化成此等之任一者之化合物的性類固醇前贐物亦被投藥以 作為一個組合治療之部分。 於另一方面，本發明提供一種用於治療肥胖之套組， 其具有一個第一容器包含至少一種SERM，以及一個第二 個谷器包含至少一種性類固醇前驅物，該前驅物係選自於 下列群組：脫氫異雄固酮、脫氫異雄固酮硫酸鹽、雄 稀_3b，17b-二醇，以及可於活體内被轉化成此等之任一者 的化合物。 一個藥學賦形劑載劑或稀釋劑也可被提供於一或多個 容器内’且可包含本技藝中已知之防腐劑和其他添加劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝 !1T--------f

I 1293246 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（6 ) 前述也能夠與此處所描述之各種不同發明之任一具體例内 所用的任一活性成份被包含之。 如此處所使用的，一個選擇性類固醇受體調節劑 (SERM)是為一個化合物，其直接地或是經由其活性代謝物 功能來當做乳房組織内之一個雌激素受體拮抗劑（“抗雌激 素”），但對體脂肪、骨骼組織和血清膽固醇含量仍提供類 似雌激素之作用（亦即，藉由減低血清膽固醇）。於活體外 或是於人類或大鼠乳房組織内會產生有如雌激素受體拮抗 劑之功能之非類固醇化合物（尤其是若該化合物對於人類 乳房癌鈿胞發揮有如一抗雌激素化合物之作用）有可能產 生有如一 SERM之功能。我們曾測試過並發現可產生有如 SERMs功能之非類固醇雌激素包含EM-800、EM-652、 EM-652.HC1 (EM-01538)、雷洛賽芬（Raloxifene)、檀莫赛 芬（Tamoxifene)、伊多賽芬（Idoxifene)、托里美芬 (Torimefene)、LY 353381、LY 335563、GW 5638和爵洛賽 芬（Droloxifene)(將於後文中作更詳盡之描述）。依照本發明 之任一具體例，當這些化合物被用作為抗雌激素時， SERMs較佳地理係以相同於本技藝中所知之予以投藥。 不欲為理論所限制，據信SERMs[有許多較佳地係具有 兩個藉由1至2個峡原子來連接之芳族環]被預期係經由最 谷易被雌激素受體所辨識之上述分子部份來與雌激素受體 交互作用。該等SERMs也具有支鏈，該支鏈可選擇性地造 成在乳房和子宮内膜組織内之拮抗特性但於其他組織（尤 其是骨路）内不具有拮抗特性。因此，SERMs能夠如所欲的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 9 ----------#裝--------訂--------§ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 B7 五、發明說明（7 ) 於乳房和子宮内膜組織内產生有如抗雌激素之功能，同時 令人訝異地且如所欲地對體脂肪具有類似雌激素之活性。 本發明同時包含如所欲地抑制額外的體重增加或如所 欲地提供體重減輕，即令正常體重沒有被達到。 如此處所使用的’肥胖此辭隱含一會導致一體重增加 之過多脂肪組織。本發明之制止和治療方法包含抑制體重 增加和誘發體重減少。本發明包含人體肥胖治療，其係藉 由減低該人體之體重至（和維持體重於）正常體重。本發明 也同時包含制止那些容易引發肥胖此種疾病之個體去產生 肥胖。需要此處所示之本發明的病患包含那些體重過重者（ 相較於醫學上所認知之正常體重）或是那些有變成體重過 重之危機者。 依照本發明SERMs也可以被用來降低血液甘油三酸 酯含量。舉例而言，ΕΜ·800(描述於本案中）被認為對此目 的而言是有效的。 於另一個具體例中，用於實施本發明之新穎的化合物 和藥學組成物被提供之。 而要δ亥治療或降低一給定疾病或病狀之開始的風險 之病患係為已被診斷為帶有此疾病者或是易於得到此疾病 者。本發明特別適用於，基於遺傳、環境因素或其他被確 認之危險因子，在得到本發明有關之病狀上要比一般群眾 處於更高危險度之個體。. 除非於他處另有敘明，本發明之活性化合物的較佳劑 量就治療和預防目的而言是一樣的。於本案中所討論之每 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格mo X 297公釐

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五、發明說明（8 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 不論要被-(或制止）的 做_二=二㊃^活性試劑於本案中被討論以當 數個不同之化合物而非-個具有多重活性之激素） 投藥之。 之早一化合物被 除非於他處另有敘明，‘‘化合 .^, ^ σ物此€和任何相關之分 合物或光學活性之形式。 以構物’呈—消旋混 除非於他處另有註明或從前後文可明顯知悉的，本案 之劑㈣指不受藥學賦形劑、稀釋劑、載劑或其他成份所 影響的活性化合物之重量，雖_等額外的成份如所欲地 :皮包含之，此如本案之實施例中所顯示的。一般被用於製 藥工業之任何劑量型態（膠囊、藥鍵、注射物或類似物）是 適合於供本案之使用，而且該等術語“賦形劑，，、“稀釋劑，， 或“載劑，，包含那些典型地在工業上與活性成份一起被包含 在該等劑量形式内之非活性成份。舉例而言，典型之膠囊 、藥丸、腸溶衣、固體或液體稀釋物或賦形劑、調味劑、 防腐劑或類似物被包含之。 於某些具體例中，於本案中所討論之活性成份的前驅 藥（亦即會於活體内轉化成活性成份之化合物）被使用之。 在製藥工業上已知許多官能基於活體内會轉化成本案中所 討論的活性化合物之官能基。參閱，例如Chaptet 5, “Design and Application of Prodrugs，” A Textbook of Drug Design & Development，Bundgaard & Larsen，Ed.，Harwood 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 11 ----------^--------^-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I293246 A7 ^--；-___ 五、發明說明（9 )

Academic Publishers GmbH (Chur，Switzerland，1991)。前 驅藥通常能夠提供較佳之生物可利用性、儲存安定性及/ 或製造之容易度、對應之活性化合物。 被使用於此處所討論之任一種治療之所有活性成份可 被配方成亦包含有一或多個其他活性成份之藥學組成物。 任擇地，其等可被各自分開地投藥但在時間上要能充分地 同時，藉此，一病患最終具有升高之血液位準或者是同時 地享受到每個活性成份（或策略）之效益。舉例而言，於本 發明之某些較佳具體例中，一或多個活性成份係要被配方 丨D於一個單一藥學組成物内。於本發明之其他具體例中，提 供一個包含至少兩個分開之容器的套組，其中至少一個容 器之内含物，就當中所含有之活性成份而言，全部或部分 地相異於至少一個另外的容器的内含物。二個或多個不同 之谷器被使用於本發明之組合治療中。於本案中所討論之 組合治療也包含使用該組合中之一個活性成份以製造一用 於治療（或制止）討論中的疾病之藥劑，其中該治療或制止 進一步包含該組合之另一活性成份或策略。 腹部脂肪被認為不同於整個身體肥胖，且可於沒有整 個身體肥胖時發生之。其亦被認為在心臟疾病上是一個$ 加危險之因子。腹部脂肪對於本發明能有利地產生反應。 本發明之較佳的SERMs，例如上述化學式1中的那些 ，對於子宮内膜不會有非所欲之雌激素作用，對於某些習 I 知方法中所應用之SERM療法是一個非常重要之改善。 被用於本發明之SERMs被認為有利地減低血液甘油 本紙張尺度3用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公爱) -----

訂·-----— (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -1裝 痤齊部皆慧材轰笱員1-消費^阼^,中製 1293246 1 A7 __B7_ 五、發明說明（1G ) 三酸酯還有胰島素抗性。 於本案中所討論之較佳具體例中，SERM之作用被 DHEA或類似之性類固醇前驅物所增強。 不欲為理論所限制，由組合SERMs和前驅物所得到之 協同作用的一個解釋可能為其等的作用機制上之至少部分 差異。舉例而言，DHEA顯現會增加食物代謝而不抑制胃 口。EM-652.HC1，一個SERM，顯現會抑制食物攝取。 圖式之簡要說明 第1圖係顯示，以增高的劑量（0.01、 0.03、 0.1、0.3 、1 mg/kg，口服，每天一次）之SERMs EM-800、雷洛赛 芬、檀莫賽芬和一個無活性之鏡像異構物 EM-776 (EM-800之鏡像異構物）對於卵巢切除的大鼠來處理35週之 整體體脂肪之作用。數據係以平均值士平均值之標準誤差 (SEM)來表示。: P<0.01實驗組相對於個別之對照組。 第2圖係顯示，卵巢完整之大鼠、卵巢切除的大鼠以及 以SERM EM-652.HC1或雌二醇來處理之卵巢切除的大鼠 ，在一個20天之處理期下，對於體重增加（A)、蛋白質增加 (B)以及脂肪增加（C)之作用。教據係以公克計之平均值 土SEM來表示。* Ρ<0·05相對於卵巢完整組；+ Ρ<0·05相對 於卵巢切除的（〇VX) +雌二醇組（僅有關於EM-652.HC1組） 〇 第3圖係顯示，卵巢完整之大鼠、卵巢切除的大鼠以及 以SERM EM-652.HC1或雌二醇來處理之卵巢切除的大鼠 ，在一個20天之處理期下，對於累積食物攝取量上之作用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 13 ----------«^ -------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) , 1293246 A7 __ B7____ 五、發明說明（11 ) 。數據係以公克來表示。 第4圖係顯示，卵巢完整之大鼠、卵巢切除的大鼠以及 以SERM EM-652.HC1或雌二醇來處理之卵巢切除的大鼠 ，在一個20天之處理期下，對於當作蛋白質之身體能量（A) 與當作脂肪（B)之身體能量的作用。數據係以千焦耳（kj)計 之平均值土SEM來表示。* Ρ<0·05相對於卵巢完整組； +Ρ<0·05相對於OVX+雌二醇組（僅有關於EM-652.HC1組）。 第5圖係顯示，卵巢完整之大鼠、卵巢切除的大鼠以及 以SERM EM-652.HC1或雌二醇來處理之卵巢切除的大鼠 ，在一個20天之處理期下，對於血清胰島素含量和血清葡 萄糖含量之作用。數據係以nmol/L計之平均值土SEM來表示 。* Ρ<0·05相對於卵巢完整組。 第6圖係顯示，動物為卵巢完整之大鼠，卵巢切除大鼠 ，以SERM EM-652.HC1或雌二醇治療之卵巢切除大鼠，在 一個20天之處理期下，對於白色脂肪組織參數之作用：鼠 蹊部的（Α)和腹膜後的（C)脂肪組織重量（數據係以公克計 之平均值土SEM來表示），鼠蹊部的（Β)和腹膜後的（D)白色 脂肪組織脂蛋白脂肪酶活性（數據係以？U/g蛋白質計之平 均值土SEM來表示；+Ρ<0·05相對於OVX+雌二醇組（僅有關 於EM-652.HC1組）。 第7圖係顯示，在一個20天週處理期下，對於肩胛骨間 棕色脂肪組織之參數的作用：（Α)棕色脂肪組織重量（數據 係以公克（g)計之平均值土 SEM來表示，*Ρ<0·05相對於卵巢 完整之大鼠之對照組；+Ρ<0·05相對於OVX+雌二醇組（僅有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 14 ------------裝 i — (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂：

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1293246 y於EM他.HC_ ;⑻蛋白f含量（數據單係㈣❹ 里％什之平均值土SEM來表示；* p<〇 〇5相對於印巢完整組 ;+Ρ<〇·〇5相對於0VX+雌二醇組（僅有關於em_652 hci組） ，和（c)脂蛋白脂肪酶活性（數據係以？u/g蛋白質計來表示） 第8圖係顯示，卵巢完整之大鼠、卵巢切除的大鼠以及 以SERM ΕΜ·652·Ηα或雌二醇來處理之印巢切除的大鼠 ，在一個20天之處理期下，對於比目魚肌重量（數據係以公 克計之平均值土SEM來表示）和脂蛋白脂肪酶活性（數據係 以？u/g蛋白質計之平均值土SEM來表示；* p<〇 〇5相對於卵 巢完整組）之作用。 發明之詳細描述 較佳地是投藥一種藥學組成物，該組成物包含有一藥 學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑以及一治療有效量之 一個具有下列通式I之選擇性雌激素受體調節劑·· 5*

其中1和R2是各自選自於下列群組：氫、經基、·〇Μ (M 係選自於群組由直鏈或支鏈C「C4烷基、直鏈或支鏈C3-C4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -15 - -----------I ^--------^-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 五、發明說明（13) 烯基、直鏈或支鏈c3-c4炔基所構成之群組中）和一個 可於活體内轉化為羥基之部分； 其中G是-H或-CH3 ;以及 其中R3是一個選自於下列群組中之物種：咄咯啶基、 哌啶並基.、嗎啉並基和NRaRb(Ra和Rb分別是氫、直鏈或 支鏈烷基、直鏈或支鏈C3-C6烯基、直鏈或支鏈C3-C6 炔基），以及 一個選自於下列群組中之性類固醇前驅物：脫氫異雄 固酮、脫氫異雄固酮硫酸鹽、雄-5-烯-3b，17b-二醇，以及 可於活體内被轉化成此等之任一者的化合物。 不同於習知技藝中已知之SERMs，一個依據上述化學 式I之SERM對於子宮内膜提供具有很少或無雌激素作用之 意想不到之優點。 較佳的是本發明的S E RM係為具有光學活性的且有大 於50%係為一個於2號碳原子上具有一絕對組態S之立體異 構物化合物。 對於安定性和水溶解性（生物可利用性）亦較佳的是， 本發明之SERM是為一個具有化學式I之化合物和一個選自 於下列群組中之酸所構成之鹽類：醋酸、己二酸、苯磺酸 、苯甲酸、d-樟腦磺酸、檸檬酸、延胡索酸、氫碘酸、氫 漠酸、氫氯酸、氫氯苯嘆酸（hydrchlorothiazide acid)、經 基-萘甲酸、乳酸、馬來酸、甲磺酸、甲基硫酸、1,5-萘二 磺酸、硝酸、棕櫚酸、三甲基乙酸、磷酸、丙酸、琥珀酸 、硫酸、酒石酸、對-S大酸、對-甲苯續酸和戊酸。

16 1293246 五、發明說明（14) 本發明之一個較佳的化合物是PCT/CA96/00097 (W0 96/26201)中所報導之EM-800。EM-800的分子結構是：

本發明之另一個更佳的化合物是EM-652.HC1 (也稱為 EM-01538)：

EM-652.HC1對於其他SERMs(例如EM-800)提供額外 之優點，因為其不含會增高血清中肉驗（carnitine)含量之降 低的危險性之三甲基乙醯基。 / 本發明之其他較佳的 SERMs包含譚莫賽芬 (Tamoxifen)((z)-2-[4-(l，2-二苯基-1-丁烯基）]_Ν，Ν·二曱基 乙烧胺）（可得自於Zeneca，UK)、多里米芬（Toremifene) (Orion - Farmos Pharmaceuticla，Finland 或 Schering-Plough)、爵洛 赛芬(Droloxifene)和CP-336，156 (順式-lR-[4'咄咯啶並-乙氧苯 基]-2S-苯基-6-經基-1，2,3,4，-四氮萘 D-(-)-酒石酸鹽）（Pfizer Inc.， USA’描述於US 5,889,042中）[另名為拉梭福賽芬(Lasofoxifene)]、 雷洛賽芬(Raloxifene) (Eli Lilly 17 1293246 A7 ______B7__ 五、發明說明（15 ) and Co·，USA)，LY 335563和LY353381(Eli Lilly and Co.， USA 描述於 WO 98/45287、WO 98/45288 和 WO 98/452864 中）、伊多赛芬（Idoxifene)( SmithKline Beecham，USA)、黎 佛美洛赛芬（Levormelxifene)(3,4-反式-2,2-二甲基_3 -苯基 -4-[4-(2-(2_吼咯啶-1-基）乙氧基）苯基]-7-曱氧基苯並二氫 口辰喃）(Novo Nordisk，A/S，Denmark，該化合物被揭露於 Shalmi 等人之WO 97/25034、WO 97/25037、WO 97/25038 中；以及Korsgaard等人之WO 97/25036]、GW5638 (描述於 Willson et al·，Endocrinology，138 (9)，3901-3911，1997)和 吲哚衍生物（被揭露於Miller等人之EP 0802183A1)，和TSE 424，以及ERA 923(由Wyrth Ay erst (US A)所研發且被揭露 於JP10036347 (Ameican home products corporation)，及描 述於WO 97/32837之非類固醇雌激素衍生物。本發明之其 他SERMs被揭露於：WO 99/07377 ; WO 98/48806 ； EP 0823437A2 ； EP 0838464A1 ； EP 0834567A1 ； EP 0835868A1 ;EP 0792&41A1 ; EP 0873992A1 ;和EP 0895989A1。 可以採用任何為達所需要之有效性而被使用之SERM (如製造商所建議的來供治療及/或制止骨質疏鬆症或乳癌） 。適當之劑量係為本技藝中已知的。任何其他商業上可購 得之非類固醇性抗雌激素能夠依照本發明而被使用之。任 何具有類似於SERMs之活性的化合物（例如：雷洛賽芬）可 以被使用。 依照本發明被投藥之SERMs較佳地係以一劑量範圍 為0.01至10 mg/kg體重/天（較佳是0.05至1.0 mg/kg)，每天 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7 ;__B7_ 五、發明說明（16 ) 為60毫克（尤其是每天20毫克）來投藥，這對於一具平均體 重且以口服來投藥之個體而言係較為理想的，或以一劑量 範圍在0.03至3.0 mg/kg體重/天（較佳是0.015至0.3 mg/kg 體重），每天為20毫克（尤其是每天10毫克），最為理想係對 於一具平均體重且以非經腸道方式（例如肌肉内、皮下或經 皮投藥）來投藥之個體而言係較為理想的。較佳地，SERMs 是如下所述與一藥學上可接受之稀釋劑或載劑一起被投藥 〇 理想之性類固醇前驅物是脫氫異雄固酮（DHEA)(可得 自於Diosynth Inc·，Chicago，Ilinois，USA)和其前驅藥（可 得自於Steraloids，Wilton，New Hampshire，USA)、5-雄 -3b，17b-二醇和其前驅藥雄-5-烯-3b，l7b-二醇3-二醋酸鹽 和雄-5-烤-31)，1713-二醇二半琥珀酸鹽（可得自於316以1〇丨(18, Wilton，New Hampshire，USA)。

性類固醇前驅物可以被配方為一種醇性凝膠，該凝膠 含有2.0-10%之辛基-癸基甘油三酸酯（Neobee M-5); 10-20%之己二醇；2.0-10%之二甘醇單乙醚（Transutol); 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 1293246 A7 ---- -B7___ 五、發明說明（17 ) 2·(Μ〇% 之賽克洛美西康（cyclomethicone^Dow corning 345); 1.0-2%之羥基丙基纖維素（KlucelHF)。 載劑（供SERM或前驅物之用）也同時可以包含一般被 使用於製藥工業之各種不同的添加物。舉例而言，香料、 抗氧化劑、香水、膠凝劑、稠化劑（例如羧基曱基纖維素） 、表面活性劑、安定劑、保濕劑、調色試劑和其他類似之 試劑可以存在《當活性成份被經皮投藥時，皮膚上之投藥 位置應做變換以避免活性成份之過高的局部濃度及可能之 由性類固醇前驅物之雄激素代謝物所致之皮膚和皮脂腺過 度刺激。 於一供口服投藥之藥學組成物中，較佳地DHEA或其 他岫驅物之存在量係為，相對於組成物之總重量，一濃度 介於5和98%重量百分比，更理想是介於50和98百分比，尤 其是介於80和98百分比。一個單一之前驅物（如DHEA)可以 為唯一之活性成份，或任擇地，數種前驅物及/或此等之類 似物能夠被使用（例如：DHEA、DHEA-S、5-二醇之一組 合’或是一個兩個或多個化合物可於活體内被轉化為 DHEA、DHEA-S或5-二醇之化合物所構成之組合，或是一 個由D Η E A、5 ·二醇以及一個或多個此等之可於活體内被 轉化為DHEA或5-二醇的類似物所構成之組合等等。dheA 之血液含量是為足夠劑量之終極指標，該指標考量了吸收 和代謝上之個體差異。 理想地’治療醫師會（尤其於治療開始時）監測一病患 個體之整體反應和DHEA之血清含量（相較於上述所討論 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝 •----訂--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293246 4 A7 ;_ B7_ 五、發明說明（18 ) 之較佳的血清含量），和監測病患對治療之整體反應，且當 一病患之代謝或治療之反應是非正常時依需要來調整劑量 0 依照本發明之治療是適合供無限定之持續治療。預期 的是，DHEA及/或5-二醇或其他前驅物之治療將單純維持 DHEA含量於一範圍，該範圍近似於婦女停經前自然之狀 態（血清濃度介於4和10毫克/每公升），或自然之年輕成年 男性（血清濃度介於4和10毫克/每公升）。 SERM化合物及/或性類固醇前驅物也能夠經由口服途 徑被投藥，且可以配方以傳統的藥學賦形劑（例如喷灑乾燥 的乳糖、微晶粒纖維素和硬脂酸鎂）而形成藥錠或膠囊來供 口服投藥。 活性物質可被製造成藥錠或糖衣藥丸之核心，此係經 由將之混合以固體、粉狀載劑物質（例如擰檬酸鈉、碳酸鈣 或磷酸氫鈣），及結合劑（例如聚乙烯基咄咯啶、明膠或纖 維素衍生物），亦可能同時添加潤滑劑（例如硬脂酸鎮、十 二烧基硫酸納、’’Carbowax”或聚乙二醇）。當然，就口服投 藥之型態而言，改善味道之物質可被添加之。 作為進一步之形式，可以使用塞劑膠囊，例如硬明膠 ，和密合式軟明膠膠囊（含有一軟化劑或塑化劑，例如甘油 )。塞劑膠囊含有之活性物質理想是呈顆粒型態，例如佳有 填充物之混合物，該填充物係如乳糖、蔗糖、甘露醇、澱 粉（例如馬鈴薯澱粉或支鏈澱粉）、纖維素衍生物或高分散 度之矽酸。於軟明膠膠囊中，活性物質理想是被溶解或懸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 21 ----------裝--------訂---------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1293246 A7 發明說明（19 浮於適當之液體（例如蔬菜油或液態聚乙二醇）内。 乳液、油膏、凝膠或乳霜形式是可能的且應被徹底按 摩入皮膚内至沒有多餘留存可清晰看見者，且皮膚上該區 域不應被沖洗直至絕大部份之經皮膚滲透已被達成，理想 地是至少4小時，且更理想是至少6小時。 一經皮膚貼劑可以依照已知之技術被使用來傳遞前驅 物或SERM。其一般被施用歷時一更長之時間，例如】至4 天，但通常是使活性成份接觸一較小表面區域，而允許一 慢而恆定之活性物質傳遞。 許多已被研發且被使用之經皮藥物傳遞系統是適合供 傳遞本發明之活性物質。釋放速率典型地是由一基質擴散 來控制，或是藉由使活性成份通經一控制膜。 經皮裝置之機械方面是本技藝所熟知的且被闡釋於， 例如，美國專利案 5，162,037、5，154,922、5，135,480、 4,666,441、4,624,665、3,742,951、3,797,444、4,568,343 、5,064,654、5,071，644、5,071，657，此等之揭露内容於此 併入本案以為參考文獻。額外之背景技藝是由歐洲專利案 0279982和英國專利申請案21 85187所提供。 该裝置可為本技藝中已知之任何一般型態，這包含黏 著性基質和蓄積槽-型經皮傳遞裝置。該裝置可以包含含有 藥物之基質，該基質結合有會吸收活性成份及/或載劑之 纖 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -丨裳 ----訂--- 於一蓄積槽型之裝置中，該蓄積槽可被定義為 法為載劑和活性成份所滲透之聚合物膜片 個無 於一經皮裝置中，該裝置本身維持活性成份與所欲之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ 297公爱 22 陘齊郎知曰慧材轰苟員!.消費合阼达中製

1293246 4 A7 "" " B7 五、發明說明（20 ) 局部化皮膚表面相接觸。於如此之一裝置中，相較於一乳 霜或膠體，供活性成份用之載劑之黏度係是較不需考慮的 。一供一經皮裝置用之溶劑系統可以包含，舉例而言，油 S曼、直!連醇乳酸醋和二丙二醇，3戈於本技藝中已知之其他 溶劑系統。該活性成份能夠被溶解或懸浮於該載劑中。 對於貼附至皮膚，一經皮貼劑可以固定至一於中央處 被穿打有一洞之外科黏貼膠帶上。該黏貼物較佳地被覆蓋 有一可撕性護膜以保護該黏貼物至使用前。適用於該可撕 性護膜之典型材料包含聚乙烯和聚乙烯塗覆之紙，且較佳 為矽酮·塗覆的以供容易移除。於使用該裝置上，僅是將該 可撕性護膜撕除，然後將之黏貼至病患之皮膚上。於美國 專利案5，135,48〇 (該案之揭露内容於此併入本案做為參考 文獻）中，Bannon等人描述一任擇性裝置，該裝置具有一用 以固定該裝置至皮膚之非黏貼構件。 本發明之經皮或經由黏膜的傳遞系統也能夠被使用為 一全新或改良之傳遞系統以供用於制止及/或治療肥胖。 本發明方法之有效性的會施例 實施例1 使用本發明化合物之35週之處理對於切除卵巢的大鼠之體 脂肪和體重之作用 材料與方法 動物及治唪 10至12週大之雌性司培瑞袼_多利（Sprague_Dawley)大 鼠（Cd:CD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） AW· ^--------^-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 -—___B7____ 五、發明說明（21 )

Canada)體重約225-250公克，於開始處理時使用。動物適 應周圍環境（溫度：22 ± 3 °C ;濕度：50 ± 2〇0/〇 ; 12小時· 光冗-12小Η守-黑暗之循環，光1於上午1 5) —週於試驗開 始前。動物每3隻一籠，且允許其等自由飲水和一丸狀檢驗 合格之嚅齒動物飼料（製造商Lab Diet 5002，RAton Purina，St-Louis，MO)。試驗之進行是以加拿大動物管理委 員會（CC AC)核准之設備，並依照CCAC之實驗動物照料與 使用指導。 276隻大鼠被隨機地分組，至每組12隻動物的23組如下 :Ό卵巢完整鼠對照組；2)OVX對照組；3-7)〇VX + EM-800 (0.01、0.03、0.1、〇.3或111^/]<^);8-12)0^/^+雷洛赛芬（〇.〇1 、〇·〇3、0.1、〇.3 或 1 mg/kg) ; 13-17) OVX + 檀莫赛芬（〇·〇ι 、G.03、0.1、〇·3 或 1 mg/kg) ; 18-22)OVX + EM-776 (0.01 、〇·〇3、0.1、〇·3 或 1 mg/kg) ; 23) OVX + 雌二醇（e2，植入 物）。試驗之第1天，條件項目符合之群組的動物於愛舒活 能（Isoflurane)麻醉下來進行兩側卵巢切除（〇vx)。一個含 雌二醇（E2)之矽橡膠植入物是經由皮下至第13組之每隻動 物的背部區域。植入物内之E2濃度和大小如下：e2 (e2 ·· 膽固醇（1:100，重量：重量）），〇·5公分（長度），0.125英吋（外 圍直徑）和0.062英吋（内圍直徑）。於試驗過程，植入物内之 E2於每個月更換。使用EM-800、雷洛赛芬、檀莫賽芬、和 EM-766或載劑（4%乙醇、4%聚乙二醇-600、1%明膠或0.09% 氯化鈉）之處理於試驗之第2天開始。適當之化合物或載劑 每曰予以給藥一次，此係藉由口服硬性餵食每隻大鼠〇 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 24 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) --裝 tT-------- 1293246 A7

'五、發明說明（22 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 亳升持續37週。最後一次給藥後大約24小時，被過夜絕食 之動物是藉由於愛舒福能麻醉下從腹部主動脈處予以放血 而將之殺死。 脂肪體組成物 處理3 5週後，每隻大鼠於愛舒福能麻醉下做其全身之 骨骼（包括其右股骨）之掃瞄，該掃瞄是使用雙倍數能量X射 線吸光分析儀（DEXA ; QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA) 和一局部高解析度掃瞄軟體。使用於全身之掃瞄區域大小 是30.492 X 17,912公分，解析度是0.1512 X 0.064公分且掃 目苗速度是每秒2.499毫米。全身之體脂肪組成被測定之。 統計分析 數據表示是以平均土標準差（SEM)。統計顯著性之決 定是依據杜肯-克拉瑪氏（Duncan-Kramer)(1956)之多重範 圍測試。 結果 當以DEXA分析儀於活體内來作測量，增加EM-800、 雷洛賽芬、檀莫賽芬和EM-776之每曰口服劑量對於體脂肪 的作用係圖解於第1圖中。能夠看出EM-800於最低劑量 0·01 mg/kg下會降低78%之OVX誘導的體脂肪刺激，雷洛賽 芬要比EM-800之活性為低，而EM-776(其為EM-800的鏡像 立體異構物）不具顯著差異之作用。於表1中所報導的是， EM-800或雷洛赛芬對於卵巢切除的大鼠之體重之作用。比 較是以卵巢完整的大鼠和卵巢切除的對照組大鼠來進行。 能夠看出小劑量之EM-800達到之重量控制係類似於明顯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 25 /----------Φ-裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . Φ 1293246 A7 ______B7_ 五、發明說明（23 ) 較高數量之雷洛賽芬（亦即0·03 mS/kgiEM-800達到類似 於0.3 mg/kg之雷洛賽芬所得的結果）。此二者於較高之劑量 下實質地逆轉卵巢切除所誘導之體重增加。 表1 組別 在Necropsy下之體重 卵巢完整的大鼠對照組 公克 356 ± 16** OVX對照組 491 ± 16 OVX + EM-800 (〇.〇1 毫克/公斤） 385 ±17** (0.03毫克/公斤） 364 ± 10** (0.1毫克/公斤） 369 ± 17** (0.3毫克/公斤） 359土7** (1毫克/公斤） 368 ±6** OVX+雷洛赛芬(0.01毫克/公斤） 439 土 13** OVX+雷洛賽芬(0.03毫克/公斤） 451 ± 14** OVX+雷洛賽芬(0·1毫克/公斤） 389 ± 14** OVX+雷洛賽芬(0.3毫克/公斤） 367 ±9** OVX+雷洛賽芬(1毫克/公斤） 342 ± 12** 實施例2 11個月之組合處理使用本發明之化合物 1 .測試材料 1.1測試化合物： DHEA :可購自於 Steraloids Inc. Wilton, NH. Lot: H137 ： EM-800 ： ^ » Lab. Of MoL Endo., CHUL. 1.2載劑 a)明膠 * Lab-Grade, ACP Chemicals Inc., Montreal, Qc. 26 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7 B7_ 、五、發明說明（24 )

Lot # F0195 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) b) 乙醇：Commercial Alcohols Inc·，Brampton, Ontario. 批號編號11296

c) 聚乙二醇-600 (PEG-600) ： Omega Chemical Company Inc.， Levis， Quebec.才比號、編號 00-0117-EZ

d) 生理鹽水:0.9 %氣化鈉 灌注USP

Abbot Laboratories Limited, St-Laurent, Qc.. e) 丙二醇Π,2-丙烷二醇，PPG)：

Sigma Chemical Co.5 St-Louis, MO. f) 載劑1 :供皮下注射之4%乙醇-4% PEG-600-1%明 膠-0.9%氣化鈉-水。 g) 載劑2 ：供局部使用之50%乙醇-50%PPG。 2 ·測試動物之特徵: 2·1 品種· Rattus norvegicus 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2.2品系:司培瑞格-多利大鼠（Crl : CD⑧（SD) BR VAF/Plus™) 2.3性別：雌性 2.4 供應源· Charles River Canada Inc. 188 Lasalle Road St. Constant, Quebec 1-800-561-4975 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7 B7 五、發明說明（25 ) 2.5劑量起始時之年齡：第18-29組之大鼠是16週大。 2.6 動物房和飼養 a) 動物房：大鼠每2-3隻關1籠之鞋盒。所有之鼠籠 清楚標記有一箱籠標記註明實驗編號、組別號碼 和動物編號。 b) 於試驗中，動物房之環境狀態將予以調控（目標狀 態：溫度20至25°C ;濕度：50 ± 20 %)。光週期 為12小時亮：12小時暗。 c) 食物和飲水:傷齒動物飼料（丸粒），和自來水的 提供是採不限制之供給。 2.7適應時間’· 至少兩週。 2.8隨機分散=於抵達時大鼠被隨機地指定至每一組。 2.9安樂死之方法：愛舒福能誘導的全身麻醉。 3.方法和實驗設計 11隻大鼠/每組 共44隻大鼠 12.5毫克 12.5 毫克 ^EM-800 (100 pg) 1卵巢完整之大鼠 2 OVX對照組

3 OVX + DHEA 4 〇VX + DHEA 3.1載劑和測試物件之製備 a)EM-800之配製： EM-800或與EM-776此二者將被溶解於 EtOH:PEG-600 (1:1)内，並於 Fisher Scientific Stirring Hot Plate上加以搖晃，然後，1% GNS將 被添加至所需體積。 28 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 I293246 ^^^ , - B7 五、發明說明（26 ) b)DHEA之配 _ ：

DHEA經由搖晃處理被溶解於5〇%乙醇、5〇% ppG 〇 3.2動物之製備和虛王g ： 動物將如項目6.1所示每曰被處理一次。 配製於50%乙醇、50% ppG内之DHEA將呈每日一次 (I.D·)且體積為〇·5毫升而藉由經皮施用（pc)至對 應之動物。 EM-800將被配製於4 〇/。乙醇、4 %pEG-6〇〇、丄％明 膠、〇·9 %氯化鈉内，然後呈每曰一次（s c.，j D ) 且體積為0·5亳升而經皮下注射被投藥至對應之組 別的動物體内。 大鼠當其未被皮下注射以任何之測試化合物時，係 被皮下注射以一體積為〇.5毫升的載劑1，且當大鼠 無5-DIOL或DHEA之處理時被局部給予〇·5毫升之 載劑2。 3.3觀察和量測 a) 臨床觀察: 母隻大鼠將被觀察至少每日一次以供一般性之表 示0 b) 體重： 大鼠將於試驗開始和結束時，以及於處理期間中 每隔三個月被稱重之。 4.結果： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------裝--------訂 丨— (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293246 五、發明說明（27) 如顯示於表2，在每曰劑量為12·5亳克之DHEA處理的作用是 降低87%之OVX刺激產生之體重。以每日劑量1〇〇 之ΕΜ-800投藥 產生協同性作用，且對於OVX刺激產生之體重得到一為140 %的抑 制作用。 表2 處理 總體重(公克） 卵巢完整之大鼠 479.5 ± 20.4 0VX 567.4 ±25.7 OVX + DHEA (12.5 mg/ 曰 /大鼠） 490.8 ±24.1 OVX + DHEA (12·5 mg/ 曰 /大鼠）+ EM-800 444.5 ± 20.5 (100 pg/日/大鼠） 使用EM-652.HC1之20天處理對於切除卵巢的大鼠之體脂肪和 體重參數之作用 材料與方法 鱼勒及處理 於處理開始時係使用8至10週大之雌性司培瑞格_多利(％黎伽㈣ 大鼠（Crl:CD(SD)Br)(CharleS River Laboratory，St_c〇nstant，

Canada)體重約200_225公克。於試驗開始前，令動物適應周圍 %境(溫度：22 ±3 °C ; 10小時-光亮-14小時-黑暗之循環，燈量 於〇6:0〇h)歷時一週。動物個別飼養於一般設計之不鏽鋼蘢，且 允許其等自由飲水和一高碳水化合物之混合飼料，該飼料含有 (公克/每1〇〇公克）：玉米澱粉，31·2;葡萄糖，31·2;酪蛋白， 2〇·0 ;玉米油，6·4，· dl_甲硫胺酸，〇.3 ;混合維生素，；^ ; Α抓％ 30 1293246 五、發明說明（28) 混合礦物質，4.9 ;和纖維素，5·0。試驗之進行是以 加拿大動物管理委員會（CCAC)核准之設備，並依照CCAC 之實驗動物照料與使用指導。 40隻大鼠被隨機地分組至每組10隻動物的4組如下：1) 卵巢完整鼠對照組；2)OVX對照組；3)OVX + EM-652.HC1 (0.5亳克/每隻大鼠，〜2·5亳克/每公斤）；4) OVX+雌二醇 (Ε2，植入物）。試驗之第1天，條件項目符合之群組的動物 於愛舒活能麻醉下被進行兩侧卵巢切除（OVX)。一個雌二 醇（Ε2)之矽橡膠植入物經由皮下被插入至第4組之每隻動 物的背部區域。植入物（於初步試驗被選定以提供Ε2之生理 含量）具有下列膽固醇濃度和大小：Ε2 :膽固醇（1:50，重量 :重量）），0.5公分（位於矽橡膠管内之稀釋之類固醇的長度） ，0.125英吋（矽橡膠管之外圍直徑）和0.062英吋（矽橡膠管 之内圍直徑）。在皮下插入至動物體内之前，雌二醇植入物 於37°C下被浸泡於0.9 %氯化鈉溶液内過夜後被使用之。僅 含有EM-652.HC1或載劑（0.4 %曱基纖維素溶於水中）本身 之處理係開始於試驗起始之第2天。本案化合物或载劑係以 每曰一次藉由口服硬性餵食0.5 ml/大鼠歷時共20天。體重 和食物攝取量是每2天記錄一次。 於最後一次給藥之後大約24小時，經隔夜絕食之動物 在利用易他明-來拉辛（ketamine-xylazine)之麻醉下以心臟 穿刺將血液抽出。血液還有白色和棕色脂肪組織被收集之 〇 能量、脂肪和蛋白質量測中之體重、食物攝取和身體增加 1293246 五、發明說明（29) 體重、食物攝取身體增加之能量、脂肪和蛋白質之定 量是依照 Deshaies et al·，Am· J· Physiol.，1997; 273, E355-E362 (1997) 〇 詛鎩之測定 脂蛋白脂肪酶活性之測定是依照〇631^丨63 6{&1.，八111.；[· Physiol·，1997; 273, E355-E362 (1997)。

結果

可以由第2A和C圖看出20天之EM-652.HC1處理係完 全逆轉4倍之體重增加和3倍之脂肪增加，該作用是分別的 ，觀察係於卵巢切除之後，而此作用是較不顯著於蛋白質 的增加（第2B圖）。雌二醇具有較小之作用。累積性食物攝 取是顯示於第3圖。處理作用反應於體重之增加。雌二醇部 份地制止食物攝取之增加係由於卵巢切除，而EM-652.HC1 之作用較雌二醇更有效，其降低食物攝取至一數量是較卵 裏無切除之動物更低。 主要之能量平衡變異是摘要說明於表3。卵巢切除 ^νχ)增加之消化性能量攝取為44 %。雌二醇減低Ovx動物 之能量攝取，但總能量攝取維持17 %係高於卵巢無切除動 物之總能量攝取，而1^1^-652·1!0則完全制止0vx誘導所增 加之能量攝取。能量增加與食物攝取成正比。再度的是， 雌二醇減低能量增加（其達到之程度係非顯著不同於卵巢 無切除動物之能量增加），但EM-652.HC1則較為有效（其顯 著不同於雌二醇）。 食物之利用效率是由0vx所增加，其降低係發生於Ovx 32 1293246 五、發明說明（3〇) 動物由E2所導致，和進一步之降低是由EM-652.HC1所 導致。 身體能量經由蛋白質之30 %的增加於卵巢無切除手 術之後同時還有身體能量經由脂肪之80 %的增加皆完全 由EM-652.HC1處理所逆轉該等可見於第4A和B圖。如顯示 於第5A圖，胰島素抗性之產生於Ovx動物體之確認是經由 出現fasting高血中胰島素症狀（其通常正比於胰島素抗性 之程度）和fasting高血糖症狀（一回應係為損失之胰島素效 能該效能使胰島素能維持正常之血糖濃度）。雌二醇和 EM-652.HC1二者皆可制止Ovx誘導之胰島素抗性。 第6A和6C圖顯示OVX增加鼠蹊部和腹膜之後脂肪組 織的質量（數量）該等代表觀察之總體脂肪的變化。此變化 之完全破壞是由EM-652.HC1處理所致。而雌二醇，其作用 則較不重要。相同之作用方式顯示於第6B和6D圖該處有脂 蛋白脂肪酶之酵素活性的結果報告。此酵素調控血管内三 酸甘油酯之水解及因此之所有脂肪酸進入至脂肪組織的儲 存。 棕色脂肪組織是一主要之產熱作用組織於嚅齒動物體 。卵巢切除手術顯示一不同之型態於肩胛骨之間之棕色脂 肪組織其不同係相較於白色脂肪組織。棕色脂肪組織的重 量是兩倍增加（第7A圖）係相較所觀察於白色脂肪組織。然 而，蛋白質含量（第7B圖）和脂蛋白活性（第7C圖）是分別減 低3；3和30 %於卵皋切除之後。就此三個參數，EM-652.HC1 處理是完全逆轉卵巢切除之作用。

33 1293246 A7 B7 五、發明說明（31 ) 比目魚肌（Soleus)之重量通常是一很好的指標係對生 物體之蛋白質質量的狀態。如所預期，比目魚肌之重量， 如顯示於第8圖，其增加係由於卵巢切除（食物攝取之增加 產生增加的能量儲存在脂肪和蛋白質兩方面）。雌二醇和 EM-652.HC1之處理二者皆制止肌肉重量的增加。於肌肉中 之脂蛋白脂肪酶是通常正面相關於胰島素敏感性（敏感性 愈好，肌肉中之脂蛋白脂肪酶愈多）。卵巢切除減低比目魚 肌之脂蛋白脂肪酶活性，其為產生胰島素抗性之一間接證 據。雌二醇和EM_652.HC1之處理二者皆制止肌肉之脂蛋白 脂肪酶的減少。 表3 能量平衡 卵巢之狀態 卵巢卵巢完整 卵巢切除 處理 無 e2 EM-652 消化性能量之攝取(千焦耳） 4708 7658 a 5511a 4479b 能量之增加(千焦耳） 532 1677a 903 278 b 顯示之能量消耗(千焦耳） 4176 5081 a 4609a 4201 b 食物之利用效率(％) 10.2 24.1 a 15.9 5.9 b a與卵巢卵巢完整之差異，p<0.05 b與卵巢切除+ E2處理之差異 ，ρ<0·05 消化性能量之攝取是所有攝入能量之總和於2 0天之處 理期間内（一併計算的有不可消化物例如纖維）。 能量增加是以千焦耳之計量儲存為脂肪+蛋白質於20 天之處理期間内。 顯示之能量消耗的計量係消耗於代謝所需和運動力（ 計算是由能量之攝取和能量之增加）。預期量會較高是當無 脂肪的質量較高（例如卵巢切除之動物）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 34 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂--- 經濟邹智慧財產局員X消費合作|£印製 1293246 1 A7 _ B7__ 五、發明說明（32 ) 實施例4 合成本發明理想化合物之實施例 合成（S)-(+)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基）-4-曱基 -2-(4’’-(2’’’-哌啶基乙氧基）苯基）-2Η-1-1苯基吼喃氫氯酸 鹽EM-01538 (EM-652, HC1)

步騍A : BF3 · Et20，曱苯；100°C ; 1小時。 步驟C : 3,4-二氫基吡喃，對-甲苯磺酸單一結晶水，醋酸 乙酯；25°C於氮氣之下，16小時，然後於異丙醇中結晶。 步驟D，E和F : (1)六氫11比唆，甲苯，迪恩&司塔克裝置（dean & Stark apparatus)，迴流於氮氣之下，（2)1，8-二味峻雙環[5，4, 0]undec-7-ene，DMF(二甲基曱醯胺），迴流3小時； (3)CH3MgCl，THF (四氫呋喃），-20至0°C然後回溫至室溫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 35 -----丨丨丨—丨裝---丨丨丨訂----I--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 _ B7__ 五、發明說明（33 ) 24小時； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 步驟G和Η ： (lS)-(+)-10-樟腦磺酸，丙酮，水，曱苯，室溫 ,48小時。 步驟HH ： 95 %乙醇，70°C，然後室溫下3天。 步驟HHR ：母溶液再循環然後沖洗之步驟HH (S)-10-樟腦磺酸，迴流；36小時，然後室溫下16小時。 步驟I ： (1) DMF(溶液），碳酸鈉，醋酸乙酯； (2) 乙醇，稀釋之氫氯酸； (3) 水。 合成2-四氮11比喃基氧-4-經基-2’ -(4-四風吼喃基氧苯基）乙 醯苯（4)。一 2,4·二羥基-2’-(4’，-羥基苯基）乙醯苯3 (97.6克 ，0.4莫耳）（可購自製造商：Chemsyn Science Laboratories， Lenexa，Kansas)溶於3，4-二氫ϋ比喃（218毫升，3·39莫耳）和醋 酸乙酯（520毫升）然後加入對_曱苯磺酸單< 結晶水（0.03 克，0.158毫莫耳）於約25°C。反應混合物攪拌於氮氣下無 另外之加熱共16小時。然後混合物之沖洗係以一溶液其為 碳酸氫鈉（1克）和氣化鈉（5克）溶於水（100毫升）。分層區分 後有機層之沖洗係以高濃度食鹽水（20毫升）。每一次沖洗 是以50毫升之醋酸乙酯再萃取。所有之有機層合併然後過 慮通過硫酸鈉。 溶劑（約600毫升）之移除係以蒸餾法於大氣壓力下且 有異丙醇（250毫升）之添加。添加之溶劑（約300毫升）以蒸餾 除去於大氣壓力下且有異丙醇（250毫升）之添加。溶液冷卻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -36 - 1293246 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（34 ) 於大約25°C且加以攪拌然後於12小時之後，結晶之固體進 行過濾，異丙醇沖洗然後乾燥（116.5克，70 %)。 合成4-羥基-4-曱基_2_(4’-[2”-六氫吼啶基-]乙氧基）苯基 -3-(4’’’ -四氫吼喃氧）苯基-7—四氫π比喃氧-苯并二氫π比喃 (10)—溶液含有2--四氫咄喃氧-4-羥基-2,-(4，，-四氫咄喃氧 苯基）乙醯苯4(1公斤，2.42莫耳），4-[2-(1-六氫吼啶基）乙 氧基]苯甲搭5 (594克’ 2.55莫耳）(可講自製造商：chemsyn Science Laboratories，Lenexa, Kansas)和六氫口比咬（82.4克 ，〇·97莫耳）（可購自製造商：Aldrich Chemical Company Inc·，Milwaukee，Wis.)溶於甲苯（8公升）迴流於I氣之下係 使用迪恩&司塔克裝置（dean & Stark apparatus)直至一相 當量之水（44毫升）的收集完成。 甲苯（6.5公升）移除自溶液是以蒸餾於大氣壓下。添加 DMF(二甲基甲醯胺）(6.5公升）和1，8·二咪唑雙環[5，4, 0]undec-7-ene(110.5克，0.726莫耳）。溶液進行搖晃約8小 時於室溫下以進行異構化使Chalcone 8轉變成Chalcone 9 然後加入至一混合物含有水和冰（8公升）及甲苯（4公升）。各 分層分開且甲苯層之沖洗是以水（5公升）。合併之溶液沖洗 液之萃取是以甲苯（3 χ4公升）。合併之甲苯萃取液最後以 高濃度食鹽水（3 X 4公升），濃縮於大氣壓力下至5.5公升然 後冷卻至-10°C。 連續之外部冷卻和攪拌於氮氣下，一 3重量莫耳濃度 (M)之溶液：甲基鎂氯溶於THF(四氫呋喃）（2.5公升，7.5莫 耳）（可購自製造商：Aldrich Chemical Company Inc.， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 37 ----------裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1293246 A7

五、發明說明（35 )

Milwaukee，Wis·)被加入，維持溫度於旳以下。於所有格 里那試劑（Grinard reagent)添加後，外部冷卻移除然後混合 物回溫至室溫。混合物攪拌於此溫度下共約24小時。 混合物再次冷卻至約-20。〇且持續以外部冷卻及攪拌 ，飽和之氯化氨溶液（200毫升）以緩慢添加，維持溫度於-2〇 C以下。混合物攪拌2小時然後添加飽和之氯化氨溶液（2 公升）和曱苯（4公升）然後搖晃5分鐘。各分層分開且溶液層 之萃取是以甲苯（2 X 4公升）。合併之甲苯萃取液是以稀釋 之氫氯酸直至溶液變成均一然後以高濃度食鹽水X 4公 升）。甲苯溶液最後濃縮於大氣壓力下至2公升。此溶液直 接使用於下一步驟。 合成（2R，S)-7-羥基·3_(4’_羥基苯基）-4-甲基-2-(4，，-[2，，，-六 氫吼啶基]乙氧基）苯基）-2Η-1-苯并二氫吼喃（is)-l〇-樟腦 磺酸鹽（±12). 於4-羥基-4-甲基-2-(4’-[2，，-六氫吼啶基-]乙氧基）苯基 -3-(4’’’-四氫吼味氧）苯基-7··四氫吼鳴氧-苯并二氫π比口南 (10)之甲苯溶液中加入丙酮（6公升），水（0.3公升）和（S)· 10-樟腦磺酸（561克，2.42莫耳）（可購自製造商：Alddch Chemical Company Inc·，Milwaukee，Wis.j 〇 該混合物擾拌 於氮氣之下48小時之後固體之（2R，S)-7-羥基-3-(4’-羥基苯 基）-4-甲基·2-(4’’-[2’’’-六氫吼啶基]乙氧基）苯基）-2Η_1-苯 并二氫啦喃（1S)-10-樟腦磺酸鹽（12)進行過濾，沖洗是以丙 酮然後乾燥（重量883公克）。此產物使用於下一個（HH)步驟 無需進一步之純化。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •38 I---------41^-裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟邹智慧財產局員X消費合阼；ώ印製 1293246 J A7 _ B7_ 五、發明說明（36 ) 合成（2S)-7-羥基-3-(4’·羥基苯基）-4-曱基-2-(4’、[2’’’· 六氫吼啶基]乙氧基）苯基）-2Η-1_苯并二氫吼喃（1S)-10-樟 腦磺酸鹽（13)，（+)-EM-652(lS)_CSA 鹽）· 一（2R，S)-7-羥基 -3-(4’-羥基苯基）-4-曱基-2-(4’’-[2，’’-六氫吼啶基]乙氧基） 苯基）-2Η-1-苯并二氫吼喃（1S)-10-樟腦磺酸鹽（±12)(759 克）溶於95%乙醇之懸浮液進行加熱並攪拌至約70°C且固 體已滲解。溶液可以冷卻至室溫並加以攪拌然後灑下一些 (2S)-7-羥基-3-(4’·羥基苯基）-4-甲基-2-(4，’-[2’’’-六氫吼啶 基]乙氧基）苯基苯并二氫吼喃（1S)-10_樟腦磺酸鹽 13的晶粒。該溶液攪拌於室溫下總計約三天。晶體過濾， 沖洗是以95 %乙醇然後乾燥（291克，76 %)。產物之產率是 94.2%其純度是98.9 %。 合成（S)-(+)-7-經基-3-(4’-經基苯基）-4-甲基 -2·(4’’-[2’’’-六氫吼啶基]乙氧基）苯基）-2Η-1·苯并二氫。比 喃氫氯酸EM-01538 (ΕΜ-652,氫氯酸）化合物13之一懸 浮液（EM-652_(+)-CSA鹽，500毫克，0.726毫莫耳）溶於二 甲基曱醯胺（11 pL，0.15毫莫耳）加入一 0.5重量莫耳濃度（M) 液態碳酸鈉溶液（7.0毫升，3.6亳莫耳）然後進行攪拌15分鐘 。懸浮液加入醋酸乙酯（7.0毫升）然後進行攪拌4小時。有 機層之沖洗是以一液態飽和碳酸鈉溶液（2 X 5毫升）和高濃 度食鹽水（1 X 5毫升）再乾燥於硫酸鎂之上，而濃縮。於一 溶液為產生之粉紅色泡沫（EM-652)溶於乙醇（2毫升）加入 2N之氫氣酸（400 mL，0·08毫莫耳），攪拌1小時，加入蒸 餾水（5毫升），於空氣中乾燥然後於一高真空（65°C)產生一 本紙張尺度適用中國國家標準（CN0A4規格（210 X 297公釐） 39 ----------裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 五、發明說明（37) 乳霜狀粉末（276毫克，77 %):細純白粉末；溶於曱醇 10毫克/毫升。掃瞄卡路里儀：熔解峰值起動於219°C， DH=83 J/g ； [a]24D=154 °C ； 1H NMR (300 MHz，CD3OD)S(ppm)1.6 (broad，2H，H-4，，，)，1.85 (broad, 4H， H-3，，，，and 5，，，，），2.03 (s，3H，CH3)，3.0 and 2.45 (broad，4H5 H-2，，，，and 6，，，，)，3.47 (t5 J=4.9Hz5 2H，H-3，，，)，4.26 (t， J=4.9Hz5 2H，H-2，，，），5.82 (s5 1H，H-2)，6.10 (d，J=2.3Hz， 1H，H-8)，6.35 (dd，J=8.4, 2·43 Hz，1H，H-6)，6.70 (d，J=8.6 Hz，2H5 H-3，，and H-5，），6.83 (d，J=8.6Hz，2H5 H-2” and H-6”）； 13C RMN (CD3OD)，75 MHz) δ ppm 14.84, 22.50, 23.99，54.78，57.03，62.97, 81.22，104.38，109.11，115.35, 116.01，118.68，125.78，126.33，130.26，130.72，131.29, 131.59, 134.26, 154.42, 157.56, 158.96, 159.33。元素組成 物：C5 H，N，Cl :理論值：70·51，6.53, 2.84, 7·18, ％，實際 值：70.31，6·75, 2·65,6.89 %。 實施例5顯示制止LHRH-Α誘導之脂肪增加其係以 EM-652.HC1，其為一本發明之化合物，單獨或組合有DHEA ，其％—性荷爾蒙前驅物，於卵巢完整之雌性大鼠。能夠 看見的是6個月大之LHRH-Α處理顯著增加卵巢完整之雌 性大鼠之58 %體脂肪百分比，然而於EM-652.HC1或DHEA 同時投藥，此增加分別僅為35 °/〇和19 %。組合兩藥物，觀 察到無脂肪增加於LHRA-A處理之後。 於實施例6，制止肥胖產生於雌性大鼠在20天之期間内是 顯現的。卵巢切除增加總體脂肪和腹膜後脂肪組織之百

40 1293246 五、發明說明（38) 分比分別是20%和68%。這些增加被制止且甚至體脂 肪和腹膜後脂肪組赛減少是由投藥：EM-652.HC1、雌二醇 、DHEA或組合之EM-652.HC1 與DHEA或EM-652.HC1 與雌 二醇產生分別為46 %，46 %，59 %，56 %，和45 %之減少 於體脂肪方面，及產生分別為59 %，78 %，75 %，69 %， 和68 %之減少於腹膜後脂肪組織方面。一類似之試驗顯示 於實施例7。於此實施例中，制止肥胖是追蹤於34週然後體 脂肪和腹膜後脂肪組織之百分比是大約增加60 %經由卵 巢切除。此增加之制止是由投藥：ethynyl雌二醇，雷洛賽 芬（EM-1105) ， EM-652.HC1(EM-1538) ， DHEA 或 EM-652.HC1 與 DHEA 之組合。 實施例8A(雄性）和實施例8B(雌性）的結果報告數據是 本發明之效力於制止和治療肥胖。於痩和肥胖之盧克 (Zucker)雄性和雌性大氣進行投藥：EM-652.HC1 2.5毫克/ 每公斤/每天共20天。制兵之模式是以無脂肪之痩大鼠代表 而處理之模式是以原來就肥胖之大鼠代表。數據為體重之 增加，脂蛋白脂肪酶活性於白色腹膜後之脂肪組織與比目 魚肌，還有血漿之胰島素、葡萄糖、總膽固醇、和三酸甘 油酯濃度均結果報'告於表7為雄性和表8為雌性動物（參閱 實施例3有關該等參數之顯著性說明）。 抗雌激素£1^-652.11(31之顯著降低體重增加是3 8°/。於無脂 肪之痩雄性大鼠和35 %於肥胖之雄性大鼠而脂蛋白脂肪 活性於白色腹膜後之脂肪組織與比目魚肌無任何變化於兩 種不同之性別。血漿胰島素的降低是35 %，57 %和48

41 1293246 A7 __B7__ 五、發明說明（39 ) %分別為瘦的雄性大鼠，肥胖的雄性大鼠和痩的雌性大鼠 ，而肥胖之雌性大鼠顯示一較高濃度之胰島素，且 EM-652.HC1無顯著之作用。血漿膽固醇於肥胖組中較高也 是會受EM-652.HC1投藥所降低。血清葡萄糖不受 EM-652.HC1處理之影響。 於實施例9中EM-652.HCn，DHEA或二者之組合的作用 於卵巢完整或卵巢切除之雌性大鼠該大鼠係給予一富含蔗 糖和脂肪之食物的結果報告是作用產生於總重量、重量和 鼠蹊部及腹膜後之白色脂肪組織，棕色脂肪組織，比目魚 肌和股肌外側肌肉（VLM)的脂蛋白活性。血漿胰島素、葡 萄糖、總膽固醇、三酸甘油酯和leptin，及肝臟膽固醇和三 酸甘油酯也一併有結果報告。 實施例10結果報告的是作用產生於重量增加和於脂質 -脂蛋白質代謝於大鼠的處理之後該處理係以不同之選擇 性雌二醇受體調節劑該等係描述於文獻（為ERA-923，拉梭 福赛芬Lasofoxifene，LY35S381和雷洛赛芬）還有 EM-652.HC1，其為本發明之理想化合物。測試化合物之投 藥是以口服強行餵入共20天（0.5毫克/每隻大鼠餵給之每一 種化合物）溶於0.4 %曱基纖維素餵食給卵巢切除之雌性大 鼠。卵巢完整之對照組，卵巢切除（0VX)之對照組和以17β-雌二醇（E2)OVX大鼠使用為參考組。體重和食物消耗之增 加係由於卵巢切除其顯著降低是由測試化合物之處理其程 度同卵巢完整之對照組。重量和鼠蹊部與腹膜後脂肪組織 之脂蛋白脂肪酶活性的減少是由以上之處理（除了 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -42 - ----------裝--------訂—.——丨- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4G) ERA-923和LY353381對白色之鼠蹊部脂肪組織及ERA-923 和拉梭福賽芬對鼠蹊部之脂蛋白脂肪酶活性）而棕色脂肪 組織和肌肉似乎沒有顯著之影響‘。能夠看見的是所有測試 化合物顯著降低血漿膽固醇、三酸甘油酯之濃度但不影響 葡萄糖濃度。血漿胰島素之降低是由處理OVX大鼠以 EM-652.HC卜ERA-923，拉梭福賽芬，LY 353381和雷洛赛 於實施例11和12，生物體外之效率於雌二醇倚賴性細 胞株產生係以已知之抗雌激素和本發明之化合物做結果報 告。抗雌激素之作用產生於鹼性磷酸酶活性於人體之子葉 内膜腺癌Ishikawa細胞的結果顯示於實施例10之表11。抗 雌激素活性的列出報告於最後一攔係以1C 50表示其單位 為nM係為抑制受InM E2刺激之鹼性磷酸酶而測試化合物 本體之雌激素活性列出報告於倒數第二欄以受InM E2刺 激之驗性碗酸酶活性的百分比。能夠看出最具活性之抗雌 ( 激素是EM-652.HC卜LY 353381，雷洛赛芬，拉梭福賽芬 ，和ERA-923。其他則至少小10倍活性。然而，當中最具 活性之化合物，某些具有一顯著之殘基之非希望之雌激素 活性：LY 353381(16 %)，拉梭福賽芬（18 %)，和雷洛賽芬 (13 %)。因此，顯示之數據指出化合物EM-652.HC1和 ERA-923並未顯示顯著之雌激素活性於Ishikawa細胞。於實 施例12中一比較為EM_652.HC1，我們理想之化合物，和 ERA-923於人體乳癌MCF-7細胞顯示出EM-652.HC1之優點 。因此，EM-652.HC1是比四倍更高之更具活性當相較於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 43 —--------I 裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 ______B7 __ 五、發明說明（41 ) ERA-923做為一抗雌激素藥物（抑制作用之EC5G(50 %有效 濃度）為 〇·8 nM對3·7 nM)(表 12)。 於實施例13，作用為20天之處理係以EM-652.HC1， ERA-923或雷洛賽芬而作用產生於體重，腹膜後之脂肪組 織，子宮之重量和膽固醇含量做評估於卵巢切除雌性大鼠 其餵食的是一販售之嚅齒動物飼料。卵巢切除誘導17 %和 19 %之增加分別於總體重和腹膜後之脂肪組織之重量，而 投藥〇·5毫克之EM-652.HC卜ERA-923或拉梭福賽芬制止之 體重增加分別為64%，59%和127%，且引發脂肪組織重量 之值低於卵巢完整對照組所觀察之值是指所有試驗之化合 物。投藥EM-652.HC1和ERA-923不具作用於子宮之重量當 相較於卵巢切除對照組之動物。然而，投藥0.5毫克之拉梭 福赛芬產生一 62%之增加（ρ<〇·〇ι)於子宮之重量此增加被 完全逆轉是以同時投藥2·5亳克之EM-652.HC1，係因此闡釋 拉梭福賽芬之一雌激素活性。最後，OVX誘導之增加於總 血清膽固醇含量被完全制止是以投藥EM-652.HC1和 ERA-923和拉梭福赛芬且引發膽固醇之含量值顯著低於卵 巢完整對照組所觀察之值。 ， 實施例5 作用產生於脂肪積聚是以EM-652.HC1和DHEA之處理 ，投藥是單獨或組合，投藥於卵巢完整之雌性大鼠其接受 或無一LHRH-A。 URMA-r-04-99 本試驗之目的是測定作用其產生於脂肪係以以 44 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公髮） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293246 ♦ A7 _ B7_ 五、發明說明（42 ) EM-652.HC1和脫氫上雄固酮（DHEA)之處理於卵巢完整之 雌性大鼠其接受或無一黃體荷爾蒙釋放荷爾蒙同效劑 (LHRH-A，LHRH-乙基乙醯胺）。為此目的，印巢完整之雌 性大鼠，其處理有或無LHRH-A(1 pg/每隻大鼠），接受每 曰投藥為EM-652.HC1 (2.5毫克/每公斤）和DHEA(100毫克/ 每公斤），單獨或組合，共6個月。EM-652.HC1之投藥是口 月艮，DHEA是使用於局部而HRH-A是以皮下注射。所有之 處理是投藥每曰一次。 測試動物 品種· Rattus norvegicus 品系：Sprague-Dawley 大鼠（Crt: CD⑧（SD)BR VAF/Plus TM) 性別：雌性 年齡：於開始給藥，大鼠是大約10-12週大。 動物房和飼養 a) 動物房: 大鼠之動物房是個別於不鏽鋼籠子於適應和試驗之期 間。 b) 溫度和濕度: 環境狀態（溫度和濕度）於大鼠動物房是持續記錄使用一 電腦化自動系統。目標設定狀態是22 ± 3°C和50 ± 20 % 之相對濕度。 c) 光-暗循環: 光週期是12小時光亮和12小時黑暗。這些參數是持續 記錄使用一有效之電腦化自動系統。光亮自07:15至19:15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -45 - -----------裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 ___B7_____ 五、發明說明（43 ) 〇 d)飲食： 有認證之嚅齒動物飼料（Lab Diet # 5002，丸狀）和自來 水的提供是採不限制之供給。 亂數分配: 大鼠被指定至每一組是以亂數於適應之期間内。 方法和試驗設計 測試分組· 120隻大鼠區分至8組每組15隻動物供進行試驗摘要於下： 處理 懸浮液 口服i .劑量 受藥 溶液劑量 局部使用 LHRH-A (皮下注射） 劑量 (毫W公斤） 體積/大鼠 (毫升） 劑量 (毫克/公斤） 體積/大鼠 (毫升） 劑量 (1μ〆大鼠） 卵巢完整 - 0.5 - 0.5 - EM-652.HC1 2.5 0.5 - 0.5 - DHEA - 0.5 100 0.5 - DHEA + EM-652.HC1 2.5 0.5 100 0.5 - LHRH-A - 0.5 - 0.5 0.5 ml LHRH-A + EM-652.HC1 2.5 0.5 - 0.5 0.5 ml LHRH-A + DHEA - 0.5 100 0.5 0.5 ml LHRH-A+DHEA +EM-652.HC1 2.5 0.5 100 0.5 0.5 ml 測試動物之準備： LHRH-A是配製為溶液其濃度是1.0毫克/毫升。我們將 稀釋此濃縮溶液（以得到一最終濃度為0.002毫克/毫升）我 們使用下列載劑：0.3 %氯化鈉和0.25 %磷酸鈉單一鹼基， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 46 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂i — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

本紙張尺度翻中(CNS)A4規格⑵g x 297公爱 1293246 A7 ______B7__ 五、發明說明（44 ) 單一結晶水溶於水中。氫氧化鈉（溶液）被使用來調整酸鹼 值介於5.6-6.2之間。 劑量之懸浮液/溶液的製備是每隔兩週依據最新測量 之體重（組平均）除外的是LHRH-A溶液。對EM-652.HC1之 口服投藥，載劑（0.4 %曱基纖維素）被添加至測試化合物， 之前先稱重至一玻璃瓶，至少48小時於第一個劑量日之前 。確定劑量懸浮液之均一度，該懸浮液至少攪拌48小時於 2-8°C。劑量懸浮液保存於2-8°C。對DHEA溶液之局部使用 ，乙醇被添加至DHEA然後混合物搖晃直至DHEA溶解。然 後，聚乙二醇被添加至溶液並搖晃至均勻。劑量溶液保存 於2-8。(：。（一部份之溶液能夠被保存於室溫以促進局部使 用於動物體。對LHRH-A溶液之皮下注射，一濃縮溶液之 稀釋液其稀釋係使用適當之載劑該稀釋液的製備是每個月 一次。劑量溶液保存於2-8°C。 動物之m,: 於第一個劑量日之前及所需於試驗期間，一部份之背 4皮膚（大約5 X 5公分）剃毛供局部使用DHEA。 篮量： 測試化合物或載劑之投藥是開始於試驗程序之試驗日 1。測试化合物的給藥是以藥物溶於〇·4 %甲基纖維素之释 浮液以強行餵食（0.5毫升/每次強行餵食/每隻大鼠）每曰一 次或局部使用溶於50 %乙醇_5〇 %丙二醇（〇·5亳升/每次使 每隻大鼠）每曰一次。第5-8組之大鼠同時接受Lhrh_a 每曰一次以皮下注射及/或單獨之局部接受適當的載 -47 - I Aw-1 · 11----1 ^ « — — — — 1 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 _ B7__ 五、發明說明（45 ) 體脂肪測量 身體組成物的測量是於全身骨骼和動物之右股骨於吸 入性麻醉劑愛舒福能麻醉下使用雙倍數能量X射線吸光分 析儀（型號：DEXA ; QDR 4500A)於適應期和處理六個月之 後。 結果 表4 處理 脂肪(％) 卵巢完整 _ 23.1 ± 1.6 EM-652.HC1 19.1 ± 1.4 DHEA 20.2 ± 2.3 DHEA+EM-652.HC1 18.8 ± 1.3 LHRH-A 36.4 ±2.2 LHRH-A+ EM-652.HC1 31.2 ±2.0 LHRH-A+ DHEA 27.4 ±2.1 LHRH-A+DHEA+ EM-652.HC1 25.0 土 1_7 實施例6 作用是一20天之處理該處理係以EM-652.HC1雌二醇 和DHEA，產生作用於卵巢切除之雌性大鼠之體月旨肪和體 重參數。

URMA-r-27-OO 本試驗之目的是評估作用其產生於體脂肪和體重參數 係以EM-652.HC1和雌二醇和DHEA投藥為口服之單一或組 合，至卵巢切除之雌性大鼠其接受一富含碳水化合物之飼 料。 測試動物 48 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 嚆 Α7

-五、發明說明（46 ) 經齊郎智慧財轰局員X-消費合阼Fi印製 品種·· Rattus norvegicus 品系：Sprague-Dawley 大鼠（Ci:t: CD⑧（SD)BR VAF/Plus tm) 性別：雌性 、 體重：劑量開始時，體重大約是200-250公克。 患_物房和飼養 a) 動物房： 大鼠之動物房是個別於不鏽鋼籠子於適應和試驗之期 間。 b) 溫度和濕廑： 環境狀態（溫度和濕度）於大鼠動物房是持續記錄使用 一電腦化自動系統。目標設定狀態是22 ± 3t*5〇 ± 2〇 % 之相對濕度。 c) 光-暗循環： 光週期是12小時光亮和12小時黑暗。這些參數是持續 記錄使用一有效之電腦化自動系統。光亮自〇7:15至19:15 〇 d)飲食： 有保β丘之邊齒動物飼料（Lab Diet# 5002，丸狀）和自來 水的提供是採不限制之供給於適應之期間。試驗期間，大 鼠將接受一富含碳水化合物之飼料以不限制之供給。營養 飼料（Diet #3)之組成是（公克/每公克）：玉米澱粉，312 ; 葡萄糖，31.2 ;路蛋白，20·〇 ;玉米油，6 4 ; dl•甲硫胺酸 ，〇·3 ;混合維生素，lo ;八；[斗76混合礦物質，4·9和纖維 素，5.0 。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----—--- -- ------------裝--------訂· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I 1293246 Α7 Β7 五、發明說明（47 ) 解剖前一天，大鼠絕食（只允許飲水）至下午結束（共約 16小時）。 亂數分配: 大鼠被指定至每一組是以亂數於試驗之第〇曰。 方法和試驗設訃 測試分組： 80隻大鼠區分至8組每組15隻動物供進行試驗摘要於下: 「 ' 處理 —_ 懸浮液劑量 | 口服投藥 劑量 (毫克/公斤） 體積/大鼠 (毫升） 卵巢完整 0 0.5 ml pvx ~ 0 0.5 ml OVX +EM-652.HC1 0.5 0.5 ml OVX + E2 ' 100 0.5 ml |OVX + EM-652.HC1 + DHEA '0.5 + 100 0.5 4- 0.5 ml |〇VX + EM-652.HC1 + E, Γ 0.5+ 0.5 0.5 + 0.5 ml 動物之準備： 於试驗第0日，第2至8組之大鼠做卵巢切除，以雙側切 除，於吸入性麻醉劑愛舒福能麻醉下進行。大鼠自第丨組開 始皆做虛擬手術。 劑量： 測試化合物或載劑之投藥是開始於試驗日1 (該曰為 卵巢切除之次一日）。測試化合物的給藥是以藥物溶於〇 ·4 %曱基纖維素之懸浮液強行餵食（0.5亳升/每次強行餵食) 共20天。 身體組成物之測詈 於試驗之第21日（解剖之前），身體組成物的測量是於 本紙張尺度刺中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） 50 ----------裝--------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Li. 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 1293246 ^ A7 _B7_ 五、發明說明（48 ) 全身骨骼於吸入性麻醉劑愛舒福能麻醉下使用雙倍數能量 X射線吸光分析儀（型號：DEXA ; QDR 4500A)以測定處理 作用產生於脂肪之百分比。 器官和組織之收集 右側和左側之腹膜後的脂肪·組織被收集並稱重。 結果 表5 處理 脂肪 % 腹膜後的脂肪組織 公克 卵巢完整 15·7± 0.8 2·20± 0·20 OVX 18·9土 1·5 3·70± 0·41 OVX +EM-652.HC1 10·2± 1·2 1.52± 0·18 OVX + e2 10.3± 0.6 0·81± 0.17 OVX + DHEA 7.8± 0.8 0.92± 0·17 OVX + EM-652.HC1 + DHEA 8·4± 0.9 1.15± 0.17 OVX + EM-652.HC1 + E2 10·4± 0.7 1·17± 0.19 實施彻7 作用是一 34週之處理該處理係以乙炔基雌二醇， EM-652.HC1，雷洛賽芬，和DHEA作用產生於卵巢切除雌 性大鼠之體脂肪和身體重量參數。 URMA-r-42-98 本試驗之目的是評估一組合處理之作用該處理係以 EM-652.HC1，和DHEA其作用產生於卵巢切除大鼠之體脂 肪和體重。為此目的，卵巢切除之大鼠接受每日之投藥是 EM-652.HC1 (1毫克/每公斤），和DHEA (80毫克/每公斤）單 一或組合共34週。EM-652.HC1的投藥是以口服而DHEA是 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 51 ----------裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 ----------B7_______ 五、發明說明（49 ) 局部使用於背部皮膚。一組動物是口服處理其係以17a-乙 炔基雌二醇（〇·1毫克/每公斤）和雷洛赛芬（EM-1105; 1毫 克/每公斤）供做比較。 材料與方法 動物和處理 10-12週大之雌性Sprague-Dawley大鼠（品系Crt : CD®(SD)BR)體重大約是20CT-250公克於處理開始時使用。 80隻大鼠以亂數區分至7組每組11至12隻動物說明如下：1) 卵巢完整之對照組；2)OVX對照組；3)OVX + ΕΕ2(0·1毫克 /每公斤）4) OVX +雷洛賽芬（1亳克/每公斤）；5) OVX +EM-652.HC1 (1 毫克/每公斤）；6) OVX +DHEA (80毫克/ 每公斤）；7)OVX +EM-652.HC1 +DHEA。試驗之第1日，條 件相符之組別的動物進行雙側卵巢切除（OVX)其切除手 術於吸入性麻醉藥：愛舒活能麻醉下進行。EM-652.HC1 ，雷洛賽芬，和EE2 (Steraloids)之投藥是每曰一次由口服 強行餵食藥物是藥物溶於0.4 %曱基纖維素之懸浮液（0.5 毫升/每隻大鼠）共34週而DHEA是局部使用每曰一次於背 部皮膚是一藥物溶於50%乙醇-50%丙二醇（0·5毫升/每隻 大鼠）於相同之期間。最後一次劑量後大約24小時，隔夜停 飼動物之處死是以放血法.其係於吸入性麻醉劑愛舒福能麻 醉下由腹部主動脈處放血。右側和左側之腹膜後的脂肪組 織被收集並稱重。 身艚組成物之測量 處理3 4週之後，每隻大鼠於吸入性麻醉劑愛舒福能麻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 52 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293246 * A7 __B7_ 五、發明說明（5G ) 醉下進行全身骨骼使用雙倍數能量X射線吸光分析儀（型號 :DEXA ; QDR 4500A，Hologic， Waltham，ΜΑ)並使用 一局部高解析度之掃瞄軟體。身體組成物（包含脂肪百分比 )由此測得。 統計分析 數據表示為平均土標準差。 結果 表6 處理 右側腹膜後之 脂肪組織 左側腹膜後之 脂肪組織 脂肪 卵巢完整對照組 1.43± 0-12 1.80± 0.26 25·7士 2.5 OVX對照組 2.53± 0.24 2.64± 0.18 42·1土 1.5 ovx +ee2 1·29± 0.22 1_15± 0.18 19·8土 1.9 (〇· 1毫克/公斤） OVX+雷洛赛芬 1·29± 0·12 1·41± 0.13 22.8土 1.6 (1毫克/公斤） OVX + EM-652.HC1 2.07± 0.18 2·19± 0.28 27.7土 1.8 (1毫克/公斤） OVX + DHEA 2.16± 0.25 1·98± 0.17 26.8土 2.3 (80毫克/公斤） OVX + EM-652.HC1 + DHEA 1·62± 0.18 1·47± 0·18 25·1土 1.8

實施例8 A EM-652.HC1的作用產生於痩和肥胖盧克雄性大鼠之 能量平衡和脂肪-脂蛋白質代謝。 URMA-r-61-99 本試驗之目的是測定EM-652.HC1的作用產生於痩和 肥胖盧克雄性大鼠之能量平衡和脂肪-脂蛋白質代謝。為此 目的，EM-652.HC1(2.5亳克/每公斤）進行投藥以口服（強行 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 53 ----------^--------訂-------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1293246 A7 ________B7_____ 五、發明說明（51 ) 餵食）每日一次共14天至卵巢完整之瘦和肥胖盧克雄性大 鼠。 測試動物 品種：worvegz’cws 品乐·盧克 β 性別：雄性 體重··於開始給藥，體重是大約·· 痩大鼠：175±15公克；肥胖大鼠：235±15公克 環境調適 大鼠調適至實驗室狀態至少於開始試驗前5天。 動物房和飼養 a) 動物房: 大鼠之動物房是個別於不鏽鋼蘢子於適應和試驗之期 b) 溫度：

>JDL度於大乳動物房之記錄是每日一次。目標設定溫度是 22 土 3〇C c) 光-暗循環： 光週期是10小時光亮和14小時黑暗。燈亮自〇7:〇〇 ,然後 燈關於17:00。 d) 飲食· 於調適期，大鼠將得到一販賣之之嚆齒動物飼料(purina ’# 5075)和自來水是採不限制之供給。於試驗期間，大 鼠將得到下列飼料（diet#3)組成為公克/每1〇〇公克）：澱 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） 54 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---------訂· 7 246 39 12

發明說明（52 ) 粉，31·2 ;葡萄糖，31 2 ·狀疋 ，路蛋白，20.0 ;玉米油，6.4 ;dl-曱硫胺酸，〇·3 ;混合维 化口、.隹生素，i.O ; ΑΙΝ-76混合礦 物質，4.9和纖維素，5 〇。大鼠停飼（只允許飲水）於解剖當天早上劃。 IL數分配： 第一個劑量曰之前一曰， 大鼠％重然後指定至每一組 以使各組具有相當之平均體重。 方法和試驗設計 j則試組： 16隻痩和肥胖之_巢完整之雄性大鼠被指定至4組其 每組有8隻大鼠以供進行試驗其摘要如τ |大鼠數量/每組4s* 劑量 -------- (宅克/母公斤） 8 〇 痩 EM-652.HC1 2.5 1 〇 肥胖 EM-652.HC1 2.5 8 痩 對照組 ~〇 " ° _肥胖 對照組 --------—-裝— (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 給藥劑詈 、 測試化合物或載劑之投藥開始於試驗之第1天。測試# 合物EM-652.HC1之給藥是藥物溶於〇·4 %甲基纖維素之髮 浮液由口服強行银食藥物（〇·5毫升/每次強行儀藥/每隻太 鼠）每日一次是共14天。對照組之大鼠接受單純載劑（〇5毫 升/每次強行餵藥/每隻大鼠）於相同之期間内。 體重 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 55 1293246 A7 ---------B7____ 五、發明說明（53 ) 於適應期間，動稱重於開始給藥之前一天以供亂數分 配。然後，大鼠稱重於給藥之第一天和此後之每隔兩天及 解剖當天。體重之記錄精確至1公克。 食物之洁耗 食物消耗之評估是以每隔兩天一次於試驗之期間。 動物犧姓之方法 緊接於大約6小時之停飼期，動物進行解剖（大約3 0小 時於最後一次給藥之後）。動物以麻醉藥物易他明-來拉辛 (ketamine-xylazine)麻醉下以心臟廢縮機將血液抽出。 血液樣品 血液脂質（總膽固醇（CHOH)和三酸甘油酯（TG)及葡萄 糖的測定是以冷束血漿樣品其分析是以Boehringer Mannheim診斷分析儀（型號：Hitachi 911)(製造商： Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems) 〇 體 循環之荷爾蒙和受質（Leptin，胰島素）之測定是以冷凍血漿 樣品使用下列套組：

Leptin : Linco放射性免疫分析套組 胰島素：Linco放射性免疫分析套組 器官和組織之收集 一葉肝臟（約1克）置入液態氮供進一步測定TG和 CHOL之含量（佛氏測定法，Folch’s method)腹膜後之脂肪 組織和比目魚（肌）收集並置入液態氮供進一步測定脂蛋白 脂肪酶（LPL)活性。腹部之前列腺，睪丸（左侧和右侧一起） 和右側半月vesicle (排空液體）進行稱重。丟棄右側半月 56 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1293246 A7 B7 五、發明說明（54 vesicle 〇 組別 外表處理 型態 痩對照組 表7 雄性盧克大鼠月i蛋;=脂蛋白脂肪 ⑽ 體重增加酶活断血魏島素血漿葡萄糖^甘 白色腹膜背 面 比目魚肌 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

膽固醇 油酯 nniol/L nmol/L

nmol/L μυ/每公克μυ/每公克_1/L 蛋白質 蛋白質 73.0±4.2 20661353 71.7±7.9 0.095±0.002 10.74±0.87 2.1010.15 1.47±0.20

G 痩 EM-652.H 44·9±3.5 1701±348 69.5±8.4 0.062±0.005 9.35±0.51 1.18±0.09 1.52±0.13 C1 2.5 mg/Kg 肥胖對照組 110,5±6·7 7233±511 51.9±8.8 1.09210.369 11.0$±0.84 5.07±0.28 4.21±0.78 肥胖 ΕΜ-652.Η 71.6±3.3 7046±1185 58.1±4.6 0.475±0.087 11.84±0.62 2.28±0.25 7.16±1.06 C1 2.5 mg/Kg 經濟部智慧財產局員I.消費合阼；ώ印製 品種 品系 性別 體重

實施例8B EM-652.HC1的作用產生於痩和肥胖盧克雌性大鼠之 能量平衡和脂肪-脂蛋白質代謝。 URMA-r-47-99 本試驗之目的是測定EM-652.HC1的作用產生於痩和 肥胖盧克雌性大鼠之能量平衡和脂肪-脂蛋白質代謝。為此 目的，EM-652.HC1(2.5毫克/每公斤）進行投藥以口服（強行 餵食）每曰一次共14天至卵巢完整之痩和肥胖盧克雌性大 鼠。 測試動物

Rattus norvegicus 盧克 雖性 於開始給藥，體重是大約： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 57 1293246 A7 五、發明說明（55 ) 痩大鼠：114±2公克；肥胖大鼠：182±6公克 i境調洎 大鼠調適至實驗室狀態至少於開始試驗前5天。 數物房和飼卷 a) 動物廣: 大鼠之動物房是個別於不鏽鋼蘢子於適應和試驗之期 間。 ’ b) 溫度:

溫度於大鼠動物房之記錄是每日一次。目標設定溫度是 22±3°C c) 光-暗循璟： 光週期是10小時光亮和；14小時黑暗。燈亮自〇7:〇〇，然後 燈關於17:00。 d) 飲食: 於凋適期，大鼠將得到一販賣之之嚅齒動物飼料（purina ’ #5 075)和自來水是採不限制之供給。於試驗期間，大 鼠將得到下列飼料（diet#3)組成為公克/每100公克）：澱 粉’ 31.2 ;葡萄糖，31·2 ;酪蛋白，2〇 〇 ;玉米油，6.4 ’ dl-甲硫胺酸，〇·3 ;混合維生素，ι·〇 ; ΑΙΝ_76混合礦 物質，4.9和纖維素，5.0。 大鼠停飼（只允許飲水）於解剖當天早上7h〇〇。 亂數分配： 第一個劑量日之前2日，大鼠稱重然後指定至每一組以 使各組具有相當之平均體重。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐.) 58 ---------41^—裝--------訂-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員X消費合作社印製 1293246 Α7 _ Β7 五、發明說明（56 ) 方法和試驗設計 測試組： 16隻痩和肥胖之卵巢完整之雌性大鼠被指定至4組其 每組有8隻大鼠以供進行試驗其摘要如下 |大鼠數量/每組 大鼠狀態 處理 劑量 (毫克/每公斤） 8 痩 EM-652.HC1 2.5 8 肥胖 EM-652.HC1 2.5 8 痩 對照組 0 8 肥胖 對照組 0 給藥劑量 測試化合物或載劑之投藥開始於試驗之第1天。測試化 合物EM-652.HC1之給藥是藥物溶於0.4 %曱基纖維素之懸 浮液由口服強行餵食藥物（0.5毫升/每次強行餵藥/每隻大 鼠）每曰一次是共14天。對照組之大鼠接受單純載劑（0.5毫 升/每次強行餵藥/每隻大鼠）於相同之期間内。 體重 於適應期間，動稱重於開始給藥之前一天以供亂數分 配。然後，大鼠稱重於給藥之第一天和此後之每隔兩天及 解剖當天。體重之記錄精確至1公克。 食物之消耗 食物消耗之評估是以每隔兩天一次於試驗之期間。 動物犧牲之方法 緊接於大約6小時之停飼期，動物進行解剖（大約30小 時於最後一次給藥之後）。動物以麻醉藥物易他明-來拉辛 (ketamine-xylazine)麻醉下以心臟壓縮機將血液抽出。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 59 ----------—裝--------訂------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 ______Β7__ 五、發明說明（57 ) 血液樣品 血液脂質（總膽固醇（CHOH)和三酸甘油酯（TG)及葡萄 糖的測定是以冷柬金漿樣品其分析是以Boehringer Mannheim診斷分析儀（型號：Hitachi 911)(製造商： Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems) 〇 體 循環之荷爾蒙和受質（Leptin，胰島素）之測定是以冷凍血漿 樣品使用下列套組：

Leptin : Linco放射性免疫分析套組 胰島素：Linco放射性免疫分析套組 器官和組織之收集 一葉肝臟（約1克）置入液態氮供進一步測定TG和 CHOL之含量（佛氏測定法，Folch’s method)腹膜後之爿曰肪 組織和比目魚（肌）收集並置入液態氮供進一步測定脂蛋白 脂肪酶（LPL)活性。子宮和卵巢進行收集，稱重並保存於 10%缓衝液福馬林供進一步組織學檢測。左侧和右侧之即 巢（無卵巢切除者）一起稱重。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 60 ---------!裝--------訂-----I--線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293246 A7 ^__— Β7___ 五、發明說明（58 ) 表8 雌.性盧克大鼠 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 紐別 體重增加脂蛋白脂肪脂蛋白脂肪血漿胰島素血漿葡萄糖血衆所有之血聚三酸甘 酶活性於酶活性於 膽固醇 油酯 白色腹膜背比目魚肌 面 外表處理 g μυ/每公克μυ/每公克nmol/L nmol/L nmol/L nmol/L 型態 蛋白質 蛋白質 痩 對照組 175±4 1586±155 55.8±8.1 0.12210.022 9.45±0.68 2.33±0.10 1.25±0.16 痩 EM-652.H 154±5 C1 2.5 mg/Kg 1349±246 60.8111.1 0.063±0.012 9.60±0.41 1.57±0.14 0.8310.07 肥胖 對照組 313±9 39801327 36.918.6 0.410±0.033 10.63±0.55 4.83±0.27 12.51±3.25 肥胖 EM-652.H 291±9 C1 3819±485 36.6±7.1 0.51510.091 11.70±0.47 3.27±0.97 22.20±4.44 2.5 mg/Kg 實施例9 EM-652.HC1和DHEA的作用，投藥是單一或組合，作 用產生於大鼠之能量平衡和脂肪-脂蛋白質代謝。 URMA-r-03-99 經齊郎知曰慧时轰笱員1-消費^阼^中製 本試驗之目的是測定EM-652.HC1的作用，投藥是單一 或組合，作用產生於大鼠之能量平衡和脂肪-脂蛋白質代謝 。處理產生之評估係以數個參數於20天之處理： EM-652.HC1 (0.5毫克/每隻大鼠，約2.5毫克/每公斤，每一 個口服投藥）和DHEA (20毫克/每隻大鼠，約100毫克/每公 斤，局部使用），投藥是單一或組合，投藥之動物是卵巢完 整（INT)和卵巢切除（OVX)之雌性大鼠該大鼠係接受一高 蔗糖·高脂肪之飼料。為做比較，一卵巢完整和卵巢切除之 對照組接/受倚營養飼料而其他對照組動物（即巢完整和 OVX)將接受販售之嚅齒動物飼料。 61 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7 五、發明說明（59 測試動物 品矛重· Rattus ^ίοrvcgicus 品系：Sprague-Dawley 大鼠（Crt:⑶⑧（SD)BR VAF/Plus TM) 性別：雌性 年齡·於開始給藥，體重約19〇土220公克。 環境調適 大鼠調適至實驗室狀態至少於開始試驗前5天。 動物房和飼養 a) 動物房： 大鼠之動物房是個別於一般設計之不鏽鋼籠子於適應 和試驗之期間。 b) 溫度：

/皿度於大乳動物房之記錄是每日一次。目標設定溫度是 22 ± 3°C c) 光-暗循環： 光週期是10小時光亮和14小時黑暗。燈亮自〇6:〇〇，然後 燈關於16h00。 d) 飲食： 於調適期，大鼠將得到一販賣之之舊齒動物飼料咖▲ ，# 5075)和自來水是採不限制之'供給。於試驗期間，第 1和2組之大鼠將得到販售之飼料而第3至1〇組將接受一 咼蔗糖-南脂肪之飼料組成為公克/每^ 〇〇公克）··蔗糖， 45 ;玉米油，10;豬油，1〇;酪蛋白，22·5;仏甲'硫胺 酸，0.3 ;混合維生素，Κ2; ΑΙΝ·76混合礦物質，和 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 62 1293246 A7 __B7_ 五、發明說明（6G ) 纖維素，5.5。 大鼠停飼（只允許飲水）於解剖前一天晚上22h00。 亂數分配· 於動物運抵後數日，大鼠稱重然後指定至每一組以使 各組具有相當之平均體重。 方法和試驗言史言十 測試組： 80隻大鼠被指定至10組以供進行試驗其摘要如下。 飼料 處理 齊 (毫克/， 每一個口 服劑量 丨量 每公斤） 局部使用 飼料1 INT 0 0 OVX 0 0 INT 0 0 INT + EM-652.HC1 0.5 0 特殊飼料2 INT +DHEA 0 20 INT + EM-652.HC1 + DHEA 0.5 20 OVX 0 0 OVX + EM-652.HC1 0.5 0 OVX + DHEA 0 20 OVX + EM-652.HC1 + DHEA 0.5 20 :販售之嚨齒動物飼料 :向庶糖-南脂肪飼料 動物之準備： 於試驗之第0日，大鼠其屬於條件符合之組別進行卵巢 切除以雙側切除，於吸入性麻醉劑愛舒福能麻醉下進行。 卵巢完整之大鼠做虛擬手術。 給藥劑量 測試化合物或載劑之投藥開始於卵巢切除之隔日（第1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --裝 tr-------會- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 63 1293246 A7 B7

L 五、發明說明（61 ) 日）。測試化合物EM-652.HC1之給藥是藥物溶於0.4 %曱基 纖維素之懸浮液由口服強行銀食藥物(0.5毫升/每次強行 餵藥/每隻大鼠）每曰一次是共20天。而DHEA是局部使用於 背部皮膚（0.5毫升/每次使用/每隻大鼠）每日一次於一相同 之期間。對照組之大鼠接受單純載劑（每次口服投藥和局部 使用）。大鼠犧牲於試驗之第21日於最後一次劑量後大約24 小時。 體重 大鼠稱重於第0日（手術之日），每隔2日於試驗期間和 解剖當日。體重之記錄精確至1公克。 食物之消耗 食物消耗之評估是以每隔兩天一次於試驗之期間。 動物犧牲之方法 緊接於大約6小時之停飼期，動物進行解剖（大約30小 時於最後一次給藥之後）。動物以麻醉藥物易他明-來拉辛 (ketamine-xylazine)麻醉下以心臟壓縮機將血液抽出。 血液樣品 血液脂質（總膽固醇和三酸甘油酯）的測定是以冷凍血 聚樣品其分析是以Boehringer Mannheim診斷分析儀（型號 :Hitachi 911)(製造商：Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)。體循環之荷爾蒙和受質（胰島素， leptin，葡萄糖）之測定是以冷;東血漿樣品描述如下： 胰島素：Linco放射性免疫分析套組 葡萄糖：貝克曼自動葡萄糖分析儀 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 ——訂-------· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 64 1293246 s ， A7 ------------ -五、發明說明（62 )

Leptin : Linco放射性免疫分析套組 器官和組織之收隼 下列組織進行收集並稱重係對於所有之動物體。 肌肉（比目魚肌和VLM)，脂肪（腹膜背面和鼠蹊部）， 心臟，棕色脂肪組織和大腦皆一併收集。 一葉肝臟（約1克）置入液態氮供進一步測定TG和 CHOL之含罝（佛氏測定法，Folch’s method)腹膜後之脂肪 組織和比目魚（肌）收集並置入液態氮供進一步測定脂蛋白 脂肪酶（LPL)活性。子宮（和卵巢於卵巢完整之組別）做移除 ，去除多餘之脂肪，稱重並保存於10%緩衝液福馬林。 ----------I 裝--------訂------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 63 總重量 A7 B7 五、發明説明（ 表9 鼠蹊部白色脂肪組織 重量 鼠蹊部白色脂肪組織腹膜背面白色脂肪組織 脂蛋白 脂肪酶活性 μυ/g 脂蛋白 重量 脂肪酶活 重量 性 g μυ/g g 脂蛋白 脂肪酶活性 工消費合作社印製 智慧財產局 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 飼料 飼料 飼料 蔗糖+脂肪 庶糖+脂肪 蔗糖 +脂肪 蔗糖 +脂肪 蔗糖f脂肪 蔗糖+脂肪 蔗糖+脂肪 庶糖+脂肪 處理 模擬對照組 OVX對照組 模《照組 模擬+B4 -652.HQ 槪+DHEA 模擬+EM -652HQ + DHEA OVX對照組 OVX+EM-6 52.HQ OVX + DHEA OVX + EM -652.HQ + DHEA 組別 g 239±6 294±6 257±10 238±5 252±5 249±4 316±8 268±5 274±9 263±5 μυ/g 0·410±0.043 252±55 0.983±0.104 1526±217 0.329±0.035 1053±138 0.888±0.146 570±100 1.472±0.199 2415±147 0.466±0.041 688±88 0.716±0.107 344±73 1.765±0.292 14701242 0.376±0.033 1073±152 0.43510.043 160 土 23 1.058±0.162 1277±56 0.306±0.044 1196183 0.659±0.075 194±45 1.06710.149 1177±188 0.373±0.036 982±72 0.489±0.083 224±45 0.909±0.124 1349±133 0.322±0.026 885±78 1.800 土 0.251 725+106 3.058±0.297 2503±215 0.519±0.064 867±99 0.709士 0.085 310±63 1.370±0.211 16121186 0.408±0.025 678±65 0.885±0.156 583±134 10699±0.151 1905+112 0.342±0.049 1069±96 0.658±0.088 306±42 10436±0.162 1542±118 0.373±0.040 876±75 比目魚肌肉 重量 脂蛋白 脂肪酶活性 重量 Vastus Laterralis muscle 脂蛋白 脂肪酶活性 總膽固醇 總膽固醇 飼料 處理 g μυ/g g μυ/g mmol/L mmol/L 飼料 模擬對照組 0.106±0.002 62.713.0 0.872±0.027 11.7±3.5 0.076±0.004 0.134±0.019 飼料 -ovx對照組 0.116m〇05 43.8±3.3 1.000±0.042 13.1 土 3.7 0.082±0.004 0.16910.027 嚴糖+脂肪 模擬對照組 0.096+0.005 55.0+5.1 0.927±0.04 13.1 土 3.2 0.083±0.002 0.123±0.014 蔗糖+脂肪 模擬+ΕΜ -652.HC1 0.098±0.005 53.9±3.3 0.965±0.034 16.2 土 3.1 0.096士 0.011 0.360±0.102 蔗糖+脂肪 模擬+DHEA 模擬+ΕΜ 0.105±0.004 53.6±7.5 0.893±0.043 11.5±2.0 0.068±0.003 0.03810.007 蔗糖+脂肪 -652.HC1 + DHEA 0.098±0.005 56.6±4.5 0.971 ±0.029 19.5±3.5 0.101+0.008 0.184±0.033 庶糖+脂肪 ovx對照組 0.110±0.004 39.213.9 1.037±0.026 10.9±1.82 0.097±0.007 0.262±0.052 蔗糖+脂肪 OVX+EM-652.HC1 OVX + EM 0.10410.004 39.1 土 5.0 0.94410.030 10.8土3.2 0.092土 0.006 0.348±0.078 蔗糖+脂肪 -652.HC1 + DHEA 0.103±0.005 45.9+4.7 0.920+0.049 13.1±5.4 0.079±0.005 0.165±0.047 蔗糖+脂肪 OVX + DHEA 0.101±0.001 48.4±4.8 0.929±0.038 11.0±4.1 0.106±0.008 0.273土0.031 組別 血漿 血漿 血聚 血漿 血漿 胰島素 葡萄糖 總膽固醇 三酸甘油酯 leptin 飼料 處理 nmol/L nmol/L nmol/L Nmol/L njnol/L 飼料 模擬對照組 0.071±0.010 7·56±0.24 1·61±0·17 0.4910.12 1.404±0.224 飼料 OVX對照:組 0.146±0.027 8.69土0.57 2.10±0.10 0.68±0.10 2.388±0.737 蔗糖+脂肪 模擬對照組 0.079±0.013 9.07±0.48 1.60±0.12 0.66±0.17 3.572士 0.699 蔗糠+脂肪 模擬+EM -652.HC1 0.057±0.004 9.03±0.49 1.15±0.06 0.60±0.12 2.019±0.402 蔗糖+脂肪 模擬+DHEA 0.048±0.012 8.05±0.51 1.59±0.17 0.61±0.11 1.977±0.255 蔗糖+脂肪 '652HC1 +0.049±0.013 DHEA 7.99±0.44 0.93±0.08 0.9510.21 1.071±0.162 蔗糖+脂肪 OVX對照組 0.125±0.022 10.46±0.72 1·62±0.26 0.83±0.13 7.900±1.982 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 66 A7 A7 經濟部〒央榉瘅^;工消費合作社印製 智慧財產局 B7 五、發明説明（64 ) ’ 蔗糖+脂肪 0.089±0.013 9.06±0.30 1.1510.11 0.97±0.16 1.989±0.326 蔗糖+脂肪 ^^^Μ~652·Ηα· 0.052±0·009 8.64±0.24 1.57±0.12 0.62±0.08 2.757±0.631 蔗糖+脂肪 0.060+0.010 8.65±0.38 0.87±0.09 0.92±0.21 1.672±0.327 實施例10 EM-652.HC1，ERA-923，拉梭福賽芬，LY 353381 和雷 洛赛芬的作用產生於卵巢切除之雌性大鼠之能量平衡和脂 肪-脂蛋白質代謝。

URMA-r-45-OO 本試驗之目的測定作用產生於大鼠之能量平衡和脂肪 -脂蛋白質代謝其處理係以不同之選擇性雌激素受體調節 劑該等描述於文獻本試驗並比較得到之結果和 EM-652.HCL之結果。為此目的，測試化合物之投藥是以口 服強行餵食共20天（0.5毫克/每隻大鼠，對每^個化合物， 0.5毫升/每隻大鼠）藥物係溶解於0.4 %甲基纖維素再投藥 給卵巢切除之雌性大鼠。卵巢完整對照組，卵巢切除（OVX) 對照組和OVX大鼠以17b-雌二醇（E2)處理係為參考之用。 測試動物 , 品種： 品系：Sprague-Dawley 大鼠（Crt: CD®(SD)BR VAF/Plus ™) 性別：雌性 年齡：於開始給藥，體重約200-225公克。 動物房和飼養 a)動物房·· 大鼠之動物房是個別於一般設計之不鏽鋼籠子於適應 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 67 1293246 A7 B7 65 五、發明說明（ 和試驗之期間。 b) 溫度： 環境狀態（溫度和濕度）於大鼠動物房是持續記錄使用一 電腦化自動系統。目標設定狀態是22 土 3°C和50 土 20 % 之相對濕度。 c) 光-暗循環： 光週期是10小時光亮和14小時黑暗。燈亮自〇7:15，然後 燈關於17hl5。 d) 飲食： 於调適期，大鼠接受一有認證之嚅齒動物飼料（Lab Diet # 5002，丸狀）和自來水的提供是採不限制之供給。試驗 期間，大鼠將接受一富含碳水化合物之飼料（Diet #3)和 自來水以不限制之供給。飼料之組成是（公克/每公克） :玉米澱粉，31.2 ;葡萄糖，31.2 ;酪蛋白，2〇〇 ;玉 米油，6.4; dl-甲硫胺酸，〇.3 ;混合維生素，ι〇 ·, ain_76 混合礦物質，4.9和纖維素.，5·〇。大鼠停飼（只允許飲 水）於解剖當天早上〇7hOO。

亂數分西匕I 大鼠被指定至每一組以使各組具有相當之平均體重。 試驗設計 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I* •丨-丨11丨丨訂· 11丨—丨丨 ' 68 1293246

經齊部智慧財產局員X.消費合阼ί£印製 五、發明說明（66 ) 且： 77隻大鼠被指定至8組每組9-10隻大鼠以供進行試驗 其摘要如下。 大鼠數量 處理 -----------_ue=— 懸浮液劑量 劑量 (毫克/大鼠） 體積/大鼠 (亳升） 9 卵巢完整 0 0.5 ml 9 -------- OVX 0 0.5 ml 10 OVX + EM-652.HC1 0.5 0.5 ml 10 OVX + ERA-923 (EM-3527) 0.5 0.5 ml 10 OVX +拉梭福賽芬(EM-3555) 0.5 0.5 ml 10 OVX+ LY 35381 (EM-1665) 0.5 0.5 ml —10 OVX + 雷洛賽芬(EM-1105) 0.5 0.5 ml 9 ----- __OVX + e2 0.5 丨丨· _1 1 aa=aaaxgBS8aaa=a 0.5 ml 1物之準借： 於試驗之第0曰，大鼠其屬於第2-8組進行卵巢切除（ 以雙側切除），於吸入性麻醉劑愛舒福能麻醉下進行。大鼠 其屬於第1組做虛擬手術。 大鼠稱重於第0日（手術之日），然後，每隔2日於試驗 期間和解剖當曰。 消耗 食物消耗之評估是以每隔兩天一次於試驗之期間。 成物（脂肪百公屮） 為測定處理之作用產生於脂肪百分比，身體組成物測 疋於第17日使用雙倍數能量χ射線吸光分析儀（型號： ΕΧΑ , QDR 4500Α ’ Hologic，Waltham，ΜΑ)。 ----------Aw-1 ^--------^--------41^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

69 1293246 A7 —______B7___ 五、發明說明（67 ) 動物犧牲之方法 於試驗之第21日，大約24小時於最後一次給藥之後和6 小時之停飼。動物以麻醉藥物易他明-來拉辛 (ketamine-xylazine)麻醉下犧牲其方法是以腹部主動脈放 血° 血液才篆品 血液脂質（總膽固醇和三酸甘油酯）的測定是以冷凍血 聚樣品其分析是以Boehringer Mannheim診斷分析儀（型號 • Hitachi 911)(製造商：Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)。體循環之荷爾蒙和受質（胰島素和 leptin)之測定是以冷凍血漿樣品描述如下： 胰島素：Linco放射性免疫分析套組 Leptin : Unco放射性免疫分析套組 器官和組镟之跄隼 下列組織進行收集並稱重： 肌肉（比目魚肌和VLM) ’脂肪（腹膜背面和鼠蹊部）， 心臟，棕色脂肪組織和大腦皆一併收集。 葉肝臟（約1克）置入液態氮供之後測STG*ch〇l 之含篁（佛氏測定法，F〇lch，s meth〇句。一 」 組織（除了子宮和陰道）;東入液態氮供之後測定脂蛋白脂肪 酶（LPL),舌性。子宮和陰道保存於1〇%緩衝液福馬林供進一 步組織學檢驗。動物之屍體置於-金屬盒並保存於】。〇直 至能量平衡之測定。 結果 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------裝--------訂------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 70 1293246 A7 B7 五、發明說明（68 )表10 處理 總重 量 鼠蹊部白色脂肪組織腹膜背面白色脂肪組織腹膜背面棕色脂肪組織 卵巢完整 ovx OVX + EM-652.HC1 OVX +ERA-923 OVX +拉梭福赛芬 OVX + LY 353381 OVX+雷洛赛芬 ovx+e2 g 232±7 284±5 252±4 260±5 210±2 231±4 230±3 198±4 重量 g 0.35010.037 0.320±0.048 0.244±0.028 0.326±0.042 0.187±0.023 0.290±0.038 0.245±0.047 0.158±0.019 脂蛋白 脂肪酶 活性 μυ/g 379±69 797197 684±21 6 766土17 3 801±13 8 559±16 5 579±46 416土74 重量 g 1.31±0.09 1.55±0.15 1.32±0.21 脂蛋白 脂肪酶 活性 μυ/g 15371253 2664±338 1917±365 1.27±0.15 1750±140 0.86710.132 1417±163 0.968±0.120 1365±119 1.32±0.24 1510±52 0.550±0.102 1442±243 重量 脂蛋白 脂肪酶 活性 g μυ/g 0.410±0.030 973±115 0.380±0.027 880±130 0.339±0.038 900±91 0.350±0.019 1017±83 0.244土0.022 982±98 0.368±0.031 888±65 0.307±0.26 960±116 0·211±0·021 1198±62 處理 比目魚肌肉 Vastus Laterralis muscle 重量 脂蛋白 重量 脂蛋白 脂肪酶活性 脂肪酶活性 卵巢完整 g μυ/g g μυ/g 0.113±0.020 17.2土2.2 0.924±0.031 ND OVX 0.108±0.006 17.6±3.9 0.963±0.045 ND OVX + EM-652.HC1 0.118±0.018 14.5±4.1 1·000±0.047 ND OVX + ERA-923 0.100±0.004 11.7±1.9 0.993土0.33 ND OVX +拉梭福赛芬 0.096±0.003 10.9±1.5 0·800±0·048 ND OVX + LY 353381 0.92±0.002 10.1±1.0 0·955±0·20 ND OVX+雷洛赛芬 0.099±0.003 10.2±2.0 0.795±0.055 ND OVX+ e2 0.086±0.003 10.9土2.0 0.718土0.026 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 處理 累積 血漿 血漿 血裝 血漿 血漿 食物攝取量 胰島素 葡萄糖 總膽固醇 三酸甘油酯 leptin g nmol/L nmol/L nmol/L nmol/L nmol/L 卵巢完整 332±14 0.08610.11 13.6土0.7 2·41±0·16 0.62±0.07 2.46±0.37 OVX 389±8 0.178±0.030 15.9±1.9 2.58±0.11 0.63±0.05 3.48±0.40 OVX + EM-652.HC1 324土5 0.122±0.021 15.9±1.4 1·41±0·09 0.91±0.17 1.10±0.22 OVX + ERA-923 347±9 0.113±0.029 16.5±2.7 1.66±0.16 0·93±0·24 2.12±0.44 0VX + 拉梭福赛芬 283114 0.095±0.017 15.8±1.32 1.29±0.06 0.81±0.21 0.97±0.29 OVX + LY 353381 312士7 0.104±0.11 17.1土0.72 1·15±0·08 1·23±·28 1.22±0.21 OVX + 雷洛赛芬 307±8 0·077±0·10 13.8 土 1.2 1·19±0.08 1.20±0.35 1.39+30 OVX+ e2 255±9 0.07010.007 11.8±1.35 2·03±0·15 0.43±0.04 0.30910.097 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 71 1293246 A7 ____B7___ 五、發明說明（69 ) 實施例11 本發明化合物之作用和前置技藝之化合物其產生作用 於人體之子宮内膜腺癌石川氏（Ishikawa)細胞之鹼性填酸 酶活性。 材料 維護保存株之細胞培養 人體石川氏細胞株係分離自一分化良好之子宮内膜腺 癌細胞該細胞株是由Erlio Gurpide博士（Mount Sinai Medical Center，New York，NY)所慨然提供。石川氏細胞一 般培養於伊果最低限必需培養基（Eagle’s Minimum Essential Medium)(MEM)含有5%(體積/體積）胎牛血清 (FBS)並補充有100 U/毫升之盤尼西林，100 pg/ml鏈黴素， 0·1 mM非必需胺基酸溶液。細胞植於商品名：Falcon T75 細胞培養瓶其培養濃度是1.5 xlO6培養溫度是37°C。 細胞培養之試驗 於一試驗開始前24小時，幾近黏連稠密之石川式細胞 培養液置換為無雌激素之基礎培養液（EFBM)含有一無酚 紅之商品名：Ham’s F-12和Dulbecco氏修改之伊果最低限 必需培養基（DMEM)二者的1 ·· 1(體積：體積）混合液補充有 100 U/亳升之盤尼西林，100 pg/ml鏈黴素，2 nM穀胺酿 胺和5%胎牛血清此培養液以袠覆聚葡萄糖（dextran)之焦 碳處理兩次以移除内含性之類固醇。然後細胞之收取是以 0·1 %之胰酶（pancreatin)(製造商：Sigma)溶於0.25 mM之 HEPES緩衝液，再重新懸浮於EFBM並植於商品名：Falcon 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -72 - ----------—裝------—訂------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ293246 i A7 _J7__ 五、發明說明（7G ) 96凹槽平底式微量細胞培養盤培養之密度是2.2 x 104個細 胞/每一凹槽且每一凹槽之體積是100 μΐ然後以24小時使細 胞黏附至培養盤表面。此後，培養液之置換是以新鮮之 EFBM含有註明之化合物濃度其一最終體積為200 μΐ。細胞 培養共5日，置換培養液於每隔48小時之後。 驗性填酸酶分析測定 培養期終止時，微量細胞培養盤反轉倒置並丟棄生長 培養液。細胞培養盤之沖洗是以每一凹槽200 pL之磷酸鹽 緩衝液（PBS)(0.15M氯化鈉，10 mM磷酸鈉，pH 7.4)。PBS 移除自細胞培養盤並小心留下一點殘餘之PBS，然後沖洗 步驟再重覆一次。緩衝之生理食鹽水於此時丟棄，且細胞 培養盤反轉倒置之細胞培養盤小心拍乾於一紙巾。於置換 一盤蓋後，細胞培養盤置放於-80°C共15分鐘接著解凍於室 溫下10分鐘。細胞培養盤於此時放置於冰上，且添加50 pL 之一冰冷溶液其含有5 mM對-硝基苯磷酸鹽，0.24 mM氯化 鎂，和1 Μ二乙醇胺（pH 9.8)。細胞培養盤於此時回溫至室 溫，然後黃色其來自對-硝基苯基之產物進行呈色（8分鐘） 。細胞培養盤監測以波長：405 nm於一酵素連結免疫分析 測定儀（製造商：BIO-RAD，機型：2550 EIA Reader)。 計算 劑量-反應曲線和IC5〇值之計算是使用一加權反覆非 線性平方回歸法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) ，裝 經濟部智慧財產局員工消費合泎社印製 73 1293246 A7 五、發明說明（71 ) 表11 化學名 編碼名 結構 EM-652.HC1 0H-檀莫賽芬 EM-652.HC1 EM-1538 EM-882

1.88±0.26 (22) 以測試化合物刺以測試化合物抑 激 制1 nM E2 鹼性磷酸酶 刺敎之鹼性 磷酸酶活性 1 nME2刺激* 之 ic5Q(nM) %(試驗數量）（“驗數量） 0H-托里美芬 EM-880 0H-伊多赛芬 EM-1750 GW-5638 EM-1796 爵洛赛芬 EM-835

• Cg. ι^2±〇,22 (18) 31.9+6.0(5) 72.1±7.6(3) >1000(2) 無抑制作用 23·8±3·1 ⑺ 雷洛赛芬 LY 156758 LY 353381 EM-1105 EM-1665

拉梭福赛芬 EM-3114 (無鹼基） ERA-923 EM-3527

291±lis(4) 3.39±〇 9⑹. 1.87±〇.〇7(2) 42.4(1) 5.84(1) M nM £2刺激*之 化合物之OD 405 nm讀值-基準之〇D 405 nm讀值/j nM E2之〇D 405 nm讀值-基準之OD 405 nm讀值。請同時參 閱Labrie等人所發表之期刊EM-652(SCH 5768)，一第三 %: 代 ----------—裝·-------訂·------ (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 74 1293246 t A7 B7 •- -- 五、發明說明（72 ) SERM作用如乳腺和子宮内膜之姑> * τ 。 义砘抗雌激素，J· Steroid

Biochem· and Mol· Bio. 69，51-84，1999 實施例12 EM-652.HC1 和 ERA-923之作田 + ^ 〜作用產生於人體乳癌MCF-7 細胞株。 方法 維護保存株之細胞培養 MCF-7人體乳癌細胞係取復 件自美國塑態收集中心 #HTB22之147號許可且常務性生 ， 王長於無驗紅-Dulbecco s 修正邮心-取…川培養液^充物二以上所提及冗胎 牛血清。MCF-7人體乳腺癌細胞株係分離自一高加索⑽ 姐病患之肋膜滲出液。MCF-7細胞使用係以介於148號許 可和165號許可且每週增殖培養。 細胞增殖研究 細胞於其指數成長後期收取是以〇」％胰酶（pancreatin) (製造商：Sigma)然後再懸浮於適當之培養液含有5〇 ng之 胎牛胰島素和5 %(體積/體積）FBs以裹覆聚葡萄糖（dextran) 之焦碳處理兩次以移除内(含性之類固醇。細胞植於24凹槽 之商ασ名· Falcon 9塑膠培養盤（2 cm2/每一凹槽）以指定之 密度且以72小時使細胞黏附至培養盤表面。此後，培養液 之置換是以新鮮之培養液含有註明之化合物濃度稀釋自 1000倍貯存溶液含有99%二次蒸餾之乙醇含有或無β2。對 照組細胞接受只有乙醇載劑（〇· 1 %Et〇H，體積/體積）。細 胞培養於專一之時間間隔是培養液更換為2或3天之間隔。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --裳 訂--------· 痤齊STJIP曰i时轰苟員1.消費^阼^印製 75 1293246 A7 B7 ----------五、發明說明（73 ) 細胞數量的測定是以DNA含量測定。 計算和統計分析 劑量-反應曲線和IC5〇值之計算是使用一加權反覆非 線性平方回歸法。所有之結果的表示以平均土標準差。 表12 化學名 EM-652.HC1 ERA-923 實施例13 比較作用產生於子宮的重量，脂肪，和脂質該作用係 由EM-652.HC1，ERA-923和拉梭福賽芬，投藥是單一投藥 或組合有EM-652.HC1，投藥至卵巢切除之雌性大鼠。 URMA-r-44-OO 本試驗之目標是比較作用產生於子宮和陰道組織學於 EM-652.HC1，ERA-923和拉梭福賽芬處理下，投藥是單一 投藥或組合有EM-652.HC1，投藥至卵巢切除之雌性大鼠。 為此目的，每一個化合物的投藥是以口服共20日投藥至卵 巢切除之雌性大鼠且於處理期結束時，子宮和脂肪做收集 和稱重。 測試動物之專一性: 品種：Rattus norvegicus 品系：Sprague-Dawley 大鼠（Crt: CD⑧（SD)BR VAF/Plus TM) 編碼名 EM-652.HC1 ； EM-1538 EM-3527 以測試化合物 刺激DNA 1 nME2刺激*之％ N.S. N.S. 以測試化合物抑制 1 nM E2 刺激DNA IC5〇(nM) 0.796 3.68 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 76 1293246 S.齊STJFP曰慧讨轰苟員!:肖費^一乍·i沪提 B7 五、發明說明（74 ) 性別：雌性 體重· d里開始時，體重大約是2〇心25〇公克。 動物房和翩養 a) 動物廣： 大鼠之動物房是個別於不鏽鋼籠子於適應和試驗之期 間。 b) 遥度和濕唐: % 1兄狀悲（溫度和濕度）於大鼠動物房是持續記錄使用一 電腦化自動系統。目標設定狀態是22 ± 3°c和50 ± 20 % 之相對濕度。 c) 一光-暗循# ： 光週期是12小時光亮和12小時黑暗。這些參數是持續記 錄使用一有效之電腦化自動系統。光亮自07:15至19:15 d)飲食—·· 有保證之嚅齒動物飼料（Lab Diet # 5002，丸狀）和自來 水的提供是採不限制之供給。 亂數分SP.: 大鼠被指定至每一組是以數於彡卩巢切除之時。 測試分組： L---------•裝--------訂--------f--------•丨一L: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7 B7 五、發明說明（75 ) 7〇隻大鼠區分至7組每組9-U隻動物供進行試驗摘 於下 要 處理 懸浮液劑量 (亳克/每隻大鼠） 卵巢完整 OVX OVX + EM-652.HC1 OVX + EM-3527 OVX + EM-652.HC1 + EM-3527 OVX +EM-3555 OVX + EM-652.HC1 + EM-3555 0.5 0.5 2.5 + 0.5 0.5 2.5 + 0.5

-------I (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) --裝 動物之準備 第2-9組之動物進行卵巢切除手術於其切除手術於吸 入性麻醉藥：愛舒活能IS0flurane麻醉下進行於試驗之第工 曰。 劑量： 載劑或測試化合物之給予是以懸浮劑溶於〇·4%之甲 基纖維素其以口服強行餵食（〇·5亳升/強行飯食/每隻大鼠） 從試驗第2至第21日。 體重： 大鼠稱重於試驗之第1日和解剖之日（第22曰）。 動物犧牲之方法 最後一次給藥之後大約24小時，隔夜停飼大鼠以麻醉 藥物愛舒福能（Isoflurane)誘導之麻醉下犧牲其方法是以腹 部主動脈放血。 78 訂-------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7 B7 五、發明說明（76 ) 器官和組織.之收隹 子宮和腹膜背面之脂肪組織進行移除和稱重。 處理

卵巢完整 OVX OVX + EM-652.HC1 OVX + ERA-923 OVX+ERA-923+EM-652.H Cl (2.5 毫克） OVX +拉梭福赛芬 OVX+拉梭福賽芬+ EM-652.HC1(2.5 毫克） 最後之體重(g)腹糢背面之脂 232±5** 肪組織(g) 1.04 土 0.13** 266±5 1.42±0.24 238±4** 0.63±0.08** 248土5** 0.84+0.09** 241 土 1** 0.91±0.17** 21〇土3** 0.52+0.05** 234土3** 0.74+0.10** 子宮重量 膽固醇 (mg) (mmol/L) 485.8+28.4** 1.52+0.09** 152·9±4·7 1·91±0·09 173.017.1 1.00±0.11** 162·6±5.2 1.20+0.10** 180.2 土 5·2 0.99土 0.07** 274.4土 9.1** 0.95±0·09** 182.3+4.6 0.95+0.07%% -----------I ^ i (請先閱讀背面之注咅P事項再填寫本頁) ，ρ<0·05 ; **，ρ<〇·〇〇ι，試驗對比於〇νχ對照組 藥學組成物之實施例 於以下所列，是以實施例之方式而不做限制，是多種 藥學組成物其使用是以理想之活性SERM EM-800或 EM-652.HC1單獨或組合有一個理想之活性的一個性類固 醇前驅物DHEA，雄-5-烯-3b，17b-二醇3-醋酸鹽或雄-5-缔 -3b, 17b-一 Sf* 一半號ίό鹽。活性成份之濃度可以變化於〜 很寬之範圍如在此所討論。其他成份之數量和型態其可能 被包含者是技藝中所以知。 79 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1293246 A7 _ B7_ 五、發明說明（77 )

實施例A 本發明理想之SERMs是以口服投藥 藥錠 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） EM-652.HC1 5.0 明膠 5.0 乳糖 73.5 澱粉 16.5

實施例B 膠囊 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） EM-652.HC1 5.0 水合乳糖 80.0 澱粉 4.8 纖維素微晶粒 9.8 硬脂酸鎂 0.4 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

藥學組成物供組合式處理 實施例C 藥錠 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） EM-652.HC1 5.0 DHEA 15.0 明膠 5.0 乳糖 58.5 澱粉 16.5 80 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1293246 A7

Ί_Εfc五、發明說明（78 ) 實施例D 明膠膠囊 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） EM-652.HC1 5.0 DHEA 15.0 水合乳糖 > 65.0 澱粉 4.8 纖維素微晶粒 9.8 硬脂酸鎂 0.4 套組之實施例 於以下所列，是以實施例之方式而不做限制，是多種 套組其使用是以理想之活性SERM EM-800或EM-652.HC1 單獨或組合有一個理想之活性的一個性類固醇前驅物 DHEA，雄-5-烯-3b，17b-二醇3-醋酸鹽或雄-5-烯-3b，17b-二 醇二半琥珀酸鹽。 本發明其他之化合物或相關之組合，可以使用於（或添 加於）EM-800或EM-652.HC1單獨或組合有一個理想之活性 的一個性類固醇前驅物DHEA、雄-5-烯-3b，17b-二醇3-醋 酸鹽或雄-5-烯-3b，17b-二醇二半琥珀酸鹽。活性成份之濃 度可以變化於一很寬之範圍如在此所討論。其他成份之數 量和型態其可能被包含者是技藝中所以知。 -----------裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 釋 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 81 1293246 A7 _B7 _ 五、發明說明（79 )

實施例A (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) SERM是口服投藥而性類固醇前驅物是經皮膚投藥。 SERM組成物供口服投藥（膠囊） 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） EM-652.HC1 5.0 水合乳糖 80.0 澱粉 4.8 纖維素微晶粒. 9.8 硬脂酸鎂 0.4 性類固醇前驅物組成物供局部投藥 (凝膠） 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） DHEA 10.0 癸基-癸酸三酸甘油酯 (編碼名：Neobee M-5) 5.0 全思庫妥(Transcotol) (二乙二酵早甲基鍵） 15.0 苯基乙醇 5.0 赛卡美i康 (編碼名：Dow coring 345) 2.0 乙醇（純乙醇） 56.0 羥基丙基纖維素 (1500 cps)(KLUCEL) 2.0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -82 - 1293246 (膠囊） 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） EM-652.HC1 5.0 水合乳糖 80.0 澱粉 4.8 纖維素微晶粒 9.8 硬脂酸鎂 0.4 A7 B7 五、發明說明（8Q )

實施例B SERM和性類固醇前驅物是以口服投藥.。 非類固醇抗雌激素組成物係供口服投藥。 10 %性類固醇前驅物組成物係供口服投藥 -----------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (明膠膠囊） 成份 重量％ (以所有之組成物之重量） DHEA 15.0 纖維素微晶粒 84.6 硬脂酸鎂 0.4 « 其他SERMs可以替代EM-800或EM-652.HC1於以上之 配方當中，與此相同的是其他性類固醇抑制劑可以替代 DHEA，雄-5-烯-3b，17b-二醇3-醋酸鹽或雄-5-烯-3b，17b-二 醇二半琥珀酸鹽。不止一個SERM或不止一個前驅物可以 被包含於此個例時組合之重量百分比之理想是等於重量百 分比供單一前驅物或單一 SERM列於以上之實施例。 本發明之描述是以理想之具體例和實施例，但不因此 而有所限制。該等技藝中之技術將易於確認更廣範之可應 用性且本發明之範疇其限制僅由本專利案於此之申請專利 範圍。 83 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1293246 六、申請專利範圍 第_113329號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：96年2月 '· 一種用於在一需要的個體體内治療胰島素抗性或降低 發展出月夷島素抗性之風險的藥學組成物，纟包含一治療 有效量之-選擇性雌激素受體調節劑，其中該選擇性雌 激素受體調節劑具有下列通式： 5, G 6· 4, Ri y 2· 1” T 3” 6” 5" 其中 心和尺2是各自選自於由下列所組成之群組：氫、 羥基、-OM (M係選自於由直鏈或支鏈(：1_(：：4烷基 、直鏈或支鏈C^-C：4烯基、直鏈或支鏈c3_C4炔基 所構成之群組中）和一個可於活體内轉化為羥基 之部分； G是-H或-CH3 ;以及 Rs是一個選自於由下列所組成之群組中之物種： 吼咯啶基、哌啶並基、嗎啉並基和NRaRb (Ra和 Rb分別是氳、直鏈或支鏈Cl-C6烷基、直鏈或支鏈 C3_C：6稀基、直鏈或支鏈C3-C6块基）。 84 1293246 六、申請專利範圍 2.如申請專利範圍第1項之藥學组成物，其中該選擇性雌 激素受體調節劑是EM-652.HC1 EM-652.HC!

3. —種具有下列分子結構的化合物： EM-652.HC1

4. 一種用於治療或預防一對於選擇性雌激素受體調節劑 具有一有利之反應的疾病之藥學組成物，其包含一藥學 可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑以及一治療有效量之 EM-652.HC1

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