TWI265974B - Genetically modified plants with enhanced resistance to fungal diseases and a method of production thereof - Google Patents

Description

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玖'發明說明 發明所屬之技術領域 本申請涉及到基因修飾植物，特別是基因修飾馬鈴 薯，通過利用載體轉形植物而使基因修飾植物對病原體的 抗性增強，該載體含有一個具有兩個或多個幾丁質結合區 的幾丁質酶基因和一個β-1，3-葡聚糖酶基因，更具體的 說，該載體含有一個具有兩個幾丁質結合區的蕓薹屬 (Brassica)幾丁質酶基因和一個三葉膠樹（Hevea) β-1，3-葡聚糖酶基因。本發明還涉及到轉形馬鈴薯植株而使馬鈴 薯植株具有病原體免疫性的載體。該載體含有一個具有兩 個或多個幾丁質結合區的幾丁質酶基因和一個β-1,3-葡聚 糖酶基因。本發明還涉及通過表達幾丁質酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因而製備對病原體抗性增強的植物的方法。 先前技術 作爲動物，包括人的營養素以及用於生産藥品、化妝 品等的原料，植物扮演著重要角色。世界人口的穩定增長 導致對農作物需求的增長。該不斷增長的需求必須滿足減 少的可用於耕種的土地資源，構建生長更好且對植物病原 體具有更強抗性的植物品種，能夠提高現有土地資源的農 作物産量。 植物受各種病原體的威脅，如真菌、細菌、病毒、昆 蟲和線蟲。其中的一小部分病原體能夠成功入侵植物組織 而導致疾病。特別地，馬鈴薯是一種主要的食用農作物， 1265974

其對真菌感染具有高度易感性。治療真菌疾病的一個方法 是利用化學殺真菌劑，但是，該方法的費用高且會造成環 境污染。以前爲了提高植物對病原體的抗性所作的嘗試是 在線蟲易感性馬鈴馨株系中表達馬鈴暑M i -1.2線蟲抗性 基因。通過這種方法獲得的轉基因馬鈴薯株系大多數對根 結線蟲 M.javanica strain VW4 和 M.incognita strain VW6 表現出抗性，但對M.javanica strain VW5不表現出抗性， 因此，和野生型植株的Mi基因的特異性相似（Milligan 等，1998，植物細胞 10: 1307_1319)。 在另一個硏究中，通過從表達Avr9，即Cf-9誘導子的 植物的基因中去除可移動元件從而啓動無活性的編碼Cf-9 抗性基因産物的轉基因，可以誘導植物的抗性 (W095/315 64 )。另外，Prf抗性基因在馬鈴薯植株中過量 表達，可以使植株對 P.s.pathovar tomato strain DC3000、 X.c.pv. vesicatoria strain 5 6 ?R. sol an ace arum strain 82 細菌 性病原體和TMV病毒性病原體的抗性增強（Oldroyd 等·，1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95: 10300-10305 )。 在增強植物抗性的另一個嘗試中，在馬鈴薯植株中表 達葡糖氧化酶而産生H2〇2，H2〇2是植株在防禦反應的過 程中通過葡萄糖氧化而産生的物質。馬鈴薯植株中h202 含量提高顯示出對 E.carotovora subspecies carotovora 和 P.infestans 的抗性增強（Wu 等，1995, The Plant Cell 7: 1 3 57-1368 )。在轉基因稻植株中表達馬鈴薯蛋白酶抑制劑 II基因，可以使植株對大螟（Sesamiainferens)的粉紅天 1265974

牛（pink stem borer)幼蟲的抗性增強（Duan 等，1 996，Nature Biotechnology 14: 494-498)。另外，表達豇豆胰島素抑制 劑的轉基因馬鈴薯植株對G.pallida的抗性增強（美國專利 號5,494,813 )。美國專利5,866,777闡述了能夠破壞植物線 蟲病原體進食結構的蛋白的表達，美國專利5,824,861討 論了在蘋果樹植株中表達溶解的蛋白。 致病相關（PR)蛋白包括幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶， 是由植物在感染病原體時産生。幾丁質酶水解真菌細胞細 胞壁的主要成分幾丁質，而β-1，3-葡聚糖酶水解葡聚糖組 分（Boiler 等，1985，In: J.L. Key 等編，Cellular and Molecular Biology of Plant Stress, Alan R. Liss， New York， 247-262 頁；Boiler，1992, In: S.J. Gurr 等（編），Molecular Plant Pathology Volume II，A Practical Approach，IRL press，Ox ford，23-30 頁）。Schlumbaum 等（1 986’Nature 324: 3 65-367 )已經證實了純化的植物幾丁質酶在體外具有抗真 菌的活性，在轉基因植物中表達帶有一個幾丁質結合區的 幾丁質酶可以提高它們對真菌性病原體的抗性（Broglie 等，1991，Science 254: 1194-1 197 ; Lin 等，1995， Bio/Technology 13: 686-691 )。在歐洲油菜（Brassica nap us) 抗性栽培變種中，通過用黑脛莖點黴（Phoma lingam )感 染而誘導ChB4 mRNA産生，並可在感染一天之內用 Northern印跡分析法檢測出來，所述ChB4是帶有一個幾 丁質結合蛋白的幾丁質酶（Rasmussen等.，1992, Plant Mol· Biol. 20: 277-287 )。而且，幾丁質酶和β-1，3·葡聚糖酶在 1265974 rim

抑制真菌生長上具有協同作用（Mauch等·，1 988, Plant Physiol· 88: 936-942 ; Zhu 等·，1 994, Bio/Technology 1 2 : 8 07-812 ; Jach 等·，1995, Plant J· 8: 97-109)。 仍然需要提高植物，比如馬鈴薯，對真菌的抗性，具 體的來說，需要提高馬鈴薯對土生（soil-borne )真菌的抗 性。 在此處或說明書中其他任何部分引用參考文獻不應解 釋爲該文獻即相當於本發明的現有技術。 發明內容 本發明是基於本發明的發明人發現：真菌感染能夠誘 導BjCHIl的轉錄和翻譯，所述BjCHIl編碼帶有雙-幾丁 質結合區的幾丁質酶。幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶是裂解 酶，對真菌細胞細胞壁的兩種主要碳水化合物組份一一幾 丁質和β-1，3-葡聚糖具有活性。本發明的目的是通過用酶 轉形植物，如農作物，特別是馬鈴薯，而使植物能夠防禦 真菌，其中牽涉的酶與病原體相關碳水化合物組分的裂 解，特別是與真菌細胞細胞壁的裂解有關。在本發明的一 個具體實施方式中，通過共表達帶有兩個幾丁質結合區的 芥菜（Brassicajuncea)幾丁質酶和三葉膠樹β-1,3-葡聚 糖酶，提供了對煎屬絲核菌（Rhizoctaniasolani)抗性增 強的轉基因馬鈴薯植株。 本發明提供了轉基因植物，該植物含有一個基因，該 基因包含啓動子，和與該啓動子可操作性連接的包含有兩 Λ1265974

個或多個幾丁質結合區的幾丁質酶編碼序列，以及一個終 止子。在具體實施方式中，幾丁質酶可以分別含有兩個、 三個、四個或五個幾丁質結合區。本發明的另一個方面是 含有包含編碼幾丁質酶核苷酸序列的基因的植物細胞以及 其他植物部分，如含有本發明基因的轉形植物的種子。 在一個具體實施方式中，本發明提供了轉基因馬鈴薯 植株，該植株含有一個包括啓動子和終止子的基因，所述 啓動子可操作性地連接芥菜（Brassicajuncea)幾丁質酶 的編碼序列。本發明的另一個方面是含有包含編碼芥菜 (Brassica juncea)幾丁質酶核苷酸序列的基因的馬鈴薯 植物細胞以及其他植物部分，如含有本發明基因的轉形植 物的種子。 在一個具體實施方式中，本發明還提供了轉基因馬鈴 薯植株，該植株含有一個包括啓動子和終止子的基因，所 述啓動子可操作性地連接β-1，3-葡聚糖酶的編碼序列。本 發明的另一個方面是含有包含編碼β-1，3-葡聚糖酶核苷酸 序列的嵌合基因的馬鈴薯植物細胞以及其他植物部分，如 含有本發明的基因的轉形植物的種子。 在一個具體實施方式中，本發明還提供了轉基因馬鈴 薯植株，該植株含有一個包含啓動子和終止子的基因，所 述啓動子可操作性地連接三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的編 碼序列。本發明的另一個方面是含有包含編碼三葉膠樹 β-1，3-葡聚糖酶核苷酸序列的嵌合基因的馬鈴薯植物細胞 以及其他植物部分，如含有本發明的基因的轉形植物的種 10 1265974

子。 在一個具體實施方式中，本發明還提供了含有幾丁質 酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉基因植物。在本發明的一個具體 實施方式中，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶由不同的載體編 碼。在另一個具體實施方式中，幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖 酶由同一載體編碼。在一個具體實施方式中，幾丁質酶具 有兩個或多個幾丁質結合區。在另一個具體實施方式中， 幾丁質酶是BjCHIl，β-1，3-葡聚糖酶是HbGLU。 在本發明的具體實施方式中，本發明還提供了含有一 個嵌合基因的轉基因植物，該嵌合基因包含第一啓動子， 終止子，第二啓動子，和第二終止子，其中所述第一啓動 子可操作性地連接芥菜（Brassicajuncea)幾丁質酶編碼 序列，第二啓動子可操作性地連接三葉膠樹β-1，3-葡聚糖 酶編碼序列。在一個具體實施方式中，通過利用重組DNA 技術導入芥菜（Brassicajuncea)幾丁質酶和三葉膠樹 β-1，3-葡聚糖酶編碼序列，提高了這種基因修飾的植物對 真菌的抗性。在一個具體實施方式中，馬鈴薯（Solatium tuberosum L.cv.Desiree )被轉形，該轉形是利用pBI121衍 生的攜帶有BjCHIl和HbGLU cDNA的植物轉形質體，通 過土壤桿菌介導而進行。 在另一個具體實施方式中，除了編碼幾丁質酶和β_ ：1，3_ 葡聚糖酶的基因序列外，其他的編碼植物保護蛋白的基因 序列也可以被導入到植物中。這些基因序列包括但不限 於：編碼核糖體失活蛋白，植物凝血素和凝集素的基因。 11 1265974

在一個具體實施方式中，可以使用絲胺酸蛋白酶抑制劑。 在另一個具體實施方式中，可以使用SaPINIIa( Xu Z.F等， 2001，Plant Molecular Biology 47: 727-73 8 ) 〇 在一個具體實施方式中，本發明提供了含有嵌合基因 的植物細胞。該嵌合基因含有編碼幾丁質酶的核苷酸序列 和編碼β-1，3-葡聚糖酶的核苷序列，所述幾丁質酶含有兩 個或多個幾丁質結合區。在一個具體實施方式中，該嵌合 基因含有編碼幾丁質酶的核苷酸序列，其中的幾丁質酶含 有四個幾丁質結合區。在一個具體實施方式中，植物細胞 對昆蟲或對細菌或對兩者都有抗性。在一個具體實施方式 中，核苷酸序列編碼芥菜幾丁質酶和三葉膠樹β-1，3-葡聚 糖酶。 在一個具體實施方式中，本發明還提供了一種提高植 物對病原體抗性的方法，該方法包括以下步驟：向植物基 因組中導入編碼含有兩個或多個幾丁質結合區的幾丁質酶 的核苷酸序列，然後使植物再生，從而得到基因組發生改 變的植株。在一個具體實施方式中，幾丁質酶是在合適的 啓動子和合適的終止子指導之下的芥菜幾丁質酶。 在一個具體實施方式中，本發明還提供了一種提高植 物對病原體抗性的方法，該方法包括以下步驟：向植物基 因組中導入在適當啓動子和適當終止子指導之下的編碼三 葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列，然後使植物再生’ 從而得到基因組發生改變的植株。在一個具體實施方式 中，葡聚糖酶是在合適的啓動子和合適的終止子指導之下 12 1265974

的三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶。 在一個具體實施方式中，本發明還提供了一種提高植 物對病原體抗性的方法，該方法包括以下步驟：向植物基 因組中導入在適當啓動子和終止子指導之下的編碼芥菜幾 丁質酶和在合適的啓動子和終止子指導之下編碼三葉膠樹 β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列，然後使之再生從而得到基 因組發生改變的植物。 爲了更好地理解和實施本發明，下面示例性地列附圖 作爲參考。 實施方式 病原體抗性是植物的一個重要的屬性，也是植物特別 是農作物保護的一個有用工具。本發明中，術語“植物” 包括整個植物體、植物的部分、單個的植物細胞、植物細 胞群（如培養的植物細胞）及其後代。在本發明中，術語 “增強”用來描述植物對病原體抗性的增加，其包括對病 原體沒有抗性或有部分抗性或基本有抗性的植株的抗性的 增加。 植物病原體包括，但不限於細菌、病毒、真菌、線蟲 和昆蟲。病原體可以感染植株並使其受到嚴重的傷害，甚 至死亡。感染後，植物可以針對病原體起始保護反應，如 過敏反應，但這要依賴於該植物能否識別病原體而定。 各種種類的病原體會發生改變，例如，發生突變。而 且，可能會産生植物種以前沒有遇到過的新病原體。例如， 13 1265974

當一個植株（例如農作物、水果、蔬菜等）被引入到一個 大陸（例如通過進口），該植株就可能易受到其以前不曾遇 到過的病原體感染。 選殖編碼芥菜幾丁質酶和三葉膠樹P-11-葡聚糠醃某闵 的核苷酸 編碼含有兩個幾丁質結合區的幾丁質酶的芥菜CDNA的分 離 用32P標記的PCR製備的鼠耳芥屬（Arabidopsis)驗 性幾丁質酶探針，在擴增了的芥菜cDNA文庫中篩選幾丁 質酶選殖株（Samac 等，1990，Plant Physiol 93: 907-914 )， 得到5個假定的陽性。核酸序列分析表明其中的三個有 1.3kb的cDNA，稱之爲BjCHIl，另外的兩個是非全長 cDNA。BjCHIl cDNA 由 3bp 的 5’非翻譯區、1200bp 的翻 譯區、86bp3 ’非翻譯區和p〇ly(A) +尾構成（圖1 a )。一個 含有400個胺基酸的開放閱讀框編碼與植物chial幾丁質 酶同源的預測的Mr42774蛋白。有趣的是，該cDNA含有 兩個120bp的重複序列（核苷67 — 186和220 — 3 39，圖 la)，編碼兩個幾丁質結合區，這兩個結合區由11個胺基 酸的間隔子連接，這兩個重複序列有7個核苷不同，因此 有兩個胺基酸發生改變。33個胺基酸的連接區將第二個幾 丁質結合區與幾丁質酶催化區連接起來（圖lb)。所有其他 以前鑑定的幾丁質酶都只含有一個幾丁質結合區。該幾丁 質結合區對於幾丁質的結合是必需的（Iseli等，1993, Plant 14 1265974

Physiol· 103: 221-226 )，細胞凝集需要至少兩個這樣的結 合區（Peumans 等，1995，Plant Physiol. 109: 347-352 )。幾 丁質結合區的産生並不限於幾丁質酶。在植物凝集素中也 存在這種區域，如橡膠蛋白，一種來源於橡膠乳汁的 4.7kDa 的蛋白（Van Parijs 等·，1991，Planta 1 83 : 25 8 —

264 )，也含有一個幾丁質結合區。BjCHIl是唯——個含有 兩個幾丁質結合區的幾丁質酶，本發明已經使用畢赤氏酵 母表達的BjCHIl證明，含有兩個結合區可以賦予凝集的 屬性（見下文部分）。以前沒有報導過具有凝集屬性的幾丁 質酶。

BjCHIl和其他幾丁質酶的比較

圖2A顯示了 BjCHIl和其他有代表性的不同幾丁質酶 種類的序列圖，這些不同種類包括：來源於煙草（Nicotiana tabacum)的 Chial ( Shinshi 等·，1 990，Plant Mol Biol 14: 357-368 )、來源於煙草（ N.tabacum )的 Chia2 ( Payne 等·，1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 98-102 )、來源於 P.vulgaris 的 Chia4 ( Margis-Pinheiro 等·，1991，Plant Mol Biol 17: 243-25 3 )、來源於 U.dioica(Lerner 等·，1992, J Biol Chem 267: 1 1085-1 1 091)和來源於 B.vulgaris 的 Chia6 (Berglund 等.，1995，Plant Mol Biol 27: 211-216)。來源 於煙草（N.tabacum )的幾丁質酶代表Chial和Chi a2與 BjCHIl具有最高的同源性。對86種植物幾丁質酶進行分 析表明在Chia類中有8個胺基酸是保守的（Levorson 等.，1997,Plant Mol Biol Reptr 15: 122-133)。其中有 7 個 15 1265974

胺基酸在BjCHIl中是保守的（E-201、A-203、Τ — 213、 C-23 0、Ν-270、P-286、G-3 77，圖 2Α)。第 8 個胺基酸殘 基（Q)在BjCHIl中被M-264取代\圖2A)。雖然BjCHIl 與煙草Chial ( 62.0% )和Chia2 ( 54.8% )具有高度的同 源性，但是BjCHIl含有兩個幾丁質結合區，而Chial只有 一個幾丁質結合區，Chia2沒有幾丁質結合區。

與來自其他植物的Chial幾丁質酶進行比較，BjCHIl 與歐洲油菜（B.nap us )具有72.7%的同源性（Hamel等，

1 993，Plant Physiol 101: 1403)，與 A.thaliana 具有 70.2 % 的同源性（Samac 等，1990，Plant Physiol 93: 907-914 )， 與 Ρ·vulgaris 具有 60.9% 的同源性（Broglie 等，1986, Proc Natl Acad Sci US A 83 ·· 6820-6824 )，與稻(Oryza sativa ) 有 51.8% 的同源性（Zhu 等·，1994,Bio Technology 12:807-812)。BjCHIl也含有在Chial幾丁質酶中高度保守 的序歹[J “ NYNYG”（胺基酸 268 — 272，圖 2 ) ( Verburg 等， 1992，J Biol Chem 267 : 3 886 — 3 8 93 )。硏究玉蜀黍(Zea mays)幾丁質酶的催化位點表明，用1-乙烷基-3-(3-二甲 胺丙基）碳化二亞胺（l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 修飾“ NiN YG”序列中的第一個Y可以使酶活性喪失。 (verburg 等，1992 )。 兩個幾丁質結合區的存在可以將BjCHIl與Chia5視爲 一類物質，已知的Chia5唯一實例是大蓴麻（Urtica dioica) 凝集素，即 UDA1 ( Levorson 等，1997 )。UDA1 是具有 327 個胺基酸的大蓴麻（U.dioica)凝集素的前體（Lerner和 16 95. 1265974

Raikhel，1992, J Biol Chem 267: 1 1085-1 1091 )，具有昆蟲 阻營養活性（Chrispeels 等，1991，Plant Cell 3: 1-9)。該 前體由一個信號肽、兩個幾丁質結合區和一個幾丁質催化 區組成。成熟的凝集素爲8.5kD，由於幾丁質酶區被翻譯 後切除，因此僅由含有兩個幾丁質結合區的86個胺基酸構 成（Lerner 和 Raikhel，1992 )。雖然 BjCHIl 和 UDA1 結 構相似，但它們僅只有36.9%的同一性（圖2A)。根據 Beintema 的方法（Beintema，1994，FEBS letters 350: 1 59-163 )比較幾丁質酶中的二硫鍵，表明BjCHIl、Chial 和UDA1之間的相似性（圖2B) : Chial的C末端二硫鍵 在UDA1中不存在，在BjCHIl中存在。和UDA1不同， BjCHIl的連接部位和間隔子中富含脯胺酸，分別有63.6 %和54.5%的脯胺酸殘基。Chia6幾丁質酶（Levorson等·， 1997)的唯一成員，B· vulgar is Chi含有有128個參基的連 接區’其中 70.3% 是脑胺酸（Berglund 等·，1995，Plant Mol Biol 27: 211-216)。BjCHIl 和 Chi 都含有 “PPTP”重複序 列（圖2Α)。但是，Chi只有半個幾丁質結合區，它們只 有45.2%的同一性。

在BjCHl中兩個幾丁質結合區的存在促使本發明的發 明人探究BjCHIl具有凝集屬性的可能性。相應地，根據 Does 等的方法（1999, Plant Physiol. 120: 421-431 )用 FPLC 純化的畢赤氏酵母（Pichia)表達的BjCHJIl進行凝集試 驗。分別使用含有一個和不含有幾丁質結合區的BjCHI2 和BjCHI3作爲對照。簡單地說，利用酵母表達載體pPIC9K 17

1265974 (invetrogen)在 Pichia pastoris 中表達 BjCHIl、BjCHI2 和 BjCHI3。將 BjCHIl、BjCHI2 和 BjCHI3 選殖到 pPIC9K 的

分泌信號肽框內，以使融合蛋白能被分泌到生長培養基 中。BjCHIl含有位於天然蛋白胺基酸位點1 8 — 3 93處的兩 個幾丁質結合區（Zhao 和 Chye，1999, Plant Mol Biol，40: 1009-1018 )，在pPIC9K中與分泌信號肽融合：BjCHI2僅含 有一個幾丁質結合區，而BjCHI3不含有幾丁質結合區。 將 BjCHIl、BjCHI2 和 BjCHI3 的 DNA 選殖到載體 pPIC9K 的EcoRI和Notl位點，針對此目的，在PCR中使用下列 弓[子：C1 (正向）弓[子 5’CTGAATTCTCCTCC GGTGAGCAATGCG3’（SEQ ID NO:5);

C21(正向）引子 5’CTGAATTCGGGGATCTTTCTGGCATC3’ (SEQ ID NO :6);和 C2 (反向）引子 5,GCGACTGCGGCCGCGTTACTACCTTCATTAAACG3, (SEQ ID NO :7)。正向引子上設計了 一個EcoRI位點，反向 引子上設計了一個Notl位點，用C1和C2引子以pBjl7 作爲模板進行PCR擴增編碼BjCHIl的1.1 kb的DNA，甩 C1和C2引子以pBj28作爲模板進行PCR擴增編碼BjCHI2 的0.95kb的DNA，質體pBj28在Fung等的文章中已經被 描述（20 02，Plant Molecular Biology 50 ： 283—2 94 )。用 C21和C2引子以PBjl7作爲模板進行PCR擴增獲得編碼 BjCHI3的0.74kb的DNA。將PCR擴增片段用EcoRI和 Notl消化，選殖到pPI9K的EcoRI和Notl位點。在用於 酵母轉形前DNA測序分析pPI9K中的插入片段。畢赤氏 18 1265974

酵母（Pichia)表達的蛋白被分泌到生長培養基中，根據 Invitrogen介紹的方法用65%的硫化銨沈澱，接著用FPLC 純化粗提取物，在進行凝集分析前，利用抗BjCHIl的抗 體通過Western印跡分析檢測FPLC純化蛋白。由於在製 備抗BjCHIl多株抗體中所使用的肽能被BjCHI2和BjCHI3 滯留，因此BjCHIl的這些衍生物會可這些抗體發生交叉 反應。 在凝集反應分析過程中，不同量（0.12、0.25、0.5、2、 4、8、16、24//g)的畢赤氏酵母表達培養的FPLC純化蛋 白（BjCHI 1、BjCHI2和BjCHI3)被加到微量滴定板的 各個孔的30ul的胰島素處理過的兔血球蛋白中（見圖3)， 在每個孔中加入5倍濃度的磷酸鹽使其終濃度爲60ul，在 對照孔中，用磷酸鹽緩衝溶液代替蛋白質。 根據其凝集屬性，結果表明BjCHIl與含有至少兩個幾 丁質結合區的殺蟲蛋白相似，該殺蟲蛋白包括小麥胚芽凝 集素、大蓴麻（Urtica dioica)凝集素和來源於馬鈴薯、稻 和曼陀羅（Datura )的外源凝集素（Chrispeels等，1 991， 見上文）。因爲已經證明帶有兩個或多個幾丁質結合區的植 物外源凝集素可以通過與細菌及真菌表面和食草昆蟲的外 殼和腸內腔的複合糖結合而使細胞凝集（Peumans等， 1995，見上文）。因此，BjCHIl的抗微生物和抗昆蟲功能 是有可能的，可以作進一步的硏究。 芥菜中BjCHIl的基因組結構 19 1265974

?95： d.

Southern印跡分析被用來檢測芥菜中BjCHIl相關基因 的存在。將EcoRI、Hindll、Hindlll和Xbal消化的基因組 DNA與BjCHIlcDNA雜交，僅僅Hindlll在cDNA內剪切 (圖1A)。檢測6_9各雜交帶（圖4A，第1一 4道）顯示 了在異四倍體芥菜、B.nigra和蕓薹（B.campestris)雜交 體中的相關基因，這些帶應該是編碼幾丁質酶或含有幾丁 質結合區的蛋白質的基因。進一步在65°C下洗脫印跡又顯 現了一些帶，第6— 8道中的帶（圖4A)，這些帶可能是 BjCHIl特異性的。爲了硏究帶有一個幾丁質結合區的幾丁 質酶的存在，利用定位引子進行PCR，引子P1和編碼第 一幾丁質結合區的區域相鄰，而P2在編碼幾丁質酶的區域 中，該編碼幾丁質酶的區域顯示了與其他幾丁質酶的同源 性（圖1A，圖2)。利用這些引子進行的BjCHIl PCR擴增 得到的産物如果在其中沒有內含子爲〇.5kb。鼠耳芥屬 (Arabidopsis)幾丁質酶基因（Samac 等，1990 )的第一 個內含子位於P2後的相應區域，將瓊脂糖凝膠電泳得到的 0.5kb的産物（圖4B)和0.3 5kb的弱勢帶（圖4C )與BjCHIl 的cDNA雜交以進行Southern印跡分析。其中的這個較小 的帶表明含有一個幾丁質結合區的相關幾丁質酶的存在， 由於引子的BjCHIl特異性，因此該帶較弱。相反地，用 引子P2和P3 PCR擴增BjCHIl，産生一個單一的〇.35kb 的帶（圖4B和C，第2道），P3，位於編碼間隔子的區域 (圖1A),是BjCHIl特異性的，適合於在RT-PCR中檢測 BjCHIl 特異性 mRNA。 -4 -41265974

三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶基因的分離 編碼三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的白花丹葉煙草 (N.plumbaginigolia ) cDNA、gnl Cdna ( De Loose 等， 1 998, Gene 70: 12-23 )被作爲異源雜交探針以從三葉膠樹 中分離相應的cDNA選殖株，42oC下在含有30%的甲醯 胺的溶液中利用原位平板雜交來檢測三葉膠樹乳汁的 cDNA文庫，分離出幾種編碼三葉膠樹β_ΐ，3-葡聚糖酶的 三葉膠樹cDNA。對1.2kb和l.lkb的最長的兩個選殖株 進行核酸序列分析表明他們屬於同一個類別，1.2kb的全 長cDNA含有一個40bp的5’非轉錄區、一個1125bp的編 碼區、一個76bp的3’非轉錄區和一個poly ( A)尾巴。其 中的編碼區編碼一個374各胺基酸的鹼性蛋白，即爲預期 的 Mr41305。 三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列與白花丹葉煙 草（Ν. plumbaginigolia) gnl cDNA的核苷酸序列表現出 68%的核酸序列同源性，比較三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的 預測胺基酸序列和由gnl編碼的三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶 的胺基酸序列，有66%的胺基酸是一致的（圖5C)。三葉 膠樹β-1，3-葡聚糖酶與II型（煙草PR-N(Linth〇rst等·， 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 8756-8760))，III 型（煙 草 ec321 391 (Payne 等·，1990, Plant Mol Biol 15: 797-808))，IV 型（煙草 sp41a (Ori 等· Membo J，1990，9: 3429_3426))分別有54%、60%、51%的胺基酸同一性（圖 21 1265974

牛 ¥ 5C)。 三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶 分析I型三葉膠樹β-1,3-葡聚糖酶的前蛋白，在蛋白 質轉移到液泡的過程中或之後，其Ν末端延伸區和C末端 延伸區被切除（Shinshi 等，1988，ProcNatlAcadSciUSA 85:5541-5545 )。在三葉膠樹β_1，3-葡聚糖酶的胺基酸序列 中存在Ν末端延伸區（胺基酸位點1 - 36 )和C末端延伸 區（胺基酸位點353 — 3 74 )進一步證明其屬於I型三葉 膠樹β-1，3-葡聚糖酶（圖5C)。三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶 的Ν末端延伸區含有一個富含絲胺酸和蘇胺酸的區域（胺 基酸位元點4 - 19)，接著是疏水性區域（胺基酸位元點22 -29)(圖5C)。雖然三葉膠樹β-1，3_葡聚糖酶的Ν末端 和編碼三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的gnl之間的胺基酸序列 同源性不高，但是他們都含有一個疏水性區域（Von Heijine 等，1985, J· Mol· Biol· 184: 99-105 )，該疏水性區域是典 型的信號肽，與蛋白質定位到液泡有關。令人感興趣的是， 負賢將蛋白定位到液泡的barley aleurain前肽的N末端序 列液富含絲胺酸位點（Holwerda等，1992，Plant Cell 4 : 3 07 - 3 1 8 )。比較三葉膠樹和白話丹葉煙草的C末端延伸 區表明在胺基酸序列和N糖基化位點（三葉膠樹β-1，3-葡 聚糖酶的胺基酸位點364 )處是保守的，三葉膠樹的C末 端延伸區，特別是胺基酸位點365 - 3 70處富含疏水性胺基 酸。已經證明，在羰基延伸前體碳中疏水/酸性基團結構在 22 1265974 年月 形成一種信號方面優於特定的胺基酸序列（Nakamura等， 1993, Plant Physiol 101: 1-5)，已經證明在處理過程中三 葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的I型異構體的C末端延伸區和 Ν-糖基被除去（Shinshi等，1998 )。 三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的基因組的結構 本發明的發明人分離的産乳菌絲特異性cDNA被用於 基因組的Soutern印跡分析以硏究三葉膠樹中的β-1，3-葡 聚糖酶家族基因的存在。根據Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Rep 1: 19-21中的方法從幼葉中分離得到基因組 DNA，整個基因組用BamHI、EcoRI、Hindll和Xbal酶切， 凝膠電泳和印跡分析。利用1.2kb的三葉膠樹β-1，3-葡聚 糖酶基因探針進行的Southern已經分析表明有2 - 4各消 化的雜交帶（圖6)，這個結果表明在三葉膠樹中存在β-1，3-葡聚糖酶的低拷貝家族基因。 用已知的技術也可以分離其他的幾丁質酶和β-1,3-葡 聚糖酶，選殖芥菜幾丁質酶和三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶蛋 白特異性的cDNA或基因組DNA或核酸，用不同的方法測 序，如雙脫氧鏈中止法測序，參見Sambrook等的方法。 用於本發明的核苷酸包括含有本發明的DN A的多核苷 酸’還包括任何編碼相連接的功能性幾丁質酶和β-1，3-葡 聚糖酶的核酸序列以及編碼開發讀框（ORF )的核酸序列， 該開放讀框在高度嚴謹條件下可以和本發明的DN Α的互 補序列雜交。例如，但不限於這些例子，高度嚴格的雜交 23 1265974

條件如下：與濾紙結合的DNA在含有50%的去離子甲醯 胺、6xSSC、5xDenhardt、1%SDS、100# g/ml 變性鮭魚精 子DNA的溶液中進行，42°C過夜（大約4 — 16小時），在 65°C 下用 O.lxSSC、0.1% SDS 清洗（Ausubel F.M·等編， 1989 5 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I? Green Publishing Associates，Inc，和 John Wiley & Sons，Inc.，New York )，得到一個功能上等同的基因産物。 對於核苷酸探針，例如但不限於，高度嚴謹條件是： 在37°C (針對14個鹼基的核苷）、48°C (針對17個鹼基 的核苷）、55°C (針對20個鹼基的核苷）、6(TC (針對23 個鹼基的核苷）下用6xSSC/0.05%磷酸鈉清洗。 其他的可用於本發明的核苷酸包括在中度嚴謹條件下 可以與編碼幾丁質酶或β-1，3-葡聚糖酶的DNA序列的互補 序列雜交的任何核苷酸序列。例如，但不限於，該中度嚴 謹條件包括在42°C下用〇.2xSSC/0.1% SDS清洗 (ausubeldeng，1989,見上文）。 其他的可用於本發明的核苷酸包括在低嚴謹條件下可 以與編碼幾丁質酶或β-1，3-葡聚糖酶的DNA序列的互補序 列雜交的任何核苷酸序列。例如，但不限於，在Shilo和 Weinberg，1 98 卜 Proc.Natl· Acad. Sci.US A 78 :6789-6 7 92 中 描述的的嚴謹條件的方法。 另外，本發明還可以使用幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶 的變體，該變體可以包括一個或多個酶胺基酸序列的改 變，例如，與野生型酶比較，通過插入、替換或刪除一個 24 1265974

或多個胺基酸的方式。任何改變都不會使酶的功能喪失， 雖然根據改變的性質不同，該改變可能會增強或減弱其能 力。優選的，該胺基酸的改變是保守的。 在各個實施方式中，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶、其 片段、變體、類似物或衍生物可以作爲一個融合蛋白或嵌 合蛋白産物（包括通過一個肽鍵與異源蛋白序列（不同蛋 白的）相連接的酶、其片段、類似物或衍生物）而表達。 可以利用本領域已知的方法將編碼目標胺基酸序列的適當 核苷酸序列彼此連接到合適的編碼框中，並通過本領域已 知的常用方法表達該嵌合産物，從而得到嵌合基因産物。 或者，該嵌合産物可以用蛋白質合成技術來製備，如利用 多肽合成儀。優選地，在融合蛋白中的酶的片段、類似物 和衍生物仍保持其酶的功能。 植物幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶蛋白特異性的cDNA 或基因組DNA可以通過篩選cDNA或基因組DNA文庫來 選殖。例如，可以利用植物的信使RNA或基因組DNA製 備這種文庫。關於分子生物學技術和怎樣去製備cDNA文 庫和基因組文庫的背景技術，參見Ansubel F.M.等，見上 文；Sambrook等，1989,見上文；和美國專利Ν〇·5,65 0，148。 可以用對芥菜幾丁質酶和三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶具 有特異性的核酸片段來檢測文庫，例如，可以利用本領域 普通技術人員已知技術測定幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋 白質序列（參見 Creighton, 1 98 3， “ Proteins: Structures and Molecular Principles’’，W.H. Freeman & Co.，New York， 25 1265974 n. 4 年月 3 4-49頁）。其獲得的胺基酸序列可以被用作一種引導物來 生産寡核苷酸混合物，該混合物可以用於篩選編碼幾丁質 酶和β-1，3-葡聚糖酶cDNA序列的cDNA文庫。 或者，可以檢測幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶特異性的 延展蛋白質序列。製備一系列各延展序列特異性的簡並寡 核苷酸，用於多聚酶鏈反應（“PCR”）擴增。該寡核苷酸至少 含有6個核苷酸，優選的含有至少10個，更優選的含有至 少15個，更優選的含有至少20個，更優選的含有至少30 個，更優選的含有至少40個核苷酸。PCR反應的模板是 cDNA或基因組DNA混合物，該混合物是已知含有或可能 含有對目標幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶具有特異性的DNA 多聚核苷酸。cDNA模板可以通過不同的方法獲得，例如， 從cDNA文庫的不同種cDNA混合物中分離，或者逆轉錄 來自已知（或可能）表達幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的細 胞或器官的可轉錄總mRNA。關於PCR的背景技術，參見 Ausubel，見上文，和 PCR Protocols: A guide to Methods and Applications 1990，Innis，M 等編，Academic Press, Inc.， New York。 爲了選殖來自不同種的全長cDNA或基因組DNA序 列，或者選殖幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的變體或異源 體，使用標記的DNΑ探針來篩選cDNA文庫或基因組DNA 文庫，其中的探針相應於本發明提到的或通過使用本發明 方法製備的任何多核苷酸相應的核酸片段。參見Ausubel F.M等，見上文；Sambrook等，1989，見上文。 26 1265974

抗體的製備 爲了製備抗體，可以通過注射幾丁質酶和β-1,3-葡聚 糖酶（例如，相應於幾丁質酶和β-1，3·葡聚糖酶的功能區 的酶）、截短的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶（一個或多個區 域被去除的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶）、幾丁質酶和 β-1，3-葡聚糖酶的功能性等同物、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖 酶的突變體或幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的短肽（或片段） 而使不同的宿主動物免疫。這種可以免疫的宿主動物包括 但不限於兔、小鼠、山羊和大鼠等。根據宿主的物種，可 以使用不同的輔助劑來增強免疫反應，輔助劑包括但不限 於Freund’s (完全或不完全的），礦物膠，如氫氧化銘，表 面活性劑，如溶血卵磷脂、多聚醇（pluronic polyols )、聚 陰離子、肽、油乳化液、匙孔血藍蛋白、二硝基酚和潛在 的有用的人輔助劑，如BCG(bacilleCalmette-guerin)和小 棒桿菌（Corynebacterium parvum )。多株抗體是衍生自免 疫動物血清的不同種抗體分子。 用於本發明的抗體包括單株抗體（參見Kohler等， 197 5，Nature 25 6: 495 — 497;和美國專利 No· 4,3 76，110)、 嵌合抗體（參見 Morrison 等，1984，Proc. Natl. Acad. Sci·， 8 1: 685 1 -6855； Neugerger 等·，1984, Nature，3 12: 604-608; Takeda 等，1 985, Nature，315: 452-454 )、單鏈抗體（參見美 國專利 4,946,778; Bird，1998, Scienc 242: 423-426; Huston 等，1988, Proc· Natl. Acad· Sci· USA 85: 5879-5883;和 27

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Ward 等，1989, Nature 341: 544-546 )、抗體片段（參見 Huse 等，1989，Science，246: 1275-1281 )、抗遺傳型抗體或抗遺 傳型抗體的Fab片段（參見Greenspan & Bona，1993， FASEBJ 7 (5): 437-444;和 Nissinoff，1991，J. Immunol· 147 (8): 2429-2438)° 利用重組DNA技術表達幾丁質酶和β-l,3-葡聚糖酶 利用本領域公知的重組DN Α技術可以方便地製備幾丁 質酶和β-1,3-葡聚糖酶、其片段或其融合蛋白，這種方法 可以用於構建含有幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶核苷酸序列 以及合適的轉錄和翻譯調控信號的嵌合基因或表達載體。 例如，這些方法包括：體外DNA重組技術、合成技術和體 外基因重組技術。參見上文Sambrook等，1989和上文 Ausubel等，1989的描述。在本文中，所使用的術語嵌合 基因是指嵌合基因的各個部分是組合在一起的，通過重組 DN A技術將各序列操作成相互關聯，該嵌合基因的各個核 酸序列可以是被導入嵌合基因植株的內源性或外源性的獨 立組分。 可選擇的，相應於幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶核酸序 列編碼的整個或部分轉錄體的RN Α可以被化學合成，如使 用合成儀。參見"Oligonucleotide Synthesis”，1984，Gait， M.J.編，EIL Press，Oxford中描述的技術，該文章全文引入 作爲參考。 任何生物技術領域已知的宿主表達載體系統都可以用 28

1265974 來在包括但不限於細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、 真核細胞和植物細胞中，表達幾丁質酶或β-1，3-蔔聚糖酶 核苷酸序列。在這些表達系統中，可以使用任何可選 擇系統。這種選擇可包括在選擇性培養基中生長（如抗生 素、最小培養基等）或使用指示劑（如染料、熒光試劑等）。

當使用植物表達載體時，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶 的編碼序列可以在任何數目的調控元件的驅動下進行表 達，例如可以使用病毒啓動子，如CaMV的35S RNA和 19S RNA 啓動子（Brisson 等，1984, Nature 310: 511-514)， 或者TMV的外殻蛋白啓動子（Takamatsu等，1987, EMBO J. 6: 307-3 1 1 )，或者，也可以使用植物啓動子，如RUBISCO 的小亞基（Coruzzi 等，1984, ENBO J· 3:1671-1680; Broglie 等，1984, Science 224: 838-843 )，或熱休克啓動子，如大 豆 hspl7.5-E 或 hspl7.3-B ( Gurley 等，1986，Mol. Cell. Biol. 6: 559-565 )。這些結構可以利用Ti質體、Ri質體、 植物病毒載體、DN A直接轉形、生物粒子轟擊、顯微注射、 電穿孔等方法而被導入到植物細胞中。這些技術的介紹參 見：Weissbach & Weissbach，1 988，Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, Section VIII，421-463 頁；和 Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed，Blackie，London，7-9 章。在本發 明中，調控元件包括但不限於誘導型和非誘導型的啓動 子、增強子、操縱子和本領域技術人員公知的可以驅動和 調節表達的其他元件。 29

1265974 優選的，啓動子能在植物的特定組織和/或植物發育的 特定階段指導表達，啓動子可以是植物同源的或異源的。 優選的，植物啓動子指導植物種子胚乳或植物根或塊莖中 的表達。啓動子優選爲小麥的高分子量麥骨蛋白（HMWG) 基因。其他合適的啓動子是本領域的技術人員已知的，如 麥醇溶蛋白啓動子、分支酶啓動子、ADPG焦磷酸化酶啓 動子、澱粉合成酶和肌動蛋白啓動子。 表達幾T質酶和β-1.3-葡聚糖酶的轉某因植物 通過用含有編碼植物幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白 或多肽編碼序列的基因構建體轉形植物細胞，可以構建一 種能夠表達植物幾丁質酶或β-1，3-葡聚糖酶多肽的轉基因 植物。在一個實施方式中，植物啓動子與目的植物幾丁質 酶或a-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的編碼序列可操作地連 接。在本發明中，“可操作地連接” “可操作地相連” 是指一種連接，在該連接中調控區（如啓動子、增強子） 與要表達的核酸序列是以能夠使其轉錄並在合適的條件下 翻譯的方式，共價連接和定位。在本發明優選的實施方式 中，其連接的啓動子是強有力的且無組織或發育特異性的 植物啓動子（如：在許多或所有植物組織中都能強烈表達 的啓動子）。這種強的、“組成型”啓動子包括，但不限於 CaMV 35S 啓動子（Odell 等，1 985，Nature 313: 810-812)、 T-DNA甘露鹼合成酶啓動子及其各種衍生物。在本發明的 另一優選實施方式中，是用誘導型或抑制性啓動子在植物 30

1265974 中表達目標幾丁質酶和/或β-1,3-葡聚糖酶，例如， Weinmann 等，1 994，The Plant Journal 5: 559-569 中描述 的破傷風（tet)操縱子啓動子；或在McNellis等，1 99 8， The Plant Journal 14: 247-257中描述的糖皮質激素誘導型 啓動子；或在 Caddick 等，1998，Nature Biotechnology 16 : 177-180中描述的乙醇誘導型啓動子。還可參見Gatz，1995, Methods In Cell Biology 50: 41 1-424，其中描述植物誘導 型和抑制型基因表達系統。 在本發明的一個實施方式中，在植物中表達幾丁質酶 和/或β-1，3-葡聚糖酶，以使幾丁質酶和/或β-1，3-葡聚糖酶 多肽定位到質體外空間。當在植物中表達時，通過將幾丁 質酶和/或β-1，3-葡聚糖酶與作爲信號或轉運體的肽一起作 爲融合蛋白進行表達，這樣可以使幾丁質酶和/或β-1，3-葡 聚糖酶多肽定位到轉基因植物的質體外空間，幾丁質酶和 /或β-1，3-葡聚糖酶可以被分泌到原生質體外空間。可以使 用各種信號或轉運多肽，例如，Lund等，1992，Plant Molecular Biology 18: 47-53 中描述的 PRlb 信號序列，或 Pfitzner 等，1987，Nucleic Acids Research 15: 4449-4465 中描述的PR-la、b和c信號序列。含有信號或轉運體多肽 和幾丁質酶和/或β-1,3-葡聚糖酶多肽的融合蛋白可以通過 將每個組份特定的核苷酸相互連接來構建（如在閱讀框中 連接各多核苷酸），使融合核酸在轉基因植物中表達時産生 期望的融合蛋白。本領域普通技術人員應該知道怎樣去構 建一個能有效將幾丁質酶和/或β-1，3-葡聚糖酶表達到轉基 31 1265974 節:"Ί·

因植物的質體外空間的多核苷酸。 在本發明的另一個實施方式中，用一個含有植物幾丁 質酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的編碼序列的基因構建 體來構建一個植株是有利的，其中的幾丁質酶和β-1，3-葡 聚糖酶蛋白或多肽的編碼序列與組織或發育特異性啓動子 可操作性連接，所述啓動子可例如，但不限於CHS啓動 子、PATATIN啓動子等。 在本發明的另一個實施方式中，用一個含有植物幾丁 質酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的編碼序列的基因構建 體來轉形一個植株是有利的，其中的幾丁質酶和β-1，3-葡 聚糖酶蛋白或多肽的編碼序列與修飾過的或人工啓動子可 操作性連接。這些啓動子典型地是通過重組不同啓動子的 結構元件來構建的，具有天然啓動子所沒有的獨特的表達 模式和/或水平。參見Salina等，1992，Plant Cell 4: 1485-1493，如將反式-調節元件和啓動子核心區域相連接 而構建的人工啓動子。 在本發明的另一實施方式中，可以利用本領域已知的 技術增加編碼目的蛋白或多肽的基因的拷貝數來表達幾丁 質酶和β-1，3-葡聚糖酶多肽。 植物和植物細朐的轉形 可以使用本領域公知的方法來轉形植物和植物細胞。 在本發明的一個實施方式中，土壤桿菌（Agrobacterium) 被用來將基因構建體導入植物中。該轉形優選使用二元土 32 1265974

壤桿菌 T-DNA 載體（Bevan，1984，Nuc· Acid Res. 12: 8711-8721 )和共培養方法（Horsch 等，1985，Science 227: 1229-1231 )。土壤桿菌轉形系統一般用於雙子葉植物 (Bevan 等，1982, Ann.Rev.Genet 16: 357-384; Rogers 等， 1986，Methods Enzymol. 118: 627-641 )。土壤桿菌轉形系 統也可以用於將DNA轉形或轉移到單子葉植物和植物細 胞中（參見 Hernalsteen 等，1984, EMBO J3: 3 03 9-3 041; Hooykass-Van Slogteren 等，1984，Nature 3 1 1: 763-764; Grimsley 等，1987，Nature 325: 1677-179 ; Boulton 等， 1 989, Plant Mol· Biol· 12: 31-40;和 Gould 等，1991，Plant Physiol. 95: 426-434 )°

在另一個實施方式中，可以使用可替換的方法將重組 核酸構建體導入到植物和植物細胞中。這些方法對於單子 葉植物或植物細胞是特別適用的。可選擇的基因轉移和轉 形方法包括，但不限於：微粒槍轟擊（biolistics)、通過鈣 -、聚乙二醇（PEG )-進行的原生質體轉形或電穿孔介導的 裸露 DNA 的吸收（參見 Paszkowski 等，1984，EMBO J 3: 27 1 7-2722，Potrykus 等，1 985，Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm 等，1 985? Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828;和 Shimamoto，1 989，Nature 38: 274-276 )和植 物組織的電穿孔（D’Halluin 等，1992, Plant Cell 4: 1495-1 505 )。用於植物細胞轉形的其他方法包括顯微注 射、碳化矽介導的DNA吸收（Kaeppler等，1990, Plant Cell Reporter 9: 415-418)、顯微投影轟擊（見 Klein 等，1988, 33 1265974

Proc. Nat. Acad· Sci. USA 85: 4305-4309 ;和 Gordon_Kamm 等，1990, Plant Cell 2: 603-61 8 )。爲了檢測轉形是否確實 發生，在任何方法中都可以至少是在最初使用選擇性標 記。有用的可選擇性標記包括能夠賦予抗生素抗性的酶， 如.慶大黴素、勻黴素、卡那黴素等等。或者，可以使用那 些能夠通過顔色變化而提供可鑑定化合物的標記，如GUS 或發光物質，如熒光素酶。 嵌合基因也可以含有一個基因開關機制，其決定在什 麽條件下或在什麽時候編碼序列會表達。基因開關結構可 以是化學誘導的啓動子或溫度控制的啓動子。 根據本發明，利用本發明的核酸構建體和上述的各種 轉形方法，可以構建大量植物和植物細胞系統以改變植物 的生理和農業特徵。在優選實施方式中，用於構建的靶植 物和植物細胞包括，但不限於那些單子葉植物和雙子葉植 物，如包括穀類（如小麥、玉米、稻、大麥）的農作物、 水果作物（如番茄，蘋果、梨、草莓、桔）、飼料作物（如 紫花苜蓿）、根菜類農作物（如胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山 藥）、葉菜類農作物（如萵苣、菠菜）、開花類植物（如矮 牽牛花、玫瑰、菊花）、針葉類和松樹（如松樹、杉木、雲 杉）、用於植物補救（phytoremediation)的植物（如重金 屬凝集植物）、油類作物（如向日葵、油菜籽）和用於試驗 目的的植物（如鼠耳芥屬（Arabidopsis ))。 轉形的植物和植物細胞的篩潠 1265974 95. S. -4 根據本發明，通過將一個或多個如上所述的表達丁質 酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因構建體轉形到各種植物細胞類 型中，可以獲得期望的植物，這些植物細胞類型包括但不 限於：原生質體、組織培養細胞、組織和器官外植體、花 粉、胚和整個植株。在本發明的一個優選實施方式中，根 據下文所述方法選擇或篩選構建的植物材料以鑑定轉形體 (並入或整合了導入的基因構建體的那些植株）。然後可以 使分離的轉形體再生成植株。可選擇地，可以使構建的植 物材料再生成一個植株。或者，在得到的植株經受標記基 因特徵的選擇或篩選之前，將構建的植物材料再生爲植 株。在標記基因的選擇和篩選之前或之後，將植物細胞、 組織或器官再生成植株的方法是本領域技術人員公知的。 可以通過選擇或篩選構建的植物材料中由轉形DN Α中 的標記基因所編碼的特徵來鑑定和分離一個轉形的植物細 胞、愈傷組織、組織或植株。例如，可以通過在含有抑制 劑量的抗生素或除草劑的培養基中培養構建的植物材料來 進行選擇，而轉形的基因構建體對所述抗生素和除草劑具 有抗性。另外，還可以通過篩選可能存在於本發明的重組 核酸構建體中的可見標記基因（例如β-葡糖苷酸酶、熒光 素酶、Β或C1基因）的活性來鑑定轉形的植物和植物細 胞。這些篩選和檢測方法是本領域的技術人員公知的。

也可以使用物理和生物化學方法來鑑定含有本發明的 基因構建體的植物或植物細胞轉形體。這些方法包括但不 限於：1 )Southern分析或PCR擴增以檢測和測定重組DNA 35 1265974

插入子的結構；2 ) Northern印跡、S 1核糖核酸酶保護、 引子延伸或逆轉錄酶-PCR擴增以檢測和測定基因構建體 的RN A轉錄産物；3 )酶學分析以檢測酶的活性，其中的 基因産物是由基因構建體編碼的；4)蛋白質凝膠電泳 (PAGE)、Western印跡技術、免疫沈澱、或酶聯免疫試驗， 其中的基因構建體産物是蛋白質。還有其他技術，如原位 雜交、酶染色、免疫染色也可以用於檢測特定植物組織和 器官中重組構建體的存在和表達。用於所有這些檢測的方 法是本領域技術人員公知的。 表達構建的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶多肽的轉基因植物 産生了能夠表達幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的轉 基因植物。表達幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉基因植物 對目的病原體的致病影響易感性降低。轉基因植物可以利 用本領域技術人員公知的技術來製備，這些技術如上文中 關於製備表達幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉基因植物所 描述的。 表達一個或多個幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因多核 苷酸的轉基因植物可以來源於植物王國中的任何植物種、 植物屬、植物科、植物目、植物綱，植物門，其中的多核 苷酸能使所說的植物對目的病原體的抗性增強。參見美國 專利 No· 5,889，189、5,869,720、5,850,01 5、5,824,842 ; PP 10, 742、PP 10, 704; PP 10, 682，在這些文章中敍述了 可使用幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的植物種、屬、科、 36 1265974

目，綱和門。 植物的例子包括單子葉植物、雙子葉植物和農作物（即 用於農業、動物包括人的食物目的而生長的任何植物種， 爲達目的典型地以超過10株的群體生長的植物，來收穫其 整個植株或植株的一部分，如水果，花，或農作物，如植 物生長出的穀物等）、樹（即，水果樹、用作木材而生長的 樹、用作裝飾而生長的樹等）、各種花（如收穫後用作裝飾 而生長的植物）、仙人掌等。 可以表達幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的其他植物 的例子進一步包括：Viridiplantae、Streptophyta、有胚植 物、維管植物、Euphyllophytes、種子植物、木蘭門植物、 Liliopsida、Commelinidae、Poales、Poaceae、稻屬植物 (Oryza )、稻（Oryza sativa )、玉蜀黍屬植物、玉蜀黍、 大麥屬植物、大麥芽、小麥屬植物、普通小麥（Triticum aestivum)、Eudicotyledons、Core eudicots、Asteridae、 Euasterids、Rosidae、Eurosids II、蕓薹屬植物 (brassicales)、十字花科植物、阿布屬植物、Magnoliopsida、 Solananae、Solanales、茄科植物、茄屬植物、煙草屬植物。 還包括，例如，特殊目的的農作物，如茄科，包括加 工的新鮮市售番茄、胡椒粉和茄子；葉類植物，包括萵苣 和菠菜；蕓薹，包括椰菜、抱子甘藍、花莖甘藍、羽衣甘 藍、花椰菜、紅球甘藍和白球甘藍；葫蘆科植物，包括黃 瓜、甜瓜、西瓜、夏季南瓜和南瓜；大種子植物，包括豌 豆、菜豆和甜玉米；根類植物，包括胡蘿蔔、和洋蔥；生 37

1265974 長繁殖類植物，包括漿果、葡萄、香蕉、鳳梨、薔薇科水 果和堅果作物，包括芒果和南瓜。 因此，本發明可以使用大範圍的植物，其包括但不限 於：來自腰果屬（Anacardium)、花生、蘆筍、顛茄屬 (Atropa )、燕麥屬（Avena )、蕓薹、柑橘、西瓜、辣椒、· 紅花、椰子樹、咖啡、香瓜屬（Cucumis )、南瓜、胡羅蔔、 油棕（Elaeis )、草莓、大丑屬（Glycine )、棉、Hlianthus、 Heterocallis、大麥、天仙子、萵苣屬（Lactuca )、亞麻、 黑麥草、羽扇豆、番前屬（Lycopersicon)、蘋果、木薯、 Major ana、苜猜屬（Medic ago )、煙草、洋橄攬、稻屬 (Oryza)、Panieum、Panneserum、鱷梨屬（Persea)、菜 丑、黃連木屬（Pistachia)、魏丑屬（Pisum )、梨屬（Pyrus)、 李、蘿蔔屬（Raphanus )、蓖麻、黑麥屬（Secale )、千里 光、芥子、節、高粱、Theobromus、胡蘆巴、Titicum、巢 菜、葡萄、豇豆和玉蜀黍。 在轉基因植物中表達構建某因的多核苷酸構津體 利用本領域公知的常規DN A重組和選殖技術構建一個 多核苷酸構建體，該構建體能指導目的轉基因植物中構建 的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因産物表達，參見 Sambrook等，見上文；Ausubel等，見上文。該多核苷酸 構建體典型的包括一個編碼構建幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖 酶基因産物的多核苷酸序列和一個或多個調控多核苷酸序 列。可用於本發明多核苷酸構建體的調控序列包括但不限 38 1265974 於：啓動子、增強子、內含子、拼接供體、拼接受體、多 聚腺苷酸序列、RNA穩定調控序列或上述任一的一個元件 (如啓動子元件包括，但不限於一個TATA盒）。 多核苷酸構建體含有一個或多個調控元件，該調控元 件能指導本發明中構建的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因 産物的表達。在一個優選的方面，調控元件具有在一個期 望表達構建的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因産物的植物 中指導表達的能力。在另一個優選的方面，調控序列具有 在一個在期望表達構建的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶基因 産物的細胞類型中指導表達的能力。 用於本發明的多核苷酸構建體的調控序列是本領域的 技術人員公知的，例如，在目的細胞類型和植物物種中表 達的已知基因的啓動子和增強子。利用常規的實驗也可以 分離出用於在目的植物細胞類型中表達構建的幾丁質酶和 β-1,3-葡聚糖酶的基因産物的啓動子，例如，分離已知以 期望的方式表達的基因的啓動子區。舉例來說，使用已知 可在目的細胞類型或目的植物物種中表達的mRNA的5’ 末端特異性cDNA探針，可以篩選基因組文庫。這種5’末 端cDNA探針優選地僅含有約100 —約3 00個鹼基對，這 樣，在基因組文庫中鑑定的選殖株可能含有基因5’末端， 該末端可能包括探針特異性的基因啓動子區域。啓動子區 域典型地包括轉錄起始位點上游大約1000-約2000個鹼 基對。這樣，用於表達本發明構建的幾丁質酶和β-1,3-葡 聚糖酶的基因的啓動子是在目的植物物種的目的細胞類型 39 1265974 中已知將要表達的基因的轉錄起始位點上游2000個鹼基 到下游50個鹼基的多核苷酸，或者是該多核苷酸的一部 分。 爲了使構建的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶能被正確的 加工，還可能必須含有一個編碼這種加工所必需的肽序列 的核苷酸片段。舉例來說，還可能必需一段在宿主植物中 用於識別並且具有功能的肽序列，如使構建的幾丁質酶和 β-1，3-葡聚糖酶的基因産物進入內質網，即信號序列。 構建的抗件植株檢測分析 用本發明的方法構建的表達構建幾丁質酶和β_;1，3-葡 聚糖酶基因産物的植株與不表達構建幾丁質酶和β-1，3-葡 聚糖酶基因産物的相同物種植株（即野生型植株）相比較， 其對目的病原體的致病性影響的抗性增強。用本發明方法 生産的抗性增強的植株可以通過本領域的公知技術進行分 析。例如，用目的病原體感染本發明製備的植株和野生型 植株。感染之後，本發明産生的植株比野生型植株成活率 至少高約20%，優選至少高約40%，更優選的至少高約 60%，更優選的至少高約80%。 檢測用本發明的方法製備的轉基因植物的另一個方法 是檢測壞死誘導活性，例如，如同Mahe等，1998, J. Peptide Res. 52: 482-494中的描述。這樣，可以在轉基因植株中表 達構建的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶，並用目的病原體感 染轉基因植株。舉例來說，當用病原體感染表達構建的幾 40 1265974

T質酶和β-ΐ，3-葡聚糖酶基因的轉基因植物時，在野生型 植株中就會發現明顯的壞死或嚴重的壞死擴散，而在來源 於該野生型植株的轉基因植株中卻沒有發現。 除了用目測外，壞死細胞的死亡也可以用組織化學染 色反應來觀測。 下文提供的實施例用於進一步解釋本發明，但對 本發明的範圍不起任何限制作用。 實施例 ί!料和方法 植物材料 在22— 24°c的培養室中12h光照/12h黑暗迴圏培養芥 菜。 篩選芥菜cDNA文庫以獲得幾丁質酶選殖株 合成一對寡核苷酸引子 φ 5’GGTGGATGGGCTACAGCACCAGAC3’（SEQ ID NO. 8)和 5’GCCACGTCCACACTCCAA3’（SEQ ID NO. 9)，用於 PCR 擴增鼠耳芥（Arabidopsis)幾丁質酶基因的414bp的片段 (核甘酸 1625 — 2038)( Samac 等，1990，Plant Physiol 93: 907-914 )。在用於篩選芥菜cdNA文庫（Pua等，1992, Plant Mol Biol 19: 541-544 )前，在含有30%去離子甲醯胺的溶 液中，42°C下進行原位平板雜交（Sambrook等，1989，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring 41 1265974

Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ·)，來確 認相應於保守幾丁質酶區域的該片段核苷酸序列。在室溫 下在O.lxSSC、0.1% SDS中清洗印跡。 DNA序列分析

用 DNA 測序試劑盒和 Sequenase Version2.0 (UBS， Amersham Life Science)以及 GCG 序列分析程式（Genetics Computer Group)分析Ml 3 mpl8中包含目的序列的DNA 片段（Yanisch-Perron 等，1 98 5, Gene 33: 1 03-1 1 9 )。

基因組DNA的分離和Southern印跡分析 爲了進行Southern印跡分析，用不同的限制核酸內切 酶消化 20pg 分離（Dellaporta et al·，1 983，Plant Mol Biol Reptr 1M9-21 )自 B.juncea 的 DNA，在 0.8% 的瓊脂糖凝 膠中電泳分離，並印跡到Hybond-N (Amersham) (Sambrook 等，1989)上。使該印記與32P標記的BjCHIl cDNA 探針 在含有30%去離子甲醯胺、6xSSC、5xDenhardt s、1%SDS 和50(^g/ml變性的超聲波處理過的鮭魚精子DNA的溶液 中42°C過夜雜交，在室溫和65°C下在O.lxSSC、0.1%SDS 中清洗印跡。

Northern印跡分析 將從幼苗葉中抽提出的2〇Kg RNA( Nagy等，1988, Plant Molecular Biology Manual B4:l-29 頁。Kluwer Academic 42

1265974

Publisher, Dordrecht)在含有乙二醒的溶液中50 °C下進行 變性處理，在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，印跡到 Hybond-N (Amersham)膜上。將該印記與32P標記的BjCHIl cDNA探針在含有50%去離子甲醯胺、lxDenhardt’s、6x SSPE、0.1% SDS和100// g/ml變性的超聲波處理過的鮭魚 精子DNA及10%硫酸葡聚糖的溶液中42°C過夜雜交，在 65°C下在O.lxSSC、0.1% SDS中清洗印跡。 多聚酶鏈反應 使用弓[子p 1和P2或P2和P3和GeneAmp PCR試劑盒 (Perkin Elmer)進行PCR。圖1A表明了引子的位置：相應 於核苷酸 56-73 的 PI (5’CCTCCGGTGAGCAATGCG3’） (SEQ ID NO. 10)，互補於核苷酸 554-536 的 P2 (5，TTAGCGGCGGTGATGAAGG3，）（SEQ ID NO. 11)，相應 於核苷酸 207-225 的 P3 (5’TCCTCCAACCCCGCAGTGT3’） (SEQ ID NO. 12)。B.junceaDNA 在 94°C 變性 5 分鐘，利 用引子進行35個PCR迴圈，每個迴圈爲94°C 1分鐘，68 °C 1分鐘和72°C 3分鐘。最後的延伸階段爲72°C 7分鐘。 PCR産物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，並印跡到Hybond-N (Amersham)膜上與32P標記的BjCHIl cDNA雜交。依照 Lasserre 等，1996，Mol Gen Genet 251 “ 81 — 90 的方法， 對利用硫氰酸胍（guanidine thiocyanate )從幼苗葉中抽提 出的總RNA (Nagy等，1 988 )進行逆轉錄聚合酶鏈反應 (尺丁-?01〇。序歹[1爲5，(：€八(：！^0八00丁丁0丁丁0€3，的弓丨子？4 43 1265974 年

(SEQ ID NO· 13)(與核苷酸 750 — 734 互補，圖 1A)和 50 // g總RNA退火。在使用Ρ2和Ρ3作爲引子的PCR中， 以第一鏈cDNA作爲模板（圖1A)。所有的RT-PCR反應 都進行3次。

抗HbGLU和BjCHIl的多株抗體的製備 從 Chiron Technologies( Australia)購得相應於 HbGLU 的胺基酸94 — 107 ( SEQ ID NO:4)的合成肽 (SDLQSLTNPSNAKS)，按照 Sambrook 等，1989 的方法 將其用於在兔中製備多株抗體。使用相應於BjCHIl胺基 酸序歹[J 231 — 242 ( SEQ ID NO:2 ) ( Zhao 和 Chye，1999，

見上文）的合成肽（YKEEIDKSDPHC)免疫兔以製備多株 抗體，這些抗BjCHIl的抗體從Chiron Technologies (Australia)購得。將每一種肽與鑰孔血藍蛋白（KLH) 一起，與Freund’s完全輔劑混合以製備抗體。收集血液， 利用蛋白A瓊脂糖CL-4B ( Pharmacia)和CNBr-啓動的 瓊脂糖4B ( Pharmacia )柱純化抗HbGLU抗體，用硫代 丙基一瓊脂糖6B ( Pharmacia)柱純化抗BjCHIl抗體。 用煎屬絲核菌（R.solani)感染芥菜（B.juncea) 將芥菜（B .jimcea)種子種植在高壓滅菌過的土壤中， 在24°C的生長室中，以12h光照（08:00-20:00 )和12h黑 暗（20:00-08:00)的日夜條件進行培養。將兩星期齢的幼苗 小心地轉移到已培養茄屬絲核菌（R.solani) —周的土壤 44

1265974 中。其中的真菌在馬鈴薯葡萄糖漿中室溫下培養了丨個星 期，並在幼苗種植到土壤前3天被加到土壤中。在幼苗被 轉移到感染的土壤中後的〇- 9天’每天收集幼苗葉，從這 些葉中提取總RNA和總蛋白，分別進行Nortern印跡分析 和Western印跡分析。

攜帶有三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶和三葉膠樹幾丁質酶

BjCHIl的質體構建體 將 H.brasiliensis β-1，3-葡聚糖酶的全長 cDNA 1.2kb 的 Smal-Hindll 片段命名爲 HbGLU ( Chye 和 Cheung，1 99 5， Plant Mol. Bio. 29: 3 97-402 )，將其選殖到二元質體載體 pBI121 ( Clontech)的 CaMV 35S 啓動子下游的 Smal 位 點，從而産生質體PHEV43 (圖7)，而將編碼芥菜幾丁質 酶的全長cDNA 1.3kb的Smal片段，良卩HjCHIl ( Zhao 和 Chye，見上文）選殖到 pBI121 ( Clontech)的 CaMV 35S 啓動子下游的Smal位點，從而産生質體pBjl7。然後，用 Klenow將來自pHEV43的含有CaMV 35S啓動子的2.04kb 的Hindlll片段和HbGLU cDNA剪切成平末端，連接到 pBjl7的GUS基因內的SnaBI位點，産生質體pBj47和 pBj48 (圖7)。在pBj47中的CaMV 35S啓動子是反向的， 而在pBj48中CaMV 35S啓動子是串聯的，每個pBj47質 體和pBj48的單個質體都含有HbGLU cDNA和BjCHIl cDNA (圖 7)。質體 pBjl7、pBj47 和 pHEV43 用於馬鈴 薯的轉形。 45 1265974 攜帶有三葉膠樹β-1,3-葡聚糖酶和三葉膠樹幾丁質亂 BiCHIl構建體的轉某因馬鈴薯植株的製備 植株的轉形 通過三親代雜交，利用輔助菌株HB 101 ( Prk2013)

分別將 pHEV43 、pBjl7、pBj47、pBI 1 2 1 質體從 E.coli 菌株DH5 a中固定到根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株 LBA4404 中。根據 Dietze 等，1 995，In Potrykus I，Sprangenberg G (編），Gene Transfer to Plants， New York，Cold Spring Harbor Laboratory，24-29 頁的方法 利用含有這些質體的根瘤土壤桿菌轉形馬鈴薯植株變體 (Solatium tuberosum L)。在含有卡那黴素（100/z g/ml) 的Murashige和Skoog培養基中篩選轉形體。在生長培養 箱中，16h光照/8h黑暗的條件下，20- 25 °C維持馬鈴薯組 織培養物。轉基因RG馬鈴薯植株在白天/黑夜條件爲12 h 光照/12h黑暗、溫度爲24°C的條件下在生長室的土壤中生 長。 在穩定轉形的馬鈴薯植株中檢測三葉膠樹β-1,3-葡聚糖 酶和三葉膠樹幾丁質酶BiCHIl産物的功能 Norhtern印跡分析 根據 Nagy 等，1988，In: SV Gelvin，RA Schilperoort， (編）Plant Molecular Viology Manual，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht, B4M-29頁中描述的方法從植物中 46 1265974

抽提總RNA，在乙二醛存在的情況下將20// g RNA在50 °C下變性處理30分鐘，在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分 離，並轉移到Hybond-N (Amersham)膜上。預雜交印跡4 - 6h，然後將該印跡與用隨機引導標記製備的32P標記 BjCHIlcDNA或HbGLUcDNA在含有50%去離子甲醯 胺、lxDenhardt’s、6xSSPE、0.1% SDS 和 100# g/ml 變性

的超聲波處理過的鮭魚精子DNA及10%硫酸葡聚糖的溶 液中42°C過夜雜交，在65°C下在O.lxSSC、0.1% SDS中 清洗印跡。

Southern印跡雜交 爲了進行Southern印跡分析，根據Dellaporta等， 1 983，Plant Mol Bio Rep. 1: 19_21 中的方法分離的 20// gDNA用限制核酸內切酶消化，在0.7%的瓊脂糖凝膠中電 泳分離，印跡到 Hybond-N (Amersham) (Sambrook 等，1 989) 膜上。該膜在含有50%去離子甲醯胺、6xSSC、5x Denhardt’s、1%SDS和l〇〇//g/ml變性的超聲波處理過的 鮭魚精子DNA的溶液中預雜交4 一 6小時。加入32P標記 的BjCHIl cDNA探針或32P標記的HbGLU cDNA ，雜交 過夜，在65 °C下在O.lxSSC、0.1% SDS中清洗膜。

Western印跡分析 根據 Kush 等 ’ 1990 ’ Proc Natl Acad Sci USA 87: 1 78 7-1 790的方法製備總植物蛋白。根據Sambrook等，1 989 47

年 h! f '- 1265974

中所描述的方法利用SDS-PAGE分離出20// g總蛋白，然 後將其轉到Hybond-C ( Amersham )膜上。在Western印 跡分析中，根據擴增的鹼性磷酸酶山羊抗兔疫印跡分析試 劑盒（Amplified Alkaline Phosphatase Goat Anti-Rabbit Immunoblot Assay Kit)中的描述（BioRad)，利用抗 GjCHIl 的多株抗體或抗HbGLU的多株抗體檢測交叉反應帶。 製備植物蛋白提取物用於進行酶學分析 根據 Boiler 等，1983，Planta 157: 22-3 1 中的方法製 備植物蛋白抽提物。在液氮中將植物磨成粉末，轉移到含 有1% ( v/v) a锍基乙醇的0.1M的檸檬酸鈉（ρΗ5·0)緩 衝液中，渦旋。離心（4°C，14000rpm，5分鐘）後，將上 清液移到另一個試管中，在50°C下培養1〇分鐘，在冰上 冷卻10分鐘。然後離心樣品（4°C，14000rpm，5分鐘）， 其上清液作爲粗蛋白用於幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的活 性分析。根據 Bradford ( 1976，Anal. Biochem, 72: 248-254 )的方法測定蛋白質濃度。 β-1，3-葡聚糖酶的分析 根據 Abeles 和 Forrence，1 970，Plant Physiol 45 : 395-400的方法對β-1，3-葡聚糖酶進行比色分析。將ΙΟΟμΙ (25//g)植物蛋白抽提物和100μ12% (w/v)海帶多糖的反 應混合物在50°C下孵育2h。通過加入600μ1的二硝基水楊 酸（dinitrosalicyclic )試劑並在100°C加熱5分鐘來中止 48 1265974 反應。冷卻到室溫後，用水以1 : 20的比例稀釋，在500nm 下測定其吸收値。 幾丁質酶的分析 根據 Wirth 和 Wolf ’ 1990 ’ J· Microbiol Meth 12: 197-205中的方法對幾丁質酶進行比色分析。將150μ1羧甲 基/幾丁質/Remaz〇l Brilliant Violet ( Loewe Biochemica ； 2mg/ml儲備溶液）的底物和150μ1 0.2M的乙酸鈉（ρΗ5·0) 及300μ1 (15 // g)的植物蛋白抽提物的反應混合物在37°C 下孵育0.5h 。通過加入150μ1 IN HC1中止反應，接著在 冰上孵育5 — 10分鐘，離心（4°C，14000rpm，3分鐘）。 在550nm下測定其上清液的吸收値。用300μ1 pH5.0的0.1M 檸檬酸鈉緩衝液代替蛋白質樣品作爲對照。 利用綠色木黴（Trichodermaviride)在體外進行真菌 的生物檢測 在馬鈴薯葡萄糖（Difco)瓊脂（PDA)平皿上培養綠 色木黴（T·viride ) Persoon (ATTC 1 2582)。根據 Sc hi umbaum 等，1 986，Nature 324: 365-367 的方法將其用 於體外菌絲抑制測定。將帶有在PDA上生長的綠色木黴 (T.viride )培養物的塞子轉移到新鮮PDA平皿的中央。 25t下保溫24h，在這個過程中菌絲從中央向外生長，在 PDA的外表面生成孔，這些孔距離塞子是等距離的，向每 個孔中加入植物蛋白抽提物（50// g)，將平皿在25 °C的黑

1265974

暗條件下進一步培養，之後可觀察到綠色木黴（T.viride) 的生長被抑制。在第16h和24h小時拍照。

利用茄屬絲核菌（R.solani)進行體內生物檢測 在Northern印跡分析中已經表明：受創傷或MeJA處 理能夠誘導BjCHIl mRNA ( Zhao等，1999，見上文）。接 下來還表明了黑色麯黴（Aspergillus niger)感染和毛蟲侵 擾液可以誘導BjCHIl ( Fung等，2002，見上文）。在本 發明中，根據Jach等，1995，Plant J· 8: 97-109的方法對 幼馬鈴薯植株進行體內生物檢測，25°C下在固體PDA培養 基中培養5-6天的R.solani被接種到100ml液體馬鈴薯葡 萄糖漿（PDB)中，並在室溫下搖床（lOOrmp)培養1— 2 周。然後，將培養物轉移到含有5〇〇ml的新鮮PDB的錐形 燒瓶中，再培養3 - 4天。接著，將培養物與6L的滅菌土 (Bio-Mix Super，The Netherlands )在盛有 8L 滅菌 土的植 物生長槽中徹底混合。1〇天後土已完全混合，先前由組織 培養物在滅菌土中生長2個星期後而得到的馬鈴薯植株被 轉移到感染過的土壤中，在24°C，12h光照/12h黑暗的條 件下繼續在生長室中培養。轉移到感染過的土壤中之後兩 個星期，對馬鈴薯植株拍照。在沒有真菌的滅菌土中生長 的植株作爲對照。 結果 煎屬絲核菌（R.s〇lani )感染能夠誘導的表達 50 1265974

爲了硏究真菌對BjCHIl表達的誘導’將芥菜 (B ·j uncea )幼苗種植在預先接種有土壌真囷’加屬絲核 菌（R.solani)的土壤中。圖8a的結果表明了在感染的土 壤中生長一天後，1.3kb BjCHIl mRNA的表達增加。圖8b 表明了在感染的土壤中生長3天後，表觀分子量爲37kDa 的期望的成熟BjCHIl蛋白的交叉反應帶有所積累。在這 條帶上面的42kDa的弱勢帶可能是前體蛋白（圖8b )。計 算得到的BjCHIl前體分子量爲42774kDa，該前體經過翻 譯後剪切，N末端信號肽和C末端液泡導向肽被切除（Zhao 和Chye，見上文）。我們得到的結果表明，在茄屬絲核菌 (R.solani)感染後BjCHIl mRNA及其相應的蛋白發生積 累，這說明它在真菌預防方面的作用。 在轉基因馬鈴薯植株中BjCHIl和HbGLU的表達 BjCHIl的表達受茄屬絲核菌（R.solani)感染的誘導， 這個發現啓發我們開始硏究：在轉基因馬鈴薯中其異源表 達是否能夠賦予抗茄屬絲核菌（R.solani)的特性。含有 BjCHIl的質體pBjl7和PBj47通過根瘤土壤桿菌介導轉形 而分別導入馬鈴薯變體中。pBj47還含有HbGLU cDNA， 這便於我們硏究HbGLU在提高BjCHIl活性方面是否會有 影響。含有HbGLU cDNA選殖株的質體PHEV43和對照載 體pGI121也用於轉形馬鈴薯。通過Northern、Southern 和Western印跡分析檢測每種轉形得到的大約20株推定的 抗卡那黴素轉基因獨立植株。對最終選用於茄屬絲核菌 51 1265974

(R.solani)感染試驗的每種轉形代表植株進行分析，其結 果如圖9、10、11所示。圖9A顯示：在對共表達HbGLU 和BjCHIl的轉基因馬鈴薯植株、pBj47-P1G(第2道）、 pBj47_P8(第 3 道）、PBj47-P7(第 4 道）和只表達 HbGLU 的 轉基因馬鈴薯植株pHEV-P14 (第5道）進行Northern印跡的 分析中，使用32P標記的HbGLU cDNA檢測到的1.2kb的 雜交HbGLU mRNA的存在。該帶在未轉形馬鈴薯中不存 在（圖9A，第1道）。圖9B顯示：在轉基因馬鈴薯植株 PBj47-P1()(第 2 道）、PBj47-P8(第 3 道）、pBj47-P7(第 4 道） 和pBjl7-P6(第6道）中用32P標記的BjCHIl cDNA探針檢 測到的1.3kb的雜交BjCHIl mRNA(用箭頭表示）的表達。 這個帶在未轉形馬鈴薯（圖9B，第1道）和pBI121轉形 馬鈴薯中（圖9B，第5道）中不存在。 對轉基因馬鈴薯植株進行Southern印跡分析 接著，利用由BjCHIl或HbGLU cDNA制得的32P標記 的探針對來自於這些轉基因馬鈴薯植株的DN A進行 Southern印跡分析。圖10A的結果表明1.2kb的HbGLU Ec〇RI雜交帶存在於轉基因馬鈴薯植株pBj43-P14 (第3 道）、pBj47-P7 (第 4 道）、pBj47-P8 (第 5 道）和 pBjAT-Pi。（第 6道），在未轉形的馬鈴薯（第1道）、pBI121轉形馬鈴薯 (第2道）中不存在。1.2kb的EcoRI雜交帶與pHEV43 圖譜（圖7)所示一致，含有全長的HbGLU cDNA。利用 32P標記的BjCHIl cDNA探針和Hindlll消化的DNA進行 52 1265974

Southern印跡分析（圖1 〇B )，在轉基因馬鈴薯植株PBj47-P7 (第 3 道）、pBj47-P8 (第 4 道）、pBj47-pi〇 (第 5 道）和 pBj 17-P6 (第6道）中檢測到〇.9kb的Hindlll雜交帶。該0.9kb的帶 與pBj 17圖譜（圖7 )中所示的BjCHI1 cDNA內第二和第 三內部Hindlll位點間的片段一致。該〇.9kb的帶在未轉形 的馬鈴薯（圖10B，第1道）、PBI121轉形馬鈴薯（第2 道）中不存在。當用32P標記的BjCHIlHbGLUcDNA探針 進行當在Southern印跡分析（圖1 〇C )以檢測EcoRI消化 的DNA時，在轉基因馬鈴薯植株pBj47-P1Q (第3道）、 PBj47_P8 (第4道）、pBj47-P7 (第5道）中就會看到不同大 小的雜交帶，這表明這些植株是獨立的轉基因植株。在未 轉形的馬鈴薯（第1道）和PBI121轉形的馬鈴薯（第2 道）中不存在這些帶。 在轉基因馬鈴薯中檢測BjCHI 1和HbGLU蛋白質 利用抗HbGLU抗體和抗BjCHIl抗體進一步進行 Western印跡分析轉基因植物。利用抗HbGLU抗體（圖11 A ) 對來源於轉基因馬鈴薯植株pBj47-P7 (第1道）、pBj47-P8 (第 2 道）、pBj47_P1()(第 3 道）、PHEV43-P14 (第 4 道）的粗 蛋白進行Western印跡分析表明，表觀分子量爲35kDa的 交叉反應帶相應於HbGLU。該帶在pBI121轉形馬鈴薯（圖 11A，第5道）和未轉形的馬鈴薯（第6道）中不存在。 利用抗Bj CHI 1抗體（圖1丨b )對來源於轉基因馬鈴薯植株 pBj47-P7(第 1 道）、pBj47-P8 (第 2 道）、pBj47-P1()(第 3 道）、 53 1265974 pHEV43 - P14 (第4道）、PBI121轉形馬鈴薯（第5道）、未 轉形的馬鈴薯（第6道）和轉基因馬鈴薯植株PBjl7-P6(第 7道）的粗蛋白進行Western印跡分析表明，在轉基因馬鈴 薯植株 pBj47-P7 (第 1 道）、pBj47-P8 (第 2 道）、pBj47-P1()(第 3道）和PBjl7-P6 (第7道）中存在表觀分子量爲52kDa的 BjCHIl交叉反應帶。該帶在只表達HbGLU的轉基因植株 pHEV43-Pi4 (圖11B，第4道）、pBI121轉形馬鈴薯（圖 11B，第5道）和未轉形的馬鈴薯（圖11B，第6道）中不 存在。馬鈴薯表達的表觀分子量爲5 2kDa的BjCHIl類似 於觀察到的煙草表達的BjCHIl ( Fung等，2002,見上文）， 且比天然BjCHIl ( 37kDa)更大，這可能是由於在異源 宿主，煙草和馬鈴薯中不能正確的進行翻譯後加工的緣故。 幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性分析 檢測轉基因馬鈴薯植株以進行幾丁質酶和β-1，3-葡聚 糖酶活性分析並與ΡΒΙ121轉形的馬鈴薯進行比較（圖 12)。利用來自ΡΒΙ121-轉形體和轉基因馬鈴薯植株 pBj47-P7、pBj47-P8、PBj47-P1Q的粗蛋白進行葡聚糖酶分 析（圖12A)表明，轉基因植株的β-1，3-葡聚糖酶的活性 比ρΒΙΙ 21-轉形體高。利用粗蛋白進行幾丁質酶分析（圖 12B)表明：轉基因馬鈴薯植株pBj47-P7、pBj47-P8、 pBj47-P1G中的幾丁質酶比pBI121-轉形體中的幾丁質酶表 現出更高水準的活性。在pBIl 21-轉形體能檢測到活性是 因爲存在內源性馬鈴薯幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶。 1265974 & 一

利用綠色木黴（T.viride)進行的體外生物檢測 接著，檢測轉基因馬鈴薯植株的粗抽提物對綠色木黴 (T.viride)生長的體外抑制。在這些生物分析過程中，來 自未轉形的馬鈴薯植株和pBIl 21轉形的轉形植株的抽提 物作爲對照，緩衝液作爲空白。在向孔中加入蛋白質抽提 物16h (圖13A)和24h (圖13B)後進行拍照，照片表明 綠色木黴（T.viride)的生長被來源於共表達BjCHIl和 HbGLU的轉基因馬鈴馨植株pBj47-P1 〇的抽提物抑制，而 在只有緩衝液作爲對照情況下（孔2 )、來自野生型馬鈴薯 的抽提物（孔3)和來自pBI121轉形的馬鈴薯抽提物（孔 4)中不存在抑制。只表達GjCHIl的轉基因馬鈴薯植株 pBjl7-P6 (孔5)和只表達β-1，3-葡聚糖酶的pHE43-P14 (孔6)比PBj47-P10表現出較弱的抑制（孔1)。 用茄屬絲核菌（R.solani進行的體內生物檢測 利用生長在預接種有茄屬絲核菌（R.solani)的土壤中 的幼苗進行體內生物檢測。在轉移到感染過的土壤2個星 期後收集的結果表明：共表達BjCHIl和HbGLU的轉基因 馬鈴薯植株pBj47-P1G (圖14A)比只表達GjCHIl的轉基 因馬鈴薯植株pBjl7-P6 (圖14B)生長的稍微好一些。轉 基因馬鈴薯植株pBj47-P1()和pBjl7-P6的根發育比只表達 β-1，3-葡聚糖酶的轉基因馬鈴薯植株PHE43-P14 (圖14C) 要好得多。但是轉基因馬鈴薯植株PHE43-P14根的發育比 未轉形馬鈴薯（圖14D)要好，這表明HbGLU的表達本身 55 1265974 9【飞一，4… 人-‘* 、·. i 牛. }:·:

L 賦予了 一些保護作用。生長在滅菌土壤中的對照植株（未 接種茄屬絲核菌（R.solani))的根發育和轉基因植株 PBj47-P1Q的相似（資料未列出）。該利用茄屬絲核菌 (R.solani)的體內生物檢測試驗重複進行，獲得了 一致的 結果。 本發明所述的具體實施方式只證明本發明的各方面， 不對本發明的範圍有所限制，本發明的功能性等同方法和 産品也在本發明的包含範圍之內。事實上，除了本發明所 描述的修飾外，根據上文的說明和附圖而進行各種修飾對 於本領域的技術人員來說是顯而易見的，因此，這些修飾 也落在本發明要求保護的範圍之內。 本發明引用的不同參考文獻，其公開的內容全文引作 參考。 圖式簡單說明 圖1表明了芥菜（B.juncea) Bj CHI 1的核苷酸序列和 BjCHIl的結構。A是BjCHIl的核苷酸序列（SEQ ID N0:1 ) 和根據該序列推導出的在其下顯示的胺基酸序列（SEQ ID 說2) 〇幾丁質結合區被劃上了下劃線。連接區被劃上點 線。推斷出的多聚腺苷化信號被劃上雙線。推斷出的Ν-末端信號肽和C-末端液泡導向肽的分裂位元點被標記上 (!)。該幾丁質結合區是具有兩個胺基酸差別的串聯重複 序列。這些差別胺基酸在第一幾丁質結合區中位於BjCHIl 位點25處的“S”和位點30處的“E” ，而在第二結合區 56 1265974

中是位於位點76處的“R”和位點81處的“A” 。引子的 位置（P1到P4)用方框標出；對於P2和P4，它們的序列 相應於其互補序列。Hindlll限制酶位點被標出。示意圖B 代表了 BjCHIl。N末端信號肽（黑色方框SP)位於被一 個間隔子（灰色方框S)間隔開的兩個幾丁質結合區 (CBDI，胺基酸22 — 61 ; CBD2，胺基酸73 — 112)的前 面。CBD2通過一個連接區（交叉方框H)和幾丁質催化 區（胺基酸146 — 393 )連接。陰影方框V表示液泡導向序 列。

圖2是BjCHIl與其他種類的植物幾丁質酶進行的比 較。A 是煙草 Chial (Shinshi 等·，1990, Plant Mol. Biol· 14: 357-368)和 Chia2 (Payne 等.，1990, Proc. Natl. Acad· Sci USA 87: 98-102)、菜豆（bean) Chia4 (Margis-Pinheiro 等·，1991，Plant Mol. Biol. 17: 243-253)、大蓴麻（stinging nettle) Chia5 (Lerner 和 Raikhel，1992, J. Biol· Chem. 267: 1 1085-1 1 091)和甜菜（sugar beat) Chia6 (Berglund 等.1 995, Plant Mol. Biol. 27: 211-216)。虛線間隔是優化區域。星號 表示一致的位置。推斷出的信號肽的分裂位元點和液泡導 向序列用（丨）標記。BjCHIl的幾丁質結合區用下劃線標 記。BjCHIl的連接區用虛下劃線標記。間隔子中的PPTP 重複序列和連接區用箭頭標記。用方框標記出了相應於 BjCHIl胺基酸位點23 1 — 242的合成肽 (YKEEIDKSDPHC)，所述BjCHIl是用於産生多株抗體。 相應於BjCHIl胺基酸位點268 — 272的序列NYNYG用方 57 1265974

框標記。Chia綱中的8個保守胺基酸位點用（★)標記。 對比各序列的幾丁質催化區，在各序列末端用圓括號表明 其與BjCHIl的同一性。示意圖B表明了 BjCHIl、Chial 和UDA1中與二硫鍵橋（用條形圖上的連線表示）的形成 有關的半胱胺酸（C)的位置。黑色框代表信號肽（SP ); 灰色框代表間隔子（s);交叉框表示連接區（H);陰影框 表示液泡導向序列（V )。 圖3顯示了對BjCHIl、BjCHI2、BjCHI3進行凝集反 應檢測的結果。其中BjCHI2和BjCHI3分別衍生自含有一 個和不含有幾丁質結合區的BjCHIl。凝集檢測根據Does 等（1999，Plant Physiol· 120: 421-431 )的方法，用 FPLC 純化的畢赤氏酵母屬（Pichia)-表達的幾丁質酶進行。微 量滴定板的每一個孔中含有30微升用胰蛋白酶處理的兔 紅血球，向其中加入不同量（0.12、0.25、0.5、2、4、8、 16、24 pg)的 FPLC 純化蛋白（BjCHIl、BjCHI2 和 BjCHI3 )。 最後在每個孔中加入五倍濃縮的磷酸鹽使其終體積爲 60μ1。在對照孔（即，“con”，每一排的最後一個孔）中， 用磷酸鹽緩衝液代替蛋白。 圖4是對芥菜基因組中的BjCHIl相關基因進行分析的 結果。A是Southern印跡分析的結果。用EcoRI (第1 道）、Hindll (第 2 道）、Hindlll (第 3 道）和 Xbal (第 4道）消化DNA，與32P標記的BjCHIl cDNA雜交，在室 溫下用O.lxSSC、0.1% SDS清洗。第5 — 8道代表了在65 °C進行清洗的相同印跡。B是用引子進行PCR的産物，P1 58 1265974

和P2 (第1道）或P2和P3 (第2道）在2%的瓊脂糖凝 膠上電泳，用溴乙啶染色。C顯示了（ b )中與32P標記的 BjCHII的cDNA雜交的瓊脂糖凝膠的Southern印跡。 圖5顯示了三葉膠樹β_1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列， Α是三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列（SEQID Ν0:3)〇Β是推導出的三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的胺基酸 序列（SEQ ID Ν0··4)。C是推導出的三葉膠樹（Η1))β-1，3- 葡聚糖酶的胺基酸序列和白花丹葉煙草 (N.plumbaginifolia) (Np) gnl 的胺基酸序歹[J ( De Loose 等·，1 98 8, Gene 70: 12-23 )、 II 型（CII )、III 型（CIII)和 IV型（CIV)三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶進行的比較。相一致 的位點用點標出。推導出的三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶的 Ν-糖基位點用星號標出。預測的三葉膠樹β-1，3-葡聚糖酶 的Ν末端和C末端延伸區分別用上劃線和下劃線標出。 圖6顯示了基因組的Southern分析。用BamHI ( B )、 EcoRI ( E)、Hindll ( Η)和 Xbal ( X)消化三葉膠樹 基因組DNA ( 20μ§)，凝膠電泳分離，印跡在Hybond Ν (Amersham)膜上，再與32Ρ標記的三葉膠樹β-1,3-葡聚 糖酶cDNA探針雜交。 圖 7 顯示了質體 pBjl7、pHEV43、pBj47 和 PBj48 的 構建。將全長HbGLU cDNA的1.2kb Smal — Hindll片段選 殖到質體PBI121的Sma I位點，位於CaMV 35S啓動子的 下游，形成質體PHEV43。通過在質體pBI121的Sma I位 點選殖全長BjCHII cDNA的1.3kb的Smal片段形成質體 59 95. 1265974

pBj47。CaM V35S 啓動子指導著 BjCHIl cDNA 在 pBjl7 中的表達。接著將來自pHEV43的2.04kb的被處理爲平頭 末端的Hindlll片段選殖到pBjl7的SnaBI位點。由於這 種平頭末端片段可以以兩種可能的方向插入，因此，得到 質體pBj47和pBj48,這兩個質體都單獨含有HbGLU cDNA 和BjCHIl cDNA。在pBj47中，幾丁質酶和葡聚糖酶cDNA 分別從CaM V 3 5S啓動子開始以不同方向進行轉錄，而在 pBj48中，這兩個DNA以相同的方向進行轉錄。RB是 T-DNA的右邊界，LB是T-DNA的左邊界；nptll是使卡那 黴素從Nos啓動子開始選擇性轉錄的新黴素磷酸轉移酶編 碼基因；35S pro表示CaMV 35S啓動子；GUS表示編碼 β-1，3-葡聚糖酶的不含啓動子的基因，Η表示Hindlll，E 表示EcoRI，S表示SnaBI。在質體pBj47和pBj48圖譜中 的HbGLU cDNA上的箭頭表示該cDNA從其5’到3’進行 轉錄的方向。附圖不按比例。

圖8顯示了茄屬絲核菌（R.s〇lani)感染後在芥菜中誘 導了 BjCHIl表達：（a)是在茄屬絲核菌感染的土壤中生 長〇天（第1道）、1天（第2道）、2天（第3道）、3天 (第4道）、4天（第5道）、5天（第6道）、6天（第7 道）、7天（第8道）、8天（第9道）、9天（第10道）後 收穫芥菜葉，用32P標記來自該葉的總RN A中BjCHIl cDNA，進行Northern印跡分析。在下面顯示的是與32p 標記的18S rDNA探針雜交的相同印記。箭頭表示i.3kb 的BjCHIl mRNA而箭頭表示18s rRNA ; ( b)是使用抗 60 1265974 95. U 一 …. .一 1 : ' :

BjCHIl抗體進行的Western印跡分析。在茄屬絲核菌感染 的土壤中生長0天（第1道）、1天（第2道）、2天（第3 道）、3天（第4道）、4天（第5道）、5天（第6道）、6 天（第7道）、7天（第8道）、8天（第9道）、9天（第 1 〇道）後收穫芥菜葉，收集來自該葉的總蛋白。交叉反應 的3 7kDa BjCHIl帶用箭頭表示。在該帶之上的弱勢帶可 能是前體蛋白（precusorprotein);(c) Coomassie 染色的 蛋白質凝膠，其上樣量與（b )相同，以證明每個孔中的蛋 白質含量是相等的。 圖9是對R〇轉基因馬鈴薯植株進行的Northern印跡分 析：A表示在未轉形的馬鈴薯（第1道）中和轉基因馬鈴 薯植株 pBj47-P1()(第 2 道）、pBj47-P8 (第 3 道）、pBj47-P7(第 4道）和pHEV-P14 (第5道）中，用32P標記的HbGLU cDNA 探針檢測到的1.2kb的雜交HbGLU mRNA的表達（用箭頭 表示）。B表示在未轉形的馬鈴薯（第1道）和轉基因馬鈴 薯植株 pBj47-P1()(第 2 道）、PBj47-P8(第 3 道）、pBj47-P7 (第 4道）和PBI121轉形的馬鈴薯（第5道）和PBjl7-P6 (第6 道）中，用32P標記的BjCHIl cDNA探針檢測到的l.3kb的 BjCHIl雜交mRNA的表達（用箭表示）。 圖10是對R〇轉基因馬鈴薯植株進行的Southern印跡 分析：A表示使用32P標記的HbGLU cDNA探針和EcoRI 消化的DNA，該EcoRI消化的DNA是來自未轉形的馬鈴 薯（第1道）、PBI121轉形的馬鈴薯（第2道）和轉基因 馬鈴薯植株pHEV43-P14 (第3道）、pBj47-P7 (第4道）、 61 1265974

PBj47-P8 (第 5 道）和 pBj47-P1G (第 6 道）。箭頭表示 1.2kb 的EcoRI雜交帶；B表示用32P標記的BjCHIl cDNA探針 和Hindlll消化的DNA，該Hindlll消化的DNA是來自未 轉形的馬鈴薯（第1道）、pBIl 21轉形馬鈴薯（第2道） 和轉基因馬鈴薯植株pBj47-P7(第3道）、pBj47-P8(第4 道）、pBj47-P1()(第 5 道）和 pBjl7-P6(第 6 道）。箭表示 0.9kb 的Hindlll雜交帶；c表示用32P標記的BjCHIl cDNA探針 和EcoRI消化的DNA，所述EcoRI消化的DNA是來自未 轉形的馬鈴薯（第1道）、pBIl 21轉形馬鈴薯（第2道） 和轉基因馬鈴薯植株pBj47-P1G (第3道）、pBj47-P8 (第4 道）、pBj47-P7 (第 5 道）。 圖11表不是對Rg轉基因馬鈴薯植株進行的Western 印跡分析：A表示使用抗HbGLU抗體對來自轉基因馬鈴薯 植株 pBj47-P7 (第 1 道）、pBj47-P8(第 2 道）、pBj47-P1()(第 3道）、pHEV43· P14 (第4道）、pBI 121轉形馬鈴薯（第5 道）和未轉形的馬鈴薯（第6道）的粗提蛋白進行Western 印跡分析。與HbGLU ( 35kDa)相應的帶用箭頭標出；B 表示使用抗BjCHIl抗體對來自轉基因馬鈴薯植株 PBj47-P7 (第 1 道）、pBj47_P8(第 2 道）、PBj47-P1G(第 3 道）、 PHEV43- P14 (第4道）、PBI121轉形馬鈴薯（第5道）、未 轉形的馬鈴薯（第6道）和轉基因馬鈴薯植株pBj17_P6 (第 7道）的粗提蛋白進行Western印跡分析。與BjCHIl( 52kDa ) 相應的帶用箭標出。 圖1 2顯示了對轉基因馬鈴薯植株進行的葡聚糖酶和幾 1265974

丁質酶分析。A是用來自PBI121-轉形植株和pBj47轉形的 轉基因R〇植株的粗提蛋白在光密度爲5OOnm的條件下進 行的葡聚糖酶檢測；B是用來自PBI121-轉形體和pBj47 轉形的轉基因R〇植株的粗提蛋白在光密度爲5〇〇nm的條 件下進行的幾丁質酶檢測。誤差條形圖代表了這三個獨立 試驗的標準偏差。 圖13是利用綠色木黴（T.viride)進行的體外菌絲抑 制分析。A是向各孔中加入50μ§來自各馬鈴薯植株的蛋白 質後，16小時真菌的生長情況。孔1 :共表達BjCHIl和 HbGLU的轉基因馬鈴薯植株pBj47_P10 ;孑L 2 :僅僅有緩衝 液的對照；孔3 :野生型馬鈴薯植株；孔4 :馬鈴薯pBI121 轉形植株；孔5:表達BjCHIl的轉基因馬鈴薯植株pBjl7-P6 和孔6 :表達HbGLU的轉基因馬鈴薯植株ρΗΕ43-Ρ14 ; B 是在加入50μ§蛋白質抽提物24h後，圖13Α中所示的滴 定板中真菌的生長情況。左下方的條形圖表示〇.9cm。 圖14表示用茄屬絲核菌在體外進行的真菌生物試驗° 將馬鈴薯植株轉移到預先接種茄屬絲核菌的土壤中，移植 兩個星期後對植株進行測定並照相。A是共表達BjCHIl 和HbGLU的轉基因馬鈴薯植株PBj47-P1G; B表達BjCHIl 的轉基因馬鈴薯植株pBj47-P6; C是表達HbGLU的轉基因 馬鈴薯植株pBj47-P14; D是未轉形馬鈴薯。 1265974 序列表 <110>蔡美蓮 麵軍 <12()>對真菌性疾病抗性提高的基因修飾植物及其製備方法 <130> 9661-025-999 <140> TW91133086 <141> 2002-11-11 <150〉 60/331,749 <151〉 2001-11-20 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 1297 <212> DNA <213>芥菜 <220> <223〉芥菜幾丁質酶（BjCHIl) <400> 1 aacatgaaga cttatctcct tctccttctc atcttctcac ttctcttatc attttcctcc 60 ggtgagcaat gcggtagtca atccataccc gagggagcac tctgccccaa cggtctatgc 120 tgcagcgagg ctggatggtg cggcaccacc gaagcttact gcgggcatgg ttgtcaaagc 180 cagtgcaatc ctggtcccta tcctcctcct ccaaccccgc agtgtggtcg, tcaatccata 240 cccgcgggag ccctctgccc caacggtcta tgctgtagcg aggctggatg gtgcggcacc 300 accgaagctt actgcgggca tggttgccaa agccagtgca ctcccattcc cactcctcct 360 gctcccactc ccactcctcc tactcccact cctcctagtc ctacccctcc tggtcccact 420 cctcctggtc ccagcgggga tctttctggc atcatttcaa gagatcagtt ctataaaatg 480 cttaagcaca tgaacgacaa tgattgtcat gctgttggtt tcttcactta cgacgccttc 540 atcaccgccg ctaagtcttt cccaagtttc gggaacacqg gagaccttgc catgaggaag 600 aaggagatag cagccttctt cggccagact tcccacgaaa ccaccggtgg gtggtcgggt 660 gcacccgatg gagcaaatac atggggctac tgttacaagg aagaaattga caaaagcgat 720 ccccactgtg atagcaacaa cctcgagtgg ccatgcgcac caggcaaatt ttactacgga 780 cgaggaccaa tgatgctgtc ttggaactat aattacggac cgtgcgggag agacctagga 840 ctcgagttac tcaagaaccc agatgttgcg tccagcgacc cagtgatagc tttcaaaacc 900 gccatttggt tctggatgac tcctcaagct cctaaaccct cgtgccacga cgtgatcacc 960 gaccagtggg agccgtcggc tgccgacatt tctgccggaa ggttaccagg ttatggagtg 1020 attaccaata tcatcaacgg tggattagag tgtgctggtc gcgacgtcgc aaaggtccaa 1080 gatcggatat cgttttatac aaggtactgt ggcatgtttg gtgttgatcc tggaagtaat 1140 attgactgtg acaatcaaag gccgtttaat gaaggtagta acgttttctt ggatgctgca 1200 atttaataag tactgttaat gaagctttgt tgtatccaag caataagaga gtatcaaatt 1260 aaattaaata aaactccttt ttattaagta aaaaaaa 1297

<210〉 2 <211> 400 <212> PRT <213〉芥菜 <220> <223>推導的芥菜i幾丁質酶（BjCHIl)的胺基酸序列 1265974 <400> 2

Met Lys Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu lie Phe Ser Leu Leu Leu Ser 15 10 15

Phe Ser Ser Gly Glu Gin Cys Gly Ser Gin Ser lie Pro Glu Gly Ala 20 25 30

Leu Cys Pro Asn Gly Leu Cys Cys Ser Glu Ala Gly Trp Cys Gly Thr 35 40 45

Thr Glu Ala Tyr Cys Gly His Gly Cys Gin Ser Gin Cys Asn Pro Gly 50 55 60

Pro Tyr Pro Pro Pro Pro Thr Pro Gin Cys Gly Arg Gin Ser lie Pro 65 70 75 80

Ala Gly Ala Leu Cys Pro Asn Gly Leu Cys Cys Ser Glu Ala Gly Trp 85 90 95

Cys Gly Thr Thr Glu Ala Tyr Cys Gly His Gly Cys Gin Ser Gin Cys 100 105 110

Thr Pro lie Pro Thr Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro 115 120 125

Thr Pro Pro Ser Pro Thr Pro Pro Gly Pro Thr Pro Pro Gly Pro Ser 130 135 140

Gly Asp Leu Ser Gly lie lie Ser Arg Asp Gin Phe Tyr Lys Met Leu 145 150 155 160

Lys His Met Asn Asp Asn Asp Cys His Ala Val Gly Phe Phe Thr Tyr 165 170 175

Asp Ala Phe lie Thr Ala Ala Lys Ser Phe Pro Ser Phe Gly Asn Thr 180 185 190

Gly Asp Leu Ala Met Arg Lys Lys Glu lie Ala Ala Phe Phe Gly Gin 195 200 205

Thr Ser His Glu Thr Thr Gly Gly Trp Ser Gly Ala Pro Asp Gly Ala 210 215 220

Asn Thr Trp Gly Tyr Cys Tyr Lys Glu Glu lie Asp Lys Ser Asp Pro 225 230 235 240

His Cys Asp Ser Asn Asn Leu Glu Trp Pro Cys Ala Pro Gly Lys Phe 245 250 255

Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Met Met Leu Ser Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly 260 265 270

Pro Cys Gly Arg Asp Leu Gly Leu Glu Leu Leu Lys Asn Pro Asp Val 275 280 285

Ala Ser Ser Asp Pro Val lie Ala Phe Lys Thr Ala lie Trp Phe Trp 290 295 300

Met Thr Pro Gin Ala Pro Lys Pro Ser Cys His Asp Val He Thr Asp 305 310 315 320

Gin Trp Glu Pro Ser Ala Ala Asp lie Ser Ala Gly Arg Leu Pro Gly 325 330 335

Tyr Gly Val 工le Thr Asn lie lie Asn Gly Gly Leu Glu Cys Ala Gly 340 345 350

Arg Asp Val Ala Lys Val Gin Asp Arg lie Ser Phe Tyr Thr Arg Tyr 355 360 365

Cys Gly Met Phe Gly Val Asp Pro Gly Ser Asn lie Asp Cys Asp Asn 370 375 380

Gin Arg Pro Phe Asn Glu Gly Ser Asn Val Phe Leu Asp Ala Ala lie 385 390 395 400 <210> 3 <211〉 1242 <212> DNA <213> Hevea <220> <223〉Hevea 1,3-葡聚糖酶（HbGLU) <400> 3 -2- 1265974 aaattataag caactttctt ctaatttccc cccttcttaa tggctatctc ctcttcaact 60 tcaggaacta gtagttcctt cccctcaaga actactgtca tgcttcttct gtttttcttt 120 gcagcaagcg ttggtataac agatgcccag gtaggtgttt gctatggaat gcaaggcaac 180 aaccttccac ctgtttcaga ggtcatagct ctctataaaa aatctaacat cacgagaatg 240 agaatttatg atccaaatcg agcagtattg gaagccctta gaggctcaaa cattgaactc 300 atactaggtg ttccaaactc agatctccaa agccttacca atccttccaa tgcaaaatca 360 tgggtacaaa aaaatgttcg tggcttctgg tcaagtgtcc tgttcagata tatagcagtt 420 ggcaacgaaa ttagtcctgt caatagaggc acagcttggt tggctcaatt tgttttgcct 480 gccatgagaa atatacatga tgctataaga tcagctggtc ttcaagatca aatcaaggtc 540 tccactgcaa ttgacttgac cctggtagga aattcctacc ctccttctgc aggtgctttc 600 agggatgatg ttagatcata cttggaccca attattggat ttctatcctc tatcaggtca 660 cctttacttg ccaatattta tccttacttt acttatgctt ataatccaag ggatatttcc 720 cttccctatg ctttgttcac ttcaccatca gttgttgtgt gggatggtca gcgaggttat 780 aagaaccttt ttgatgcaac gttggatgca ttgtactctg ctcttgagag ggctagtggt 840 ggttctctgg aggtggttgt ttcggaaagt ggctggccgt ctgccggagc atttgctgcc 900 acatttgaca atgggcgtac ttatctctca aatttgatcc aacatgttaa aggaggtact 960 cctaagaggc ctaacagagc tatagagact tacttatttg ccatgtttga tgaaaataag 1020 aagcaaccag aggttgagaa acactttgga cttttctttc ctgataaacg gccaaaatat 1080 aatctcaatt ttggtgcaga aaagaactgg gatatttcta ctgaacacaa tgcaacaata 1140 cttttcctta agagtgatat gtgagattgt gagaatttaa gtactatata tatttccaat 1200 gtatgcatgt atccatgtat taaataagag aaccttttct ca 1242 <210〉 4 <211> 374 <212> PRT <213> Hevea <220〉 <223>推導的Hevea 1，3·葡聚糖酶的胺基酸序列（HbGLU) <400> 4

Met Ala lie Ser Ser Ser Thr Ser Gly Thr Ser Ser Ser Phe Pro Ser 15 10 15

Arg Thr Thr Val Met Leu Leu Leu Phe Phe Phe Ala Ala Ser Val Gly 20 25 30 lie Thr Asp Ala Gin Val Gly Val Cys Tyr Gly Met Gin Gly Asn Asn 35 40 45

Leu Pro Pro Val Ser Glu Val lie Ala Leu Tyr Lys Lys Ser Asn lie 50 55 60

Thr Arg Met Arg lie Tyr Asp Pro Asn Arg Ala Val Leu Glu Ala Leu 65 70 75 80

Arg Gly Ser Asn lie Glu Leu lie Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu 85 90 95

Gin Ser Leu Thr Asn Pro Ser Asn Ala Lys Ser Trp Val Gin Lys Asn 100 105 110

Val Arg Gly Phe Trp Ser Ser Val Leu Phe Arg Tyr lie Ala Val Gly 115 120 125

Asn Glu lie Ser Pro Val Asn Arg Gly Thr Ala Trp Leu Ala Gin Phe 130 135 140

Val Leu Pro Ala Met Arg Asn lie His Asp Ala lie Arg Ser Ala Gly 145 150 155 160

Leu Gin Asp Gin lie Lys Val Ser Thr Ala lie Asp Leu Thr Leu Val 165 170 175

Gly Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Asp Asp Val Arg 180 185 190

Ser Tyr Leu Asp Pro lie lie Gly Phe Leu Ser Ser lie Arg Ser Pro 195 200 205

Leu Leu Ala Asn lie Tyr Pro Tyr Phe Thr Tyr Ala Tyr Asn Pro Arg 210 215 220

Asp lie Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ser Pro Ser Val Val Val 225 230 235 240

Trp Asp Gly Gin Arg Gly Tyr Lys Asn Leu Phe Asp Ala Thr Leu Asp -3- 1265974 年月 ❿轉換頁i

Glu Arg Trp Pro 280 Tyr Leu 295 Pro Asn Lys Lys Lys Arg He Ser 360

Ala Leu

Val Val

Phe Asp 290 Gly Gly 305

Ala Met

Gly Leu

Ala Glu

Phe Leu 370

Tyr Ser 260 Ser Glu 275

Asn Gly

Thr Pro

Phe Asp

Phe Phe 340 Lys Asn 355

Lys Ser 245

Ala Leu

Ser Gly

Arg Thr

Lys Arg 310 Glu Asn 325

Pro Asp Trp Asp Asp Met 250 Ala Ser 265

Ser Ala

Ser Asn

Arg Ala

Gin Pro 330 Pro Lys 345

Thr Glu —〜一一 一 ^;一. 255 Gly Gly Ser Leu Glu Val 270 Gly Ala Phe Ala Ala Thr 285 Leu lie Gin His Val Lys 300 lie Glu Thr Tyr Leu Phe 315 320 Glu Val Glu Lys His Phe 335 Tyr Asn Leu Asn Phe Gly 350 His Asn Ala Thr lie Leu 365 <210> 5 <211> 27 <212> DNA<213>人工的 <220〉<223〉人工序列的描述：Cl(正向)引子 <400> 5 ctgaattctc ctccggtgag caatgcg <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213〉人工的<220> t <223>人工序列的描述：C21(正向)引子 <400> 6 ctgaattcgg ggatctttct ggcatc 27 26 <210> 7 <211〉 34 <212> DNA<213>人工的 <220><223>人工序列的描述：C2(反向)引子 <400〉 7 gcgactgcgg ccgcgttact accttcatta aacg 34 •4- 1265974 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400〉 8 ggtggatggg ctacagcacc agac <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400〉 9 gccacgtcca cactccaa <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>人工序列的描述：P1(正向)引子 <400〉 10 cctccggtga gcaatgcg <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>人工序列的描述：P2(反向)引子 <400〉 11 ttagcggcgg tgatgaagg <210> 12 1265974

<211〉 19 I 《糾.，冰n v，.ViU 一 ^ <212> DNA <213>人工的 <220> <223>人工序列的描述：Ρ3(正向)引子 <400〉 12 tcctccaacc ccgcagtgt <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213>人工的 <220〉 <223>人工序列的描述：P4(反向)引子 <400〉 13 ccactcgagg ttgttgc

Claims (1)

1265974

年

月

拾、申請專利範圍 1、 一種重組載體，其包括：（a) SEQ ID NO: 1的核 苷酸序列或編碼SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的核苷酸序 列；和（b) SEQ ID NO: 3的核苷酸序列或編碼SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的核苷酸序列。 2、 一種重組載體，其包括：（a)編碼含有二至五個 幾丁質結合區的幾丁質酶的第一核苷酸序列；和（b)第二核 苷酸序列，其爲SEQ ID N0:3或可編碼出SEQ ID NO : 4 之胺基酸序列之核苷酸序列。 3、 如申請專利範圍第1或2項的重組載體，還包括 與第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可操作連接的一個或 多個調控核酸。 4、 如申請專利範圍第3項的重組載體，其中的調控 核酸是花椰菜花葉病毒的35S啓動子。 5、 一種重組細胞，其含有如申請專利範圍第1或2 項的重組載體。 6、 一種重組細胞，其含有如申請專利範圍第3項的 重組載體。 7、 如申請專利範圍第5項的重組細胞，該細胞是植 物細胞。 8、 如申請專利範圍第6項的重組細胞，該細胞是植 物細胞。 9、 如申請專利範圍第7項的重組細胞，其中的植物 1265974 細胞係衍生自選自：小麥、玉米、稻、大麥、番茄、蘋果、 梨、草莓、胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山藥、萵苣和菠菜所 組成群之植物。 1〇、 如申請專利範圍第8項的重組細胞，其中的植物 細胞係衍生自選自：小麥、玉米、稻、大麥、番煎、蘋果、 梨、草莓、胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山藥、萵苣和菠菜所 組成群之植物。 11、 如申請專利範圍第9項的重組細胞，其中該植物 細胞係得自馬鈴薯（Solanum tuberosum )。 12、 如申請專利範圍第1〇項的重組細胞，其中該植 物細胞係得自馬鈴薯。 13、 一種重組細胞，包括：（a)含有編碼幾丁質酶的 第一核苷酸序列的第一重組載體，其中的幾丁質酶含二至 五個的幾丁質結合區；和（b)第二重組載體，其包括爲 SEQ ID NO : 3或可編碼出SEQ ID NO : 4之胺基酸序列之 核苷酸序列的第二核苷酸序列。 14、 一種重組細胞，包括：（a)含有SEQ ID NO : 1 之第一核苷酸序列的第一重組載體；和（b)含有SEQ ID N0: 3之第二核苷酸序列的第二重組載體。 1 5 ' ~種製備對真菌病原體具有抗性的轉形植株的 方法’包括：（a)將植物以重組載體轉形，該重組載體包 括：⑴SEQ ID N〇: 1之第一核苷酸序列；和（H) SEQ ID NO : 3之第二核苷酸序列；和（b )選擇可表達第一和第 二核苷酸序列的轉形植株。 65 1265974 16、 一種製備對真菌病原體具有抗性的轉形植株的 方法，包括··（ a )將植物以第一重組載體轉形，該第一重 組載體包括SEQ ID NO·· 1之第一核苷酸序列；（b)將植物 以第二重組載體轉形，該第二重組載體包括SEQ ID NO: 3 之第二核苷酸序列；和（c )選擇可表達第一和第二核苷酸 序列的轉形植株。 17、 如申請專利範圍第1 5或1 6項的方法，其中的真 菌是節屬絲核菌（R. solani )。 1265974 年 σ\Γ ulcfzdul^oadlcoomcfuafMo^ 的，ίΜΊΊΊ03.ίΙΊΊΊΊΊλζ}ίχ 个s 个fool Ilipujif SL J5*gloillv!)llollo«lcfJ; J<fifJ>1<fvi)JAr 5 S Soil5 0xlol oirCVJ(tf4->riuu.<->ffl(tf04->tn0-p.6£II^Bl4JIJ5gID»ltnlooolDlTglgploll4JIOD:tlD0:p0-pfft.p::>00.p<7>5-p004->^(tf05-p.6B00£>(dB<T<04.>5.p.p6£>-pttf0£>.6£>0£>-p0rT<4->.p〇-6tdn5.600<T<00rt0t7>tnu£>.p6£>.p(Tt£>64->u£>6al£o£><d0.6.p 5ZT 111¾¾ 6ΙΠΊ: Λ·;ίΛ.ίαα¥<0ΗΗ^5·τσ£?iocfucfij; iuftniij; cf^cfJJ; <fj： <iJJ； cfJ； J<; οονοtr>n3al5£^5.prtoo£>.M-poonl£re5£oortun}^trvtr>£>o.p-p-p£>ff5atuoo-p:l^o.p£>jglrtflI.IJIo 叻 006oogpl*JIgol4JIl4JIpol£>0扣汸 ϋ(ϋ·ρ4->ϋ(τ1υ·ρ·ρο·ρ·ι->·μ£>·6·ρ4->£>^ϋ6·ρΕυ·ρ5-ρ·ρΒ£>-ρπ5^υπ<6υ坩H£>4J(tiu(do6njtt<4->.l->:> 62 334}ίίχί^νΊρο1ΖΌΑ(ηβ1,ίω:>ίν}ίί 6CZ 0rr8 H6£>B4Jou<Tj6rt5rt£>£>£>otn^6uo^tn£>o扣扣：ve(tf4Jtti4Jon<ttf汸 B-p.po.pfq.utp-pntE^gBOoBtntr.iTtBog^tnOB.port.p^.p-pEggubtr'-eougu^ob.pttfoullsJSUBlftflBOl.tJIoolgglolglgoLalg.p^f^tp.ponjooou SLZ ΟΊα}ίουάολ2;λζιήΒ:Ίχ^山οβολ λ,ί^ο^νυβ^^ωΊζ ΛΓ5 auifd· 6σ>ε vvplhAfzcooM^,idpiozCJuGI^SOaiaAo^^oux}Ilx.ssI}Ia OOCSIIrtoBJJu^^itJtnf^-Map^+J.pfiortnJ+JtT'rtyf^rtinif^^ai+.'p^^oof^ai'Bnjo^iTjnJoflJfi+Jtn^onJ&'^^rt^njrt+JtJ'niaifitr.^oo^nJfr^-pf^o'tn+Jy-pf^rtutnfi-pcn.portptJ'tr.airtoni^nJyw+Jpa'oynJprttr-iopnJb 096 υοπίυ·ρ(ΰ£>4->6υ<«^ϋ«1ϋϋ£>4-)^υ^υυυ<ΰ<τί<τ}4->υυβυ£>Λ12υ·ρυυ^υ<τί£>^πϊ£>£>4^υ^+ίζη6^^4-><τίυυ£>υυπίπίηίπίϋ·ρ^·ρυ£>(τ1^(ϋ6-ρ£ι01υϋυΒ£>υ5<τ1υυρ£>ϋβ4^·ρ£>·ρΗ£>Βυυυ<τ1πί£>αίΒυ-ρυπί^-ρ5Β5ϋ^υ Z.6CSII OOP nirt(TJ<tJrt<TlniflJ+J£>nJnJ-»J4J<TJ-p4J-p+J+Joo+Jo(T]^^7^e:v^rtBCTi4J:l.nicdrto4JnJ-p&»rt^rt6rt(TJ4Jrtnl35nJrt〇o-pni4->D-'4->4->£>:^+J+Jotr>nJ(TJtT*4.'ainJ+J+J£>4Jofti4-»£>nini4-'rtrt4J+.'4-)付11 Ipcsrir VIB 1265974 iη6ε pqib

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§ 6C 1265974 陸、（一）、本案指定代表圖爲：第1A 圖 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明: 柒、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 111^^