TWI257480B - Cellular micro-particle detection chip and manufacturing method thereof - Google Patents

Description

!257480 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種細胞微粒檢測晶片及其製造方法 斗寸別疋私一種可分類及計數細胞之細胞微粒檢測晶片及 其製造方法。 【先前技術】 、傳統之細胞計數器是利用大型幫浦將樣本流體流入一

樣品通道，並利用邊鞠流（sheath flow)使流體聚焦（ hydr〇dynamic focusing)之原理，將樣品流體聚焦成單一細 胞之寬度，一個個地依序送往測量區檢測。並使樣品流體 流經電極或光學等檢測單元進行計數，最後再使用高電場 來進行細胞的分類收集。但是傳統之細胞計數器之缺點在 於價格過於昂貴、體積龐大、無法方便攜帶且需要受過訓 練之專業人員才可操作等。 料，一般常見具有細胞計數功能之檢測晶片所檢測 的樣品流體必須做左右與上下的三維聚焦，左右的二維聚 焦在平面式的晶片上是非常容易查 易達成的，例如有平面微流 體、或利用流力來聚焦，或利用从 飞剜用外加電場或磁場來聚焦等 方式。但在三維聚焦時的Z轴之 十土 <方向如果要用上述的方法 來達成聚焦之功能，則具有一定的 的困難度。且利用製作電 極，或利用介電泳力、磁力等韶？ 寻超距力來做聚焦，皆有製程 困難與聚焦效果缓慢等問題發生。 此外在具有細胞計數功能之曰 十土 曰日片中’以光學檢測系統 來達到計數功能是最常被使用的古4 万式之一，但是往往只能 5 1257480 谓測單一種細胞，且樣本細胞除了必須利用兩旁的邊勒流 聚焦外，在上下亦需使用介電 1 % /水刀木進仃聚焦，否則會因 為檢測樣本不會每個完全經過光制區，產生細胞計數時 偵測到的粒子信號強度不均一的問題。 另外也有使用影像分析系統來做細胞的偵測方法，作 疋此種方法必須要使用昂責之光學顯微鏡以及電荷耗合元 件（Charge Coupled Device，CCD)。 最後’在細胞分類收集的方法中，最常見的技術是使 用磁力與電力來做分離’但是利用磁力來分離之細胞，必 須標定在磁珠微粒之上’且同一時間只能夠分離一種細胞 ’而電場則是需使用高電場來做細胞之分離，否則細胞分 離之速度會有太過於緩慢的缺點。 【發明内容】 因此’本發明之目的即在提供一種不需三維聚焦且可 多種樣本同時計數分類與收集，並達到微型化且低成本之 細胞微粒檢測晶片及其製造方法。 、於疋’本發明細胞微粒檢測晶片，適用於計數及分類 -樣品流體中之細胞，該細胞微粒檢測晶片包含：一透明 板狀基座、—中空地形成於該基座内的微管道單元，及一 設置於該微管道單元内之感測單元。 β亥微官道單元具有：—頭端連通至一形成於該基座表 ㈣μ之導人孔的樣品通道、二間隔排列 於该樣品通道之二側且末端與樣品通道末端連接以供水流 體肌動的限流通道、-頭端連通於該樣品通道與該等限流 6 1257480 通這之末端以匯流接引樣品流體及水流體的匯流通道、至 少一設置於該匯流通道一側並連通至該基座外的激光通道 ’及至少一没置於該檢測通道另一側且内端轴向對應於該 激光通道並連通至該基座外的感光通道。該等限流通道頭 端分別連通至二形成於基座表面以供水流體進入之進流孔 〇 該感測單兀具有至少一插置於該激光通道内的激光光 纖，及至少一插置於感光通道内之感光光纖，該激光光纖 Φ 傳送光源照射至匯流通道内。 該等限流通道中之水流體流至該匯流通道時形成二邊 鞠流，該二邊鞘流限制樣品流體之寬度至單一細胞可流通 之寬度，並流入匯流通道中，其中樣品流體中之細胞經該 激光光纖與感光光纖間，造成光源訊號變化並經由感光光 • 纖感測後傳遞訊號至基座外。 該細胞微粒檢測晶片的製作方法包含以下步驟： (A)以微顯影_的方式將—第—模板上微影餘刻出 微閥門、導入孔之凸模。 (B )於第一模板上微影韻刻出激光通道與感光通道 、導入孔之凸模。 (C) 於一第三模板上微影蝕刻出微管道單元之樣品通 道、限流通道與匯流通道及樣品分類單元之分類通道的凸模 σ (D) 於-第四模板之頂面蝕刻出複數收集槽之凸模。 (Ε)將該第一、二、三、四模板頂面分別灌印上高分 7 1257480 末且由n亥等限流通道32流入頸 成二邊鞠流，對於進入頸通道33之樣 之水一 厭，拟士、-* 银口口，爪體進行兩侧之擠 ^焦效應，此時適當地調整邊鞘流血樣。、、* 體之流速比可將樣品流體 jm抓 # ^ ^ . 石足度鈿減至數微米寬，也 就疋3亥_邊勒流可限制樣品流體2之寬 通過的寬度。此外，吁、A、3、， 早、屈胞 此外’该匯流通這34於製作時，匯流通道％ 之上下冰度製作為與光纖的導光層尺寸相同，、約丨㈣微

未’：與―細胞之高度相同，再藉由二邊翹流與匯流通道 34,之冰度限制’使樣本流體内之細胞—個接著—個依序於 匯流通道3 4内流動。 該感測單元4具有三分職置於料激光通道35内的 激光光纖41，及三分別插置於感光通道36内之感光光纖 .該等激光光纖41分別傳送紅、綠及藍色雷射光源照射 至匯流通道34内。本實施例中是將三激光光纖41與三感 光光纖42裝設於三激光通道35與三感光通道％内以傳送 一種不同波長之光波，貫際實施時可依據晶片檢測細胞種 類之數置，於製造時增減上述元件之數量，目此實施上不 以上述光纖之數量為限。 藉此，樣品流體中的細胞流入匯流通道34中並已聚焦 後，經该激光光纖41的光源照射，如果該樣品流體内之細 胞已被可激發出螢光之標定物染色，且該標定物可被其中 激光光纖41傳送之光源所激發，當該細胞通過相對應之 激光光纖41時，激發標定物之螢光，並被對應之感光光纖 42接收，且經由感光光纖42傳送至基座2外，外部儀器將 !257480 光纖傳迗之訊號處理成電子訊號，藉此以計數該細胞，該 訊號處理過程是一般常見之光纖通訊技術，非本發明之特 徵，在此不再多作說明。 此外’本實施例中是以不同光源激發不同染色之細胞 為例作說明’但實際實施時亦可以光源照射未經染色之細 胞’僅利用激光光纖41與感光光纖42間之光線被細胞遮 斷之訊唬來计數細胞數量，故其實施不以細胞是否染色為 限。 @ 3所7Γ疋以本i明細胞微粒檢測晶片偵測肺癌細胞 數里之貫驗’所緣出之偵測曲線圖。首先利用異硫氫酸鹽 螢光物（FITC)螢光標定肺癌細胞後，並輸送通過激發藍光之 激光光纖41前被激發出綠色螢光，而為感光光纖42感應 並傳送至基座2外，形成電子訊號計數，在圖3之曲線圖 當中，一個波峰即是代表感光光纖42接收到一個被激發出 之螢光訊號’利用此曲線圖就可以來判斷細胞的數目，另 外兩組感光光纖42之之摘測分析方法也相同，以下不再多 作說明。 此外，參閱圖4，該感測單元4是裝設於該微管道單元 3之激光通道35與感光通道36内，而匯流通道34之深度 較感光通道36與激光通道35淺，藉此以確保匯流通道34 完全於感測單元4之光源照射範圍内，以增加計數之精確 度。 參閱圖1、圖2及圖5，該樣品分類單元5具有複數頭 端共同連通該匯流通道34末端且分歧地往不同方向延伸之 10 1257480 分類通道51、複數分別連通於該 槽52、複數分別由基座2頂_、、刀 '貞通道51末端之收集 幻、複數分別設置於該分類通、^至㈣集槽52之輸出孔 由基座2表面分別連通=上之微閥門54,及複數 進氣孔55。 、^閥門54以供應控制氣體之 该寺㈣Η 54受料感光顧42 以調控氣體進出特定之進 一 虎“丨卜

關，當不同感光光镟42 : 此操控微闕門54開或 訊號至基座…成定之細胞時’立即傳送光 體停止進人㈣之進氣1: 子訊號可控制厂堅縮氣 ^ 以輸送樣本流體内之細胞至特 刀類通道51内，最後流人料之收集槽52内收集。、 而已被分類收集於收隹揭 出利用或再回收使用; 閥門54是一般常見 ^ ，級-之目的。该等微 ，以下不再就其構造多作說明 、 吊見之氣動溥膜微閥門54非本發明之特徵 月|J述基座2之材質可為玻璃、石夕晶片或高分子材料， 南分子材料係可為：壓克力、聚碳酸酯（pc)、聚苯乙婦（ ps)、、工程塑膠（ABS)、聚二w氧烧或其他聚合塑膠。 以下績針對本發明細胞微粒檢測晶片之製作方法加以 "兒明，其製作方法包含以下步驟： (A)參閱圖6，以微顯影蝕刻的方式將一第一模板 2〇1之頂面蝕刻出微閥門54構造、導入孔311、進流孔321 及輸出孔53之模型。 1257480 (B)芩閱圖7 ,於一第二模板2〇2上微影蝕刻出激光 通道35與感光通道％、導入孔311、進流孔321及輸出 53及之凸模。 、、…（C)參閱圖8，於一第三模板2〇3上微影韻刻出微管 兀3之樣品通道31、限流通道32與匯流通道34及樣 口口刀類早兀5之分類通道51的凸模，再以微影蝕刻的步驟 ，將匯流通道34 >几> > + ’孙 之凸拉之咼度向下層蝕刻使其較激光通 35與感光通道36之凸模的高度低。 (D)茶閱圖9 ’於_第四模板2⑽上微影餘刻出複數 收集槽5 2外型之凸模； 四模板201〜204頂面如圖1〇 Ε)將該第一 一 …，'八--▲一 V W叫％固 所示地分別灌印上高八 丨上阿刀子材料，固化脫模後，形成如 所示之四透明基板21〜24 ; ⑺將該等基板21〜24依序固定疊合形成該基座2, 即形成該細胞微粒檢測晶片。 利用上述之fy jρ、、上π " 法可以達成將整體系統微小化之目 的’且微影餘刻技術是一 I+蛉體業及微機電工業以技術 成元、之製私’以此技術製古 、， 卞」挺回生產良率，且可大量生 產1w，亚可以節省下研發 ^ 乂衣私的時間，降低成本。 綜上所述，本發明利 L 、直*、 用俽&道早元3之限流通道32產 生之邊勒流與匯流通道3 4 古 % iik ^,ί 'ώ 向又以聚焦樣品流體内之細胞 依序排列流動，並以朵武虛 7拍、目u ^ 感〜的方式偵測細胞數量，最後再 以偵測細胞之訊號控制微閥 右每 4 ’以達到細胞分類的目的 ，確貫可達到本發明之目的。 12 1257480 惟以上所述者，僅為本發 — 能以此限定本發明實施之範圍，即例而已，當不 範圍及發明說明内容所作之 ::明申清專利 „ , ]平的等效變化與修飾，敁加 屬本發明專利涵蓋之範圍内。 7 【圖式簡單說明】 圖1是本發明細胞微粒檢測晶片 分解圖； 竿乂么男、施例的立體 圖2是該較佳實施例之俯視圖； 圖3是該較佳實施例檢測—樣品流體中已標定榮光物 之肺癌細胞的訊號圖； 、、，圖4是該較佳實施例之—匯流通道、—激光通道與一 感光通道的部分立體圖； 圖5是該較佳實施例之一樣品分類單元的俯視圖； ^圖6是本發明細胞微粒檢測晶片之製作方法的較佳實 施例的一第一模板的立體圖； 圖7是該較佳實施例的一第二模板的立體圖； 圖8是該較佳實施例的一第三模板的立體圖； 圖9是該較佳實施例的一第四模板的立體圖；及 八圖1〇是該較佳實施例的第-、二、三、四模板灌填高 分子材料的立體圖。 13 1257480 【主要元件符號說明】 2 基座 34 匯流通道 21 〜24 基板 35 激光通道 201 第一模板 36 感光通道 202 第二模板 4 感測單元 203 第三模板 41 激光光纖 204 第四相:板 42 感光光纖 3 微管道單元 5 樣品分類早元 31 樣品通道 51 分類通道 311 導入孔 52 收集槽 32 限流通道 53 輸出孔 321 進流子L 54 微閥門 33 頸通道 55 進氣孔 14

Claims (1)

1257480 十、申睛專利範圍： 1 · 一種細胞微粒檢測 、θ片，適用於檢測一樣品流體中之細 存在，該細胞微粒撿測晶片包含： 透明基座； 一微管道單元，由& , 平兀中空地形成於該基座内，具有： 樣叩通道，碩端連通至一形成於該基座表面 供所述樣品流體進入之導入孔；

一 卩〃IL通道’間隔排列於該樣品通道之二側， 員而刀別連通至二形成於基座纟面以I纟流體進入 、L孔且限流通道末端與樣品通道末端連接； 一匯流通道，頭端連通於該樣品通道與該等限 机通迢之末端以匯流接引樣品流體及水流體； 至少一激光通道，設置於該匯流通道一側並連 通至該基座外；及 至少一感光通道，設置於該檢測通道另一側且 # 内端軸向對應於該激光通道並連通至該基座外；及 .....感測單兀，具有至少一插置於該激光通道内的激 光光纖，及至少一插置於感光通道内之感光光纖，該激 光光纖傳送光源照射至匯流通道内； 該等限流通道中之水流體流至該匯流通道時形成二 邊鞠流，該二邊鞠流限制流入匯流通道中之樣品流體的 寬度至單一細胞可流通之寬度，其中樣品流體中之細胞 經该激光光纖與感光光纖間，造成光源訊號變化並經由 感光光纖感測後傳遞訊號至基座外。 15 1257480

接於該匯流通道之頭端。

片，其 :您細胞微粒檢測晶片，其 上下高度僅樣品流體内含 中该被管道單元之激光通道及感光通道之數量是複數， 且4感测單元之激光光纖及感光光纖的數量分別與激光 通道及感光通道相對應，該等激光光纖是輸送不同波長 之光源以檢測樣品流體中不同螢光標記之細胞。 5 ·依據申印專利範圍第4項所述之細胞微粒檢測晶片，更 包含一樣品分類單元，其具有複數頭端共同連通該匯流 通這末端之分類通道，及複數分別設置於該分類通道上 之彳政閥門’該等感光光纖之輸出訊號分別用於控制該等 微閥門開關，藉此，不同感光光纖感測到不同之細胞時 ，可控制對應之微閥門開啟，以輸送至特定之分類通道 6.依據申請專利範圍第5項所述之細胞微粒檢測晶片，其 中’该樣品分類單元更具有複數分別與該等分類通道末 端連通，以分類收集樣品流體内含細胞的收集槽。 7·依據申請專利範圍第6項所述之細胞微粒檢測晶片，其 中’该樣品分類單元更具有複數分別由基座頂面連通至 16 1257480 該收集槽之輪出孔。 依據申請專利範圍第 ψ _ , 昂1項所述之細胞微粒檢測晶片，並 通道小。 匸級通道的高度較該激光通道與感光 9. :種專利範圍第7項所述之細胞微粒檢測晶片的製造方 法，並包含以下步驟： 方 心（A)以微顯㈣刻的方式將—第—模板上微影钱 刻出微閥門、導入孔之凸模； 、 ）；苐一模板上微影姓刻出激光通道與感光 通道、導入孔之凸模； 一心 (C )於第二模板上微影蝕刻出微管道單元之樣 品通道、限流通道與匯流通道及樣品分類單元之分類通 道的凸模； (D)於一第四模板之頂面蝕刻出複數收集槽之 模； (E )將該第一、二、三、四模板頂面分別灌印上 高分子材料，固化脫模後，形成四透明基板； (F)將該等基板依序固定疊合成該基座，就形成該 細胞微粒檢测晶片。 10.依據申請專利範圍第9填所述之細胞微粒檢測晶片的製 造方法，其中，於步驟（A)及（B)中於該第一及第二 模板上形成進流孔及輸出孔之凸模。 11·依據申請專利範圍第9項所述之細胞微粒檢測晶片的製 造方法’其中’步驟（C )後再以微影餘刻的方式，使 17 1257480 用光刻微影之技術將匯流通道之凸模的高度向下層蝕， 使其較激光通道與感光通道之凸模 Μ據巾料侧第9㈣μΓΓ偷之細胞 U粒榀測晶片的製造方法，其中，步驟（Ε )中之高分 子材料是選自聚二甲矽氧烷、壓克力、聚碳酸酯、聚苯 乙烯工私塑膠及聚二甲矽氧烷所組成之群體。

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