TWI235180B

TWI235180B - A process for parallel, transposon mediated sequencing of DNA

Info

Publication number: TWI235180B
Application number: TW090116787A
Authority: TW
Inventors: Paul R August; Pamela J Keagle; Henry Long; Anna Wiencis; Katherine Call
Original assignee: Aventis Pharma Inc
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-06
Publication date: 2005-07-01
Also published as: US7229798B2; NZ523507A; AU7318501A; US20030219779A1; JP2004502467A; NO20026206D0; ATE361994T1; WO2002004674A3; EP1327000A2; CA2415786C; AR029582A1; BR0112261A; NO20026206L; KR20030021244A; DE60128379T2; IL153797A0; MXPA03000038A; NO329791B1; JP4807921B2; ZA200300035B

Description

1235180 A7 B7 五、發明說明（1 ) 發明之領域本發明為有關插入載体中之DNA片段經轉位子媒介多重定序的自動方法。特別指能提昇該自動方法之效率而言，其提昇之效率藉由在定序插入轉位子於載体序列之建構体前的篩選而取得。其可避免時間以及進行定序載体而非所欲DNA片段之反應之資源的浪費。發明之眢景近10年内自基因组及表現序列標幟(EST)定序所取得之龐大的豊富訊息在選殖全長cDNA之努力上已有相當大的貢獻。雖然可預期從人類和小白鼠之基因组定序計劃可於近期内完成’但是這些物種之轉錄体(transcriptome)有時仍存在未解之謎。複雜性涉及完全確實之預測，從基因組序列進行之mRNAs接合計劃已迫使另外之研究聚焦在取得全長cDNAs序列上。此外，應用有關增殖cdnAs的方法於選殖之後的cDNAs序列確認亦需要在全長cDNAs定序上做進一步之努力。此過程特別盛行於致力開發葯物而專注在確認標的基因之基因組中心。很明顯地，在投入鉅額的經費和人力之後，並不值得祗因為標的基因編碼序列的錯誤而在確認過程中造成臆測標的之失敗。因此，基因組中心必需能迅速、低成本和準確地定序大量之全長選殖体。為了達成此目標，因此申請人創造一種新穎、完整之高效率方法稱為轉位子加速之多重定序法(TEMS)。在過去20年中，發展出許多定序質体(plasmids)之大 -3· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------tr---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235180 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（插入物的方法。然而，這些方法中許多係麻煩的，並且無法將其轉為高效、自動化系統。藉引子步進（primer walking)的定序方法速度緩慢而且昂貴，並且由於設計做為定序之引子缺乏特徵性的區域因此經常導致失敗的結果。同樣的’從選殖之標的尾端藉外切酶(exonuc〖ease)2 酵解來收集選殖体之定序方法的速度緩慢，選殖体之特異性以及對DNA模板的純度和完整性非常敏感。此外，用此方法的成功率差異非常之大。選殖体之散彈搶式定序 (shotgun sequencing)是一種生產量較高的方法，然而，其需要從各別選殖体中分離出插入物然後再選殖由各種不同方法所產生之較小片段。此外，利用限制酵解之散彈搶基因庫(shotgun libraries)會導致選殖上的偏差(ci〇njng bias)以及後續DNA序列資料的非隨機分佈。轉位子媒介之定序方法可藉匯集大量含標的DNA序列的載体和隨機地將定序引子與轉位子插入該構体各端而完成。請看以下資料有關此方法之描述Devine，s E， Boeke，J· Ε·(1994)生体外有效整合人工轉位子進入標的質体·一種DNA定位、定序和基因組分析之有效工具核酸研究期刊，第3765〜3772頁；或Kimmel，B，M j

Palazzola，C· Martin，J· D· Boeke，和 S.E· Devine，1997,轉位子媒介之DNA定序。於基因组之分析··實驗手冊(E伽抓， Β· Birren，R· Myers，和p扭咖編輯），冷泉港實驗室出版，冷泉港實驗m傳統上，由於在選殖和轉位子插入的階段必需移動質体經過不同的宿主株，故此方法係 -4· ^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G x 297公楚- ------------氮--------fiii (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235180 Α7 Β7 五、發明說明（3) 麻須的。然而最近’許多商業分子生物廠商已發展出生体外的轉位系統(transposition systems)以利用修飾轉位子（即 Tn5等)之隨機插入。不幸的是，這些系統中有些會導致很高的假陽性比例，並且不易使用藉聚合酶鏈反應(“pCR，，)篩檢出陽性選殖体之方法c申請人利用數個以此類轉位子為基礎之定序方法’結果其得自新英格蘭生物實驗室之生体外GPS-1轉位系統之修飾版並未遇到任何上述之困難。然而’轉位子之插入無法以排外之方式被引導之標的DNA, 並且以高頻率出現於載体内Q在努力解決此種困難和增加轉位子助益之定序之效率下，申請人發展出一種獨特、高生產力的方法稱為轉位子加速之定序法(TEMS)。因此，本發明之目的係為提供一種高生產力、高效率和低成本的方法來定序DNA之片段。本發明進一步之目的係為提供一種高生產力、高效率和低成本的方法以轉位子媒介來定序標的DNA之片段，其可減少非標的DNA序列的產生量。本發明之另外目的係為提供一種PCR為基礎之篩選方法來區分含插入標的DNA序列之所欲構体和含插入他處之轉位子的非所欲構体。發明之棒诫本發明藉提供下列之方法來符合上述之目的，其可被自動化以逹到方便使用之目的。匯集各選殖進入一載体之多重DNA標的序列，並且在各端隨機插入可選擇之轉位 (請先eatt背面之漆意事項再填寫本 ·丨丨丨丨丨丨丨ir--— — — — — — . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 •5- 1235180 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4 ) 子及定序引子於含DNA標的之載体。被選擇之含轉位子及DNA標的序列之載体再利用聚合酶鏈反應(pCR)進行個別篩檢來辨認那些有轉位子位於DNA標的序列之内的載体。此PCR反應利用位於載体序列各端之引子，並且經最適化以提供PCR聚合酶足以有效產生載体長度之產物的延伸時間，但提供PCR聚合酶不足以有效產生載体加上該轉位子長度之產物的延伸時間。因此，祗有内含轉位子於 DNA標的序列之載体才能產生足量的pCR產物，而非載体。每一次的PCR反應是否有足夠量的PCR產物可利用選擇做為雙股DNA(“dsDNA”)之定量螢光染料將其迅速測定。在前篩選中藉顯著之PCR產物鏗別出之載体再利用在轉位子各端之定序引子個別篩檢以讀出各別DNA標的序列。此個別定序反應之初步DNA標的序列可被結合以測定基因庫中各別DNA標的之全長序列。此選殖体之並行處理使速度大為增加，其中反應可被設定和定序。此外，此方法並不依賴任何特定之載体，並且不需要任何再選殖之步驟。整体效率中最重要的是，在篩檢步驟中載体主幹之定序被減至最小或被消除。可以利用自動DNA定序技藝中人士可獲得之設備輕易地完成此方法各個步驟之自動化。圖不之簡革說明圖1 TEMS各步驟之圖示。圖2為GPS-Apra轉位子載体之序列。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 1235180 __B7________ 五、發明說明（5 ) ^ 圖3為GPS-Apra-2m-URA3轉位子載体之序列。圖4為利用各種聚合酶增殖含轉位子和標的DNA之載体的載体部份的PCR反應產物之電泳凝膠染色圖。圖5為PCR反應產物有太長延伸反應時間而除去約9 千鹽基對(kb)之產物的電泳凝膠染色圖。圖6為PCR反應產物於各種延伸反應溫度而有不同數目的循環之電泳凝膠染色圖。圖7為PCR反應產物之電泳凝膠染色圖以及 PICOGREEN②經由相同之PCR反應所得之結果。定義本文t之： “載体’’為細胞内複製之任何DNA構体，並且具有可插入未知DNA序列之插入部位。有關一載体或轉位子之”可選擇”意指該載体或轉位子攜帶一表現型，其可被用來鑑別出以該載体或轉位子轉形之細胞。較佳，此表現型使轉形細胞可在未轉形之細胞無法存活之情況下存活。 “標的DNA”或”標的DNA序列，，為一已知或未知DNA 分子序列，其被本方法之操作者所欲定序。 “個別轉形体之代表數量，，為個別轉形体之最低數量，其確保對於基因庫中之各別標的DNA存在有足夠數量之含插入轉位子於標的DNA的轉形体，以提供標的DNA内各別基獨立定序測定之所欲數量。 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----------線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235180 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製五、發明說明（6 ) 有關PCR反應之實質數量的“dsDNA”為已超過預定閾值之dsDNA的數量。此預定閾值可用數個已知含轉位子於載体序列内或外之構体評估PCR反應内所發現PCR產物的變化來判定。較▲佳具体例之詳細說明本發明提供一方法，其可有效地自動化以供並行定序多重標的DNAs。此方法中，各別標的· DNA序列於該載体序列内之相同插入點被插入一可選擇載体，較佳為質体。重點是所有標的DNAs被插入相同之載体或，如果使用不同之載体，每個載体實質上具相同尺寸其在插入點附近具有相同之序列，故可利用一組引子藉PCR反應放大全部談載体。

含各別多重標的DNA序列之載体根據各別標的DNA 序列之長度以比例被匯集一起，故基因庫實質上含等量之各kb的標的DNA序列。基因庫内所含各別載体之比例可藉測定各別標的DNA序列之長度而被測定出來(例如，和私準尺寸標識比較其在一瓊脂糖上電泳的情形），在該載体内標的DNA序列每kb長度將一設定量之各別載体加入基因庫。於是在基因庫上開始進行轉位子-插入反應以隨機方式將可選擇轉位子插入含標的-DNA之載体。雖然此步驟可藉傳統的生体内轉位子插入方式來完成，但是在生体内，轉位子之插入需要移動質体經過一種以上之細胞類 -8- 本紙張尺度適用中國國€標準（CNSjA4規格⑽x 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %

五、發明說明（經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235180 型。生体外之轉位子插入反應較單純和快速。此轉位子必需攜帶-可選擇標識並且必需有足夠之尺寸以能夠建立 PCR條件而有效複製和雜姉尺权d_A片段，但不會複製和載体加上齡子細尺权dsDNA諸。此轉位子以約相等於歧於載体之長度為佳。此轉位子以約相等於或大於5M之載体長度最佳。轉位子㈣相等於或大於5/3之載体長度更佳。當此載体為一細菌質体時，此轉位子以至少約3 kb為佳，以至少約4 kb最佳，並且以大於或約等於5 kb更佳。來自轉位子-插入反應之載体基因庫於是被用來將細胞轉形，並且使轉形体生長於選自轉位子之條件。分離選擇之轉形体，並使其生長於肉汁培養基内。生長於肉汁培養基内之轉形体之分離數目視基因庫内標的DNA序列之數目和尺寸而定。足量之轉形体必需加以分離和培養，以確保能使齡紅娜体將包括足4之轉奸於特定標的 DNA序列個別之插入以提供標的dna彳列内之各別和每個鹽基之數倍的獨立序列測定。為了避免錯誤，熟諸此藝者，J：常尋求能涵蓋6倍之相資料，但是視情泥需要可能或有多）。當嘗試尋求涵蓋6倍之資料時，照例來說，每1 kb之核甚酸必需能正確定序出18個選殖体。然而，為了正確疋序18個選殖体，必需分離和繁殖較多量的轉形体’因為轉位子並不會每次都整合進入該標的 DNA，但是八會隨機插人整個含標的DNA之載体的任何部位。因此’此18之數目為轉位子插入標的dna序列内之大約之

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五、發明說明（8 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製倍數。所以，得到可涵蓋基因庫内各別標的dna序列之6 倍定序量時，可分離出之娜体相等於：標的DNA序列之吐長度乘以18，再乘以其比例(載体尺寸/DNA標的序列尺寸）。來自選擇轉形体之每一個培養物在其 DNA上進行 PCR反應。此pcr反應利用和插入點之載体序列3,末端互補的引子，其允許PCR增殖出和整個載体序列相同尺寸之片段。此PCR反應之反應條件適合有效產生一載体長度之片段，但是卻無法產生載体加上該轉位子長度之片段q根據本發明之用於任何特定載体和轉位子混合物的最適合 PCR條件能經由熟諳此藝者透過例行之試驗測定出來，其了參考下述此類之试驗如幻皿加丨，2”^1.1?&1&22〇1&，（1 Martin，J· D. Boeke，和 S· E· Devine，1997，最適化 PCR 測定’ PCR之改進方法，測定和定性pCR產物，測定和定性 PCR產物之計劃。基因組之分析：實驗手冊(由e Green，B. Birren，R. Myers，和R Hieter編輯），冷泉港實驗室出版，冷泉港’紐約；以及 Cha5 R. S·和 Thilly，W· G.(l"5)於：PCR 引子，Dieffenbach，C. W·和 Dveksler，G· S·(編輯），CSH 出版，紐約。雖然聚合酶之選擇可能使此反應更完美，但此方法中應用於PCR之特定DNA聚合酶不應受到限制。通常’ PCR之延伸溫度和/或時間經改變以達所欲載体加上轉位子尺寸之產物的排除。最適化條件之範例請看實例2。於是測定各別PCR反應之產物的產生量，以光學方式較佳。光學之測定可應用任何能夠區別dsDNA和核苷酸 -10- 本紙張W通用中國國家標準（CNS)A4規格⑵“挪公楚） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .蜃

I I I I I I I 訂·111 1 I I I I

123518〇 A7 B7 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製五、發明說明（9 ) ~的方法，但是以利用對dsDNA有特異性之螢光染料為佳。 dsDNA特異性染料包括雙-苯嘧啶染料Hoechst 33528和分子探測器之花青染料，Eugene有限公司，奥瑞岡，其包括 ΡΐαΧΜΕΝ@。pIC0GREEN@較受歡迎之原因為，其對 dsDNA較敏感且具選擇性。將測得之螢光值和預測之界閥值做比較以判定是否存在足夠量之dsDNA的pCR產物。考J用和單獨載体和載体加上轉位子尺寸之PCR模板的陽性和陰性對照組在用以篩選轉形体之相同pCR條件下的閥值含量。對應至不產生大量dsDNA之PCR反應的轉形体含有轉位子於㈣DNA序射而加以定序。各別轉形体分別進行兩種定序反應，利用引子從轉位子各端讀出圍繞轉位子附近之標的DNA序列的序列。此定序反應可藉本領域技術範圍内任何已知的方法來進行。、一旦定序資料從通過PCR篩選之所有轉形体收集完成，此序列必需被組合進入標的DNA序列基因庫内之全、另！元件内。此可應用本技術領域範圍内之電腦定序分析法來完成，並且本發明並未限制任何特定之方法。此方法之優點包括速度、效率和將過程自動化的能力。尤其是，本方法可提供一種快速PCR篩選法，其可除去因轉值子插入載体序列而在定序時勢必產生主要之載体序^的非職產生之轉形体。此PCR篩選法非常迅速，並 β動4匕彡不需將PCR產物進行任何之分離手續，例在遣知凝膠上跑來測定其尺寸。利用標的dna之基因 -11-

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) $ — — — — — — — 訂-----— I!線

1235180 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（10) 庫可允許單-轉位子的反應以及進行單—_形作用，不需要針對各別之標的DNA序列來進行。實铒兔例1_遷擇後复適合高-生產來自新英格蘭生物實驗室之原始之轉位子來自新英袼蘭生物實驗室，32 丁〇如路，比佛利州01915ΓΝΕΒ”)首先被用來證明轉位子隨機插入標的 DNA之基®㈣子，為能城大的準確度定序全部標的的有效方法。此套組供應兩種轉位子之一，含康黴素抗性基因。然而，康徽素為相當普遍之抗性標記，並且如果—找的麵序列已被選疫進入一康黴素_可選擇之載体^ 必需使用-不同之轉位子或是再選殖該標的dna序列。此套組提供另一種含氨黴素抗性標記之轉位子，但是，其亦相當普遍。因此，此轉位子必需加以修倚使其含一較不普遍之抗雜記，例如安鎌素(apfamydn)，以避免額外之選殖步驟並且減低在為各別標的DNA選擇正確的轉位子時發生人為的錯誤。此GPS_Apra轉位子(圖2)藉由 NEB pGPSl轉位子而建構得。利用修飾轉位子GPS_Apra之篩選方法初步的試驗顯示一種篩選方法可從為轉位子選擇之轉形体確認那些在標的DNA序列内含轉位子而非载体之轉 •12- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4极_21() χ 297公爱）而 (請先閱磧背面之注意事項再填寫本頁〕 -------訂---------線

1235180 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（η) 形体。此原始之NEB pGPSl轉位子為2.614 kb，其各別末端之引子部位有〜1.7 kb以隨機方式插入該標的DNA。利用補体M13F和補体M13R引子藉pCR反應放大3 okb載体，在平板凝膠上可看到兩條明顯的PCR反應產物。由於載体為3·0 kb ’故3.0 kb之PCR反應產物表示轉位子必定在標的ONA序列内。4.7 kb之PCR反應產物表示一載体 (3.0 kb)含該轉位子（1·7 kb)。因此，凝膠上出現3〇 kb之 PCR反應產物可確認標的DNA序列内含轉位子之選殖体。為了說明如何鑑別插入物内含轉位子之選殖体，在轉位子反應之後從轉形作用選擇其聚落(colonies)，並將其接種至含兩種做為選擇用之抗生素，即安痢黴素和該質体抗生素’的肉汁培養基。隔夜培養該肉汁培養基，並在隔天藉kerplunking約1微升之培養液進入96孔平板内之pCR 雞尾酒來進行PCR反應。此PCR雞尾酒含來自pE公司， PE公司Main街，Norwalk，康乃狄克州〇6859，之 Amplitaq酵素和反應劑。此PCR反應在標準條件下[95^ 進行5分鐘，（95。(：進行30分鐘，54t進行1分鐘，72〇c 進行6分鐘，30次循環），72°C進行1分鐘，永久保持4 °C]。完成該循環之後(約2.5小時），利用50微升pCR反應之8微升在標準尺寸凝膠上完成凝膠電泳。來自無轉位子之載体序列的PCR產物和含轉位子之載体序列之間出現明顯可測得之尺寸差異。然而’為了維持此定序反應之高生產力，電泳必需在 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 ' ' ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - II ----訂--— — — — — — —

A7 1235180 B7 五、發明說明（12) 同時可處理數百種以上樣本之大型凝膠上進行。在這些大型凝膠上’自動系統很難重覆檢測3 kb和4·7 kb片段之間的差異。同時’凝膠電泳非常耗時，並且會干擾此高生產力方式的篩選效率。在尋找其它高生產力之方法中，螢光檢測dsDNA因較省時和具有可重覆性而被選用。其中特別以 PICOGREEN，^定法最方便。然而，以螢光檢測dsDNA# 法區分不同尺寸之片段，故必需改變pCR反應而使任pCR 產物之存在與否能指出轉位子在含標的DNA之載体内之位置。如果祗有標的DNA序列内有轉位子之選殖体產生 dsDNA PCR產物，則抵有所欲之選殖体會使此 PICOGREEN⑧dsDNA染料發出高量的螢光。載体内含轉位子之孔不會明顯將dsDNA產物放大，因此祗發出低量的螢光。可利用已知之樣本來區分所欲和非所欲選殖体之間所散發出螢光量的分界點。藉降低延伸溫度來測試各種不同之PCR條件，但是在不增加假陽性的情況下，此4.7 kb帶必需不能經常有漏失之情形。於是決定，如果此轉位子能再經過修飾而增加其尺寸，則可發展出經常可漏失上端含轉位子之帶的pCR 條件，而因此可降低假陽性率。尋找一種對轉位子反應不會有負面影響之大型”填塞物(stuffer)，，基因。一種含URA3 基因之酵母2微米質体符合此尺寸之標準，並且在將來亦可被用於酵母試驗中❶因此，構建一種總尺寸為61 kb含〜5 0 kb轉位子之GPS-Apra-2um-URA3轉位子質体(圖3)。 -14- 職格⑵。X a--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（u) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PCR條件被成功地改變以敎載軸含轉好之選殖体，並且不會影響其移位反應。請看實例2。陰牲和假陽怪盖果之PCR鉻件^^ 基本的PCR概念此篩選為建立在PCR循環狀態，其特別適合放大整個載体DNA之3.9 kbp片段。在此情況下，此載体為來自 Invitrogen 公司 ’ 1_ Faraday 街，Carlsbad，加州 92_ 之 PCR4Blum-T0P0。如果此載体有5 kbp轉位子插入其中，其尺寸將增加至8.9 kbp，在此最適化之PCR條件下其已太大而無法被放大。被選擇做為放大選殖体之載体部份的引子序列為全方位引子M13F(-20)和M13R。其為如下述之序列：5，_ ACTGGCCGTCGTTTTAC-3,和 5，_CATGGTCATAGCTGTT- 3’。此放大作用說明於圖i。發展384·孔格式的背景為了從含多重選殖体之基因庫篩選轉位子反應，必需發展一套迅速又省成本之篩選方法。最初嘗試的發展為根據96-孔之計劃。改變使用384_孔平板之後，所有反應劑的容積必需減半以適應較小孔之容量。然而，由於觀察之後發現有很多PCR失敗之例子，因此證明此方法較不理想。因此進行研究最適合此格式之PCR反應劑和條件。下節將會說明廣泛測試酵素和熱循環條件之試驗結果。 -15· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — « — — — — — — I —

1235180 A7 ___ B7 _ 五、發明說明（14) 384•孔PCR之最適當方法聚合酶之選擇經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

快速篩選來自許多廠商之各種PCR套組，測定以 384-孔代替被使用於96-孔格式之PE公司AmpliTaq聚合酶的情形。測試下述之PCR套組：Clontech，s Advantage cDNA PCR 套組、Epicentre’s Failsafe PCR 系統、以及來自 Takara 之三種套組，LA Taq、Ex Taq 和 Z Taq。（Clontech 實驗室位於 1020 Meadow Circle Palo Alto,加州 94303-4230; Epicentre科技公司位於1402 Emil街，Madison，威斯康辛州 53713;以及Takara Shuzo有限公司的生物醫藥團隊營業地點為 Seta3-4_1，Otsu，Shiga，520-2193,日本）。測試的樣本代表3〇個標的DNA基因庫。其從stratagene，11011北 Torrey Pines 路，La Jolla，加州 92〇37 被選殖進入 pBluescript SK-(3.0 kb)。其在384-孔格式中的生長時間為20小時。根據先前之資料由於Z-Taq系統擁有所尋找之酵素的性質，使其成為似TEMS中利用於高生產量之理想系統。請看圖 4 ,其顯示樣本之pcr產物跑在染色的電泳凝膠之上。最適化反應劑亦需要降低每次PCR篩選的反應成本。下表2顯示各種試驗之摘要，其測試各種反應劑在不影響結果之下所能降低的數量。 -16-

A7 1235180 ___B7 五、發明說明（I5) 測試項目測試條件最適化結果 Z-Z-Taq聚合酶 0.625,0.313,0.156 單位 0.313單位 ΙΟΧΖ-Taq緩衝劑 lx, 0.5x lx 引子 2.5,5,10皮莫耳濃度(皮莫耳濃度） 5皮莫耳濃度引子 cM13f&cM13r cT3&cT7 cM13f&cM13r <MTFs 100，150,200微莫耳濃度 150微莫耳濃度表2·測定各種PCR雞尾酒成份能夠達到最適當反應之摘要表。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據上述之試驗，測定出下列為最適當反應之雞尾酒 (每件樣本)混合·· ddH20 : 17.875 微升 ΙΟχΖ-Taq緩衝劑：2.5微升 dNTP混合物：1,5微升模板 DNA : 1 升（以 Kerphmker#96/384，Nalge Nunc International 公司製造 ’ 75 Panorama Creek Drive，Rochester，紐約14625，和Pin複製器#250520/250393沉澱） Z-Taq DNA 聚合酶：〇·ΐ25 微升(0.3125 單位） cM13f(5皮莫耳濃度/微升）：1微升 cM13r(5皮莫耳濃度/微升）：！微升經濟部智慧財產局員工消費合作社印製熱循環器條件之最適化最初使用之熱循環條件為根據Takara文獻中之推薦。其條件為： 1·變性：98^5秒鐘 2·煉合：55°C10秒鐘 3·延伸：72t60秒鐘（15·4秒/千鹼基對） •17- 本紙張尺度通用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱)"' " — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235180 A7 " " ---—-----B7 —_—- _ 五、發明說明（l6) 4·返回！步驟，3〇次 5· 4°C直至測定出PCr反應應用上述條件之結果列於圖2。從該資料中得知煉合的溫度必需嘗試儘量降低，並減少反應之特異性而因此增加被放大的陽性數目。在下一項試驗中，煉合的溫度被降低至52C。雖然其有助於整体反應之結果，但發現，每千驗基對應用15·4秒的延伸時間導致轉位子插入之載体的放大載体。圖5顯示跑在染色電泳凝膠上之PCR產物，其選自轉位子插入含標的DNA之pBluescript SK後所選出並生長在384孔平板之孔内的47個轉形体。此9 kbp帶的出現，被認為是含轉位子之載体的放大產物，其導致需要較長的延伸時間。此外，測試48°C到68°C之間的煉合溫度梯度證明52 C確實為使用於此PCR之最適合溫度。在此同樣的試驗中亦測試其循環的次數。共測試3〇、35、4〇和45次循環。從試驗之結果確認必需維持低的循環次數，以避免背景的躁音。從48。(：和68t：之梯度再次證明最適合之煉合溫度為 52°C。此溫度不會過低而失去其特異性，並且亦不會過高而接近56。(：造成PCR失敗之溫度。此結果列述於圖6之染色電泳凝卵巾，其各職出之產物代表每孔2 5毫微克之對照組pBluescript SK-載体在384孔格式内和乃微升之PCR雞尾酒体積之放大作用D根據以上之資料，證明最適合利用於此熱循環之條件為利用下述之循環。 1·變性：98^5秒鐘 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規辂（210 X 297公--*----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線

1235180 A7 B7 五、發明說明（⑺ 2.煉合：52。(： 10秒鐘 3·延伸· 72 C30秒鐘(7·7秒/千驗基對） 4·返回1步驟，％次 5· 4°C直至測定出PCR反應由於發現在384-孔平板内會產生蒸發的問題，因此在開始熱循環之前以MJ研究公司，590林肯街，Waltham，麻叫 02451之橡皮’P’封塞置於密封的平板。和此相同，如製场商所推薦其蓋子的溫度設定為85。(：。下列表3提供在最佳化的過程中各種pCR熱循壤# 件的測試摘要。' 測試項目 ’ 測試條件最適當結果煉合溫度 38〇C〜68〇C 52〇C 、 PCR循環 30、35、40、45 35 〜表IPCR熱循環1 条件最佳化的測試過程摘J to ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

* - * « ... 利用dsDNA定量反應劑PICOGREEN®筛選陽性選殖体為了迴避凝膠電泳勞力密集的工作，因此利月 dsDNA定量試劑PICOGREEN®進行此TEMS PCR的產選。將PICOGREEN®在lXte緩衝劑内稀釋至1 : 150之？操作稀釋量。雖然此稀釋濃度比製造商的推薦稀釋濃名 1 : 200為高，但發現其為較適合之稀釋濃度。利用 Robbins 科技，1250 Elko Drive，Sunnyvale，加只 94089-2213，之 Robbins Hydra 96 分配器在黑色 384-孔今板上之各孔内加入25微升等量1 : 150之PICOGREEN®。再次利用Hydra分配器將5微升之PCR產物各別加入每子I -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） !!!訂·！-線

1235180 A7 B7 五、發明說明（α) 之PICOGREEN®内。立刻將此平板置於分子動力雙子座螢光平板判讀計内，並且在測量螢光訊號之前將此平板混合 10秒鐘。為了測定此篩選的功能，陽性和陰性孔之間螢光訊號必需有很明顯的區別。PCR產物的量為1.3、2.5、5，並且測試10微升以決定陽性訊號至背景的最大測定範圍。結果顯示於圖4，其顯示最適化的使用條件為將5微升之PCR 產物加入25微升之PICOGREEN⑧内。撤升 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 高· 低 13 353 287 206 987 180 345 1734 351 171 312 309 237 1102 308 202 245 843 134 126 318 223 308 635 223 1608 25 839 827 495 1924 412 751 2941 694 397 710 711 413 2129 541 456 549 1713 313 217 634 407 690 1434 552 2724 5 1489 15Q3 835 2769 635 1450 3703 1640 813 1220 1447 882 2991 1198 934 1003 2560 624 552 1259 1112 873 2341 1116 3151 10 1806 2234 1775 3023 1354 2099 3870 2112 1378 2095 1909 1746 3401 1882 1681 1574 2902 1197 983 ⑹7 1642 1560 2967 1333 2887 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 龜經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表4·利用PICOGREEN®測定法配合各種PCR產物量所檢測之螢光訊號。此24種PCR產物來自代表尺寸至多4.5 kb選殖入 PCR4Bblunt-TOPO載体的11種DNA標的基因庫之樣本。所用轉位子為 pGPS-Apra-2uM_URA3。由螢光判讀器所產生之訊號輸出再輸至柱狀圖表顯示器上，然後從該柱狀圖表指定陽性選殖体之截止值 value)。利用目前的狀況，其載止值通常落在ι〇〇〇〜15〇〇之間。利用Genesis RSP 150 TECAN機械人技術站(TECAN 美國公司；郵政信箱13953，Research Triangle Park，北卡羅萊州27709)產生96-深孔平板，其含有藉篩選標的DNA 序列内有轉位子所鑑定出之選殖体的細胞。將來自各別陽性選殖体之置於Superbroth,並在其申一孔「加入適量之抗生素（雙重選擇）。將這些平板經過培養之後進行自動化定 -20- 奉紙張尺度過用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐 --— — — — — 訂·-----I--線

經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 1235180 A7 B7 五、發明說明（19) 序。 384-孔平板最適化PCR篩選技術之實例利用Q-Bot挑選含轉位子之選殖体的菌落置於 Genetix 384-孔淺-孔平板，其每孔含65微升之Superbroth 和適當量之抗生素。將平板置於37°C溼度保溫箱内19〜22 小時。利用Multidrop 384 115V之液体分配器（Labsystems 有限公司，8 東 Forge Parkway, Franklin，麻州 02038)，每孔置入等份25微升之無菌50%甘油於生長平板内。應用甘油平板做為模板，利用下列之配方設置PCR : ddH20 ·· 17.875 微升 10 X Z-Taq緩衝液：2.5微升 dNTP混合物：1.5微升. DNA 模板* · 1 微升(利用 Kerplunker，pin-tool) Z-Taq DNA 聚合酶：〇,125微升(〇.3125單位） cM13f(5皮莫耳濃度/微升）·· 1微升 cM13r(5皮莫耳濃度/微升）：1微升了確保Kerplunker無菌，必需貯存於精内，並且在使用前燒灼之。而了仔於70/。之酒 /將PCR反應平板置於熱循環器内，並開始進行下列之循環： 1·變性：98°C5秒鐘 2. 煉合：52。(：10秒鐘 3. 延伸·· 72t30秒鐘(7.7秒/千鹼基對） -21· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — ^ ·11111111

1235180 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（） 4.返回1步驟，35次 5· 4°C直至測定出PCR反應全部循環時間：1小時18分30秒在反應進行期間，將PICOGREEN®反應劑在室溫下解冰。在lx TE緩衝液内製備1 : 15〇之PICOGREEN®稀釋液。每片384·孔平板製備10毫升。利用R〇bbins Hydra將每孔25升等分至全部384-孔黑色平板。利用Robbins Hydra每孔分配5升之PCR反應至 PICOGREEN®平板。立刻將此平板置於螢光平板判讀器，並在搖狀下混合10秒鐘。將螢光訊號資料輸出至一磁碟片。將資料輸入一 Excel macro，並使用1500作為閥值產生陽性選殖系之重陣列表。圖7為得自PCR選之最後 PICOGREEN®資料的一實例。打開在TECAN自動機械的重陣列表，重陣列選殖体從甘油貯備平板進入含 Superbroth和適當抗生素之96-孔-深孔平板内。在平板經過培養之後，將此培養物以自動方法定序。宜金丨3_載体PCR4Bblimt-TOP〇内之夫知庠功丨夕轉你子‘ 的多重定序利用得自新英格蘭生物實驗室之基因組引子系統(GPS) 套組進行轉位子反應。除了轉位子GPS1之外，使用所有套組内所提供之成份。所用轉位子為GPS1之修飾版。產生兩種變異株。其中一變異株pGPS-Apra中，其抗性標記 •22· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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，置換成安舰素抗性基因。此操作確保均能用以將載体定序不管任何抗性標記。另外一變異株pGPS-Apra-Y2um，一含酵母2um複製源之，，填塞物，，區域被選殖進入轉位子_，因而使其尺寸增加至5 kb(圖6)。此改變是為了藉篩選出轉位進入載体主幹來增加此方法之效率。此反應藉電穿刺轉形進入DHl〇B大腸桿菌勝任細胞（觀petem cells)，並且置於含適量抗生素[安痢黴素（1〇〇公克/毫升康黴素(50公克/毫升)]之Luria-Bertani(蛋白腺1% ,酵母萃取物0.5%，氣化鈉1%，pH7 〇)璦脂平板上做為選擇藏有轉位子之選殖体。其生長時間為2〇〜22小時。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - TEMS(轉位子加速之多重定序）藉使用Notl將含標的DNA載体的限制消化來評估進行TEMS之所有標的DNA序列的尺寸。匯集所有被包含於相同載体主幹内之各種財_ DNA^_f体組。在匯集之前計算各別標的DNA序列之等莫耳濃度。將匯集之DNA模板視為單—模板來進行轉位子反應。涵蓋$ 倍各別標的DNA序列之各別鹼基，此各別標的DNA序列之總尺寸乘上標準因子18選殖体/lkb序列來測定隨機所選擇選殖体之定序數目。基於載体之總尺寸和標的DNA序列之總尺寸，計算轉位子插入位置之機率。將此因子乘以 6倍涵蓋選殖体之數目可測定隨機選擇之選殖体數目並進行PCR篩選。選擇所計算出之選殖体數目，並接種進入在96或 384孔培養平板内含適量抗生素之Superbr〇th(蛋白腺酵 --------^---------^

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1235180 五、發明說明（22) 母萃取物，氣化鈉，氫氧化鈉）培養基。在不搖動的情形下，視此生長平板之格式而定(96/384孔）隔夜培養此平板 18〜22小時。製備甘油備料做為短暫儲存此乎板之用。將 50%甘油直接加入此平板並混合之Q其可不限期地儲藏於_ 8〇t之下。以PCR薛選出載体插入物被選擇做為供篩選用之選殖体之載体部份的引子序列為適用引子M13f(-20)和M13r之互補序列。其為如下述之序列·· 5，-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3，和 5，· CATGGTCATAGCTGm。PCR培養在下列狀況下被建立：模板利用等分成約1微升之點複製器工具（pin replicator tool)置入PCR反應劑製備物中。至於96-孔之格式其lOxPCR緩衝液之組成為1〇〇毫莫耳濃度之Tris-Hcl ρΗ8·3、500毫莫耳濃度之氣化鉀、15毫莫耳濃度之二氣化鎂、0.01%重量/体積之明膠。各別反應中利用5皮莫耳濃度之前述引子和5皮莫耳濃度之反向引子。此反應之 dNTP濃度為2.5毫莫耳濃度最終濃度。加入各別反應之 Taq聚合酶之量為單位。所有的反應均在總体積為5〇微升之下進行。此384-孔格式之PCR為在總体積25微升之下利用得自Panvera公司，545科學路，Madison，威斯康辛州53711之TaKaRa Z-Taq套組所完成。此套組由Z-Taq聚合酶(2.5單位/微升、含30毫莫耳濃度之Mg2—的 l〇xZ-Taq緩衝液、以及一 dNTP混合物(分別為2.5毫莫耳) 組成。熱循環器在加熱蓋(MJ Research)下操作。由於延伸 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — — — — — — — — — —

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時間較短，故此PCR循環之設計祗能放大無轉位子之載体。由於使用黑色PCR平板，故之後的螢光分析可直接在該平板上操作。利用PICOGREEN®之分析狀況一完成PCR，將25微升之PICOGREEN㊣加入PCR 平板内。將以1 : 200溶於50微升体積之lXte(tris-醋酸建，EDTA)緩衝液的稀釋pIC0GREEN®貯備液和1〇微升之PCR反應混合。將此平板置於螢光分光計内判讀，在該處分子於480納米下激化，且於540納米發射出其訊號。高於預設閥值下發射出螢光之PCR產物為將定序之陽性選殖体。此閥值為利用已知含轉因子於載体或於載体插貨物之構体在試驗之下所測定。分類此陽性選殖体，並壓縮進入適合藉TECAN機械手臂操作之陣列的格式。將甘油貯料接種進入含1.5毫升Superbroth(蛋白腺、酵母萃取物、氣化鈉、5當量濃度之氫氧化鈉)和適量之抗生素的96深孔平板。此培養基生長24小時之後，利用位於轉位子兩端之一的引子定序來自此培養物之標的DNA。序列組合載体修剪和利用Phred軟体定名粗序列之鹼基後，利用 Phrap 軟体(請看 Brent Ewing、LaDeana Hillier、Michael C. Wendl、和Phil Green利用Phred之自動定序器的驗基定名追縱。I .準確性的測定。1998。基因組研究8 : 175〜185。以及 Brent Ewing 和 Phil Green 利用 Phred 之自動定序器的驗基定名追蹤。Π .錯誤的可能性。1998。基因 -25- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) in----訂--------

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235180 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（24) 組研究8 : 186〜194)組合該序列。利用c〇nsed軟体檢討此項組合（請看consed ··完成定序之繪圖工具。Gordon等人。1998)。完成的標準具有高品質，並且覆蓋6倍整個全長基因。每10 kb序列預期之錯誤率必需低於〇 1。如果不符合上述之標準，選擇引子和模板一起做為標的DNA序列之易犯錯誤之區域的引子步進定序。此引子步進定序可在ABI 310定序器（sequencer)上完成，或視定序之体積的需要利用ABI 3700進行高生產力定序，並且在之後將此序列加入至該組合。BLAST分析是做為比較之用，特別是在瞭解基因方面(請看：Altschul，S. F.，Gish，W.，Miller，W.， Myers，Ε· W· & Lipman，D. J.(1990)”基礎序列區域比對選殖工具(BLAST)”。分子生物期刊。215 : 403〜410 ; Gish, W. & States，D· J· (1993)”藉資料庫類似性之研究鑑別蛋白質質之編碼區域，，。自然遺傳學。3 : 266〜272 ; Madden，T. L.， Tatusov，R，L· & Zhang，J. (1996)，，BLAST 伺服器網絡之申请。酵素學方法。266 : 131 〜141 ; Altschul，S· F·，Madden, Τ· L·，Schaffer，A. A.，Zhang J·，Miller, W, & Lipman D. J. (1997)’’Gapped BLAST 和 PSI-BLAST，，：一種新世代的蛋白質資料庫研究程式。，，核酸之研究。25 : 3389〜34〇2 ;以及 Zhang，J· & Madden，Τ· L, (1997)，，PowerBLAST : — 種做為相互作用或自動定序和註解之網絡BLAST申請。，，基因組研究〇 7 : 649〜656)。重要的是，產生全長序列必需使用另一種組合程式稱為 Sequencher(請看 Cash，H.，Clark，B.， Galt，J·，Garb，C·，Goebel Π，C· J·，& Singer，J· Sequencher -26- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裊 « — — — — — — I.

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） [235180 A7 B7 五、發明說明（ 25 使用手冊”解決DNA定序之完全軟体，，。基因編碼公司。 1999)。利用此程式可以很容易發現打開之可讀框架，而如果有變異的話可加以確認，並且不會導致框架的移位。必需瞭解，上述之實例僅為舉例和說明之便，本發明並非僅侷限於此實例。上述之具体例可用本領域内之技術做各種的改變而不偏離本發明如下述專利申請之範圍。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -β I I ϋ ϋ ϋ I*^r«»J> ϋ ϋ 1 I ϋ ϋ I ·

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 27· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

六、申請專利範圍專利申請案第90116787號 ROC Patent Application No.90116787 修正之申請專利範圍中文本一附件（一） Amended Claims in Chinese - Enel. (I) (民國93年11月yV曰送呈） (Submitted on November yY, 2004) 1. 一種做為並行、轉位子媒介之定序DNA的方法，此方法包括： 10 i) 提供一或多個標的DNA序列，各別於一插入部位插入一載體中； ii)放大各別含標的DNA之載體並將其匯集，其中各別標的DNA序列代表基因庫内每kb 之實質等量； 15 iii)暴露該含標的DNA之載體的基因庫至一可選擇之轉位子，其中該可選擇之轉位子在實質隨機部位整合進入該含標的DNA之載體而形成含標的DNA和含轉位子之載體的基因庫； 20 iv)在選擇條件下，以含標的DNA和含轉位子經濟部智慧財產局員工消費合作社印製之載體基因庫將細胞轉形，並分離和培養一代表數目之個別轉形體為培養物； v) 對來自各別培養物之DNA進行聚合酶鏈反應，其中該聚合酶鏈反應利用一對和插入部 25 位之載體序列3’末端互補之引子，並且在各別反應循環期間有足以有效產生該載體序列之全長複本但不足以有效產生之載體序列的全長複本之延伸時間； ~ 28 " 90308B-接本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） Αδ Β8 C8 D8 !23518〇〜---______ 六、申請專利範圍 vi) 測定各別聚合酶鏈反應所產生之DNA量；以及 vii) 從產生實質DNA量之聚合酶鏈反應的培養物將含標的DNA之栽體的轉位子旁側區域定序；其中測定各別聚合酶鏈反應產生 DNA量之步驟包括將為dsDNA選擇之螢光染色劑加入結束之聚合酶鏈反應中，並且測疋其所得螢光ΐ，及該轉位子在長度上等於或大於該載體。 2·如申睛專利範圍第1項之方法，其中第丨)至vh) 步驟中一或多個被自動化。 3.如申請專利範圍第1項之方法，其中為dsDNA 所選擇之螢光染色劑選自PICOGREEN®和雙-笨嘧啶染料之群組。 15 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中為dsDNA 所選擇之螢光染色劑為plc〇GREEN®。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中該載體和轉位子攜帶不同可選擇之標記。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6·如申請專利範圍第1項之方法，其中該轉位 20少為3 kb。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該轉位子少為4 kb。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中該轉位 GPS-Apra_2um-URA3。 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規袼（2丨〇>(297公4) 1235180 3 C8 _^_D8_ 六、申請專利範圍 9. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該轉位子至少為5 kb。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該轉位子之長度至少為該載體之5/4。 5 11.如申請專利第10項之方法，其中該轉位子約為 5kb而該載體約為4kb。 12·如申請專利範圍第1項之方法，其中該轉位子之長度至少為該載體之5/3。 13.如申請專利範圍第12項之方法，其中該轉位子 10 約為5 kb而該載體約為3 kb。經濟部智慧財產局*:工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐)