BR0112261B1 - processo para seqüenciamento de dna mediado por transposon, paralelo. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA SEQÜENCIAMENTO DE DNA MEDIADO POR TRANSPOSON, PA- RALELO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método automatizado de

seqüenciamento multiplex mediado por transposon de fragmentos de DNA inseridos num vetor. Ela refere-se mais particularmente a uma eficiência aumentada em tais métodos automatizados, onde a eficiência aumentada é obtida por seleção antes do seqüenciamento, daqueles constructos nos quais o transposon foi inserido na seqüência do vetor. Isto previne uma per- da de tempo e de recursos na realização de reações de seqüenciamento do vetor no lugar de fragmentos do DNA de interesse.

Fundamentos da Invenção

A grande profusão de informação adquirida do seqüenciamento ge- nômico e tag de seqüência expressa (EST) nos últimos 10 anos contribuiu signi- ficativamente nos esforços para clonar cDNA de comprimento total representati- vos. Embora antecipe-se que os projetos de seqüenciamento genômico de seres humanos e de camundongo estarão completos em futuro próximo, o transcripto- ma dessas espécies permanecerá vago por algum tempo. As complexidades envolvidas na previsão com absoluta certeza, o programa de emendas de gene de mRNAs de seqüências genômicas compeliu a mais pesquisas genômicas voltadas para a obtenção da seqüências de cDNAs de comprimento total. Além disso, os esforços de seqüenciamento de cDNA de comprimento total são tam- bém necessários para a confirmação de seqüências de cDNA após terem sido empregados para clonagem, métodos que envolvem a amplificação do cDNA . Este cenário é particularmente de valor em centros genômicos que se salientam pela validação de alvos genéticos no sentido de descoberta de droga. Obviamen- te, após grandes dispêndios econômicos e diligência, seria de insensibilidade para um suposto alvo falhar no processo de validação simplesmente porque a seqüência de codificação do gene alvo estava incorreta. Consequentemente, são requeridas tentativas nos centros genômicos para seqüenciar grandes nú- meros de clones de comprimento total, de modo rápido e econômico e preci- samente. Para este fim, os Depositantes criaram um novo processo de grande produtividade integrado denominado seqüenciamento multiplex ex- pedido por transposon (TEMS). Nos últimos 20 anos, foram desenvolvidos muitos métodos para seqüenciar grandes insertos em plasmídeos. Contudo, muitos desses méto- dos, eram incômodos e não puderam ser transferidos para os sistemas au- tomatizados, de alta produtividade. O seqüenciamento por deslocamento do primer é lento, caro e freqüentemente falha uma vez que os iniciadores são indicados para seqüência em uma região fracamente caracterizada. Simi- larmente, o seqüenciamento pelo criar uma coleção de clones por digestão de exonuclease das extremidades do clone alvo é lento, específico para o clone e extremamente sensível à pureza e integridade do DNA matriz. Além disso, a relação de sucesso desta abordagem é bastante variável, O se- qüenciamento de "shotgun" dos clones é um método de maior produtividade, contudo ele requer isolamento do inserto de cada clone e a seguir a nova clonagem dos fragmentos menores gerados por uma ampla variedade de métodos. Adicionalmente, bibliotecas "shotgun" que utilizam digestos de restrição resultam na tergiversação da clonagem e, subseqüentemente, uma distribuição não aleatória dos dados da seqüência de DNA.

O seqüenciamento mediado por transposon pode ser feito por agrupamento de um grande número de vetores contendo seqüência de DNA alvo e inserção aleatória de um transposon com iniciadores de seqüencia- mento, em cada extremidade para o construto. Ver Devine, S.E. Boeke, J.E. (1994) Efficient integration of artificial transposon into plasmid targets in vitro: a useful tool for DNA mapping, sequencing and genetic analysis, Nucleic Acids Research pags. 3765-3772; ou Kimmel, B., M.J. Palazzola, C. Martin, J. D. Boeke, e S.E. Devine, 1997, Transposon-mediated DNA sequencing. In Genomic Analysis: A Iaboratory manual (ed. E Green, B. Birren, R. Myers and P. Hieter), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. para uma descrição do método.

Tradicionalmente, este método era algo incômodo visto que re- queria deslocar os plasmídeos através de diferentes cepas de hospedeiros para clonagem e etapas de inserção do transposon. Recentemente, contudo, vários comerciantes de biologia molecular desenvolveram sistemas de transposição in vitro para obter vantagem da inserção aleatória de um trans- poson modificado (ie. Tn5 etc.) Infelizmente, alguns desses sistemas resul- tam num alto antecedente de falsos positivos, e são difíceis de usar com métodos para seleção de clones positivos por reação em cadeia da polime- rase (" PCR"). Os depositantes utilizaram vários desses métodos de se- qüenciamento com base em transposon e não experimentaram quaisquer dessas dificuldades com uma versão modificada do sistema de transposição in vitro GPS-1 do New England Biolabs. Não obstante, inserções de transposon não podem ser direcio- nadas exclusivamente par o DNA alvo de interesse e aparecem no vetor com uma alta freqüência. Num esforço para solucionar este problema e au- mentar a eficiência do seqüenciamento facilitada por transposon, os Depo- sitantes desenvolveram um procedimento de alta produtividade, singular, denominado seqüenciamento multiplex expedido por transposon (TEMS).

Consequentemente, constitui um objeto desta invenção provi- denciar um processo eficiente e econômico de alta produtividade para o se- qüenciamento de fragmentos de DNA.

É ainda um objeto desta invenção providenciar um processo efi- ciente e econômico de alta produtividade para seqüência mediado por trans- poson de fragmentos de DNA alvo que minimiza a quantidade de seqüência de DNA não-alvo gerada.

E ainda um outro objeto desta invenção providenciar uma sele- ção com base em PCR para distinguir entre os constructos desejados com transposons inseridos na seqüência de DNA alvo dos constructos indeseja- dos com transposons inseridos em qualquer outro sítio.

Sumário da Invenção

A presente invenção atende os objetivos acima por providenciar o método a seguir, que pode ser automatizado para mais conveniência. Se- qüência alvo de DNA múltiplas, cada qual clonadas em um vetor são agru- padas e transposons selecionáveis com iniciadores de seqüenciamento em cada extremidade são inseridos aleatoriamente nos vetores contendo DNA alvo. Vetores contendo transposon e seqüência de DNA alvo são a seguir selecionados individualmente usando uma reação PCR para identificar os vetores que possuem transposóns localizados na seqüência de DNA alvo. A reação PCR utiliza iniciadores localizados em cada extremidade da seqüên- cia de vetor e é otimizada para providenciar um tempo de prolongamento suficiente para a polimerase de PCR produzir, eficazmente, um produto do comprimento do vetor, mas tempo de prolongamento insuficiente para poli- merase de PCR produzir eficazmente um produto do comprimento do vetor mais o transposon. Portanto quantidades significantes do produto PCR irão apenas ser produzidas para vetores contendo o transposon na seqüência de DNA alvo e não no vetor. A presença ou ausência de uma quantidade signi- ficante de produto PCR para cada reação PCR pode ser rapidamente deter- minada mediante uso de um corante fluorescente quantitativo seletivo para DNA duplamente filamentado ("dsDNA"). Vetores identificados por um pro- duto PCR significativo na pré-seleção são a seguir individualmente seqüen- ciados, usando os iniciadores de seqüenciamento em cada extremidade do transposon para leitura em cada seqüência de DNA alvo. As seqüências alvo de DNA bruto de reações de seqüenciamento individuais podem ser combi- nadas para determinar a seqüência completa de cada um dos DNA alvos no agrupamento. O processamento paralelo de clones aumenta em muito a velo- cidade, à qual as reações podem ser ajustadas e seqüenciadas. Adicional- mente, o processo não confia em qualquer vetor particular e não requer quaisquer etapas de nova clonagem. Mais importante para eficiência global, o seqüenciamento da estrutura principal do vetor é minimizado ou eliminado com a etapa de seleção. A automatização de cada uma das etapas do pre- sente processo pode ser prontamente adquirida usando equipamento dispo- nível aos versados na técnica de seqüenciamento de DNA automatizado.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um diagrama das etapas de TEMS.

A figura 2 mostra a seqüência do vetor transposon GPS-Apra. A figura 3 mostra a seqüência do vetor transposon GPS-Apra-2μm-URΑ3.

A figura 4 é uma foto de um gel de eletroforese manchado para mostrar os produtos das reações PCR1 usando várias polimerases para mul- tiplicar as partes do vetor dos vetores contendo transposon e DNA alvo.

A figura 5 é uma foto de um gel de eletroforese manchado para mostrar os produtos das reações PCR com um tempo de extensão grande demais para eliminar um produto de aproximadamente 9 kb.

A figura 6 é uma foto de um gel de eletroforese manchado par mostrar os produtos das reações CR a uma série de temperaturas de exten- são com diferentes séries de ciclos.

A figura 7 é uma foto de um gel de eletroforese manchado para mostrar os produtos das reações PCR e uma tabela dos resultados PICO- GREEN® para as mesmas reações PCR.

Definições

Como usado aqui:

Um "vetor" é qualquer construto de DNA que replica em uma célula e tem um sítio de inserção ao qual podem ser inseridas seqüências de DNA desconhecidas.

"Selecionável" na referência a um vetor ou transposon, significa que o vetor ou transposon porta um fenótipo que pode ser usado para identi- ficar células transformadas com o vetor ou transposon. De preferência o fe- nótipo permite as células transformadas sobreviverem em condições nas quais nenhuma célula transformada poderia.

Um "DNA alvo" ou "seqüência de DNA alvo" é uma molécula de DNA de seqüência conhecida ou desconhecida que o operador do método deseja seqüenciar.

Um "número representativo de transformantes individuais" é um número mínimo de transformantes individuais que garante que para cada DNA alvo no agrupamento existirá um número suficiente de transformantes contendo inserções de transposon para o DNA alvo para dar um número desejado de determinações de seqüenciamento independente de cada base naquele DNA alvo.

"Quantidades substanciais de dsDNA" em relação aos produtos PCR é uma quantidade de dsDNA que excede um predeterminado limiar. O limiar predeterminado pode ser identificado avaliando-se a variabilidade dos produtos PCR encontrados nas reações PCR com vários constructos, que são conhecidos por conterem o transposon dentro ou fora da seqüência de vetor.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

A presente invenção providencia um método que pode ser sufi- cientemente automatizado para seqüenciar DNAs alvo múltiplos em paralelo. No método, cada seqüência de DNA alvo é inserido num vetor selecionável, de preferência um plasmídeo em pontos de inserção idênticos na seqüência de vetor. É importante que todos os DNAs alvo sejam inseridos ao mesmo vetor, ou caso sejam usados diferentes vetores, que cada vetor seja subs- tancialmente do mesmo tamanho e possua seqüências idênticas em torno do ponto de inserção, de modo que um conjunto de iniciadores possa ser usado para ampliar todos os vetores por reação PCR.

Os vetores contendo cada uma das seqüências de DNA alvo múltiplas são agrupados em relações baseadas no comprimento de cada seqüência de DNA alvo, de modo que o grupamento contenha substancial- mente, quantidades iguais de cada kb de cada seqüência de DNA alvo. As relações para cada vetor para estar incluído no grupamento pode ser deter- minada, determinando-se os comprimentos de cada seqüência de DNA alvo (por exemplo, por eletroforese contra marcadores de tamanho padrão em um gel de agarose), e adicionando-se ao grupamento uma quantidade de- terminada de cada vetor para cada kb em comprimento da seqüência de DNA alvo naquele vetor.

Uma reação de inserção por transposon é então realizada no grupamento para inserir aleatoriamente um transposon selecionável para os vetores contendo DNA alvo. Embora esta etapa possa ser realizada por in- serção de transposon in vivo, tradicional, que iria requerer deslocar um plasmídeo através de mais de um tipo de célula. Reações de inserção do transposon in vitro são muito mais simples e mais rápidas. O transposon deve portar um marcador selecionável e deve ser de tamanho suficiente para permitir condições PCR de serem estabelecidas que multipliquem efi- cazmente um fragmento de dsDNA do tamanho do vetor, mas que não mul- tipliquem significativamente um fragmento de dsDNA do tamanho do vetor mais o transposon. De preferência, o transposon é cerca de igual ou maior do que o vetor em comprimento. Mais preferivelmente, o transposon é igual ou maior a 5/4 do comprimento do vetor. Particularmente e preferivelmente, o transposon é igual ou maior do que 5/3 do comprimento do vetor. Onde o vetor for um plasmídeo bacteri- ano, o transposon é preferivelmente pelo menos cerca de 3 kb, mais preferi- velmente pelo menos cerca de 4 kb e, particularmente e preferivelmente maior do que ou igual a cerca de 5 kb.

O grupamento de vetores da reação de inserção do transposon é a seguir usado para transformar células e os transformantes são cultivados sob condições que selecionam para o transposon. Transformantes selecio- nados são isolados e cultivados em culturas. O número de transformantes isolados crescendo em culturas depende do número e tamanho das seqüên- cia de DNA alvo no grupamento. Transformantes suficientes devem ser iso- lados e crescidos para garantir que para cada seqüência de DNA alvo, o transformaste isolado incluirá suficientes inserções individuais do transposon para aquela seqüência de DNA alvo particular, para providenciar muitas ve- zes determinações de seqüência independentes de cada e toda base na- quela seqüência de DNA alvo. Para se garantir contra erros, os versados na técnica, procuram obter, o mais das vezes um alcance de 6 vezes dos dados de seqüência, embora possam optar por mais ou menos, conforme a situa- ção. Quando se tenta obter um alcance de 6 vezes, como uma regra geral sucinta, 18 clones serão necessários para serem, de fato, seqüenciados por 1 kb de nucleotídeos para obter-se este alcance. Contudo, para, realmente, seqüenciar 18 clones um número maior de transformantes será isolado e cultivado, porque o transposon não se terá integrado ao DNA alvo em cada caso, mas ter-se-á inserido aleatoriamente sobre todo o vetor contendo o DNA alvo. Portanto, o número 18 é multiplicado pela probabilidade de que o transposon inseriu-se na seqüência do DNA alvo. Assim, para se obter uma cobertura de seqüenciamento de 6 vezes, para cada seqüência de DNA alvo no grupamento, uma série de transformantes para isolamento é igual a: comprimento da seqüência do DNA alvo em 18 vezes kb, vezes a relação (tamanho do vetor)/(tamanho da seqüência de DNA alvo).

Cada cultura de um transformante selecionado então tem uma reação PCR realizada em seu DNA. A reação PCR utiliza iniciadores com- plementares às 3'extremdades da seqüência de vetor no ponto de inserção, que permite a multiplicação por PCR de um fragmento do tamanho de toda a seqüência de vetor. As condições de reação da reação PCR são otimizadas para produzir eficientemente um fragmento do comprimento do vetor mais o transposon. A otimização das condições PCR para qualquer combinação particular de vetor e transposon de acordo com a invenção pode ser deter- minada pelo versado na técnica através de experimentação de rotina, con- forme evidenciada pelo trabalho de referência de Kimmel, B. M.J. Palazzola, C. Martin1 J.D. Boeke1 e S.E. Devine, 1997 Optimizing PCRAssays, Methods for Improving PCR, Detecting and Characterizing PCR products, Protocols for Detecting and Characterizing PCR Products. In Genomic Analysis: A Ia- boratory manual (Ed. e Green, B. Birren, R. Myers, e P. Hieter), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y e Cha, R.S. e Thilly,, W. G. (1995) in: PCR Primer, Dieffenbach, C.W e Dveksler, G.S. (eds.) CSH Press, New York. A polimerase de DNA particular usada para PCR não deve ser Iimitante para o método, embora a escolha da polimerase possa ajudar a otimizar a reação.

Em geral, a temperatura de alongamento e/ou tempo da PCR (reação em cadeia da polimerase) são variados para se conseguir a exclu- são desejada do vetor mais produto dimensionado ao transposon. Para uma demonstração de otimização ver

Exemplo 2

A quantidade do produto produzido em cada reação PCR é a seguir medida, de preferência opticamente. A medição óptica pode ser feita por qualquer método que distingue dsDNA dos nucleotídeos, mas é preferi- velmente feita usando um corante fluorescente específico para dsDNA. Co- rantes específicos para dsDNA incluem o corante bis-benzimida da Hoechst 33528 e corantes cianina de Molecular Probes, Inc1 Eugene, Oregon, inclu- indo PICOGREEN®. PICOGREEN® é preferido, devido à sua sensibilidade e seletividade para dsDNA. O valor medido da fluorescência é comparado com um nível limite predeterminado para determinar se uma quantidade si- gnificativa de produto PCR dsDNA está presente. O nível do limite da fluo- rescência é determinado experimentalmente usando matrizes PCR de con- trole positivas e negativas do tamanho do vetor sozinho e do vetor mais o transposon, sob as mesmas condições PCR que serão usadas para selecio- nar os transformantes isolados.

Os transformantes correspondentes às reações PCR que não produzem quantidades substanciais de dsDNA não são seqüenciados, por- que eles contém o transposon na seqüência de vetor. Os transformantes correspondentes às reações PCR que produzem quantidades substanciais de dsDNA contém o transposon na seqüência de DNA alvo e são seqüenci- ados. Duas reações de seqüenciamento são realizada para cada transfor- maste, usando iniciadores de cada extremidade do transposon para ler a seqüência da seqüência de DNA alvo que circunda o transposon. As rea- ções de seqüenciamento podem ser realizada por qualquer métodos do co- nhecimento da técnica.

Uma vez que os dados da seqüência foram coletados de todos os transformantes que passaram pela seleção PCR as seqüências devem ser agrupadas em todos os membros individuais do grupamento das se- qüência de DNA alvo. Isto pode ser realizado pelos métodos de análise de seqüência por comput6ador conhecido na técnica, e a maneira precisa não é Iimitante nesta invenção.

As vantagens do presente método incluem velocidade eficiência e uma capacidade em automatizar o processo. Particularmente, o presente método provê uma seleção PCR rápida que permite a eliminação dos trans- formantes improdutivos que têm o transposon inserido na seqüência de ve- tor, e produziriam principalmente seqüências de vetor, caso fossem seqüen- ciados. A seleção por PCR é rápida, pode ser automatizada e não requer qualquer isolamento do produto PCR, tal como operação de um gel de aga- rose para determinar seu tamanho. O uso de um agrupamento de DNAs alvo permite uma única reação de transposon e uma única transformação a ser realizada, em vez de requerer uma para cada seqüência de DNA alvo. Exemplos

Exemplo 1 - Escolha de um transposon para ajustar um proces- so de seleção de alta produtividade

Transposon original oriundo de New England Biolabs O Kit Genome Priming System da New England Biolabs, 32 Tower Road, Beverly, MA 01915 ("NEB") foi usado para inicialmente provar que um transposon inserido aleatoriamente aos alvos de DNA poderiam ser um modo eficiente para seqüenciar completamente os alvos com um grau elevado de precisão. Um dos dois transposons foi suprido com o kit que continha o gene resistente para canamicina. Contudo, a canamicina é um marcador de resistência bastante comum, e caso uma seqüência de DNA alvo fosse já clonada no vetor selecionável para canamicina, então ambos um transposon diferente ou reclonagem da seqüência de DNA alvo seriam necessários. O kit providenciou um outro transposon que continha o marca- dor resistente para cloranfenicol, mas que, também é bastante comum. Por- tanto, o transposon deveria ser modificado para conter um marcador de re- sistência incomum, como apramicina, para evitar etapas de clonagem adici- onais e reduzir erro humano na escolha do correto transposon para cada DNA alvo. O transposon GPS-Apra (Figura 2) foi construído por modificação do transposon NEB pGPS1.

Método de Seleção usando o Transposon modificado GPS-Apra Experimentos iniciais mostraram, que um processo de seleção poderia identificar a partir de transformantes selecionados para o transpo- son, aqueles transformantes contendo o transposon na seqüência de DNA alvo e não no vetor. Isto reduz custos por eliminação de seqüenciamento não produtivo da seqüência de vetor. O transposon original NEB pGPS1 era .2.614 kb com -1,7 kb daquele, com sítios de formação de iniciadores em cada extremidade sendo aleatoriamente inseridos ao DNA alvo. Por amplifi- cação por PCR do vetor de 3,0 kb usando M13F complementar e iniciadores M13R complementares, dois produtos PCR distintos puderam ser visualiza- dos em um gel de lâmina . Um produto PCR de 3,0 kb indica que o transpo- son deve estar na seqüência de DNA alvo, visto que o vetor é de 3,0 kb. Um produto PCR de 4,7 kb indica um vetor (3,0 kb) contendo o transposon (1,7 kb). Portanto, os clones contendo o transposon na seqüência de DNA alvo puderam ser identificados pela presença dos produtos PCR de 3,0 kb no gel. Para demonstrar a identificação dos clones contendo o transpo-

son no inserto, selecionaram-se colônias da transformação seguinte à rea- ção do transposon e inocularam-se ao meio contendo, tanto antibióticos para seleção, apramicina e o antibiótico de plasmídeo. A cultura foi crescida du- rante a noite e a PCR foi feita no dia seguinte por "kerplunking" aproxima- damente 1 ul de cultura num coquetel PCR em uma placa de 96 cavidades. O coquetel PCR incluiu a enzima Amplitaq e os reagentes de PE Corporati- on, PE Corporation, 761 Main Avenue, Norwalk, CT 06859. As condições para PCR foram {95C por 5 minutos, (95 C por 30 segundos, 54 C por 1 mi- nuto, 72 C por 6 minutos, 30 ciclos), 72 C 1 m, 4C padrão para sempre}. Após o término do ciclo (aproximadamente 2,5 horas), foi feita eletroforese de gel usado 8 ul dos 50 ul da reação PCR num gel de tamanho padrão. Houve um distinção de tamanho perfeitamente detectável entre os produtos PCR da seqüência do vetor sem o transposon e seqüência de vetor incluindo o transposon.

Para manter uma alta produtividade para reações de seqüenci-

amento, contudo, a eletroforese teria de ocorrer em géis grandes que pode- riam abranger centenas de amostras de uma só vez. Nesses géis grandes, a diferença entre um fragmento de 3 kb e um de 4,7 kb seria difícil detectar, reprodutivelmente, com um sistema automatizado. Ainda, a eletroforese de gel levou muito tempo iria interferir com a realização da seleção num modo de alta produtividade. Na busca para outros métodos de alta produtividade, a detecção fluorescente dos dsDNA foi assente como reproduzível e menos consumido- ra de tempo. O ensaio PICOGREEN® pareceu particularmente conveniente. Contudo, a detecção fluorescente do dsDNA não pode distinguir entre frag- mentos de diferente tamanho, de modo que a reação PCR teve de ser alte- rada de modo que a presença ou ausência de qualquer produto PCR indica a posição do transposon no vetor contendo o DNA alvo. Se apenas clones com o transposon na seqüência de DNA alvo produzissem um produto PCR dsDNA, então o corante PICOGREEN® de dsDNA fluoresceria a um alto nível para somente clones desejados. As cavidades que contém o transpo- son no vetor não amplificariam um produto dsDNA significativo e resultariam num baixo nível de fluorescência, um nível de corte de fluorescência entre clones desejados e indesejados pode ser determinado mediante uso de amostras conhecidas.

Uma série de condições PCR foram testadas pela redução da temperatura de alongamento, mas a faixa de 4,7 kb não cairia sistematica- mente, sem ter um aumento de falsos positivos. Decidiu-se que, caso o transposon pudesse ser modificado novamente, para aumentar seu tamanho grandemente, então as condições PCR poderiam ser desenvolvidas, o que cairia sistematicamente, a faixa superior contendo o transposon, reduzindo assim, a taxa de falso positivo. Um grande gene "material de refugo" que não efetuaria a reação do transposon num modo negativo foi pesquisado. Um plasmídeo de 2 um de levedura com o gene URA3 atendeu os critérios de tamanho pode também ser usado nos experimentos de levedura no futu- ro. Consequentemente, um plasmídeo transposon GPS-Apra-2um-URA3 (figura 3) foi construído com um tamanho total de 6,1 kb, incluindo o trans- poson de ~5,0kb. As condições PCR foram vitoriosamente alteradas para baixar os clones com o transposon no vetor e a reação de transposição não foi afetada. Ver exemplo 2.

Exemplo 2 - Otimização das condições PCR para reduzir os re- sultados falsos negativos e falsos positivos

Conceito PCR básico

Esta seleção é baseada nas condições da ciclagem PCR que fo- ram especificamente otimizadas para ampliar um fragmento de 3,9 kbp de todo o DNA vetor. Neste caso, o vetor era PCR4Blunt-TOPO da Invitrogen, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA 92008. Caso o vetor tenha o transposon de kbp inserido nele, seu tamanho será aumentado para 8,9 kbp, que é gran- de demais para ser ampliado sob condições PCR otimizadas.

As seqüências do primer selecionadas para ampliar a parte de vetor dos clones são as seqüências complementares dos iniciadores univer- sais M13F(-20) e M13R. As seqüências são como segue: 5'- ACTGGCCGTCGTTTTAC-3'e 5'-CATGGTCATAGCTGTT-3'. Esta ampliação está ilustrada na Figura 1.

FUNDAMENTOS DO DESENVOLVIMENTO DO FORMATO DE 384 CAVI- DADES

De modo a selecionar reações de transposon de grupamentos contendo múltiplos clones foi necessário desenvolver um teste que fosse, rápido e econômico. Tentativas iniciais de desenvolvimento foram baseadas no protocolo de 96 cavidades. Para trocar uma placa de 384 cavidades, to- dos os volumes de reagente foram divididos pela metade para acomodar o volume menor de reservatório. Contudo, essas condições provaram ser me- nos do que ideal devido ao alto número de falhas da PCR que se observa- ram. Uma busca para reagentes PCR e condições que fossem mais condi- zentes para este formato foram garantidas. Os resultados dos experimentos que testaram uma ampla gama de enzimas e condições termocíclicas serão descritas nas seções a seguir.

PROCESSO DE OTIMIZAÇÃO POR PCR DE 384 CAVIDADES

Seleção da Polimerase

Foi elaborado um exame minucioso rápido de uma série de kits PCR de vários comerciantes para determinar uma substituição de 384 cavi- dades para a polimerase AmpIiTaq de PE Corporation que tinha sido usada no formato de 96 cavidades. Os kits PCR a seguir foram testados: kit PCR de cDNA de CIontechTs Advantage, sistema PCR Failsafe de Epicentro, e três kits de Takara; LA Taq1 Ex Taq e Z Taq. (Clontech Laboratories Inc. está localizado em 1020 East Meadow Circle Palo Alto, CA 94303-4230; Epicen- tre Technologies está localizado em 1402 Emil Street, Madison, Wl 53713, e Takara Shutzo Co., LTD tem um endereço comercial em Biomedical Group Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 52-2193, Japão). Amostras testadas representaram 30 alvos de DNA agrupados. Eles foram clonados em pBluescript SK-(3,0 kb) de Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037. O tempo de cultivo foi de 20 horas em formato de 384 cavidades. Com base nos dados preliminares, o sistema Z-taq foi escolhido como a enzima para prosseguimento devido a propriedades inerentes que a tornaram ideal para uso em um sistema de alta produtividade como TEMS. Ver Figura 4, que mostra um gel de eletroforese manchado no qual foram operados os produ- tos PCR das amostras.

Otimização do Reaaente

Foi também desejável diminuir o custo por reação do teste PCR.

A tabela 2 vista abaixo, resume os vários experimentos que foram feitos para testar a quantidade que cada um dos vários reagentes pôde ser reduzida sem comprometer os resultados._ <table>table see original document page 15</column></row><table>

Tabela 2: Tabela resumindo os vários ingredientes do coquetel PCR que foram testados durante o processo de otimização.

Com base nos experimentos acima a seguinte mistura de co- quetel de reação otimizada (por amostra) foi determinada: dClH2C): 17,875 μL tampão Z-Taq 10x. 2,5 μL mistura dNTP: 1,5 μL

matriz de DNA: 1 μL (depositada usando um Kerplunker n° 96/384, fabricado por Nalge Nunc International, 75 Panorama Creek Drive, Rochester, NY 14625, e PinRepIicator n° 250520.250393)

DNA polimerase Z-Taq: 0,125 μL (0,3125 unidade)

cM13f (5 pmol/μΙ): 1 μL

cM13r (5 pmol/μΙ): 1 μL

Otimização de Condições termocíclicas

As condições termocíclicas iniciais usadas foram baseadas nas recomendações encontradas na literatura de Takara. Estas condições eram a seguir:

.1. desnaturação: 98°C por 5 segundos

.2. recozimento: 55°C por 10 segundos

.3. extensão: 72°C por 60 segundos (15,4 segundos/kb)

.4. ir para 1, 30 vezes

.5. 4°C até ser avaliada a reação PCR.

Os resultados de uso dessas condições são vistos na Figura 2. Daqueles dados, decidiu-se que a temperatura de recozimento deveria ser baixada de modo a tentar e diminuir a especificidade da reação e aumentar assim, o número de positivos que são ampliados. No próximo teste, a tempe- ratura de recozimento foi reduzida para 52°C. Embora isto tenha ajudado os resultados globais da reação, descobriu-se que o uso de um tempo de pro- longamento de 15,4 segundos por kbp resultou em uma amplificação do ve- tor contendo a inserção do transposon. Ver Figura 5 que mostra um gel de eletroforese manchado no qual foram testados os produtos PCR de 47 transformantes selecionados após inserção do transposon no pBluescript SK contendo DNA alvo e crescimento por 20 horas em cavidades de uma placa de 384 cavidades. A aparição de uma faixa de 9 kbp vista como o produto ampliado do vetor contendo o transposon, é o resultado de um excessivo tempo de extensão. Adicionalmente, um gradiente de temperatura de recozimento entre 48°C e 68°C foi testado para confirmar que 52°C era, de fato, a tempe- ratura ótima para uso neste PCR. No mesmo teste o número de ciclos tam- bém foi ensaiado. 30, 35, 40 e 45 ciclos foram testados. Dos resultados da- quele experimento determinou-se que, o número de ciclos precisa permane- cer baixo para se evitar ruído de fundo. Do gradiente de 48°C e 68°C a tem- peratura de recozimento foi reconfortada como sendo ótima. A temperatura não é tão baixa a tornar-se não-específica e não tão alta que corra riscos a aproximar-se da temperatura de 56°C à qual a PCR começa a falhar. Esses resultados são mostrados na Figura 6, um quadro de um gel de eletroforese manchado onde cada produto ilustrado representa a ampliação do vetor pBluescript SK a 2,5 ng por reservatório, num formato de 384 cavidades com volume de coquetel PCR de 25 ul. Com base nos dados expostos, as condi- ções de termociclagem foram determinadas para realizar otimamente usan- do o seguinte ciclo:

.1. desnaturação: 98°C por 5 segundos

.2. recozimento: 52°C por 10 segundos

.3. extensão: 72°C por 30 segundos (7,7 segundos/kb)

.4. ir para 1, 35 vezes

.5. 4°C até a avaliação da reação PCR.

Desde que a evaporação foi vista como um problema nas placas de 384 cavidades, vedações de borracha "P" de MJ Research, 590 Lincoln Street, Waltham, MA 02451, foram colocadas sobre as placas vedadas antes de começar a termociclagem. Juntamente com isso e como recomendado pelo fabricante, a temperatura da tampa é ajustada para 85°C

A tabela 3, mostrada abaixo, providencia um resumo de várias condições de termociclagem PCR testadas durante o processo de otimiza- ção. _

<table>table see original document page 17</column></row><table> Tabela 3. Resumo das condições de termociclagem de PCR que foram testadas durante a otimização.

SELEÇÃO PARA CLONES POSITIVOS USANDO O REAGEN- TE DE QUANTIFICAÇÃO DE dsDNA PICOGREEN®

Para desviar a árdua tarefa de gel de eletroforese, o teste TEMS PCR utiliza o reagente de quantificação de dsDNA, PICOGREEN®. O PI- COGREEN® é diluído a uma diluição de operação de 1:150 num tampão TE 1x. Esta diluição foi vista sendo ótima, embora ela seja ligeiramente mais concentrada do que a diluição 1:200 recomendada no protocolo do fabri- cante.

μl por reservatório de PICOGREEN® 1:150 é colocado em alíquotas em placas de 384 cavidades negras usando um Dispensor 96 Ro- bbins Hydra da Robbins Scientific, 1250 Elko Drive, Sunnyvale, CA 94089- 2213. 5 μl por reservatório da reação PCR é a seguir adicionado ao PICO- GREEN® , novamente usando o Dispensor Hydra. A placa é a seguir imedi- atamente colocada em uma Leitora de Placa Fluorescente Molecular Dyna- mics Gemini e a placa é a seguir misturada por 10 segundos antes de seu sinal fluorescente ser medido.

Para o ensaio funcionar como uma seleção, deverá existir uma clara diferença no sinal fluorescente entre cavidades positivas e negativas. As quantidades do produto PCR de 1,3, 2,5, 5 e 10 μΙ foram testadas para determinar a maior faixa de ensaio de sinal positivo para o fundo. Os resul- tados mostrando que 5 μΙ do produto PCR em 25 μΙ de PICOGREEN® é a condição ótima para uso são vistos na Tabela 4. <table>table see original document page 19</column></row><table> Tabela 4. Sinal fluorescente detectado usando o ensaio PICO- GREEN® com várias quantidades do produto PCR. Os 24 produtos PCR são provenientes de amostras representando um agrupamento de 11 DNA alvos com um tamanho de até 4,5 kb clonado no vetor PCR4Blunt-TOPO. O trans- poson usado foi pGPS-Apra-2uM-URA3.

O sinal de saída gerado pela leitora fluorescente é a seguir envi- ado para um mostrador de histograma, e um valor de faixa para clones posi- tivos é emitido do histograma. Usando as condições atuais, a faixa geral- mente se enquadra entre 1000-1500.

Uma estação automatizada Genesis RSP 150 TECAN (TECAN U.S. INC., P.O. Box 13953, Research Triangle Park NC 27709) foi usada para gerar placas profundas de 96 cavidades contendo células dos clones identificados pelos testes como tendo o transposon na seqüência de DNA alvo. As células de cada clone positivo são colocadas no Superbroth e os antibióticos apropriados (seleção dupla) em uma das cavidades. Essas pla- cas são crescidas e a seguir as culturas são submetidas ao seqüenciamento automatizado.

EXEMPLO DE TÉCNICA DE SELEÇÃO PCR OTIMIZADA PARA PLACAS DE 384 CAVIDADES

Uso de Q-Bot para coleta de colônias dos clones contendo transposon em placas rasas de 384 cavidades Genetix, contendo 65 μΙ por reservatório de Superbroth mais antibiótico apropriado. Colocar as placas em um incubador a 37°C umedecido por 19-22 horas. Fazer alíquotas de 25 μΙ por reservatório de glicerol a 50% estéril nas placas de cultura usando um dispensorde líquido Multidrop 384 115V (Labsystems Inc., 8 East Forge Pa- rkway, Franklin MA 02038). Usando a placa de glicerol como uma matriz, ajustar PCR usando a seguinte receita: ddH20: 17,875 μL tampão Z-Taq 10x: 2,5 μL mistura dNTP: 1,5 μL

DNA matriz*: 1 μL (usando a ferramenta de sujeição Kerplunker) DNA polimease Z-Taq: 0,125 μL (0,3125 unidade) cM13f (5 pmol/μΙ): 1 μL

cM13r (5 pmol/μΙ): 1 μL

* Para garantir que o Kerplunker seja estéril este deve ser arma- zenado em etanol a 70% e flambado antes do uso.

Colocar a placa de reação PCR num termociclador e iniciar o seguinte ciclo:

.1. desnaturar: 98°C por 5 segundos

.2. recozer: 52°C por 10 segundos

.3. prolongar: 72°C por 30 segundos (7,7 segundos/kb)

.4. ir para 1, 35 vezes

.5. 4°C até ser avaliada a reação PCR.

Tempo total de ciclagem: 1 hora, 18 minutos, 30 segundos.

Enquanto a reação se realiza, descongelar o reagente PICO- GREEN® à temperatura ambiente.

Preparar uma diluição 1:150 de PICOGREEN® num Tampão TE 1x. Preparar 10 ml por placa de 384 cavidades. Usar o Robbins Hidra para fazer alíquotas de 25 μΙ por reservatório por uma placa negra completa de 384 cavidades Usar o Robbins Hydra para dispensar 5 μΙ por reservatório da reação PCR para a placa PICOGREEN®. Imediatamente colocar a placa na leitora de placa fluorescente e misturar com agitação por 10 segundos. Ex- portar os dados de sinal fluorescente para um disquete. Importar os dados para um macroExcel e gerar uma lista de rearranjo de clones positivos usando 1500 como o limite. Ver Figura 7 para um exemplo dos dados PI- COGREEN® finais obtidos de um teste PCR. Abrir a lista de rearranjo no automatizado TECAN e rearranjar os clones da placa de estoque de glicerol para uma placa profunda de 96 cavidades contendo Superbroth e antibióti- cos apropriados. Após as placas terem sido incubadas, as culturas são a seguir seqüenciadas num processo automatizado.

Exemplo 3 - Seqüenciamento Multiplex Expedido por Transpo- son de seqüências desconhecidas no vetor PCR4Blunt-TOPO

REAÇÃO DO TRANSPOSON

A reação do transposon foi realizada usando o kit Genome Pri- ming System (GPS) de New England BioLabs. Todos os componentes pro- vidos no kit foram usados com exceção do transposon GPS1. O transposon utilizado era uma versão modificada de GPS1. Duas variações foram gera- das. Em uma variante, pGPS-Apra, o marcador de resistência atual foi subs- tituído pelo gene resistente para apramicina. Isto se realizou para garantir que o vetor pudesse ser usado para seqüenciar qualquer vetor independen- temente do marcador de resistência. Em uma outra variante, pGPS-Apra- Y2um uma região "de recheio" contendo a origem de replicação 2 um de levedura foi clonado ao transposon, aumentando assim seu tamanho para 5 kb (Figura 6). Esta alteração foi criada de modo a melhorar a eficiência do processo selecionando-se transposições para a estrutura do vetor. A reação foi transformada por eletroporação para células competentes de E. coli DH10B e colocadas em placas de ágar Luria-Bertani (1,0% bacto-triptona, 0,5% bacto-extrato de levedura, 1,0% de NaCI, pH 7,0) contendo os antibió- ticos apropriados (apramicina (100 μg/ml)/canamicina (50 μg/ml)) para sele- ção dos clones abrigando o transposon. O período de cultivo é de 20-22 ho- ras.

TEMS (Seqüenciamento Multiplex Expedido por Transposon)

O tamanho de todas as seqüências de DNA alvo submetidas a TEMS foi avaliado por digestão de restrição dos vetores contendo DNA alvo com Notl. Conjuntos de plasmídeos contendo seqüências de DNA alvo de vários tamanhos contidos na mesma estrutura de vetor foram agrupados. Concentrações equimolares foram calculadas para cada seqüência de DNA alvo antes do agrupamento. A reação de transposon foi realizada tratando a matriz de DNA agrupada como uma matriz simples. Para cobertura de seis vezes de cada base de cada seqüência de DNA alvo, o tamanho total de cada seqüência de DNA alvo foi multiplicado pelo nosso fator padrão de 18 clones por 1 kb de seqüência para se determinar o número de clones aleato- riamente selecionados para seqüência. Com base no tamanho total do vetor e tamanho total da seqüência de DNA alvo, calculou-se uma probabilidade do local da inserção do transposon. Multiplicando este fator com o número de clones para cobertura sêxtupla determina-se quantos clones para seleci- onamento aleatório e submissão ao teste PCR.

O número calculado de colônias foi selecionado e inoculado em meio Superbroth (bacto-triptona, extrato de levedura, NaCI, NaOH) contendo os apropriados antibióticos em placas de cultura de 96 ou 384 cavidades.

Essas placas de cultura foram crescidas durante a noite sem agitar por 18-22 horas, dependendo do formato da placa de cultura (96/384 cavidades). Estoques de glicerol foram produzidos para armazenagem temporária da placa. Adicionou-se glicerol a 50% diretamente para a placa e misturou-se. Isto permitiu a armazenagem indefinida a -80°C.

SELEÇÃO DE INSERÇÕES DE VETOR POR PCR

A seqüência de primer selecionada para ampliar a parte de vetor dos clones para seleção foi as seqüências complementares dos iniciadores universais M13F (-20) e M13R. A seqüência é como segue: 5'- ACTGGCCGTCGTTTTAC-3' e 5'-CATGGTCATAGCTGTT-3'. O PCR de cultura foi montado com as seguintes condições: A matriz foi depositada na preparação de reagente de reação PCR usando uma ferramenta replicadora de pino que formou alíquotas de aproximadamente 1 μΙ. Para o formato de 96 cavidades, a composição de tampão PCR 10x era 100 mM Tris-HCI pH 8,3; 500 mM de KCI; 15 mM de MgCI2; 0,01% peso/volume de gelatina. Cin- co picomoles do primer dianteiro e cinco pmoles do primer reverso foram usados em cada reação. A concentração dNTP na reação foi 2,5 mM de concentração final. A quantidade de polimerase Taq adicionada para cada reação foi 0,1 unidades. Todas as reações foram realizadas num volume total de 50 ul. O PCR de formato de 384 cavidades foi feito num volume total de 25 μΙ usando o kit TaKaRA Z-Taq obtido de Panvera Corporation, 545 Science Drive, Madison, Wl 53711. Este kit consiste de Z-taq polimerase (2,5 unidades/μΙ), tampão Z-Taq 10x contendo uma concentração 30 mM de Mg2+ e uma mistura dNTP (2,5 mM cada). Operaram-se termocicladores com uma tampa aquecida (MJ Research) Este ciclo PCR foi indicado para ampliar apenas o vetor sem o transposon devido ao curto tempo de prolon- gamento. Placas PCR pretas foram usadas de modo que a análise fluores- cente pudesse ser mais tarde realizada diretamente nas placas. CONDIÇÕES DA ANÁLISE USANDO PICOGREEN®

Com o término da PCR1 25 ul do PICOGREEN ® foi adicionado para a placa PCR. Uma diluição de estoque PICOGREEN® 1:200 no tam- pão de 1 χ TE(tris-acetato, EDTA) a 50 ul volume, foi misturado com 10 ul da reação PCR. A placa foi lida num espectrofluorímetro onde as moléculas são excitadas a 480nm e o sinal é emitido a 540 nm. Os produtos PCR que fluo- rescem acima de um predeterminado limite eram os clones positivos para serem seqüenciados. O limite foi determinado experimentalmente usando constructos conhecidos contendo o transposon, seja no vetor ou num inserto para o vetor. Os clones positivos foram ordenados e comprimidos num for- mato adequado para arranjo pelo braço automatizado TECAN. Estoques de glicerol foram inoculados para a placa profunda de 96 cavidades, contendo 1,5 ml de Superbroth (bacto-triptona, extrato de levedura, NaCI, NaOH 5N) e antibióticos apropriados. Essas culturas foram cultivadas por um tempo de 24 horas e a seguir os DNA alvos as culturas, foram seqüenciados usando os iniciadores em cada extremidade do transposon.

Conjunto da Seqüência

Após disposição do vetor e denominação da base das seqüên- cias brutas usando software Phred, as seqüências são dispostas usando software Phrap (ver Brent Ewing, LaDeana Hillier, Michael C. Wendl e Phil Green. A denominação da base dos traços do seqüenciador automatizado usando avaliação Phred. I. Accuracy 1998. Genome Research 8:175-185 e Brent Ewing e denominação Phil Green Base dos traços do seqüenciador automatizado usando Phred. Probabilidades de erro. 1998. Genome Rese- arch 8:186-194). O conjunto é revisto usando software consed. (Ver Con- sed:: A Graphical Tool for Sequence Finishing Gordon et al., 1998). Os crité- rios para término são alta qualidade, cobertura sêxtupla de todo o gene de comprimento total. O coeficiente de erro esperado por 10 kb da seqüência deve ser < 0,1. Caso esses critérios não sejam atendidos, os iniciadores são selecionados juntamente com matrizes para seqüenciamento em andamento do primer da seção sujeita a erro da seqüência de DNA alvo. O seqüencia- mento em andamento do primer é feito em, seja seqüenciador ABI 310 ou através de seqüenciamento de alta produtividade usando ABI 3700 depen- dendo do volume do seqüenciamento necessário e aquelas seqüências são a seguir adicionadas ao conjunto. Análise BLAST é feita para se comparar especialmente a genes conhecidos (Ver: Altschul1 S.F., Gish, W., Mileler, W. Miller, W. Myers1 E.W. & Lipman1 D.J. (1990) "Basic Local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215-403-410; Gish, W. & States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266- 272, Madden, T.L. Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. Madden, T.L. Schàffer, A.A. Zhang, J. Zhang, Z., Miller, W & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST e PSI-BLAST: a new generation of protein database search pro- grams" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; e Zhang, J. & Madden, T.L. (1997).

"Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation" Genome Res. 7:649-656). A seqüência de comprimento total gerada é importada para um outro pro- grama de reunião denominado Sequencher. (Ver Cash, H., Clark, B. Galt, J., Garb, C., Goebel III, C.J. & Singer, J. Sequencher User Guide "The complete Software Solution for Sequencing DNA". Gene Codes Corporation, 1999). Com este programa fica fácil visualizar o quadro de leitura aberto para certi- ficar-se que mutações, caso hajam, não ocasionaram um desvio do quadro.

Deve ficar entendido que os exemplos precedentes são exem- plares e explicativos apenas e não se destinam a restringir a invenção. Vári- as alterações podem ser feitas às modalidades descritas acima pelos versa- dos na técnica, sem se afastar do escopo da invenção, conforme indicado nas reivindicações apensas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> AVENTIS PHARMACEUTICALS INC- August, Paul Keagle, Pamela Call, Katherine Long, Henry Wiencis, Anna

<120> SEQÜENCIAMENTO MULTIPLEX MEDIADO POR TRANSPOSON

<130> A3932 WO PCT

<140> PCT/US01/21269 <141> 2001-07-05

<150> US 60/216,381 <151> 2000-07-07

<160> 4

<170> PatentIn versão 3.0

<210> 1

<211> 2613

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GPS-Apra transposon vetor <400> 1

ggtaccctgt gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct 60 ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 120 tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 180 atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 240 gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 300 cagcgccctg caccattatg ttccggatct atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa 360 tggcagatcc ctggcttgtt gtccacaacc gttaaacctt aaaagcttta aaagccttat 420 atattctttt ttttcttata aaacttaaaa ccttagaggc tatttaagtt gctgatttat 480 attaatttta ttgttcaaac atgagagctt agtacgtgaa acatgagagc ttagtacgtt 540 agccatgaga gcttagtacg ttagccatga gggtttagtt cgttaaacat gagagcttag 600 tacgttaaac atgagactta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtac tatcaacagg 660 ttgaactgct· gatcttcgga tctatgtcgg gtgcggagaa agaggtaatg aaatggcatc 720 cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg 780 aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt 840 tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg 900 agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg 960 gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc 1020

cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagagctc 1080

ttactgtcat gccatccgta tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat 1140

ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca 1200

gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact cttcattttc 1260

tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggg gtcgacgcgg ccgcgccgta 1320

tttgcãgtac cagcgtacgg cccacagaat gatgtcacgc tgaaaatgcc ggcctttgaa 1380

tgggttcatg tgcagctcca tcagcaaaag gggatgataa gtttatcacc accgactatt 1440

tgcaacagtg ccgttgatcg tgctatgatc gactgatgtc atcagcggtg gagtgcaatg 1500

tcgtgcaata cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac cttggggtta 1560

cccccggcgg tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc ctcgaagatg 1620

ggccacttgg actgatcgag gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg acgctcgtca 1680

tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg cccgttacac 1740

cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag cgcagcgccc 1800

atccatttgc ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct gatccattgc 1860

ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc gatgggcagg 1920

tacttctcct cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc gagttgatgg 1980

caaaggttcc ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc aagttggtac 2040

gcgtcgatta tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg gacaggtggc 2100

tcaaggagaa gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct cggttgatcc 2160

gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg ttgatcttcc 2220

tgcatccgcc agagggcggg atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga 2280

gctcatgagc ggagaacgag atgacgttgg aggggcaagg tcgcgctgat tgctggggca 2340

acacgtggag cggatcgggg attgtctttc ttcagctcgc tgatgatatg ctgacgctca 2400

atgccgtttg gactagtgtc gaccaaccag ataagtgaaa tctagttcca aactattttg 2460

tcatttttaa ttttcgtatt agcttacgac gctacaccca gttcccatct attttgtcac 2520

tcttccctaa ataatcctta aaaactccat ttccacccct cccagttccc aactattttg 2580

tccgcccaca ccgtaagatg cttttctgtg act 2613

<210> 2 <211> 6114 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> GPS-Apra-2um-üRA3 transposon <400> 2

ggtaccctgt gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct 60 ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 120 tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 180 atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 240 gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 300 cagcgccctg caccattatg ttccggatct atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa 360 tggcagatcc ctggcttgtt gtccacaacc gttaaacctt aaaagcttta aaagccttat 420 atattctttt ttttcttata aaacttaaaa ccttagaggc tatttaagtt gctgatttat 480 attaatttta ttgttcaaac atgagagctt agtacgtgaa acatgagagc ttagtacgtt 540 agccatgaga gcttagtacg ttagccatga gggtttagtt cgttaaacat gagagcttag 600 tacgttaaac atgagagctt agtacgtgaa acatgagagc ttagtacgta ctatcaacag 660 gttgaactgc tgatcttcgg atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcat 720 ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat ctgtattaac 780 gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag 840 ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt 900 gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc ccccttacac 960 ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag 1020 ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagagct 1080 cttactgtca tgccatccgt atgtgggcgg acaataaagt cttaaactga acaaaataga 1140 tctaaactat gacaataaag tcttaaacta gacagaatag ttgtaaactg aaatcagtcc 1200 agttatgctg tgaaaaagca tactggactt ttgttatggc taaagcaaac tcttcatttt 1260 ctgaagtgca aattgcccgt cgtattaaag aggggcgtgg ggtcgacgcg gccgcgaatt 1320 ctgaaccagt cctaaaacga gtaaatagga ccggcaattc ttcaagcaat aaacaggaat 1380 accaattatt aaaagataac ttagtcagat cgtacaataa agctttgaag aaaaatgcgc 1440 cttattcaat ctttgctata aaaaatggcc caaaatctca cattggaaga catttgatga 1500 cctcatttct ttcaatgaag ggcctaacgg agttgactaa tgttgtggga aattggagcg 1560 ataagcgtgc ttctgccgtg gccaggacaa cgtatactca tcagataaca gcaatacctg 1620 atcactactt cgcactagtt tctcggtact atgcatatga tccaatatca aaggaaatga 1680 tagcattgaa ggatgagact aatccaattg aggagtggca gcatatagaa cagctaaagg 1740 gtagtgctga aggaagcata cgataccccg catggaatgg gataatatca caggaggtac 1800 tagactacct ttcatcctac ataaatagac gcatataagt acgcatttaa gcataaacac 1860

gcactatgcc gttcttctca tgtatatata tatacaggca acacgcagat ataggtgcga 1920

cgtgaacagt gagctgtatg tgcgcagctc gcgttgcatt ttcggaagcg ctcgttttcg 1980

gaaacgcttt gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcag 2040

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ggactgtaac gagctactaa aatattgcga ataccgcttc cacaaacatt gctcaaaagt 2160

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catcggtata gaatataatc ggggatgcct ttatcttgaa aaaatgcacc cgcagcttcg 2520

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accaaagtag ccttcttcta accttaacgg acctacagtg caaaaagtta tcaagagact 2640

gcattataga gcgcacaaag gagaaaaaaa gtaatctaag atgctttgtt agaaaaatag 2700

cgctctcggg atgcattttt gtagaacaaa aaagaagtat agattctttg ttggtaaaat 2760

agcgctctcg cgttgcattt ctgttctgta aaaatgcagc tcagattctt tgtttgaaaa 2820

attagcgctc tcgcgttgca tttttgtttt acaaaaatga agcacagatt cttcgttggt 2880

aaaatagcgc tttcgcgttg catttctgtt ctgtaaaaat gcagctcaga ttctttgttt 2940

gaaaaattag cgctctcgcg ttgcattttt-gttctacaaa atgaagcaca gatgcttcgt 3000

taacaaagat atgctattga agtgcaagat ggaaacgcag aaaatgaacc ggggatgcga 3060

cgtgcaagat tacctatgca atagatgcaa tagtttctcc aggaaccgaa atacatacat 3120

tgtcttccgt aaagcgctag actatatatt attatacagg ttcaaatata ctatctgttt 3180

cagggaaaac tcccaggttc ggatgttcaa aattcaatga tgggtaacaa gtacgatcgt 3240

aaatctgtaa aacagtttgt cggatattag gctgtatctc ctcaaagcgt attcgaatat 3300

cattgagaag ctgcagcgtc acatcggata ataatgatgg cagccattgt agaagtgcct 3360

tttgcatttc tagtctcttt ctcggtctag ctagttttac tacatcgcga agatagaatc 3420

ttagatcaca ctgcctttgc tgagctggat caatagagta acaaaagagt ggtaaggcct 3480

cgttaaagga caaggacctg agcggaagtg tatcgtacag tagacggagt atactagtat 3540

agtctatagt ccgtggaatt ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc ttttcaattc 3600

aattcatcat ttttttttta ttcttttttt tgatttcggt ttctttgaaa tttttttgat 3660 tcggtaatct ccgaacagaa ggaagaacga aggaaggagc acagacttag attggtatat 3720

atacgcatat gtagtgttga agaaacatga aattgcccag tattckyrrc cgcwwytgca 3780

cagaacaaaa acctgcagga aacgaagata aatcatgtcg aaagctacat ataaggaacg 3840

tgctgctact catcctagtc ctgttgctgc caagctattt aatatcatgc acgaaaagca 3900

aacaaacttg tgtgcttcat tggatgttcg taccaccaag gaattactgg agttagttga 3960

agcattaggt cccaaaattt gtttactaaa aacacatgtg gatatcttga ctgatttttc 4020

catggagggc acagttaagc cgctaaaggc attatccgcc aagtacaatt ttttactctt 4080

cgaagacaga aaatttgctg acattggtaa tacagtcaaa ttgcagtact ctgcgggtgt 4140

atacagaata gcagaatggg cagacattac gaatgcacac ggtgtggtgg gcccaggtat 4200

tgttagcggt ttgaagcagg cggcagaaga agtaacaaag gaacctagag gccttttgat 4260

gttagcagaa ttgtcatgca agggctccct atctactgga gaatatacta agggtactgt 4320

tgacattgcg aagagcgaca aagattttgt tatcggcttt attgctcaaa gagacatggg 4380

tggaagagat gaaggttacg attggttgat tatgacaccc ggtgtgggtt tagatgacaa 4440

gggagacgca ttgggtcaac agtatagaac cgtggatgat gtggtctcta caggatctga 4500

cattattatt gttggaagag gactatttgc aaagggaagg gatgctaagg tagagggtga 4560

acgttacaga aaagcaggct gggaagcata tttgagaaga tgcggccagc aaaactaaaa 4620

aactgtatta taagtaaatg catgtatact aaactcacaa attagagctt caatttaatt 4680

atatcagtta ttacccggga atctcggtcg taatgatttt tataatgacg aaaaaaaaaa 4740

aattggaaag aaaaagcttt aatgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 4800

ggcaccggcg gccgcgccgt atttgcagta ccagcgtacg gcccacagaa tgatgtcacg 4860

ctgaaaatgc cggcctttga atgggttcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata 4920

agtttatcac caccgactat ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt 4980

catcagcggt ggagtgcaat gtcgtgcaat acgaatggcg aaaagccgag ctcatcggtc 5040

agcttctcaa ccttggggtt acccccggcg gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta 5100

gcgtccggcc cctcgaagat gggccacttg gactgatcga ggccctgcgt gctgcgctgg 5160

gtccgggagg gacgctcgtc atgccctcgt ggtcaggtct ggacgacgag ccgttcgatc 5220

ctgccacgtc gcccgttaca ccggaccttg gagttgtctc tgacacattc tggcgcctgc 5280

caaatgtaaa gcgcagcgcc catccatttg cctttgcggc agcggggcca caggcagagc 5340

agatcatctc tgatccattg cccctgccac ctcactcgcc tgcaagcccg gtcgcccgtg 5400

tccatgaact cgatgggcag gtacttc.tcc tcggcgtggg acacgatgcc aacacgacgc 5460

tgcatcttgc cgagttgatg gcaaaggttc cctatggggt gccgagacac tgcaccattc 5520

ttcaggatgg caagttggta cgcgtcgatt atctcgagaa tgaccactgc tgtgagcgct 5580 ttgccttggc ggacaggtgg ctcaaggaga agagccttca gaaggaaggt ccagtcggtc 5640 atgcctttgc tcggttgatc cgctcccgcg acattgtggc gacagccctg ggtcaactgg 5700 gccgagatcc gttgatcttc ctgcatccgc cagagggcgg gatgcgaaga atgcgatgcc 5760 gctcgccagt cgattggctg agctcatgag cggagaacga gatgacgttg gaggggcaag 5820 gtcgcgctga ttgctggggc aacacgtgga gcggatcggg gattgtcttt cttcagctcg 5880 ctgatgatat gctgacgctc aatgccgttt ggactagtgt cgaccaacca gataagtgaa 5940 atctagttcc aaactatttt gtcattttta attttcgtat tagcttacga cgctacaccc 6000 agttcccatc tattttgtca ctcttcccta aataatcctt aaaaactcca tttccacccc 6060 tcccagttcc caactatttt gtccgcccac accgtaagat gcttttctgt gact 6114

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 3

actggccgtc gtttta 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 4

catggtcata gctgtt 16

Claims (14)

1. Processo para seqüenciamento de DNA mediado por transpo- son, paralelo, caracterizado pelo fato de que compreende: i) providenciar uma ou mais seqüências de DNA alvo, cada qual inserida num vetor num sítio de inserção; ii) ampliar cada vetor contendo o DNA alvo e agrupá-los em que cada seqüência de DNA alvo é representada no grupamento em uma quan- tidade substancialmente igual por kb; iii) expor o grupamento dos vetores contendo DNA alvo a um transposon selecionável em que o transposon selecionável integra-se aos vetores contendo DNA alvo em sítios substancialmente aleatórios para for- mar um agrupamento de vetores contendo o DNA alvo e transposon; iv) transformar células com o grupamento de vetores contendo DNA alvo e transposon e isolar e cultivar um número representativo de trans- formantes individuais em culturas sob condições de seleção; v) realizar uma reação em cadeia da polimerase no DNA de ca- da cultura, em que a reação em cadeia da polimerase utiliza um par de inici- adores complementares às extremidades 3' da seqüência de vetor no sítio de inserção e tem um tempo de prolongamento durante cada ciclo de reação suficiente para produzir eficazmente uma cópia de comprimento total da se- qüência de vetor, mas curto demais para produzir eficazmente uma cópia de comprimento total da seqüência de vetor com o transposon inserido; vi) medir a quantidade de DNA produzido em cada reação em cadeia da polimerase, compreendendo adicionar um manchamento fluores- cente seletivo para dsDNA para a reação em cadeia da polimerase acabada e medir a quantidade resultante da fluorescência; e vii) seqüenciar as regiões de flanco do transposon dos vetores contendo o DNA alvo daquelas culturas correspondentes às reações em ca- deia da polimerase que produziram quantidades substanciais de DNA.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das etapas i) a vii) são automatizadas.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mancha fluorescente seletiva para dsDNA é selecionada do grupo consistindo de PICOGREEN® e corantes bisbenzimida.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mancha fluorescente seletiva para dsDNA é PICOGREEN®.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor e transposon portam diferentes marcadores selecioná- veis.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transposon tem pelo menos 3 kb.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o transposon tem pelo menos 4 kb.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o transposon é GPS-Apra-2um-URA3.

9. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o transposon tem pelo menos 5 kb.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que o transposon é igual ou maior do que o vetor em comprimento.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o transposon tem pelo menos cerca de 5/4 do comprimento do vetor.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o transposon tem cerca de 5 kb e o vetor é cerca de 4 kb.

13. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o transposon tem pelo menos cerca de 5/3 do comprimento do vetor.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o transposon tem cerca de 5 kb e o vetor tem cerca de 3 kb.