TWI235062B - A combination of the medicine for the prevention and treatment of sexual disorder and vasoconstrictive diseases - Google Patents

Description

1235062 __案號 五、發明說明（1) 本發明涉及 縮的藥物組合。 89111805 修正

種用於預防或治療性功能障礙和血管收 男 是在神 生理反 起性慾 疾病， 性性功 者年齡 為陽萎 大部分 達已經 系、血 月良各種 男 分泌系 勃起。 使陰莖 綿體小 綿體内 從而導 達到插 性的性 經 内 應，故 減退、 而且， 能障礙 增加而 、早泄 被認為 明確了 管系、 藥物等 性的性 統的調 這種陰 血流量 孔膨脹 屢升高 致陰莖 入陰道 =能包括性欲、陰莖勃起、射精和性快感， 分泌系統的調節下，陰莖血管系統的複雜的 上述系統的某一過程出現異常既可能引 勃起障礙、射精障礙或陰莖疲軟障礙等 ^ 疾病可以單獨出現或相互合併出現，男 婵率大約占成人男性的30一60%，併有隨 、，趨勢。傳統的醫學把性功能障礙通稱 口 β到最近十年以前，把性功能障礙的原因 ^f理原因，但是隨著現代科學技術的發 内八1以上的性功能障礙患者中發現有神經 二/必系疾病以及患有高血壓病、糖尿病、 益^性的原因。 功能主敢日 » , 咏 晋疋在有各種性刺激時，在神經—内 郎下诵、H 1 1 贫的A ^血管系統的複雜的生理反應使陰莖 i加勃起過程首先是依靠陰莖小動脈的擴張 ，曰^ ’相繼出現陰莖海綿體平滑肌鬆弛而海 ，芦=血液流入量近一步增加，導致陰莖海 ★ A ^陰莖白膜下的小靜脈阻斷血液流出， ，二瑕内ik液充盈而陰莖堅硬勃起其強度可 並維持勃起的時間足以達到性高潮而射精 這種陰莖勃起過

程中陰莖海綿體平滑肌的鬆弛作用起

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案號 89111805 五、發明說明（2) 著關鍵作用’而且陰莖勃起過程受神經内分泌系統的調^ 。動物實驗表明許多局部因數影響陰莖勃起功能如去甲: 上腺素（NA)、神經扒Y(NPY)、乙贼膽鹼(Ach)、前列腺♦月 (pGE)、五經色胺（5-HT)、降每素基因相關眇（CGRp)、I 管活性腸砭（VIP)、内皮素（EDRF)等。 m 近來的研究表明’一氧化氮（NO)在陰莖勃起過程中起 ^要作用。當性刺激時NO由分佈在陰莖的副交感神經和 腎上腺素非乙鵃膽鹼能神經（NANC)末梢釋放，而且N〇也在 分佈於血管内皮層的内皮細胞和陰莖海面體竇内皮細胞釋 敌，N 〇可啟動平滑肌細胞内鳥裔酸環化雨，使環鱗酸島芬 (cGMP)合成增加，也可啟動蛋白_〇(?“），PKG可以使^ 通道關閉和鉀通道開放，兩種作用均可引起陰莖海面體I 滑肌鬆弛導致陰莖勃起。環磷酸鳥甘（cGMP )又被碟酸二西旨 (P D E )滅活。 性功能障礙可分為性欲減退，勃起障礙，性高潮障礙 和射精障礙。性功能障礙的原因有血管神經性、内分泌性 、心理性病變、糖尿病、高如壓、脊聽神經損傷、吸煙等 因素均可引起性功能障礙。 傳統的觀點認為性功能障礙主要是由於心理性原因引 起。治療上用口服藥如安定劑曲唑酮，和育亨賓等。但是 足種藥物的作用機制尚不明確，其療效不高，並有不同程 度的副作用。 ^ 近年來隨著弄清陰莖勃起機制，各種對陰莖海綿體平 滑·机有鬆弛作用的藥物企圖用來診斷和治療男性性功能障

1235062 五、發明說明（3) 礙，目前，已有血管擔張 拉明（Phentolannne)、前二櫻束域（paparvarin)、芬托 藥物直接陰莖海綿體内、、主^腺素£1(1^〇以4131^^£1)等 較滿意的療效。但是，^ 、療法來治療陰莖勃起障礙獲得 性陰莖勃起、•莖纖唯Π療法可以引起局布疼痛、持續 。 寻副作用故臨床上常被限制使用 最近，美國發明的户 V抑制劑（Viagra)被世功起障礙的口服藥物磷酸二酯 僅僅是用來一次誘發降β目，上述樂品作為化學性假體 如面紅、頭痛、視覺Π ""有不同程度的副作用’ 疾峨者安全性有=值；：「:等’特別是對有心血管 有待：：究Ξΐ而Π:增進人體本能性勃起功能的藥物 用來〉口療性功能障礙。 仏 常常= 醫學界裡用來滋補強壯劑的處方中 =雀有效成份研究證明淫羊t*含有許多成份 : 匕：發油增醇、州一烧、謂醇、韓f、亞：： ' 、“又分尚隹出微量的magnoflorin、淫羊藿糖试A " ePU-Hn A，B，C、獬皮素、脫水淫羊藿试、 I,，、千涅手雀砍目前僅被兩做淫羊藿成份分析用桿車^ = 些研究報告淫羊藿具有抗疲勞作用、増近免疫功： 善肝臟功能。但是到目前為止，還沒有關於淫羊^ 單體用來治療性功能障礙的研究報告。 雀

第7頁 1235062 案號 89111805 年 月 修正 五、發明說明（4) 本發明的目的是尋找並開發淫羊藿甙新的醫藥用途。 本發明人經研究發現，淫羊藿甙出人意料的具有強烈 鬆弛陰莖海綿體平滑肌的作用，還具有對大動脈平滑肌輕 度的鬆弛作用，其藥理作用與平滑肌細胞内一氧化氮（NO) 一cGMP通路的活性增強有關。從而可用於改善和增進陰莖 勃起功能以及與改善血管收縮有關疾病的症狀。 因此，本發明涉及淫羊藿忒在製備用於預防治療性功 能障礙的藥物中的用途以及與改善血管收縮有關疾病用途 本發 治療性功 有關疾病 本發 關疾病的 藥用載體 本發 病的方法 有關疾病 的藥物 淫羊 ，其化學 2 3 0。。。 根據 或以藥物 明涉及 能障礙 藥物中 明涉及 藥物組 和賦形 明涉及 ，包括 的患者 組合物 結構式 下試本發 的藥物中 的用途。 用於預防 合物，其 劑。 預防或治 給需要預 預防或治 明涉及淫羊藿甙在製備用於預防 的用途以及製備與改善血管收縮 或治療性功能障礙和血管收縮有 包括作為活性成分的淫羊藿禚及 療性功能障礙和血管收縮有關疾 防或治療性功能障礙和血管收縮 療有效量的淫羊藿洛或含淫羊藿 生藥淫羊鳘分離出來的屬於黃酮 類單體 H40 〇1: 本發明，本發明 組合物形式使用 、分子量：6 7 6 . 6 7，熔點：2 2 5 - 中使用的淫羊藿 可以單獨使用 ，藥物組合物包括作為活性成份

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的淫羊藿禚及藥用載體。 f據本發明，本發明的藥物組合物，可按本領域以知 方法製備並可以通過口服或非腸道或局部途徑給藥。口 2 製劑^括如片劑、口嚼劑，膠囊、懸浮液、溶^，非腸 道給藥製劑包括如注射液。局部給藥製劑包括如霜劑、 膏劑、貼劑，噴霧劑等。 人 ^ 、根據本發明，淫羊藿是從淫羊藿生藥中通過有機溶 劑或有機溶劑與水的混合物提取得到，可使用的有機溶劑 包括®子類如曱醇、乙醇等、鹵代烧類如二氯甲烧、氯仿、 醚類如乙醚、酮類如丙酮、脂類如乙酸曱脂、乙酸乙脂、 烴類如已烷等。 下面的貫施例用來更詳細的說明本發明，但不意味著本發 明僅限於此。 實施例1淫羊藿硌的製備 提取方法（1 )

取乾燥淫羊藿（地上部分）5 0 0克加MeOHIO升，加溫提 取3日’共3回，過濾回收溶媒，減壓濃縮獲得Me0H提取物 ° MeOH提取物加水混懸後用同量的已烷提取共4次，取水 層濃縮到1 / 3量。在此濃縮水層中加5%檸檬混懸（Ph = 5 · 5 ) ，再用同等量的CHC13提取，再加適量ΝΗ40Η混懸（ph=10) ’再用同等量的C H C 13提取。此過程反覆3次。最終驗性水 層用同等量丁醇反覆提取3次，獲得淫羊藿热粗品 (icariin rich fraction, IRF)(利用HPLC 分析法測定 結果淫羊藿贰含量為8 % )。

第9頁 1235062 ____£^ 89111805 --±-a____ 五、發明說明（6) 提取方法（2 ) 取乾燥淫羊藿（地上部分）5 0 0克加E10 Η 1 0升，8 0 °C 加溫匯流提取3次，每次1小時，共3回。過濾，減壓回收 乙醇濃縮成漿狀。加4倍量水分散後靜止3小時除去葉綠素 幾堪脂等，正丁醇淬取4次後合併濾液，減壓濃縮。用4 〇 -60目聚祇氨枉吸附，30%乙醇洗脫至無色，洗脫液減壓濃 务百。加7 0 %乙醉（1 : 2 0 )溶解’靜止8小時，過滤得淫羊蹇輿 成。淫羊養總承與無水乙醇（1 ·· 1 5)反覆洗脫重結晶得淫羊 藿總禚粗品。淫羊藿總禚含量5 2 %。 淫羊蹇承.分離 淫羊藿承或淫羊藿總裱粗品溶化在Me〇H，吸附在矽膠 乾燥’再加入已備好的石夕膠柱（8 X 6 0 c in )中，以c H C 1 : M e Ο Η 二5 ·· 1，4 : 1，3 : 1，2 : 1的順序溶出，各溶出的分離液濃縮，再 用Me0H/H20混合液析出淡黃色結晶。 該結晶在UV發色，Pau 1 y試劑顧陽性反應，TLC分析結 果RU直為〇·6，熔點：23 9。c，確認為是純品淫羊藿甙（淫羊 藿贰，利用HPLC分析法測定結果淫羊藿贰含量為99·8%) 實驗1安全性實驗

杈…一。丨生毋丨生式驗規則利用S D系大白鼠雌雄各5只為1 組，共分4組，第i組口服給藥量為淫羊藿威 2、、έΗ 2g/kg ，第3 組lg/kg ，室二相 n , 乐/組 处盅ID ^ / 、、、 · g/kg。投藥後觀察7曰的 、、、σ 果，LD5G 雄性為1 · 88g/kg，雌性為1. 95g/kg。 灵驗2樂夕文及樂理作用機制

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-- 案號 89111805 五、發明說明（7) 實驗原理 男性的性功能主要是·在 内分泌系統的調節下通適血 陰莖勃起。這種陰莖的勃起 擴張作用和陰莖綿體肀清肌 促使陰莖海綿體血液流入量 高而壓迫陰莖白膜下的小靜 陰莖海綿體内血液充盈而陰 程中’陰莖海绵體平滑脈的 對陰莖海綿體平滑肌有鬆他 能。陰莖海绵體平滑肌的鬆 膽驗（N A N C )能神經和内皮細 這種EDRF中一氧化氮（NO)在 用。N〇或含有no的物質擴散 烏答酸環化确，使cGMP合成 鬆弛促使陰莖勃起。陰莖海 V型失去活性。所以，促使 ’或促進鳥苷酸環化獅活性 藥品，能使cGMP合成或活性 能障礙有治療作用。利用陰 實驗（1 n v 11 Γ 〇 )，觀察藥物 對磷酸二酯_的影響，是研 驗方法。 有各種性刺激下時，在神經〜 管糸統的複雜的生理反應促使 過程首先是依靠陰莖小動脈的 鬆弛作用，陰莖海绵體竇膨服 增加，導製陰莖海绵體内壓^ 脈以阻斷血液流出，從而$致 莖堅硬勃起’這種陰莖勃起^ 鬆弛作用起著關鍵作用。故具 作用的藥品有助於陰莖勃起功 弛作用也受非腎上腺素非乙酿 胞鬆弛因數（EDRF)的調節，而 陰莖勃起過程中起著重要的作 到平滑肌細胞内，啟動可溶性 增加而誘發陰莖海綿體平滑肌 綿體内的cGMP又被磷酸二酯幽 陰災海棉體平滑肌N 0生成增加 ’或抑制磷酸二酯_的活性的 ^加’促進陰莖勃起故對性功 |海綿體活體組織在體外進行 ，f張力的影響，或測定藥物 究藥物陰莖勃起功能的有效實

淫羊藿甙對家兔陰莖海棉 體平滑机鬆弛作 用：

1235062 襄號89111805 修正 曰 五、發明說明（8) 中雄性家兔（新西蘭家兔，體重：2.5-3.〇kg) ’分離 ，海綿體平滑肌，在體外進行了淫羊藿试的藥理藥效 二=使用的家兔共6 0只’觀察了不同濃度淫羊董试對陰 肢平滑肌張力的影響，並觀察了同濃度淫羊藿甙對 、ϋ動脈平滑肌張力的影響。為了研究淫羊藿咸對陰莖 滑平滑肌鬆他作用的藥理機制，觀察了已蔽膽鹼（ναν 經阻斷劑阿托品，前列腺素E1抑制劑消炎痛，抑制 N一〇 =成或NO活性的試劑Nw_nitric_L—精氨酸（l_nna)和連苯 一-刀、、，烏磷酸環化$活性抑制劑亞甲蘭、1H—〔 i，2, 4〕噁 亚（4’ 3，—a ) 4喔稱―卜酮（〇DQ)對淫羊藿系對陰莖5 棉脰平滑肌鬆弛作用的影響。 、 實驗方法 豕兔用戊巴比妥鈉（30 —5〇mg/kg)麻醉後切除陰莖和 邛大動脈，在持續供給9 5%氧氣和5%二氧化碳混合氣妒 盛有Tyrode營養液並保持衡溫37 5。〇的容器中，將 海綿體分離成2x2x 6mm大小的肌條，並將在大動脈中二， 出4mm寬的動脈環，分別在盛有Tyr〇de溶液丨―丨並持= 給9 5 %氧氣和5 %二氧化碳混和氣體的玻璃器管浴中，」二 在底部固定，另-端連接力位移傳導器上'陰口莖二端 和動脈環的緊張度的變化，利用多道記錄儀（tsd 1〇5岐條

Biopac Systems， Santa Barbara，CA， USA)測定並士， 觀祭了淫羊藿提取物和淫羊藿裱對陰莖海姊一錄’ 環的緊張度所引起的效應。 耻* 動脈 為了誘導起初安靜狀態陰莖海綿體條和動脈環的張力

第12頁 1235062 發明說明（9) 曰 五 ，將陰莖海面體條和動脈環牽技^ 小時。當利用苯副林（ΡΗΕ;5χ1〇 克的張力，效准1, 5 氏溶液洗去直到回復基線。此 誘發收縮反應後再用a 縮反應幅度之差在1〇%以内時，/、〜反覆三次以上，如三次: 棉體條和動脈環的張力，進行疋為效准安靜狀態陰莖海 肌條或環在實驗過程中的先後徐:步藥效分析。每個&平^ 回覆到安靜狀態陰莖海绵體=驗間隔保持30分鐘，使= 一步實驗。 和動脈環的張力後再進 a·淫羊藿提取物和淫羊藿甙對 、、— 緊張度所引起的效應實驗 二’母、’、條和大動脈環的 為了觀察淫羊藿提取物和、、< 某 地環的緊張度所引起的致；，ς陰以巧體條和 脈環：用苯福林(ΡΗΕ:5χ1")誘發收縮，大， 沒平雈提取物和淫羊藿忒以濃度遞增的口守，將 -50丨ng/ml，淫羊藿试1〇_ι '平隹&取物1 澶声斟巫#抓M t M )依—人投入，亚觀察其個個 物並= 至少觀察… 莖㈣體條所引起的鬆他效應機制實驗。 一、·/ $ 如膽鹼（NANC)能神經阻斷劑阿托品（ι〇-6Μ)對 ^手雈承對陰莖海綿體條所引起的鬆弛效應的影塑。 卜2二硯察了前列腺素£1抑制劑消炎痛（ι〇_4Μ)對淫威對 陰呈海綿體條所引起的鬆弛效應的影響。 # #JN〇 ^ ^ ^N〇 ^ ^ ^ ijNW-mtrxc-L-# ^ 义 '1 0 4 M )和連苯三酚（1 ο-4 Μ)對淫羊藿忒陰莖海綿

1235062 年 月 修正 曰 五 1^ 89111805 發明說明（10) b體條所引起的鬆弛效應的影響。 〔工T、了鳥石外酸環化硫活性抑制劑亞甲蘭（1 〇-4M )，1 H- 4Μ)對淫羊4藿：二並J4.，3，_a〕嗱喔眷卜酮(ODQm。-、 ^势對陰里〉母面體平滑鬆弛作用的影響。 π A ί 了觀察上述各種試劑對淫羊藿甙對陰贫海绵體條鬆 弛效應的影燮，收队β…， Ηπ丄母^收知松 讀I A A曰 將陰！、/母绵體條利用苯幅林（PH E ; 5 X 1 0-6 ^ : μ '、庙，保持平台時，將各種試劑按照各自的濃度分 t’俊，等待2〇分鐘，再將陽藿成以濃度遞增的量（淫 ==二1〇 u — 4M)依次投入，並觀察其個個濃度淫羊藿洛 ^月肌的他效應。與透各種試劑前的鬆弛程度作比較 ^ t析ΐ對淫羊藿忒對陰莖海綿體條鬆弛效應的影響。每 4 τκ物✓辰度至少觀祭5只動物肌條或肌環的藥物效庳並作 統計學分析。 〜 實驗使用溶液 苯福林鹽酸鹽，氯化乙職膽鹼，硫酸阿托品、連苯三酚 、消炎痛、Nw-nitric-L-精氨酸，1Η-〔 1，2, 4〕噁二唑並 〔4, 3, -a〕今喔啦、—1—酮來自 sigina Chemical C〇. (St.Louis ’ Mo ’USA)產品，亞甲蘭來自Mallinckrodt Chemical Co· (St. Lou is，Mo，USA)產品。Tyrode 溶液的 組成（Eq/l)Na-(153.6)，Κ，（5·3)，Ca--(3.0)，Mr+(1.2 )，Π_—(157.2)，H2P〇4---(0.6)，S04-(1.2)，HC03—(7·1) ，葡萄糖（1 1 · 4 )。 統計學分析 資料用電腦分析（Acqk〇wlege3· 2program, Bi〇p ac

第14頁 1235062 年 月 修正 案號 89111805 發明說明（11) 五 "—^^. systems, USA)且所有鬆他反應用 示，最大鬆弛指在所有嗲驗 a 〇松弛反應百分比表 中最大向下偏差之間的距離，統;收縮點與曲 '取八松他相隹所有試驗中PHE誘道 了 線中最大向下偏差之間 -的取大收 '.、但點與. 試驗進行。不同藥物濃二=2计分析用Student，s t =定。如。值小心衰減 有值用平均標準誤差表示。 〇、、死计學上有意義。所 實驗結果 C ·淫羊藿提取物和淫革紫 緊張度所引起的效應實；济.陰莖海綿體條和大動脈 觀察淫羊藿提取物和淫 f ^ ^ ^ ^ ^ ^^ ；, ^ J ^ Μ ^ Λ % 和表2中的貝料可看到，淫羊篇 表1和表2，由表】 苯幅林（Ρ Η Ε · 5 γ 1 n r 隹&取物和淫羊第试、 脈環，顯示久度^ f ^ -ΐί 4.67xl〇i，2.7Ul〇， 母要4:和動脈環分別 海綿體的鬆弛作用較對 ：果^:淫羊蹇劣對陰贫 〇1)。 一 的鬆他作用強5.8倍（p<〇\ 表1、淫羊藿提取物（iRF)對 )誘發收縮的陰莖海緯體條j =笨幅林（ΡΗΕ; 5 χ 的鬆弛作用。 大動脈環表現 0 Μ ’辰度依存性 1235062 案號89111805_年月日 修正 五、發明說明（12) 淫羊S贰度 (mg/ml) 0.1 0‘ 5 ! L 0 5. 0 I ) 10. 0 15. 0 P值 陰莖海棉體條 鬆弛效應 (%)(“） 2. 24 土 0. 82 9. 86 土 1，27 18, 74 土 3. 25 44、24 ± 4. 35 87. 45 ± 4· 12 ;94, 23 土 4, 36 <0.001 大動脈環鬆弛 效 應（％)(n二8) 0, 12 ± 0, 08 1. 34 ! 士 0· 98 4. 12 土 3, 35 9、4.5 ± 3· 24 1 23. 05 土 4、21 36.45 丨 ± 4, 35 <0. 001 P值 <0.001 t <0.001 1 <0, 001 <0、001 <0.001 表2 ，淫羊藿甙對利用苯福林（PM : 5X.10+M.)誘發收縮的 陰莖海綿體條和大動脈環表現出濃度依存性的鬆弛作用。 淫羊藿武濃度（M) 10"7 ίο-6 1G'5 10 4 P值 1 |陰莖海绵體條鬆弛效 應（％)(ω=8) 0. 08 0, 04 123± 0,82 442± 1.08 23,12+ 1.36 <0,001 ! 1 ! 大動脈環鬆弛效應 (%)(η:8) 0. 02 0, 03 0.13± 0,07 !.12± 0.86 1 1 6.78± L23 <0,001 Ρ值 >0· 05 0. 004 !<〇. 001 <0.001

第16頁 1235062 案號 89111805 a_a. 曰 修正 五、發明說明（13) 淫羊藿菸粗品（I PF )和淫羊藿试的半數有效濃度（EC5。） 不同藥物濃度下的平滑肌張力變化用1 og衰減分析結 果，淫羊藿甙粗品（I RF )在陰莖海绵體和動脈環的半數有 效濃度（E C5。）分別為4 . 0 8 m g / m 1，2 2. 4 m g / m 1。淫羊藿试在 陰莖海綿體和動脈環的半數有效濃度（EC5())分別為4. 67x10 -4M，2. 8 3xlO-3M，按照淫羊藿甙粗品（IRF)中淫羊藿试含量 8%計算可換算得出淫羊藿甙濃度為4.08乂10-1,2.64又10-1 ，這種結果與淫羊藿试的半數有效濃度（EC5。）4. 67x1 0-4M， 2. 8 3x1 0-3M相差無幾。說明淫羊藿甙是淫羊藿成分中的主 要藥效成分，並且對陰莖海綿體的鬆他效應較大動脈環強 5. 5倍以上。 淫羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的鬆弛效應機制實驗 1. 在觀察已職膽鹼（N ANC )能神經阻斷劑阿托品（1 0·—6 Μ )對淫 羊藿甙對陰莖海綿體條所引起的鬆弛效應影響的結果表明 ，淫羊藿忒對用阿托品預前處理的陰莖海绵體條所引起的 鬆弛效應較對照組無顯著差異（ρ > 0 . 0 5 )，這說明這種鬆弛 效應不受阿托品的影響。 2. 在觀察前列腺素Ε1抑制劑消炎痛（1 0-4Μ)對淫羊藿杀對陰 莖海绵體條所引起的鬆弛效應的影響的結果表明，淫羊藿 對用消炎痛預前處理的陰莖海綿體條所引起的鬆弛效應 較對照組無顯著差異（ρ> 0 . 0 5 )，這說明這種鬆弛效應不受 消炎痛的影響。結果見表3。 3 .在觀察抑制Ν 0生成或Ν 0活性的試劑Nw - n i ΐ r i c - L -精氨酸 (L-NNA ) (1 0_4M)和連笨三酚（1 0_4M)對淫羊藿祗對陰莖海綿

第17頁 I235〇62 _ 案號 89111805 曰 修正 、發明說明（14) Ν、η、]_十起的鬆弛效應的影響的結果表明，淫羊藿试對用 前處精氨酸（L~NNA)( 1〇1)和連苯三粉（1〇1)預 抑制（D<n 母綿+體條所引起的鬆弛效應較對照組顯著被 作用右. ，廷說明這種鬆弛致應與ΜΟ生成或NO活化 /用有關。結果見表3。 U在2觀4察鳥:舞—酸還化确活性抑制劑亞甲蘭(1〇，）’ 1H- 對淫羊箸咸坐亚〔4, 3,_a〕#喔鱗-卜酮（〇dq)(i〇-4M) ，淫羊ί贰^ 海棉體平滑肌鬆弛作用的影響結果表明 〆壬平萑砍對用亞曱蘭n 4 ) 4,3，-a〕嗱喔办—]闌（）1H〜〔1，2,4〕噁二唑並〔 體條所引起〜酮（0DQ) (10~4M)預前處理的陰經海綿 見表4 政應比對照組顯著被抑制（P<〇. 〇〇1) ’結果 上述實焉会έ士田 、 氧化氮⑽- 羊胸平滑肌的鬆弛效應與一 表3。 馬七醆環化_( CGMP )活化作用有關。結果見 表3破壞内士 / ，消炎痛前處理〜細胞，連苯/盼，亞甲蘭'托6 M)誘發收縮的^交;_淫羊箸截對利用苯福林（PHE;5X1() ^ !海绵體條鬆弛效應的影響。

第18頁 1235062 _案號 8911 1805_年月日_ 五、發明說明（15)

第19頁 淫羊藿貳漾度（Μ) 10" ί(Γ P值 對照組（η二8) L23 ±0,82 4· 42土1.08 |23.12±L 36 i壞内皮細胞 (n:5) 0, 82±0, 58 ： 3. 23土0· 89 丨 15. 68±L 15 <0.001 ί苯三紛前處理 (π-5) 0.85±0.45 3, 45±0. 73 18· 12 土 1· 08 <0.01 虿甲蘭前處理 (n:5) . 0. 52±0. 68 2. 02±0, 45 13. 45±L 12 <0.001 ODQ (n-5) *0. 42进 48 L85±0. 35 ；10. 45±L 08 <0. 001 阿托品前處理 (η 二 5) ;1.21±0.58 4, 11±0·98 21. 78土 1. 06 ML 05 消炎痛前處理 (η=5) L18±0.48 4. 09±1. 08 20. 12±L 14 >0. 05 表4不同濃度O DQ予處理對淫羊S甙對PHE預接觸海綿體肌 肉條的鬆弛作用的反應（P H E ; 5 X1 Ο'·6 Μ ) ODQ濃度 ur? UT 1(Γ5 10-4 Ρ value 淫羊藿贰 鬆弛作用 (%) 4 33±1.22 14· 55土2‘ 4 5 48.02±3·7 8 87. 76±4. 7 8 <0,001 1235062

實驗3淫羊藿甙對磷酸二酯_活性的影響 貫驗方法 1 ·人血小版中分離鱗酸二酯 磷酸二酯_ V型不僅分佈在陰經海綿體，還 版。利用血小版分離出磷酸二酯_ V型，分析藥物對其活 性的景彡響是一種常規實驗方法。其方法是將新鮮人血液（3 6 0gm)離心分離（ 3 6 0g)10分鐘，得出血小板豐富血聚（p^p) ’再將P R P離心分離（1 4 0 0 g ) 1 〇分鐘沈殿血小版。取得1 m 1 沈澱的血小板，用冰冷緩衝液（Hepes 20nM，Sucrous 0. 2 5M，EDTA lmM，苯甲基磺酿氟化物（PMSF ) 1 mM，pH 7· 2 )混 勻漂浮後，用超聲波震盈器（Cell distuptor， Burkard Scientific，Uxbridge，Middlesex，UK)破壞細胞膜。細 胞溶解物遠心分離（7 9 9 g ) 1 0分鐘後，再次連續離心分離（1

65.000g)60 分鐘，取上層液用 pharmacia FPLC (Pharmacia LTD·， Milton Keynes， UK)將複合_ 分離出 來備用。 為了利用Mon o- Q離子交換色譜法提純磷酸二醋雜’利 用M〇n〇-Q柱（5nilx50inm)，緩衝液A 5ml和緩衝液B l〇ml反 覆沖洗後，遠心分離（1 6 5. 0 0 Og)得到的上清液1 0ml ’放入 Mono-Q柱，流速訂為lml /mi η。再讓複合_的活性成分以

第20頁 1235062 曰 修正 案號 89111805 五、發明說明G7) ^1/分鐘的流速通過線性梯度鹽（Unear gI_adient salt) (〇 一 1.5M NaC1)分析各種鍋成分。在所得到的各種_成分 分，測定其活性，收集對活性酿成份，放入液氮瓶備用。 2 ·篩選抑制 活性物質 碟酸二醋_的活性分析在最終反應容量〇 · 丨進行，而 且從加入臨到反應開始的操作在冰上做準備。分析用緩衝 液(Tris 40mM ρΗ8·0，MgCl2 10 mM，BSA 〇·125π^/ιη1，2

-魏基乙醇3· 75 mM)每次使用新鮮配製的緩衝液，被翻作 用物〔2H〕cGMP(ca. 28 ci/mm〇l; ca i()()，QQQ c p m / 1 〇 〇 // L )是事前用分析用緩衝液做好準備備用。p p e v 型的活性檢測方法是利用〔3 Η〕c G Μ P標記的同位素兩步分 析法。測定時將〔3H〕cGMP 2 0 0 pL加入試管内，再加入被 試物質（淫羊藿或1 〇-1。从-10—4M)或對照物用同量DMSO)100 # [ 和提純的碟酸二酯_ 1 〇 〇 p L，再加入緩衝液到〇 · 5 ίη 1，在 3 0 C恆溫下反應2 0分鐘後，將試管浸入開水中以終止反應 。反應終了後試管内加入蛇毒（ophiophagUS Hannah;

Sigma Chemical Co) 100 //L (ling /ml)，30°C 恆溫下孵 化1 0分鐘，將〔3 Η〕5 - G Μ P轉化成〔3 Η〕鳥备。被轉換的 〔3Η〕鳥笼在八01-乂2 resion (Bi〇〜Rad)反應器中，利用 NaOH (0 • 1 N)在離子交換柱型色譜分析洗脫後得到的樣品，測定其 放射性來分析磷酸二酯輪V的活性。 3. 貫驗結果

第21頁 1235062 _案號 891Π805 年月日_i^jL 五、發明說明（18) 本實驗結杲淫羊藿甙對磷酸二酯酶V活性有濃度依賴性抑 制作用（l〇-sM， 0.06%: 10_7M， 32.7%; 10~βΜ， 56.2%; iO 5M， 83· 7% : 10〜4M， 99.9½) ，EC50 為(K43yM。見下表。 表5淫羊藿贰對磷酸二酯鲢V活性的抑制作用（¾) 濃度 10、 10"5M 1(ΤΜ 1(Γ7Μ 10，1(Γ9Μ 淫羊藿贰 99· 7 87. 9 63.2 42 2 0 通過實驗證明，淫羊藿甙對陰經海錦體比對大動脈環有強 大的鬆弛作用，而且淫羊_甙的陰經海绵體平滑肌的鬆弛 作用的機制是，通過增加NO的生成和鳥磷酸環化酶活化作 用，並抑制鐵酸二酯酶的活性來阻止c G Μ P的滅活，使陰經 海轉體半滑肌内Cg mp濃度增加而鬆弛陰經海錦體，誘發陰 莖勃起。 實驗4 臨床效杲 為了暸解淫羊藿甙的臨床效果，在5 6名性功能障礙為主 述並自願受試者為物件利用國際性功能評價詢問表 (I η t: e r π a t; i ο n a 1 Index for Sexual Function, I I E F - V ) 進行了安慰劑對照，二重雙盲預備臨床試驗。被試者平均 年齡為3 9 土 6 * 1歲，發病期間為5 , 4 土 3, 7年。其中患糖尿病 1 7例，高血壓病9 (列，心臟：病8例c 實驗藥品（含淫羊藿武5 0 in g /片）和安慰劑包裝相同。透 1235062 案號 89111805 年 月 臼 修正 五、發明說明（19) 藥者和服藥者均不知道藥品情報的條件下進行實驗。被選 的自願者不隨機的分成兩組，投用安慰劑或實驗藥品（2片 /次，3次/日），口服1個月。患者在投藥前和服藥完了後 分別添寫性功能評價詢問表（共5項，各項5度評分），比較 用藥前後的性功能變化通過S t u d e η 1: ΐ 1: e s ΐ分析來評價藥 效。 實驗結果，在治療前受試者性功能評價分數分別為，對 勃起和勃起的維持功能的自信感評分為1. 8 2 ± 0 . 5 4，陰經 可插入陰道的勃起頻度評分為1. 8 9 ± 0. 6 7，性交時陰莖插 入陰道並維持勃起的評分為1. 8 2 土 0 . 6 5，性交時陰莖勃起 和勃起維持困難評分為1 . 8 9 ± 0. 6 1，對性生活的滿足度評 分為1. 7 9 ± 0 . 6 2。治療後性功能評分分別為，對勃起和勃 起的維持功能的自信感評分中淫羊藿甙組為3. 3 2 ± 0. 3 9， 安慰劑為2. 0 4 ± 0. 6 3，陰莖可插入陰道的勃起評分中淫羊 藿 組為3 . 1 1 ± 0 . 3 2，安慰劑為2 . 0 了 ± 0 · 8 8，性交時陰莖 插入陰道並維持勃起的頻度評分中淫羊藿袼組為3. 1 8 ± 0. 4 7，安慰劑為2. 1 7 ± 0 · 9 7，性交時陰莖勃起和勃起維持困 難評分中淫羊藿该組為3 . 2 5 ± 0 . 4 3，安慰劑為2 · 1 8 ± 0 · 9 2 對性生活的滿足度評分中淫羊藿禚組為3. 3 6 ± 0 . 4 7，安慰 劑為2. 1 4 ± 0 . 9 5，服用淫羊蜜甙片組的評分比較安慰劑顯 著增高（Ρ<〇. 01 )。總體臨床效果淫羊藿迖片組和安慰劑分 別為75. 4%和3 5. 4%。除4名患者有輕微的胃腸道反應外未 發現明顯的副作用。患糠尿病、高血壓和心臟病患者在臨 床效果和副作用方面並顯著差異，結果見下表。

第23頁 1235062 修正

_案號89111805_年 月 五、發明說明（20) 表5淫羊笤貳對性功能陳礙治療效果的HgF評分表. 賞驗藥物 對涂莖勃起和 勃起維待的自 信感 能夠插入飧 道的勃起頻 度 性交時陰莖勃 起和勃起維持 到性交的頻度 對陰莖勃起 和勃起維待 的難度 對性生活的 滿足度 治療 治療 治療 治療 治療 治療 治療 治療 治療 前 後 前 後 前 後 前 後 前 後 淫羊菝贰1.82 土 3. 32土 1.89± 3. U 土 L82 士 3. 18± L89± 3. 25士 L79± 3, 36士 Μ 〇. 54 0. 39 0.67 0. 32 0.65 0.47 0.61 0.47 0,62 0.47 (π-280) 安慰劑 2.04± 2. 07土 2.17 土 2· 18 土 2. !4± (π-28) 0.83 0.88 0. 97 0.92 0.35 Ρ ίί 0. 002 0.001 0.01 0.002 0.001

弟24.頁 1235062 案號 89111805 年 月 修正

第25頁

Claims (1)

1235062 案號89111805 年月日 修正 圍 範 利 專 請 申 % 六 藥 的 縮 收 管 血 和 礙 障 匕b 厶月 功 性 療 治 或 防 預 於 用 種 甙克 藿毫 洋00 淫 5 二 分含 成合 性組 活物 為藥 作的 括述 包所 其中 ，其 合 ， 組劑 物形 藥 之 述 所 項 r—Η 第 圍 範 利 專 請 申 據 依 2 賦 ， 和。中 體戒其 載藿， 用羊合 藥淫組 及的物 性 述3 所 該 功 功 起 勃 是 礙 障 第 圍 範 利 專 請 申 據 依 其 合 組 物 藥 之 述 所 。項 障或 藥 的 礙 障 能 功 起 勃 療 治 或 防 預 於 用 是 合 組 物 藥 述 所。 該合 ,組 中物 中 據 良Μ 忙物 4藥 述 所 第 圍 範 利 專 •物 5藥 述 所 •物 6藥 述 所 據 據依：：依 合纟合 是 中 片 囊 該 中 其。 ，液 合浮 組懸 物或 藥液 之溶 述、 所劑 項丸 範 利 專 或 劑 片 是 合 組 物 藥 之 述 所 項 4 第 圍 亥 =口 中 其 囊 該 中 其 合 組 物 藥 之 述 所 項 IX 第 圍 範 利 專 請 中 有 含 合 藿 羊 淫

第26頁 1235062

第1胃