TWI233945B - Rice alpha-amylase transcriptional enhancers - Google Patents

Description

0) 1233945 玖、發明說明 (發明說明應敘明··發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 菸明所屬之技術頜媸 本發明係關於水稻α -;殿粉水解酶基因促進子，其 < 用 來增加基因轉殖植物細胞中，或基因轉殖植物中的啟動子 活性。 發明背景 各種不同策略已廣為使用來增加在基因轉殖植物中的 啟動子之活性。一種策略是使用促進子，增加與該促進子 同種或異種之啟動子的轉錄活性。該策略可用來產生過度 表現用以控制農業上的重要特性或生物分子的過度產生 之内源或外源基因的基因轉殖植物。 内容 本發明係關於水稻α ·澱粉水解酶基因促進子，其可用 來增加基因轉殖植物細胞中，或基因轉殖植物中的啟動子 活性。 一方面，本發明的特徵在於重組核酸，其含有得自水稻 a Amy8基因的轉錄促進子；與該促進子異種的啟動子， 其可經操作與該促進子連接；以及可經操作與該啟動子連 接’並編碼轉錄本的密碼序列。轉錄本可在諸如單子葉植 物（m〇nocot)(例如穀類）之類的植物細胞中編碼多肽，或 可以是干擾其他RNA(例如mRNA、轉移RNA、核糖體 RNA，和小形核rna)之功能的RNA。 水稻a A m y 8基因促進子的一個實例為如下所示 s E q IDNO:l，也就是aAmy8的鹼基對- 318至- 89:

1233945 (2) CGTCATGCGTGATCGGTGATCGATCACCGAGAGAGACCGGACGACGAGTCGA GAGAGCTCGCGCCGCCTCGATCGGCGCGGCGGTGACTCGAGCAGGGCCTGAAGTAG CTGCACGGCTCAAGGCGGCACTCCATCACCGGACACCGGGGTCCAGACTACTCGTTT CCGTTGGAGAAATAACCACCTTTATCCATGTTGCTTATCCGTGAATTGCAACAGCAT TGATTGTT( S E Q ID N 0 : 1) 另一方面，本發明之特徵為重組核酸，其含有多個得自 水稻a Amy8基因的轉錄促進子（例如2、3或4個副本）； 可經操作與該促進子連接之與該促進子同種或異種的啟 動子；以及可經操作與該啟動子連接，並編碼轉錄本的密 碼序列。 本發明之重組核酸可導入植物細胞内，產生穩定轉形細 胞，可進一步栽培至產生基因轉殖植物。這類穩定轉形植 物細胞，和基因轉殖植物，均在本發明的範圍内。 含有包括多個得自水稻aAmy3基因之轉錄促進子；可 經操作與該促進子連接之與該促進子同種或異種的啟動 子；以及可經操作與該啟動子連接，並編碼轉錄本之密碼 序列的重組核酸之穩定轉形植物細胞，或基因轉殖植物， 亦在本發明的範圍内。 水稻a Amy3基因促進子的實例，包括如下所示SEQ ID Ν0:2(α Amy3 的鹼基對-186 至- 82)、SEQ ID Ν0··3(α Amy3 的鹼基對-133至- 82)，和SEQIDNO:4(aAmy3的鹼基對 -186 至-122):

ATCCCGTCGCCTTGGAGACCGGGCCCCGACGCGGCCGACGCGGCGCCTAC

GTGGCCATGCTTTATTGCCTTATCCATATCCACGCCATTTATTGTGGTCG

1233945 (3) TCTCT(SEQ ID N〇：2)， GCCATGCTTTATTGCCTTATCCATATCCACGCCATTTATTGTGGTCGTCT CT(SEQ ID NO :3) ^ 和 ATCCCGTCGCCTTGGAGACCGGGCCCCGACGCGGCCGACGCGGCGCCTAC GTGGCCATGCTTTAT(SEQ ID N〇：4)。 本發明提供在穩定轉形植物細胞或基因轉殖植物中，高 度活化並緊密調節内源或外源基因表現的系統。a Amy3 和a Amy8促進子以感糖性、荷爾蒙反應性、組織專一性， 及依賴發育階段的方式，增加啟動子的活性，並可用於發 展可過度表現疾病-、昆蟲-或緊迫-抵抗力基因及編碼具 有商業價值多肽的基因之植物系統。 在下文的說明中，陳述本發明的一些具體實施例的細 節。將可從說明和申請專利範圍中瞭解本發明的其他特 徵、目標和優點。 實施方式 本發明係關於水稻α -澱粉水解酶基因促進子，其可用來 在轉形植物細胞中，或在基因轉殖的植物中增加啟動子之 活性。 α -澱粉水解酶是在穀類穀物的發芽期間，水解儲存在 胚乳中之澱粉的主要澱粉水解酵素，以提供胚芽生長所需 的營養。在穀類中，係藉著赤黴素（GA)和糖饑餓兩者誘 導α -澱粉水解酶基因的表現。水稻α -澱粉水解酶同功異 構酶至少被9個基因編碼（Thomas，B.R.，和Rodriguez，R丄.（1994) PlantPhysiol 106:1235-1239)，其中 a Amy3 和 a Amy8 是可由糖 1233945

(4) 饑餓高度謗導。先前已經在aAmy3中確認出105 -個驗基 對的糖反應序列（S R S )，其係為前述之s E Q ID Ν Ο : 2 (L u 等人（1998) J Biol Chem 273:10120-10131)。 在本發明中，發現在水稻aAmy8基因中的230 -個鹼基 對序列（削述之S E Q ID Ν Ο · 1)可提南植物細胞中啟動子的 活性。該促進子位在a Amy8的鹼基對_318至-89 ,並包含在 位置- 266至-236處之31個驗基對的gc盒子（GC box)，以及 在轉錄起始位置之上游位置-131至-126處之TATCCA元件， 兩者皆保留（conserved)在 aAmy3 SRS(也就是 SEQ ID NO:2) 中。其亦含有與c-Myb-結合位置（Nakagoshi等人（199〇) JBi〇1

Chem 265:3479-3483)和 GA 反應序列（GARS)(Gubler 等人（ 1 999) ?1&1^了17:1-9)同種的序列，這兩個均未出現在“八11^33113 中。因此將該230個鹼基對的a Amy8促進子及其變體命名 為 a Amy8 SRS/GARS 〇 比S E Q ID Ν Ο : 1長或短的序列（例如^ Amy8的驗基對·200 至-89)亦可作為促進子，只要藉著在下文實例中描述的方 法，或藉著類似的方法判定其顯露出促'進子活性即可。亦 可使用具有核酸變異之序列，例如因為多型現象或重組遺 傳操作的結果’亦可作為促進子。例如’具有重覆之 TATCCA元件的經修飾a Amy8促進子，在水稻胚芽中之活 性增加6倍。確實，在本發明的範圍内亦企圖包括含有仍 保留促進子活性之這類序列變異體的重組的核酸，穩定轉 形植物細胞，以及基因轉殖植物。 因此，本發明之特徵為含有得自水稻a Amy8基因之轉錄 1233945

(5) 促進子（也就是a Amy8 SRS/GARS)的重組核酸，其可用於產 製轉形細胞和基因轉殖植物。本發明之重組核酸可以是本 有得自水稻a Amy8基因之轉錄促進子；可經操作與該促 進子連接之與該促進子異種的啟動子；和可經操作與該啟 動子連接’並編碼轉錄本之密碼序列的核酸片段。它也可 以是質體或病毒載體，其含有剛剛說明的核酸片段。

轉錄本可以是在植物細胞中，干擾其他RNA功能的 RNA，例如防止mRNA轉譯成多肤，或謗發特定的rna降 解’以助於標的之轉錄後基因不活動（Mol等人（1990) FEBS

Lett268(2):427〇0 和 Fire 等人（1998) Nature 391:806-811)。另者， 該轉錄本可編碼在改良基因轉殖植物之某些特性上所需 要的多肽’或在轉形植物細胞或基因轉殖植物中過度產生 多肽所需要的多肽。欲有助於回收該過度產生的多肽，可 將編碼信號肽的序列整合到上述的重組核酸中之適當位 置’例如在啟動子和該多肽之密碼序列之間。結果，該多 肽將被分泌到細胞培養基中，或發芽種子中的胚乳中，藉 此利於其回收。 因為a Amy8 SRS/GARS促進子係以劑量-依賴性之方式增 進啟動子的活性，所以該重組核酸最好含有多個（例如2、 3或4個副本）得自水稻α Amy 8基因的轉錄促進子；可經 操作與該促進子連接之與該促進子同種或異種的啟動 子；以及可經操作與該啟動子連接，並編碼轉錄本的密碼 序列。 當使用多個促進子副本時，其不需要以彼此相同的方向

1233945 放置它們。再者，在促進子的兩個副本之間，可出現插入 的序列（例如50-100個鹼基對的長度或更長），其限制條件

為它不得干擾促進子的功能。通常，如果使用太多的促進 子副本（例如超過4個副本），當載體在細菌中複製時，它 們可能經由重組作用而接合到載體之外。此外，太多的促 進子副本可能在基因轉殖植物中引起基因不活動。因此， 雖然啟動子的活性通常隨著促進子副本數目成正比地增 加，但可藉著在下文實例中描述的方法，或藉著類似的方 法，判定促進子之實際最大的副本數目。

在本發明重組核酸中使用的啟動子，可以是在那裏都具 有活性的，像是衍生自肌動蛋白基因、花椰菜鑲嵌病毒 35S(’’CaMV35Sf’)RNA，或泛素基因的；或可以是可誘導的， 像是衍生自α -殿粉水解酶（例如水稻a Amy3、a Amy6、α Amy7、a Amy8或a Amy 10基因，其為糖-反應性的；參見美 國專利第5,460,952號）、轉化酶、蔗糖合成酶、馬鈐薯塊 莖儲藏蛋白（patatin)、/3 -澱粉水解酶、甘薯塊根儲藏蛋白 (sporamin)或光合成基因的。在本發明的重組核酸内，亦可 包括額外的轉錄調節元件，像是其他的促進子，以便高度 激活並緊密調節啟動子的活性。 可將本發明的重組核酸（例如含有得自水稻a Amy8基因 之轉錄促進子的重組核酸）導入植物細胞内，產生穩定轉 形細胞，其可進一步栽培產生基因轉殖植物。這類穩定轉 形植物細胞和基因轉殖植物皆在本發明的範圍内。 含有包括多個得自水稻a Amy3基因之轉錄促進子的重 -10- 1233945

組核酸；可經操作與該促進子連接之與該促進子同種或異 種的啟動子；和可經操作與該啟動子連接，並編碼轉錄本 之密碼序列的穩定轉形植物細胞和基因轉殖植物，亦在本 發明的範圍内。水稻a Amy3基因促進子的實例包括SEQ ID NO:2(aAmy3 的鹼基對-186 至-82)、SEQ ID Ν0:3(α Amy3的驗基對-133至- 82)和SEQ ID Ν0:4(α Amy3的驗基 對-186 至-122)。 a Amy3 SRS(例如S E Q ID N 0 : 2、3或4)在糖-饑餓的水稻 原生質體中，提高了啟動子之活性（Lu等人（1998) JBiol Chem 273:10120-10131)。意外的是，在穩定轉形的水稻懸浮細胞 中，a Amy3 SRS明顯地增加了啟動子活性，而與細胞有或 無補充糖來培養無關。啟動子在穩定轉形細胞中的活性， 也比在原生質體暫時表現系統中的活性高很多。 a Amy3 SRS和a Amy8 SRS/GARS兩者在基因轉殖水稻中提 高了啟動子活性。a Amy3 SRS以組織-不依賴的方式提高啟 動子活性，而a Amy8 SRS/GARS則主要在發芽水稻種子的胚 乳和胚芽中提高啟動子活性。此外，a Amy8 SRS/GARS的促 進子活性，係受水稻胚芽中的糖阻遏和GA謗導作用所影 響，而糖阻遏可壓過GA誘導作用。因此，在穩定轉形植 物細胞或基因轉殖植物中，a Amy3 SRS和a Amy8 SRS/GARS 可用來調節内源或外源基因的表現。 下文的特定實例主要是作為解釋之用，並非企圖以任何 方式限制其餘的揭示内容。無需進一步推敲，咸相信熟諳 此藝者可以在本文中的說明為基礎，使用本發明至其最充 1233945 ⑻

分的程度。所有在本文中提及的出版物均完整地以引用的 方式併入本文中。 實例 實驗程序 (1)植物材料 在這些實例中使用的水稻種類為水稻台農 67號 (Oryzasativa L· cv. Tainung 67)。將不成熟的種子脫殼，以 3 % N a 0 C 1滅菌3 0分鐘，以無菌水徹底沖洗，並放在N 6 D 瓊脂培養基（Toki，S.(1997) Plant Mol Biol Rep 5:16-21)上，進行愈 傷組織（callus)的誘導。在1個月之後，在新鮮的N6D培養 基上繼代培養衍生自值片（scutellum)的愈傷組織，以便進行 轉化作用。 (2)質體建構 為了建構含有Act 1-Luc嵌合基因的質體，首先藉著以 EcoRI 切割，移除在 pBluescript SKII+(Stratagene)之多重選殖 位置中的EcoRI位置，然後將末端弄鈍並再度連接。利 用Hindlll，從pDM302中切下水稻的Actl 5*區域（包括 1.4kb之5 W則面序列，7 9個鹼基對的5 ’非密碼表現序列， 447個鹼基對的5’插入序列和25個鹼基的第一個密碼表 現序列）（Cao 等人（1992) Plant Cell Rep 11:586-591)，並繼代選 殖到缺乏 EcoRI位置之 pBluescript中的相同位置内，產生 pAct。使用寡核甞酸 5，-CCC〇Mri£ATCCCGTCGCCTTGGAGA-3，（ SEQ ID N0:5，下標線者為 EcoRI位置）作為 5·引子，和 5，-CCCGAATTCAGAGACGACAATAAT-3，（ S E 0 ID NO :6，下標線者為

-12- 1233945

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EcoRI位置）作為3’引子，以及p3G-132n(Lu等人（1998) J

341(：1^111 273:10120-10131)(其含有〇：八11^3的1.71^5，區）作為 DNA模板，以PCR-擴大水稻α Amy3 SRS(相對於a Amy3 之轉錄開始位置為-186至-82)。以EcoRI切割含有SRS 的DNA片段，並以三個縱列重覆段且與該啟動子相同之 方位，將其插入 Actl啟動子的 EcoRI位置内，產生 pACT-3SRS。從 pJD312(Luehrsen 等人（1992) Methods Enzymol 216:397-414)中切下含有Luc密碼序列-Nos終止轉錄序列的 融合序列的Sall-Bglll片段，弄鈍末端，並插入pAct和 pAct-3SRS 的 Smal 位置内，產生 pB-Act-LN 和 pB-Act-3SRS-LN。利用 PstI 將 pB-Act-LN 和 pB-Act-3SRS-LN 弄 直，並插入在二元載體pSMYlH(Ho等人（2000) Plant Physiol 122:57-66)中的相同位置内，其含有35S啟動子-Hph密碼區 -腫瘤形態學大基因（Tml)終止轉錄序列的融合基因，藉此 產生 pAct>LN 和 pAct-3SRS-LN。

(3)水稻的轉形 利用電穿透器（BTX，San Diego)，根據製造者的指示，將質 體 pAct-LN 和 pAct-3SRS-LN 導入農桿菌 株（Hood 等人（1986) J Bacte-riol 168:1291-1301) 内。將從不成熟的水稻種子中誘導出的愈傷組織與根癌土 壤桿菌一起培養，並根據Hiei等人（Plant J 6:271-282，1994) 和 Toki(Plant Mol Biol Rep5:16-21，1997)描述的方法，從愈傷組 織中再生假定的基因轉殖植物。 (4)懸浮細胞培養 -13 -

1233945 (10) 按照先前 Yu 等人（J Biol chem 266:21131-21137，1991)的描 述，繁殖經過轉形的愈傷組織。按照先前Lu等人chem 273:10120-10131，1998)的描述，繼代培養已確立的懸浮細胞。 (5 )蟲螢光素酶活性測定

利用 CCLR 緩衝溶液（l〇〇mM KH2(P〇4)，ρΗ7·8, ImMEDTA，10% 甘油，1% Triton X-100, 7mM /3 -巯基乙醇），從經過培養的懸 浮細胞或植物組織中，萃取全部蛋白質，並利用考馬斯 (Coomassie)蛋白質測定試劑（Pierce)，判定蛋白質之濃度。按 照先前的描述（Lu 等人（1998) J Biol Chem273:10120-10131)，進 行蟲螢光素酶活性測定。 實例1 a Amy8 SRS/GARS在基因棘殖永稻中提高Act 1啟 動子的活十生

將a Amy8 SRS/GARS促進子，其包括a Amy8啟動子的位 置-3 1 8至-8 9，以三個縱列重覆段並與Act 1啟動子相同之 方位，插入Actl啟動子的位置-459處，並測試其在基因 轉殖水稻中對A c 11啟動子活性的影響。 使攜帶 Actl-Luc 和 Actl-8SRS/GARS-Luc(pAct-8SRS/GARS-LN) 嵌合型基因的轉形愈傷組織再生，自體受精三代’獲得 T3同種接合子的種子。藉著25個基因轉殖種子，在含有 5 0克/毫升潮黴素的水中發芽7天，判定基因轉殖種子的 同種接合性（homozygosity)，並計算生長中之秧苗數目對未 生長之秧苗數目的比例。理論上，與轉殖基因為同種接合 子之基因轉殖株的種子，在相同的條件下，應該全部發芽 並生長。 -14- 1233945 〇1)

使基因轉殖株Act6-9-l和Act(8SRS/GARS)5的T3同種接合 之種子發芽和生長8天。收集秧苗的各種組織，並測定蟲 螢光素酶活性。意外的是，a Amy8 SRS/GARS促進子主要在 發芽之種子和秧苗的胚乳和胚芽中，增加Actl啟動子的 活性。 亦將a Amy8 SRS/GARS促進子融合在CaMV35S最小啟動子 -L u c融合基因的上游，然後將其導入水稻基因組内。獲 得數個基因轉殖水稻品系，並使一個隨機選擇品系T 4 -1 2 的T2種子發芽6天。收集已發芽之種子的各種組織，並 測定蟲螢光素酶活性。發現在胚乳和胚芽中的蟲螢光素酶 活性，分別是在根部的74和20倍，而在嫩芽中的蟲螢光 素酶活性與在根部的類似。這些發現顯示a Amy8 SRS/GARS 促進子，在發芽之基因轉殖的水稻種子中，賦與對最小啟 動子的胚乳和胚芽比活性。 在第二個實驗中，以2,4-D預先處理得自上述之基因轉 殖品系T4-12的同一批T2種子8天。收集胚芽，並分成 4組。將每組胚芽以含或不含蔗糖，以及含或不含GA之 條件下培養2天，並測定蟲螢光素酶活性。在蔗糖的存在 下，胚芽中的蟲勞光素酶活性是相對較低的，與GA是否 存在無關。在缺乏蔗糖和GA兩者時，在胚芽中的蟲螢光 素酶活性明顯地增加5.5倍。在缺乏蔗糖下添加GA ,提 高蟲螢光素酶活性8.2倍。 在第二個貫驗中，移除得自基因轉殖品系τ 4 -丨2之T i 種子的胚芽，以便除去GA的來源。然後將胚乳分成4組。

-15- 1233945

(12) 將每組胚乳以含或不含蔗糖，以及含或不含GA之條件下 培養2天’並測定蟲螢光素酶活性。在缺乏GA之下，在 胚乳中的蟲勞光素酶活性是低的，與蔗糖是否存在無關。 在GA和篇糖兩者都存在時，在胚乳中的蟲螢光素酶活性 增加了 4倍。在Ga的存在下移除蔗糖，不改變蟲螢光素 酶活性。這些結果證實α Amy8 SRS/GARS促進子在水稻胚芽 和胚乳中’賦與對最小啟動子的GA反應性。 實J…·2在穩形水稻縣浮細胞中，a Amy3 SRS提高了 Actl的啟動子活 將螢火蟲的蟲螢光素酶基因（Luc)融合在Actl啟動子的 下游，或含有a Amy3 SRS之3個縱列重覆段的A c 11啟動 子的下游，產生Actl-Luc和Actl-3SRS-Luc。藉由土壤桿菌 (jgrokckn·謂）-調節的轉形作用，將所得的嵌合基因導入水 稻基因組内。獲得數個轉形細胞株，並對每種構築體隨機 選擇4個品系，進行進一步的研究。

經轉形的愈傷組織經培養成懸浮細胞。然後在接受螢光 素酶活性測定之前，先在有或沒有蔗糖的培養基中培養這 些細胞2天。在薦糖-饑餓的細胞中’由野生型A c 11啟動 子所賦與之螢光素酶活性是極低的。它比在提供蔗糖之細 胞中的螢光素酶活性低6奚8倍。相反的，在蔗糖-饑餓 的細胞中，由Actl-3SRS啟動子所賦與之螢光素酶活性大 量地增加，較在提供蔗糖細胞中的增加大約2 - 5 · 5倍。意 外的是，Actl-3SRS啟動子赋與明顯較高的螢光素酶活性， 而與該細胞是否供應蔗糖培養無關’也就是說，a Amy3 SRS

1233945 (13) 在提供蔗糖的細胞中，平均提高了 Act 1啟動子活性3倍， 而在蔗糖-饑餓的細胞中，提高至少 2 0倍。這些結果表 示，在穩定轉形水稻懸浮細胞中，藉著a Amy3 SRS整合到 Actl啟動子内的作用，明顯地提高了蟲螢光素酶的表 現。此外，a Amy3 SRS將糖-可謗導的Act 1啟動子，轉變 為糖饑餓-可謗導的啟動子。

實例 3 a Amy3 SRS在基因轉殖水稻中提高了 Ac11啟動 子的活性

使 4個攜帶 Actl-Luc之基因轉殖品系和 8個攜帶 Actl-3SRS-Luc之基因轉殖品系的 T3同種接合子的種子發 芽並生長8天。收集得自秧苗的葉片，並測定蟲螢光素酶 活性。在所有攜帶相同構築體之基因轉殖品系的葉片中， 螢光素酶活性並沒有顯著的差異。在不同轉形物中，由 Actl-3SRS啟動子所賦與之平均螢光素酶活性是類似的：比 由Actl啟動子所賦與的更高大約2.5至3倍。這些結果 表示a Amy3 SRS在基因轉殖水稻中通常地提高了 Act 1啟 動子的活性。 意外的是，a Amy3 SRS所增進Act 1啟動子之活性係受 發育調整的。使基因轉殖品系Act6-9-l和Act(3SRS)5-15-l之 T3同種接合子的種子發芽並生長某段期間。在2週之後， 在發芽種子和秧苗的各種組織中，Actl-3SRS啟動子賦與比 A c 11啟動子更高的蟲螢光素酶活性。在提高蟲螢光素酶 活性上的差異，在根部是差異最大的（5至5 6倍），接下 來是在嫩芽（4至11倍）和胚芽（3至18倍）中。在發芽後 -17- 1233945 (15)

具體實施例亦在下列的申請專利範圍之範圍内。

-19- 1233945 序列表 <ilO>中央研究院 < 12 0 > 水稻α s殿扮酶轉錄促進子 <130> 08919-076001 <140> TW091134177 <141> 2002-11-25 <150> US 10/060,515 <151〉2002-01-31 <160> 6

<210> 1 <211> 230 <212> DNA <213>水稻 <400> 1 cgtcatgcgt gatcggtgat gcgccgcctc gatcggcgcg aggcggcact ccatcaccgg ccacctttat ccatgttgct cgatcaccga gagagaccgg gcggtgactc gagcagggcc acaccggggt ccagactact tatccgtgaa ttgcaacagc acgacgagtc gagagagctc tgaagtagct gcacggctca cgtttccgtt ggagaaataa attgattgtt 120 ISO 230 <210> 2 <211> 105 * <2X2> DNA <213>水稻 <400> 2 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc tctattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct <210> "3 <211> 52 <212> DNA <213> 稻 50 105

<400> 3 gccatgcttt attgccttat ccatatccac gccatttatt gtggtcgtct ct <210> 4 <211> β5 t <212> DNA <213>水稻 52 <400〉 4 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc tttat es

<210> 5 <211> 27 <212> DNA 1233945 <213 > 人工序列 <220> <223 >合成引子 <400> 5 cccgaattca tcccgtcgcc ttggaga <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 合成引子 <400> 6 cccgaattca gagacgacaa taat

Claims (1)

1233945 第091134177號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(94年3月） 拾、申請專利範圍 .正 '補充本〜…丨 1 · 一種重組的核酸，其包括： 得自水稻a Amy8基因的轉錄促進子； 可經操作與該促進子連接的啟 促進子是異種的；以及 可經操作與該啟動子連接，I編碼轉錄本的 列； 其中該轉錄促進子為SEQ ID NO.1。 2.根據申請專利範圍第丨項之核酸，其中該轉綠 多肽。 ’ 3 · —種重組的核酸，其包括： 多個得自水稻a Amy8基因的轉錄促進子·， 可經操作與該促進子連接的啟動子；和 可經操作與該啟動子連接，並編碼轉綠本的 列； 其中該核酸包括該促進子的2、1Z , ]Z 3或4個副本 轉錄促進子為SEQIDN〇:i。 4. 根據申請專利範圍第3項之核酸，其中該轉 多肽。 ^ 5. —種製備穩定轉形植物細胞或基因轉殖植物的 其包括將重组核酸轉移至該細胞或植物内，該 酸含有 得自水稻a Amy8基因的轉錄促進子·， 可經操作與該促進子連接的啟動子，該啟 該促進予是異種的；以及

予與讀 会碼序 本編 碼 密碼序 ’且該 本編碼 方法， 重組核 動子與 79147-940302.doc 1233945 可經操作與該啟動子連接，並編碼轉錄本的密碼 序列； 其中該轉錄促進子為SEQ ID NO: 1。 6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該轉錄本編碼 多肽。 7. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該植物為單子 葉植物。 8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該植物為穀類 植物。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該植物為水稻。 10. —種製備穩定轉形植物細胞或基因轉殖植物的方法， 其包括將重組核酸轉移至該細胞或植物内，該重組核 酸含有 多個得自水稻a Amy8基因的轉錄促進子； 可經操作與該促進子連接的啟動子；以及 可經操作與該啟動子連接，並編碼轉錄本的密碼序列； 其中該核酸包括該促進子的2、3或4個副本，且 該轉錄促進子為SEQ ID ΝΟ:1。 11. 根據申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該轉錄本編碼 多肽。 12. 根據申請專利範圍第1 0項之方法，其中該植物為單子 葉植物。 13. 根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中該植物為穀類 植物。 14. 根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中該植物為水稻。 79147-940302.doc