TWI228147B - An attenuated Japanese encephalitis virus adapted to Vero cell and a Japanese encephalitis vaccine - Google Patents

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1228147 A7 B7 五、發明説明（ 發明摘要說明 發明領域 請 先 闕 讀 背 面 之 注 意 事 項 丨再 填 寫 本 頁 本發明係指一種藉繼代培養至Vero細胞而適應於 Veto細胞的減毒日本腦炎病毒與一由該減毒病毒組成之 曰本腦炎疫苗。 先有技術說明 曰本腦炎(JE)係一種以蚊子為傳染媒介的節肢昆蟲病 毒疾病’在亞洲的公共衛生上極具重要性。每年在該地區 據報至少有三萬五仟個案例，其中，死亡的超過一萬人， 但官方的報導，無疑比實際的個案數還少（okuno, T· World Health Stat Q· 3:120-31，1978; Umenei，Τ· et al·，Bull World Health Org.63:625-31，1985)。此一疾病可能出現的 徵狀為發燒性頭痛癥候群、無菌性腦脊髓膜炎或腦炎，而 且一半存活者傾向於具有永久性神經性與心理性的後遺症 (Burke, D. S. et al. The Arborivrus: Epidemiology and Ecology 3:63-92，1988; Monath，T.P· Virology 763-814, 1990) 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 曰本腦膜炎病毒是一種66型黃熱病病毒屬 (Flaviviridae)，具套膜、單股正極之核醣核酸病毒，此種病毒 大多數係由媒介物傳載（Chambers，T.J· et al· Ann· Rev. Microbio· 44:649_88，1990)。形態學上，黃熱病病毒為球 狀，直徑約40nm，由ΙΙ-kb基因體與蛋白衣殼(C)所形成 的核殼蛋白體及圍繞在外的脂質雙層膜所組成（1?^6，（：.％· et al，Science 229:726-33, 1985)。膜表面突狀物係由醣基化 尺度適用中國國家榡隼（CNS ) A4規格{ 210X297公釐） 1228147 A7 B7 五、發明説明（） 套膜(E)蛋白與細胞膜(M)蛋白組成。在細胞内的初生病毒 粒子中的前-M醣蛋白，依解離成Μ蛋白質而出現在細胞 外的成熟的病毒粒子，包括血液凝集反應、病毒中和、病 毒粒子組合、膜熔合與病毒結合到細胞受體等重要的生理 活性與 53-kd Ε 蛋白有關（Koshini，E，et al. Virol. 188:714-20, 1992)。 共有二種人體使用的JE疫苗（Tsai，Τ· et.al. Vaccines 617-713，1993)。其中只有在老鼠腦中所生產的去活性jE 疫苗在國際間通用。行銷國際的去活性JE疫苗大部分是大 阪大學微生物疾病研究基金會(Biken)所生產的；該疫苗於 一九九二年獲得美國執照，交由Connaught Laboratories， Inc·以JE_VAX™的名義經銷。初級倉鼠腎臟細胞（phk)所 配製的去活性與減毒JE疫苗僅在中國境内行銷。. 經濟部智慧對產局員工消費合作社印製 由老鼠腦中所製得的去活性JE疫苗係在一九五四年 獲得日本的執照。由於生產方法係藉著幼鼠腦注射，不僅 製造相當費時費力，而且還有可能產生與疫苗相關的神經 學副作用。雖然後績在製程方面完成多項改良以提高該種 疫苗的純度與效力（Oya，A· Vaccination Theory and Practice J· 11:25-39, 1968)，直到最近還是陸績有報告指出 相當程度的局部與輕微全身性反應(Hoke，C.H. et al. New Engl J Med. 319:608-14, 1988; Poland, J.D. et al5 J Infect Dis. 161:878-82, 1990; Sanchez, J. L. et al. Lancert 335:972-73, 1990)。經報導有百分之二十（2〇%)疫苗的注射 部位出現局部觸痛、發紅以及/或腫大。百分之十（10%)至 適用中國國家樣隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 1228147 五、發明説明（） 百分之三十（30%)的疫苗則是會出現輕微的全身性癥候 群，主要為頭痛、輕微發燒、肌痛、不適、與腸胃癥候群。 為人注意到新近出現的不良反應模式自一九八九年以來即 陸續有報導。主要是在澳洲、歐洲與北美旅行且注射過疫 苗的旅者之間傳出，包括蓴麻疹、血管浮腫、呼吸窘迫、 紅斑多形、紅斑病症與嚴重神經失調等。（Anderson，Μ. M. et al. Lancet.337:1044, 1991; Ruff，T.A. et al· Lancet 228:881-2，1991)。此外，Ohtaki於一九九二年與一九九五 年報告指出指出有七個兒童經過JE注射後，發生瀰漫性腦 脊髓炎（ADEM)及核磁共振儀（MRI)影像亦有異常變化 (Ohtaki，E. et al· Pediatr Neurol. 8:137-9，1992; Ohtaki，E· et al· J Neurol Neurosurg Psychiatry 59:316-7，1995) 〇 另外 值得注意的是含有動物腦組織的狂犬病疫苗注射時引起的 嚴重神經併發症（Plotkin，S.A. et al. Vaccines 661义 1994)。基於此等理由，世界衛生組織(WHO)已經將jE疫 苗的發展列為1¾度優先。 經濟部智慧3Γ產局員工消費合作社印製 最近，中國去活性與活性減毒JE疫苗業經證實有效、 可激發出高濃度中和病毒的抗體並提供具體的保護作用 (Tsai，T· et al· Vaccines 671_713, 1993)。然而其中用來配製 中國疫苗的PHK細胞尚未獲得世界衛生組織認可或在已 開發國家可供人體使用的執照。使用初生倉鼠細胞生產疫 苗的主要缺點在於針對疫苗品質的不確定性。縱使用特= 2無病原倉鼠可用，也有可能意外受到感染而使疫苗生產 造成問題。偶而這種類型的感染可能長期都無法偵知

尺度適用中 1228147 A7 B7 五 、發明説明（ 對此等批評，有必要對疫苗的安全性進一步實施管控研究 以k南该·一疫苗普遍使用的可信度。使用初生細胞生產该 一疫田的另一項缺點是病毒低採集率以及成本過南而典法 量產。 鑑於以上各點，有需要提出一種係可在該等業經認可 為人類疫苗受質如Vero或人類二倍體細胞的標準細胞株 群中生產並具有成本效益的新JE疫苗。Vero細胞係源自 猴子腎臟，屬轉型過但非癌性細胞。Vero細胞株之所以 優於其它任何標準細胞株在於更易於轉成大規模的細胞培 養而且有轉型細胞有生存期限無止盡之特性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 目前已發現JE病毒可在Vero細胞培養中生長。在je 疫田領域中亦已投注很大心力在有生產價值的標準細胞培 養中大量生產疫苗。然而，包括透過使用Vero細胞培養 將疫苗商品化所需的基因穩定度、產量與產程等從未符合 人體疫苗規定。基於此等事實以及在將在其它病毒培養物 所獲得知識轉置到JE病毒，先前技術尚未成功地從連績細 胞株群上發展出一種基因穩定並具有高度免疫原特性的 JE病毒疫苗。截至目前為止的所有該等研究結果當中，並 無任何一項可滿足基本資料說明中所提到的各項標準的新 疫苗產品。 本發明揭7JC的是在連績性細胞株群中使JE病毒择殘 的研究結果，即用Ven>細胞來生產疫苗可克服用鼠腦或糸 生細胞株生產JE病毒時所帶來的問題。本發明亦可鐘明择 CNS ) { 210X297^# ) 1228147 心 Β7 五、發明説明（) 養JE病毒的方式及具成本效益的下游疫苗量產過程。 此外，本發明可用下列方式繼明原先上市JE疫苗的 改良生產方法： 一、 安全性：本發明的病毒經Vero細胞的培養不帶 毒性，除可降低產品危害外，還可讓接受者免除 即使嚴格控管病毒失活過程所帶來的風險，進而 提高額外的安全性。先前商業化的JE病毒從未 能提供此一優點。 二、 增加更安全的生產受質供應量：本發明的JE疫苗 的生產環境並無涉及牛的血清，且可以提高產量 與平價與可計量的產品等皆為先前商業化的JE 疫苗所未能達成者。 三、 不良反應性較低：本發明的JE疫苗並無添加明膠 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 穩定劑，可降低含有該物的現有疫苗出現的疫苗 反應風險（Saskaguchi M. et al· Vaccines 68_69, 1998)。此外，本發明亦有效排除現有疫苗中所併 入不需要的牛血清衍生的各種組成。結論是，本 發明此一安全特點係先有JE疫苗所從未能提供 的。 四、 增加效力：以Vero細胞成功地完成可計量生產， 不使用添加物生產，以及有效的純化，因此在JE 疫苗配方中德以首次使用到有效的佐劑。雖然本 發明疫苗的配方中佐劑使用亦已在其它的疫苗 中應用到，由於現有疫苗中無一可確保其安全生 A7 B7 1228147 五、發明説明（) 產，因此要將此一知識應用到JE疫苗中一直是 很困難。 總結而言，針對JE疫苗商業化方面在新疫苗當 中截至目前為止尚無一樣可滿足本發明上述的各項 優點。 因此，本發明目的是為提供一種在標準細胞受質中生 產安全有效的JE疫苗以使其能為更多國家所接受。本 發明之另一目的為提供一種供生產高度純化又穩定的疫 苗，以及配製一種抗原含量但少具有高度免疫原特性的疫 苗製造流程。 發明摘要說明 本發明一方面提供一種藉繼代培養至Vero細胞而適 應於Vero細胞的減毒日本腦炎病毒。本發明的減毒日本腦 膜炎病毒，亦即CJ50003，係於一九九八年四月二十曰根 據國際上對專利程序目的使用微生物儲存認證的布達佩斯 特公約規定儲存於“韓國微生物培養中心”永久收藏，以及 可從收藏物第KCCM-10125號的倉庫中取得其中一次培養 物，並申請了多國的專利保護。 經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 另一方面，本發明提供一由一種繼代培養至Vero細 胞而適應於Vero細胞的減毒日本腦炎病毒所組成的曰本 腦炎疫苗，並寄存於食品工業發展研究所，寄存日期為88 年2月11曰，寄存編號為CCRC 970023。 附圖簡要說明 本發明前述與其它特性、方面與優點配合以下說明、 本纸張尺度適用中國國家標隼{ CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -9- 1228147 A7 ------ B7 五、發明説明（） 隨附專利請求事項以及附圖等說明可獲得進一步暸解： 圖一顯示JE病毒SA14-14-2(PDK)在Vero細胞的繼 代培養。病毒繼代1係以O.i moi SA14-14-2(PDK)株接種 至單層Vero細胞後的第五天所採集的。該JE病毒濃度係 在單層Vero細胞上行病毒斑鑑定法測量的。其後連續的繼 代培養是用病毒繼代1作為起始物，如例1中所述的連續 性病毒感染及定量濃度，直至30次的繼代培養。 圖二顯示在一滾筒瓶中從感染後三天至十七天每隔一 天多次採集CJ50003的JE病毒。單層的Vero細胞以每一 細胞〇·〇1病毒斑形成單位(pfu)的moi來感染。讓病毒在35 C吸附2小時’接著用PBS清洗三次後注入一百（100)毫升 無血清的EMEM並置於35°C培養。經接種後的三天到十七 天期間每隔四十八(48)小時使用新鮮無血清的EMEM取代 培養上層清液。採集物的病毒感染強度係利用在單層Vero 細胞形成的病毒斑來測定。 經濟部智慧對產局員工消費合作社印製 圖三顯示使用SDS-PAGE蔗糖梯度超離心法與惠氏屯 拓印法(Western blotting)純化的CJ 50003 JE病毒的分析結 果。將六十（60)毫升的濃縮上層培養液加到濃渡為15-60% 的四十（40)亳升蔗糖梯度中，於45Ti轉子，12。(：下，以每 分鐘22000轉，離心18小時。從試管底部取樣兩(2)毫升 並置入4-20%梯度SDS-PAGE當中，將所溶解的蛋白質轉 移到硝化纖維膜。藉Coomassic亮藍(A格）或硝酸銀(B格) 染色顯示該等蛋白質，而與單株抗體與JE病毒蛋白質E(C 格）反應所引起的反應可見到抗原。預先著色的蛋白質標準 本紙張W相巾S目家縣（CNS ) A4胁（2HTX297公釐} 1228147 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 物（Novex Seeblue™)的繼代培養1由上往下分別為代表 250,98,64,50,36,30，16 與 6 kDa 的分子量；繼代培養 2-10， 代表超離心後在試管底部所取的第3-11的分量，而E代表 套膜蛋白；C代表蛋白衣殼蛋白；Μ代表膜蛋白。 圖四顯示純化的CJ50003 JE病毒利用甲醛去活性的 動力學。經純化的JE病毒製備物用0.018%甲醛在4t或 2(TC去活性。依據設定時間的取樣直接在單層Vero細胞 上測定殘餘的感染病毒量。此外，用下述擴增量檢測方式 檢出低量的病毒。取自病毒失活時間各點的樣本接種到含 有單層Vero細胞的複製瓶。經過置於35°C兩小時的吸附 作用後再添入細胞並於35X：培養。感染後在七天與十四天 再添入細胞。採集培養液並計數病毒斑以偵知感染病毒的 存在。去活性的時間點由兩個個別實驗得知：4°C(實心方 形）與22°C(實心圓）。利用熱去活性作用（未加甲醛）的對照 組（空心方形與空心圓分別代表4°C與22t)同時實施比較。 發明詳細說明 本發明係指一具有供配製JE疫苗所需屬性的JE病毒 株。該病毒係一減毒病毒，並可在Vero的連續細胞株中 增殖者，該Vero係經世界衛生組織認可作為人體疫苗生 產用的細胞受質。因此預期該一病毒可用來配製比現有各 種疫苗更安全的去活性與活性JE疫苗。 本發明提供一種可滿足目前需求的疫苗。在溫度不高 於35°C，利用系列繼代培養將JE病毒適應於Vero細胞。 Vero細胞内的連續性繼代培養導致病毒的濃度增加到每 ί^ι先聞讀背面之注意事項再填yI) 本纸張尺度適用中國國家樣率{ CNS ) A4規格{ 210>α97公釐） -11- A7 B7 1228147 五、發明説明（） ~- 毫井培養上層清液達107pft以上，並可降低達到病毒高峰 濃度所需的培養時間。 本發明係有關發展一種不需補充血清而可獲得高產量 I 的病毒及多次採集的過程，此種過程能商業化可供大量生 產該疫苗並具成本效益的屬性。根據本發明，病毒培養中 多次採集過程得以降低受感染細胞的細胞病理效應iCPE) 的程度。由於CPE程度降低，本發明的JE疫苗含有相當 少量殘餘細胞衍生組成。此外，本發明的JE疫苗預期可提 供比當前各種JE疫苗更強的免疫原特性，以及更大的抗病 保護。本發明經過純化的疫苗與現有各種疫苗相比具有一 項主要優點’就是從所培樣Vero細胞純化的病毒符合發展 人體疫苗的規定。 本發明亦指出配製該疫苗的方法。該等方法提供該疫 苗高生產力，純度與效力。JE病毒CJ50003係藉著將je SA14- 14-2(PDK)在溫度不超過35 °C條件下繼代培養四次 或更多次適應於Vero組織培養細胞中的產物，在Ven)以 | 及/或LLOMK2細胞形成的病毒斑數以監測病毒的增殖

智 慧 財 產 局 員 消 費 合 η 社 印 製 時，選足所需之培養病毒。自該一適應取得之病毒在Vero 細胞培養基之培養層清液具有一至少lxl〇7 pfu/ml的高值 濃度。JE病毒SA14-14-2係一減毒株，其可藉著適應於一 從初生倉鼠腎(PHK)組織培細胞以及初生狗腎(PDK)組織 培養細胞中蚊子的野生型JE病毒SA14取得（Kenneth H.

Eckels，et al· Vaccine 6513-518, 1988)。然而，WHO 並未核 准PHK與PDK細胞，因此不適合於供配製可供人體使用 -12- 的疫苗。WHO准許Vero供人體使用，因此以Ver〇適應的 JE病毒株，CJ50003，係可供生產人類用疫苗的良好對象。 已知SA14-14-2(PDK)病毒屬於一黃熱病病毒屬並具 有生化屬性：附帶5’甲基化端以及不含聚A結構3,端的單 股正極之核醣核酸(RNA)基因組。該RNA的基因組的大小在 11 kb左右，而該基因組與13,500 Da核殼的蛋白體為組合 的狀態。該病毒另由8,700 Da膜(M)蛋白，53,000 Da的套 膜(E)蛋白以及NS1，2a，2b，3, 4a，5等類的非結樽性蛋白質 所組成。 適應於Vero的JE病毒株CJ50003係在Vero細胞中經 過三十次以上的繼代培養。該病毒濃度以及病毒斑的形態 學經繼代培養期間並未改變，顯出該病毒具有穩定的表型 特性。 經濟部智慧ST產局員工消費合作社印製 為對於JE病毒CJ250003的生物特性的分子層次取得 更深入了解，業對該病毒的生化屬性加以分析。藉著cDNA 選殖與排序病毒基因體的鹼基序列。結果發現JE SA14-14-2(PDK)病毒中 E 蛋白基因的 1032，1506 與 1704 三個位置的腺嘌呤基，以及一 1769位置的鳥嘌呤基分別由 JE CJ50003病毒中的三個鳥嘌呤與一個胸腺嘧啶所取代。 據此，E蛋白的胺基酸序列從位置19的酥胺酸、位置177 的酥胺酸、243位置的離胺酸以及位置264的穀胺醯胺分 別改變到丙胺酸、丙胺酸、穀胺酸與組織胺酸。在我們研 究期間，E蛋白上的胺基酸變化一直維持到繼代培養至 Vero細胞中的病毒。

雖不同次數繼代培養s Ver0細胞之JE病毒CJ50003 在幼鼠時以腦内注射結果並不會殺死成鼠。據此，可認為 經適應於Yen)的】E病毒α5_3為1毒誠定的病毒 株，不具有或具有少量的神經毒力。此為使用該病毒作為 活性JE病毒疫苗以及/或去活性疫苗的要點之一。 本發明亦提供-不必將原生或中間純度材料冷滚就可 從細胞培養物純化病毒的方法。該方法藉由沉殿細胞原材 料與蔗糖梯度超離心作用梯度區隔及各區隔梯度内病毒檢 出等方式以移除細胞屑、濃縮病毒、純化病毒。尤其特異 地，本發明可用或不用血清蛋白補充物的情況下將病毒在 連續細胞株中增殖到高濃度，，再以超離心作用純化病毒 並匯集病毒於區隔内的方式來生產純化的JE病毒的方法。 經濟部智慧财產局員工消費合作社印製 遠病毒係在Vero組織培養細胞中增殖。滾筒瓶中大量 增殖的Vero細胞用CJ50003病感染及培養D可依多次採集 方法完成採集該病毒。感染後二天或三天根據感染的m〇i 開始採集培養物上層清液，並將新鮮的培養基再添入到培 養物中。該再添入的培養物經過兩天的培養後，再次進行 對上層清液的採集。經過八天或九天之感染其間可重複採 集四次，而培養基上層液内的病毒濃度可達lxl〇7 pfu/ml。 該多次採集方法在每單位滾筒瓶可採得高產額的病毒，因 此可使本發明比較適於市場法則。另外，本過程能降低感 染細胞的CPE程度。CPE減少有助於將本發明JE疫苗中 殘餘細胞衍生組成保持在相當低的水準。經採集的培養物 上層清液可於4°C中存放直到要開始純化時再使用。採集 本纸張適用f國國家樣李（CNS ) A4規格（210X297公釐) -14- A7 B7 1228147 五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的培養物上層液的過濾，可用一般常用的低速離心方法， 例如，1500g離心十分鐘，以及/或藉0.45孔徑濾器的濾清 而達成。所採集的培養液在濃縮之前先存放4°C。就病毒 濃縮方面，係將培養液超過濾並收集滯留物。於另一濃縮 方法中，係將聚乙二醇(PEG)8000溶於培養液中達10%為 止並將沉澱物溶解於一如磷酸鹽緩衝的食鹽水（PBS， pH7.0)等適當的緩衝液當中。魚精蛋白硫酸鹽沉澱作用的 目的是要移除細胞的DNA或其它原生於細胞的物質，此種 移除作用可藉著添加魚精蛋白硫酸鹽於濃縮病毒溶液並用 如12,000 g的高速離心五分鐘達成。為了進一步純化病 毒，針對15-60%連績或多階蔗糖梯度等實施超密度梯度離 心作用。將蔗糖梯度分凝後再對所得分溜物進行化驗是否 有病毒的存在。化驗病毒存在與否分館物的方法包括使用 病毒斑化驗、血球凝集化驗、聚丙烯醯胺膠電泳作用、以 及抗原檢測等作為免疫化驗法。供進一步處理的分餾物是 指含有高病毒濃度與其它少量雜質的聚合樣本。藉測試驗 源自Vero細胞的染色體DNA與蛋白質的方式來評估匯集 純化後的病毒濃度。結果顯示宿主細胞的DNA與蛋白質， 每5 pg純化JE病毒分別僅只有2.5 pg與2 ng，此顯示前 述各種純化方法可以有效的從病毒抗原上將其他雜質移 除。1L受感染培養液中的JE病毒產量預計約在2.3毫克。 本發明亦提供一種失活JE病毒以去除其感染性，同時 又能保存其抗原力的方法。該一方法包括添加有效數量的 甲醛並使用該劑在可使該病毒經失活的特定條件下培養該 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15- A7 B7 1228147 五、發明説明（ 病毒。尤指，係分餾物將匯集的加入PBS等適當的緩 稀釋成蛋白質含量適度的溶液，再把甲醛添加到細:衝劑 的分餾物匯集池中。與甲醛的共培養係在22。(：或4〇e、 度下實施。在22°C或4它溫度條件下，至少分別駑要^溫 或四十六天才能完全去除病毒感染性同時又不會頓失、= 的抗原力。大規模的培養為能簡便計，宜於22¾進扣母 病毒失活過程’並將培養時間延展為七天仍為安全的 度。然而，有效的失活劑範例不只限於甲醛而己。 言可藉化學或物理方式達成失活。例如，化學失法作用位 藉使用酵素、β-丙酸鹽内脂、次乙基亞胺或其等街生物以 及使用有機溶劑如Tween，Triton,去氧膽鹽酸麵_ sulphohetain來處理病毒。必要時可於事後將失活物質中 和；例如使用甲醛失活的物料可使用硫代硫酸鹽來中和 物理失活作用的實施宜將病毒置於如紫外線燈光，χ射線 或伽瑪射線等高能源的射線照射。 經濟部智慧S#產局員工消費合作社印製 JE疫苗配製成溶液或懸浮液形式的注射劑型。可添知 碳水化合物類如（山梨糖醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、聚葡萄 糖、葡萄糖等）、蛋白質類如（白蛋白、酿蛋白等）、含多種 蛋白質類如（牛血清、脫脂牛奶等）與各種緩衝劑(如鹼性金 屬磷酸鹽）等穩定劑^>疫苗的配製可在添加穩定劑後加以真 空冷凍乾燥並可用真空或置於氮氣中存放。若需要時可添 加一種或多種佐劑化合物。供此目的使用的合適化合物有 氫氧化鋁、磷酸鹽或氧化物、礦物油（如Bayol，Marcol 52> 與％素等。此外，必要時亦可將該等如Tween與Span等 本纸張用悄目家縣（CNS)从祕（2lGx297公着） -16 - 1228147 A7 B7 五、發明説明（ 绖濟部智慧對產局員工消費合作社印製 乳化劑添加到病毒的物料中。 佐劑效力的判定’係指疫苗内已失活病毒經吸附至佐 劑後’仍需要中和該病毒之中和抗體量。有效的佐劑範例 不只限於氫氧化鋁而已。製得的疫苗，其效力之測析是用 病毒斑減少的中和試驗法(PRNT)，作法是以該疫苗免疫過 的老鼠的血清對具神經毒性病毒免疫過的老鼠作直接的反 應。結果顯示該疫苗在引出中和作用抗體方面的效能與可 相比擬疫苗一樣或更佳。 為調查經過不同次數繼代培養過的適應於Vero細胞 的病毒免疫原特性可能出現的變化，於不同次數繼代培養 製備的疫苗中比較各個的效能。雖然在Ver〇細胞連績的繼 代培養，但在不同次繼代培養過程中所製備的疫苗中，並 未發現顯著的差異。因此可認定Vero細胞適應的JE病毒 株CJ50003具有穩定的免疫原特性。 以下各範例詳細說明根據本發明適應於Vero細胞的 去活性JE病毒以及該JE疫苗的代表性。先前說明與文下 所舉範例，相信該彼等熟悉本技術者將能完整地實施本發 明。 範例一：SA14-14_2(PDK)在Vero細胞内之適應 在犬類腎細胞培養繼代培養8次的JE SA14-14-2(PDK)，SA-14-14-2病毒當作Vero細胞培養物的 系列繼代培養起始物。Vero細胞單層的每一細胞接種JE SA14-14-2(PDK) 0.1 pfu的ni〇i量。將感染後的培養物置於 含有5毫升營養基質的25 cm2培養迸中生長，其中該營養 請 先 « 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁

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國國家(CNS) ( 21〇x29^^ A7 B7 1228147 五、發明説明（) 經濟部智慧对產局員工消費合作社印製 基質係由Eagle最少基本需要養分添加10%胎兒牛血清組 成，並在約5%C〇2含量的空氣及在不超過35°C的溫度條 件下，典型的作法是在32°C至35°C左右，而以35°C左右 為佳。藉細胞病理效應（CPE)的顯微鏡觀察以及包括血球吸 附檢驗（HA)病毒斑檢測與酵素聯結免疫吸附檢驗法 (ELISA)等各種病毒抗原存在的化驗方法來監測病毒的生 長。JE病毒係在感染後第五天，當培養物顯示病毒濃度達 高峰值時經由離心過滤後採集。單一病毒斑取自過濾後的 上層清液並在Vero細胞增殖。增殖後的病毒再度感染到 Vero細胞作為後續繼代培養用。後續的系列繼代培養3〇 次是按前述的連續病毒感染、定量與病毒斑純化方式進 行。如圖一所示，以Vero細胞經四次繼代培養，病毒濃度 可達每毫升的培養上層清液約4xl〇7的程度，更多次的繼 代培養，亦有類似的病毒量。此外，採集病毒的最適期間 可從第一次繼代培養的需時五天降到於第四次繼代培養的 兩至三天内。病毒產量則大幅地從每亳升1〇5?沅增加到超 過每毫升107以上以及在培養時間的減少，以致用Vero細 胞的第四次的JE繼代培養病毒為製備所要的JE疫苗的最 佳起始材料。Vero細胞的第四次JE繼代培養病毒標示為 CJ50003(Vero, PS4)。簡寫PS代表指定細胞中的病毒繼代 培養次數。 範例二：CJ50003病毒特性化；套膜基因的排序與神經毒性的 排序研究 為了深入瞭解CJ50003株的生物特性的分子層次，特 1228147 A7 B7 五、發明説明（） 將擁有主要中和作用的基因區的套膜基因所對應1500個 核苷酸序列定出並將之與母疫苗株SA14-14-2(PDK)， SA14-14_2(PHK)以及野生型SAI4病毒等加以比較(Aihira， S. et al. Virus Genes, 5:95-109, 1991; Ni, H. et al. J Gen Virol. 76:401-407, 1995; Ni? H. et al. J Gen Virol. 76:409-413, 1995; Nitayaphan，S. et al· Virology 177:541-542，1990)。CJ50003 病毒(Vero, PS4)用來作定序 之作。得知C-終端區域(胺基酸280-500)完全固定不變，同 時，N-終端區域(胺基酸1-279)，則隨不同病毒株而有不同 的變化。N-終端區域中的突變幾乎呈平均分佈。CJ50003 的E蛋白的基因核苷酸序列與SA14/CDC的相差八個核苷 酸與七個胺基酸，而與SA14-14-2(PDK)與SA14(CDC)相差 七個核苷酸及五個胺基酸。表一摘要該等比較結果。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CJ50003病毒的序列在五個位置上有別於已經發表的 SA14_14_2(PDK)病毒序列；核苷酸在位置1032, 1506, 1704 與1769的變化導致SA14-14-2(PDK)與CJ50003病毒之間 有四個胺基酸差異；但在位置989的核苷酸變化並未導致 胺基酸取代作用。CJ50003病毒較多次的繼代培養，亦即 繼代培養15與繼代培養30並未顯露新增的核苷酸變化。 因此在CJ50003與母病毒SA14_14-2(PDK)之間，有五個特 定的核苷酸及四個胺基酸的變化，而該等變化在細胞培養 物中於病毒的繼代培養過程呈現穩定。SA14-14-2(PDK)中 位於243的離胺酸殘基(Lys)很特異與其它減毒JE病毒不 同。在CJ50003它為Glu所取代。 本紙 CNS ) A4規格（2!0X297公釐） -19- A7 B7 1228147 五、發明説明（） CJ50003序列亦與SA14-14-2(PHK)病毒已發表序列不 同（Aihira，S· et al· Virus Genes，5:95-109，1991)。在 1〇32 位 置的核苷酸差異使得在E19位置的胺基酸亦產生差異’但 在核苷酸位置989的變化並未導致胺基酸取代作用。 CJ50003病毒中位置1506與 Π〇4的核苷酸與 SA14_14_2(PHK)的同位置核苷酸相同，但與 SA14-14_2(PDK)的就不一樣。CJ50003的N-終端區域以及 SA14-14-2(PHK)E基因所發生的取代作用模式除了在E19 位置取代胺基酸以外，其餘幾乎都一樣。 SA-14-14-2(PHK)，SA14-14-2(PDK)與 CJ50003 病毒與 母SA14病毒在E107, E138, E176與E279位置順序不同不 過，是有4個相同胺基酸取代。位於E138與E176的胺基 酸已知與減毒作用有關，在Vero細胞適應後仍保留下來， 顯示CJ50003並未失去其已減毒特性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 李 榡 I家 一國 I國 I中 用 適 I% 公 97 2 1228147 A7 B7 五、發明説明（ 表一：SA14, SA14-14-2(PHK)，SA14-14-2(PDK)與 CJ50003JE病毒株之間核苷酸與胺基酸序列的比較 2r二 ts i 22 05? SI 217 2S s 5S ocv 704 m769 B 9】I 977 23 2 ΓΟ19 25 500 i i soo E176 i E?二 3 i E2S i 5二 s、· •Tw 0 > 0 ccc 0 > > 0 0 G > cc > 0 > A u 0c 0 > Λ G Λ G Λ cC C; 0 > A U cC 0 Λ > 0 > 0 > c u > c > >c u u > 0 0 0 、\ > u uc G Λ c > >cc cA 0 > Λ > 0ccc a > 0 0 Λc 0 c Λ 0 0 0 A U c c 0 Cl > i TV Uu Aip Ai*» Uu oiu IJT •Fhr Glu Glu Gin %y* AJu po 1¾ Gly f Ήν Uu &P Ah Uu cc = Thr 9U oly Gin ¥ il 1*0 >c= Giy

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S00S 震越 1228147 A7 B7 發 五 經濟部智慧¾產局員工消費合作社印製 I説明（) CJ50003與母SA14-14-2(PDK)經使用腦内（i.c·)注射到 四個星期大的BALB/c老鼠以試驗其等對鼠類的神經毒 力。試驗結果載於表二。年輕成鼠的致命性在 SA14-14-2(PDK)與CJ50003之間並無顯著不同，與野生 型SA14病毒的神經毒力相比較係屬非常的低。因此顯然 導入Vero細胞受質並未提供神經毒力的表現型給 SA14-14-2(PDK)而CJ50003病毒仍具有減毒特性。 表二：四個星期大老鼠接種Vero-繼代培養CJ50003病毒的腦内毒 力，PS表PDK或Vero細胞的繼代培養 病毒 PFU接種量 log LDsomI·1 LD50/PFU 比 SA14(PDK，PS3) 2 x 10(7) 6.5 0.17a SA14-14-2(PDK，PS8) 1.3 x 10(6) <1.5b <0.00002a CJ50003(Vero, PS6) 3.4 x 10(7) <1.5b <0,000001 CJ50003(Vero3 PS 16) 3.2 x 10(7) <1.5b <0.000001 CJ50003(Vero, PS30) 3.6x10(7) <1.5b <0.000001 a: Kenneth H. Eckels et al (Vaccine 6:513-518, 1988)。 b: 0/10接種未稀釋病毒後死亡的老鼠。 腦内(i.c.)注射的接種量為每隻老鼠0.03 ml。 範例三：病毒的生長與純化 生產種子取自Vero細胞[CJ5〇003(Vero，PS5)内的第5 次繼代培養的病毒。Vero細胞係在含有10%胎兒牛血清 (FBS，Gibco)Eagle的最少必須培養基(EMEM，Gibco)中成 長。將單層Vero細胞的滚筒瓶培養物以生產種子病毒依每 細胞0.01至0·lpfu的moi量感染。病毒吸附兩小時後，以 PBS將培養物洗三次並添入未含血清的EMEM，置於35X： 本纸張尺度適用中國國家標李（CNS > A4規格（210X297公釐} -22- 1228147 五、發明説明（） 培養。在感染的Vero細胞培養物中’病毒於感染兩天或二 天後濃度約在每毫升1〇7至1〇8 Pft左右。從感染後兩天或 三天開始直到感染後八天或九天為止，雖依每二天採集一 次，共採集四次方式，病毒濃度仍可維持在每亳升1〇7pfu 的水準以上，且只有非常微弱的CPE。但疋感染經過九天 後，濃度則掉到每毫升1〇7 Pfu以下（圖二-）°匯集的採集 物以8,000 rpm速度離心十五分鐘，並透過篩孔為0.45Pm 濾清器濾取上層清液。病毒的上層清液係藉超過濾作用 (Ultrasette，Filtron，100k)或使用PEG沉殿的方式來濃縮。 使用PEG沉澱的病毒以離心方式收集並在PBS或STE(10 mM Tris pH 7.2，1 mM EDTA，150 mM NaCl)緩衝劑中懸 浮。超過濾後的留存物，濃縮至兩百五十毫升並用一百毫 升的PBS清洗。病毒濃縮液經添加〇·5·2每毫升毫克的魚 精蛋白硫酸鹽後，置於冰水中冷卻兩小時”再以10,000 rpm的速度離心五分鐘取得上層清液。濃縮後的病毒再以 蔗糖的梯度，使用超離心予以純化。超離心作用是指38,000 g運轉十八小時。析出物經置於含有清潔劑的十二烷基硫 酸鈉（SDS-P AGE)聚丙婦醯胺凝膠進行電泳。核芽殼蛋白體 經濟部智慧ST產局員工消費合作社印製 (C 13,500 Da) ’ 膜蛋白（M，8,700 Da)與套膜蛋白（e，53,000

Da)帶顯現於SDS-PAGE(圖三A柱）。套膜抗原（E)以惠氏屯 拓壓法用老鼠抗JE病毒的單株抗體偵知（圖三c柱）。病毒 停處的析出區份（即4至9區份）内，除了病毒的蛋白質外， 其他的蛋白質，以銀染色的凝膠並不顯現（圖3B柱），將 又匯集後使用Lowry法測疋其内蛋白質濃度。的結果 1228147 五、發明説明（ Α7 Β7 從感染過的Vero培養物，或用切向流超過濾法或藉 PEG8000沈澱法所得的兩種純化樣本得知（表2與表3)。純 化後的病毒用二倍體積的PBS稀釋，再加入Tween8〇,直 至其濃度達0.01%，再以篩孔為0.22μπι的濾清器濾取得。 表二：以切向流超過滤濃縮法純化病毒 樣本 總體積 總pfU %產量 (pfu) 總蛋白質 (mg) %產量 (蛋白質） 比活性 (pfii/mg) 匯集的培養 上層液 10,000 4.4 X 1011 100 600 100 7.3xl07 Filtron 濃度 200 4.0 xlO11 90 280 47 1.4 χ 108 +蔗糖梯度+ 匯集物 500 3.8 x 1011 86 42 7 9.0 χ 109 0.22μ濾液 50 2.4 x 1011 55 23 3.8 1.0 χ 1010 表四： 以 PEG8000 沉澱濃縮法純化JE病毒 樣本 總體積 總pfU %產量 (P&) 總蛋白質 (mg) %產量 (蛋白質） 比活性 (pfu/mg) 匯集的培養 上層液 10,000 4.4 x1ο11 100 600 100 7.3xl07 PEG沉派物 200 2.7 χ 1011 61 40 6.7 6.8 χ 109 +藏糖梯度 匯集物 500 2.5 χ 1011 56 15 2.5 1.7 xlO10 0·22μ濾液 50 1.6 χ ΙΟ11 41 12 2 1.3 χ 1010 請 先 闕 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部智慧3Γ產局員工消費合作社印製 病毒製備物利用比活性測量（亦即pfu/mg蛋白質）的方 式來比較彼等的相對純度。以超過濾所得濃縮物純化的病 毒與使用PEG8000沉澱濃縮物所得純化病毒的活性大約一 樣。匯集的純化病毒的純度亦藉測試源自Ver〇細胞的染色 體DNA與蛋白質的方式來評估。結果顯示且不論使用合種 ‘縮方法’每5pg的純化過JE病毒含有宿主細胞DNA與 蛋白質分別低於2.5 pg與2 ng，這結果顯示前述兩種純化 ^ CNS j ^ 210X297^ ) -24- A7 B7 1228147 五、發明説明（） 方法都能有效地從病毒抗原中除去其它的雜質。然而就已 純化病毒的蛋白產量而言，使用超過濾的純化方法要優於 使用PEG8000沉澱法的純化方法兩倍。 範例四：病毒的去活性 經過純化的病毒以PBS透析後用來製備活性減毒疫 苗，或用甲醛來去活性再裝備成去活性疫苗。在22°C或4 ， °C下用0.018%甲醛進行去活性作用。在一定的時間間隔的 取樣，以病毒斑定量法直接檢驗看是否存有具感染力的病 毒（圖四）。直接病毒斑檢驗呈陰性之樣品置於單層Vero細 胞上的對照繼代培養以擴殖低量的病毒，然後再作病毒斑 檢驗。結果是在22°C時需要四天而在4°C時則需要四十六 天才能使感染性完全去活（表五與表六）。去活性期間，藉 抗原點壓法檢驗與株落抗血清試測樣品的方式來.監測該病 毒的抗原性，藉此種檢驗方法，顯示在22°C下，暴露於 0.018%甲醛十天或在4°C暴露十五天，皆未測知有抗原性 方面的減失。 經濟部智慧射產局員工消費合作社印« 在該等條件下以甲醛實施去活性作用在22°C為至少 七天或在4°C時至少為六十天，仍得到安全程度。去活性 後，樣品中游離的甲醛藉添加0.038%的偏硫酸氫酸鈉來中 和。以PBS行透析，再以篩孔為0.22μπι的濾清器過濾。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐} -25- A7 B7 1228147 五、發明説明（） 表五：4°C時，對CJ50003 JE病毒的甲醛去活性作用 天數 JE 病毒(-HCHO) JE 病毒(+HCHO) 增殖作用 0 3.2 χ 108 3.2 χ ΙΟ8 + 0.5 2.6 χ ΙΟ8 3.2 χ ΙΟ8 + 1 1.52 χ ΙΟ8 7.9 χ ΙΟ8 + 1.5 2.4 χ ΙΟ8 4.8 χ ΙΟ8 + 2 2.6 χ ΙΟ8 6.4 χ ΙΟ8 + 3 2.8 χ ΙΟ8 4.3 χ ΙΟ8 + 4 1.9 χ ΙΟ8 1300 + 5 2.4 χ ΙΟ8 285 + 6 2.8 χ ΙΟ8 480 + 7 1.5 χ ΙΟ8 200 + 11 1.5 χ ΙΟ8 0 + 22 1.4 χ ΙΟ8 0 + 32 1.2 χ ΙΟ8 0 + 46 1.0 χ ΙΟ8 0 - 60 1.0 χ ΙΟ8 0 - 表六：22°C時，對CJ50003 JE病毒的甲醛去活性作用 天數 JE病毒(-HCHO) JE病毒(+HCHO) 增殖作用 0 3.2 xlO8 3.2 χ ΙΟ8 + 3 3.0 X 108 1.3 χ ΙΟ6 + 6 2.7 X 108 1.1 χ ΙΟ5 + 12 2.5 X 108 3.5 χ ΙΟ5 + 24 1.2xl08 140 + 36 1.2 xlO8 140 + 48 1.2 x 108 0 + 72 1.1 χ 108 0 + 96 1·1χ 108 0 - 360 1.0 X ΙΟ8 0 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 範例五：CJ50003純化過，去活性病毒(PIV)與活性減毒病 毒(LAV)在鼠類的免疫抗原性 接著使用先前經商業化的Biken去活疫苗，測試鼠類 對LAV與PIV的免疫抗原性。由二十隻六個星期大的 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2丨0><297公釐） -26- A7 B7 1228147 五 、發明说明（

Balb/c老鼠群體以腹膜内（ί·Ρ·)内方式投用三種免疫原來免 疫。免疫的實施疋在不用佐劑及相隔兩星期情況下，接種 兩次。第二次接種後的第二星期，採取各每組鼠體的血清， 隱集在一起，再以PRNT方法’檢測中和作用接體出現與 否（表七）。一如表七所示，在接受三種免疫原群體之間的 中和抗體濃度並無顯著的不同。 表七：老鼠用PIV或LAV謗生中和抗體的反應 免疫原 劑量 中和抗體濃度

邶吨邶飓劑 1:320 1:320 1:320 1:640 1:320

PIV

PIV

LAV

LAV

Biken疫苗b a:中和抗體濃度的定義’是指令老鼠腦繼代培養的 Nakayama病毒斑數減少50%的血清稀釋倍數的倒數。 b:依製造商規定，一劑Biken疫苗含有5 的病毒蛋合 (TCA可沉澱的部份）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PIV的免疫接原性在鼠體内進一步的測試。近親交配 的成鼠用各種稀釋濃度的去活病毒，或加含銘佐劑或不加 佐劑的方式來免疫。二十隻六個星期大的Balb/C老鼠群5〇〇 50與5 ngPIV溶於生理食鹽水或溶於含氳氧化鋁的生理食 鹽水，皮下注入方式給予免疫。老鼠在相距三個星期的期 間内接受第二次的接種。第二次免疫的三個星期，採集各 鼠的血清並匯集在-起。中和抗體存在與否用在鼠腦繼代 培養之Nakayana株作為被中和的病毒來剛試(表八）。在所 有測試的劑量當中’PIV要優於Biken疫苗，而佐劑對2 本纸張尺度適用中國國家樣隼（CNS ) A4規格（210X297公 1228147 A7 ^____B7 五、發明説明（） 與500 ng HV的免疫反應分別增進了四倍與八倍。 表八：用加有式不加氫氧化鋁的PIV免疫的老鼠，中和抗 體濃度的比較 免疫原 劑量 中和抗體濃度a PIV 500 ng 1:160 PIV 50 ng 1:40 PIV 5ng 1:20 PIV+ 鋁 500 ng 1:1280 PIV+ 50 ng 1:160 PIV+ 銘 5ng 1:20 Biken疫苗 1/10劑量 1:80 Biken疫苗 1/10劑量 1:10 Biken疫苗 1/1000劑量 1:10 a:中和抗體，濃度的定義，是指令老鼠腦繼代培養的 Nakayama病毒斑數減少50%的血清稀釋倍數的倒數。 b:依製造商規定，一劑Biken疫苗含有5 ng的病毒蛋白 (TCA可沉澱的部份）。 谷 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 接著在Balb/c老鼠中試驗piv在體内的保護效能。為 了測試保護效能’特將由十隻三個星期大的Balc/c老鼠後 肢群皮下接種添加與未添加氫氧化鋁生理食鹽水的去活 JE病毒。年齡配對控制組則施打pBS或鋁中有非特定抗 原。三個星期後，老鼠用同等劑量追加一劑。免疫後三星 期’在顱内接種30 μΐ PBS，其内有500 pfu老鼠神經毒JE 病毒(Nakayama，鼠腦適應）以測其反應。受感染刺激的老 鼠’在為期二十一天的期間每天監測其罹病率與死亡率。 一如表九所示者，用50 ng ριν免疫的老鼠顯示90%的保 護作用。進一步以50ng與5ngPIV混合鋁來免疫的老鼠分 別顯示100%與70%的保護作用，而1/100劑量的Biken疫 ^相中目目家縣（CNS ) A4«L^ ( 210X297^1 -28- A7 1228147 _____B7 五、發明説明（） 苗則僅顯示只有50%經免疫的老鼠獲得保護。相較之下， 在對照群的所有老鼠都於感染刺激後的五到七天開始生病 及死亡。 表九：疫苗接種的老鼠對抗Nakayama病毒a免疫原感染刺 激的保護作用 免疫原 劑量 存活率 設控組b N/A 0/10 PIV 500 ng 10/10 PIV 50 ng 9/10 PIV 5ng 3/10 PIV+ 鋁 500 ng 10/10 PIV+ 鋁 50 ng 10/10 PIV+ 鋁 5ng 7/10 Biken疫苗。 1/10劑量 10/10 Biken疫苗 1/10劑量 5/10 Biken疫苗 1/1000劑量 3/10 a:隔開三個星期注設兩劑試驗疫苗免疫的老鼠，随後再施 打500 pfu有鼠類神經毒性的Nakayama病毒。 I年齡配對設控組接種PBS或鋁中有非特定抗原。 c:依製造商規定，一劑Biken疫苗含有5 ng的病毒蛋白 (TCA可沉澱的部份）。

經濟部智慧財產局員工消費合作社印M 對CJ50003病毒在Vero細胞繼代培養的免疫學穩定 性，把在Vero細胞内不同時段的繼代培養病毒，分別給予 純化，其免疫原性依表八所記的方法加以評估。一如表十 中所顯示，取自Vero細胞的不同時段的繼代培養病毒，引 起中和抗體的能力並無顯著差異，指出就免疫抗原力而 言，CJ50003是一種在Vero細胞的繼代培養過程中相當穩 定的病毒。表十：以Vero細胞内不同繼代培養數的JE病毒 製備之疫苗效力。 本紙張細細目辦（⑽）^祕（2似騰f9>_ 1228147 五、發明説明（ 免疫原 劑量 S.d.c PIV - 4ps PIV - 6ps PIV - 15ps PIV - 20ps PIV-30ps

a:免疫原（PIX-Xps);使用CJ50003 純化後失活 的疫苗。在Vero細胞的繼代培養次數為χ。' b:中和抗體濃度的定義’是指令老鼠腦繼代培養的 Nakayama病毒斑數減少‘的血清稀釋倍數的倒教值。 平均值取自三個個別實驗的結果。並用Reed盥Muench 法測定50%終點。 〃 e:標準偏差。 在此出的結果表不失活JE病毒疫苗以及Cj5Q〇〇3 株的活減毒疫苗，兩者前途看好。令JE病毒在Ver〇細胞 内的生長，濃縮純化的改進達適於人體使用及令其去活性 又不多喪失免疫力的進展，相當快速且實用。該等配製劑 經發現在老鼠體内確具有免疫抗原性與保護作用。。

訂 經濟部智慧ST產局員工消費合作社印製

Claims (1)

1228147 申請專利範園

1. 一藉繼代培養至Vero細胞上而適應於Vero細胞的 減毒日本腦炎病毒，其中該減毒日本腦炎病毒，其特徵在 於數量眾多，即在Vero細胞中超過每毫升1 X 10(7)PFU而 在年輕成鼠中的LD5〇/PFU低於0.000001者。 2. 依據申請專利範圍第1所述之適應於Vero之減毒 曰本腦炎病毒，其中該減毒曰本腦炎病毒係CJ50003者， 我國之寄存編號為CCRC970023者。 3. —含有申請專利範圍第1項所載之該減毒曰本腦炎 病毒的日本腦炎疫苗。 4. 依據申請專利範圍第3項所述之適應於Vero之曰 本腦炎疫苗，其中該病毒係經去活劑所去活性者。 5. 依據申請專利範圍第3項所述之適應於Vero之曰 本腦炎疫苗，其中該病毒係未經一去活性劑處理的病毒活 性減毒JE病毒。 6. 依據申請專利範圍第3、第4或第5項所述之曰本 腦炎疫苗，其中該疫苗另含有製藥學上可接受的添加劑者。 經濟部智¾¾產局員工消費合竹衫卬¾ -31- ㈡姻辑_半#丨砌 砘陆藤#澈 _Λ —X ^ 0 0 0 0 ¾ 厶 cn 〇 @ 3 5 7 9 11 13 15 铖l·® 17 1 _画 I I I Ι1ΙΙ 藿 _胤 驪 ϋ mir 1 Ϊ_ ρ K _

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