TW585909B

TW585909B - Method for gene transfer into target cells with retrovirus

Info

Publication number: TW585909B
Application number: TW86102752A
Authority: TW
Inventors: Kiyozo Asada; Takashi Uemori; Takashi Ueno; Nobuto Koyama; Kimikazu Hashino
Original assignee: Takara Shuzo Co
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-06
Publication date: 2004-05-01

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909

發明領域本發明係關於-種提升將㈣轉人目標細胞之效率之方法。此方法可在各式技術領域中允許目標細胞之有效轉形，如醫藥科學、細胞技術、基因工程及發育技術，以及與其相關之一系列技術。先前技藝由於對於許多人類疾病機制之瞭解，以及重組dna技術和基因轉移技術之快速發展，近來，已發展出體細胞基因治療之程序，以治療嚴重之遗傳疾病。此外，目前亦有許多行動，企圖將基因治療不僅用於遣傳疾病之治療，同時也用於病毒感染之治療，如AIDS及癌症0 迄今，幾乎所有由食品及藥物管瑾局（FDA)核准之人類體内基因轉移實驗，皆是以重組逆轉錄病毒進行之轉導 (transduction)。逆轉綠病毒可以有效地將所需之外源基因轉移至細胞之中，以穩定地將外源基因整合進入染色體dna 中’因此，其特別是基因治療之較佳基因轉移工具，在此等治療之中，長期之基因表現是所需者。此等載體係以各式不同之方式設計，以避免其對經轉導生物體之任何副作用。舉例而言，載體之複製功能受到移除，以防止因此等用於將基因轉移至細胞之載體的自我複製而造成感染（轉導）之無限制重複。由於此等載體（複製缺失性逆轉錄病毒載體）並不具有自我複製之能力，一般而言，包裝於病毒顆粒中之逆轉錄病毒載體皆是使用逆轉錄病毒生產細胞 (包裝細胞）進行製備。表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210><297公釐 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（2 ) ' 在另一方面，骨髓細胞是體細胞基因治療之良好目榛，因爲骨髓細胞可以輕易地於體外操縱，同時，其含肴可自我複製之造血幹細胞。或者，人類脊索血液亦已於先料證實含有大量之初級組細胞，包括造血幹細胞。當基因治療藉由活體中目標細胞之基因轉入及此等基因之整合進行之時，由此轉移之基自便可在血液細胞中進行長期之表現。以對疾病產生終生之治療。然而，儘管有著不同小組所進行之密集研究，造血幹細胞卻是難以獲得有效轉導之對象細胞之一。迄今，關於小鼠灰其他動物造血幹細胞最有效之基因轉移程序便是造血幹細胞與逆轉錄病毒生產細胞之共培養。然而，對於人類之臨床性基因治療而言，由於生物安全的考量，無細胞之轉導係較希望獲得者。不幸地，在未與逆轉綠病毒生產細胞進行共培養的情況之下，進入造血幹細胞之有效基因轉移一般皆仍無法達成。近來已有報告提出，逆轉錄病毒之基因轉移效率，可單猶藉由一種細胞外基質之組成份，纖連蛋白，或其片段，而獲得增進（J· Clin，Invest.，93, pp. 1451-1457 (1994); Blood，88, ρρ· 855-862 (1996))。此外，亦已揭示由基因工程產生之纖連蛋白片段具有同樣的特性，而且，藉由其之使用，可進行進入造血幹細胞之有效外源基因轉移（W0 95/26200)。其建議，纖連蛋白之肝素結合域與逆轉錄病毒之結合係纖連蛋白造成基因轉移效率改良之原因。在所有使用纖連蛋白及纖連蛋白片段的方法之中，細胞係在纖連蛋白或其片段所固定之 __ -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂_ 585909 五、發明説明（3 培養基平板上，以逆轉錄病毒進行感染。發明目的事項再上述使用纖連蛋白及纖連蛋白片段之基因轉移法，被認爲可以藉由同一分子上同時具有逆轉錄病毒結合域以及目標細胞結合域之纖連蛋白或其片段完成（NatureMedidne 2，pp 876-872(1996))。gut，爲使用上逑方法進行各式目標細胞之有效基因轉移，必須分別根據特定細胞，製備一種功能性物質，其在同一分子上同時具有病毒及目標細胞結合而就將其作爲一般性之基因轉移方法而言，仍有問題同時，上述之基因轉移方法係在逆轉錄病毒進行感染之訂時，將纖連蛋白或纖連蛋白片段固定於培養目標細二用之培養基平板上進行。然而，培養基平板上之固定化處理需要複雜之步驟，而這和所謂簡單而方便之基因轉移方法相距甚遠。線再者，用於上述基因轉移方法中之㈣性物f僅限 =何生自纖連蛋白之肝素結合域，以作爲逆轉綠病毒結合 ’者。因此’可能藉由其他逆轉綠病毒結合物質之發發展出改良之基因轉移方法。本發明之目的即是解決此—問題，同時，提供便利及有效之基因轉移方法。更爲發明概述本發月之發明人已發現，藉由功能性物質(一般蛋白或其片段)而進行之逆轉綠病毒感染，可以獲= W尺國國家標準 585909 A7 _________________ B7 五、發明説明（4 ) 良，甚至在具有逆轉綠病毒結合域之區域和具有細胞結合域之區域並非存在於同一分子上之時。亦即，本發明之發明人已發現，以逆轉錄病毒將基因轉入目標細胞之效率，可藉使用有效量含有逆轉錄病毒結合域之功能性物質，其混合具有目標細胞結合域之功能性物質，而獲得改良。此外，本發明之發明人亦發現，由功能性物質造成之逆轉錄病毒感染增強活性，甚至可在功能性物質並未固定於培養基平板表面之時得見。本發明之發明人尚發現，基因轉移至目標細胞之效率，可在固定於玻珠上之功能性物質存在下，使逆轉錄病毒與目標細胞接觸而獲得改良。此外，本發明之發明人尚發現一種逆轉綠病毒結合物質，其並未含有衍生自纖連蛋白之肝素結合域，同時也發現，此一物質及其衍生物可用於以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞的過程中。同時，本發明之發明人已成功創造出功能性物質，其可用於以逆轉綠病毒將基因轉移至目標細胞之過程中。因此，本發明已獲得完成。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線ί 是以，本發明的第一範疇係關於一種增加以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的方法。此方法係以逆轉錄病毒轉導目標細胞，且其特徵爲在有效量具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質和有效量具有目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物存在下，以逆轉錄病毒感染目標細胞，因而使基因轉移至目標細胞。用於本發明第一範疇，具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質，並非具有專一性限制者，而且，舉例而言，其係選

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製自纖連蛋白之肝素-π結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白、聚離胺酸及其功能性當量物之功能性物質。具有目標細胞結合域之功能性物質可爲含有可結合目標細胞之配位體的物質。作爲配位體者包括細胞黏著蛋白、荷爾蒙、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物及目標細胞之代謝物等等。黏著蛋白之實例包括纖連蛋白細胞結合域之多肽。作爲纖連蛋白細胞結合域者，包括對VLA-5及/或VLA«4之結合域多肽。另外，配位體之其他實例包括促紅血球生成素。用於本發明第一範疇之功能性物質可以未固定之狀態使用，或者，其亦可爲固定者。而且，當其係固定於玻珠上之時，其可相當便利地使用。此外，當選擇對目標細胞具有專一性之配位體，作爲具有目標細胞結舍域之功能性物質時，本發明之第一範疇可對預設之目標細胞進行便利之轉導作用。如上所述，在WO 95-26200及Nature Mdicine所揭示之習知方法中’其認爲將逆轉錄病毒與目標細胞於同一分子上同時具有逆轉綠病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質上之共同定位，是改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的重要機制。然而，根據本發明，將基因轉移至目標細胞之效率，可藉由在有效量具有逆轉綠竭毒結合域之功能性物質和有效量具有目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物存在下，以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞而獲得改良。 •8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 585909 Α7 Β7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 _I_L 五、發明説明（6 ) 本發明之第二範_係關於一種用於以逆轉綠病毒將基因轉移至Θ標細胞之目標細胞培養基，其包含有效量具有逆轉綠病毒結合域之功能性物質和有效量具有目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物。藉由本發明第二範疇培養基之使用，本發明之第一範缚可便利地進行。本發明之第三範蜂係闞於一種逆轉錄病毒之定位方法，且該方法之特徵係在對一培養基進行培養，該培養基含有逆轉錄病毒，其接觸有效量具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質及有效量具有目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物。本發明之第四範疇係關於一種用於進行由逆轉錄病毒仲介進入目標細胞之基因轉移之套組，該套组包含： (汪）有效量具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質及/或有效量具有目標細胞結合域之另一功鸪性物質； (b)用於培養目標細胞及逆轉錄病毒之人造物質；及 (<0用於預刺激目標細胞之目標細胞生長因子。藉由本發明第四範疇套組之使用，本發明之第^及第三範疇可便利地進行。本發明之第五範疇係關於一種改良以逆轉錄病毒將基因轉移進入目標細胞之效率的方法，讀方法之特徵係爲在有效量於同一分子上同時具有目標細胞結合域及逆轉錄病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸’或其功能性當量物）之功能性物質存在下，以逆轉石氏張尺度適用^^?7^77^721〇><2_97公釐)-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂線ί 585909 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（7 縴病毒感染目標細胞，以對目標細胞進行轉導。

在上述述於WO 95-26200及Nature Mdicine之習知方法中’其揭示纖連蛋白片段爲可用於對使用逆轉錄病毒進入目標細胞之基因轉移進行改良之最有效方法中的物質。然而，關於纖連蛋白片段外之其他功能性物質，其乘未明確揭示何種功能性物質可用於以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之有效方法中。明確言之，在習知方法中，其僅揭示纖連蛋白之重複序列12-14爲逆轉錄病毒結合域P 本發明乏發明人已意外發現，在結構上與纖連蛋白之重複序列12-14完全無關之纖維母細胞生長因子、膠原蛋白、聚離胺酸等等，亦可有效用於改良以逆轉錄病毒將棊因轉移至目標細胞之方法中。因此，此等物質之任何功能性當量物，亦即，任何具有和此等物質功能上相等之逆轉錄病毒結合域，而且，可以改良以逆轉綠病毒將基因轉移至目標細胞之效率的物質，皆可用於本發明之第五範脅中。在本發明之第五範_中，作爲目標細胞結合域者，可使用含有可結合目標細胞之配位體的物質，而此物質可與逆轉綠病毒結合域偶合。配位體之實例包括細胞黏著蛋白、荷爾蒙、細胞因子、抗禮、糖鍵、碳水化合物及目標細胞之代謝物等等。黏蛋白之實㈣括.織μ白細胞結合域之多肢。例如 VLA-5及/或VLA4之結合域多肽。另夕卜，配位體例包括促紅血球生成素。、Χ 在本發明之第五範4巾，作爲逆轉錄病毒結合域之纖維 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

線I 585909 A7 B7 五、發明説明（8 母細胞生長因子，可包括選自，舉例而言，由序列表中序列編號No. 3表示之纖維母細胞生長因子、該因子之功能性當量物、及含有該因子或其功能性當量物之多肽者。此等功能性物質之實例包括含有由序列表中序列編號 Nos. 4及5表示之胺基酸序列的多肽。在本發明之第五範疇中，作爲逆轉錄病毒結合域之膠原蛋白包括，舉例而言，選自衍生自第V類膠原蛋白，含有胰島素結合域之膠原蛋白片段、該片段之功能性當量物、及含有該片段或其功能性當量物之多肽者。此外，該等片段之實例亦包括含有由序列表中序列編號N〇 6表示之胺基酸序列者。此等功能性物質之實例包括由序列表中序列編號N〇s 7及8 表示之多肽。在本發明之第五範轉中’作爲逆轉錄病毒結合域之聚離胺酸係L -離胺酸之聚合物’而且，舉例而言，其係具有適當聚合度，可由商業上可得之產品選擇並使用者。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂假如衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸之逆轉錄病毒結合域同時具有目標細胞結合域，以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率，便可在有敦量衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸之逆轉錄病毒結合域的存在下，以逆轉錄病毒感染目標細胞而獲得改良。假如目標細胞爲黏著細胞，逆轉錄病毒及目標細胞分別結合及黏著於該功能性物質之上，以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率，便可在有效量衍生自纖維母細胞

經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 585909 Α7 __ Β7 五、發明説明（9 ) 生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸之逆轉綠病毒結合域的存在下’以逆轉錄病毒感染目標細胞而獲得改良。亦筆現，假如由序列表中序列編號No· 1表示之多肽（於下文中稱作H-271)同時具有目標細胞結合域，亦即，假如每標細胞可與多肽Η·271結合，以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率，便可在有效量該多肽的存在下，以逆轉錄病毒感染目標細胞而獲得改良。換言之，儘管於上述Nature Mdicine所揭示之逆轉錄病毒結合域僅有纖連蛋白之重複序列12-14,本發明之發明人已意外發現，此一H-271可根據特定種類之目標細胞，有效作爲目標細胞結合域，以改良進入目標細胞之基因轉移效率。此外，當目標細胞爲黏著細胞，逆轉錄病毒及目標細胞分別結合及黏著於該多肽之上，以逆轉綠病毒將基因轉移至目標細胞之效率，便可在有效量該多肽的存在下，以逆轉綠病毒感染目標細胞而獲得改良。在本發明之第五範疇中，功能性物質可以未固定或固定之狀態使用，儘管在目標細胞爲黏著細胞之時，固定狀態爲較佳者。 ~ 本發明之第六範疇係關於一種用於以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之目標細胞培養基，其包含有效量於同一分子上同時具有目標細胞結合域及逆轉綠病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸，或其功能性當量物）之功能性物質。本發明 < 第七範疇係闕於一種逆轉錄病毒之定位方法， L_______-12- 本、氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇χ297公釐）'-----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 且該方涂之特徵係在對一培養基進行培養，該培養基含有逆轉錄病毒，其接觸有效量在同一分子上同時具有目標細胞結合域及逆轉錄病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸，或其功能性當量物）之功能性物質。此等功能性物質可有效用於逆轉綠病毒之定位，以改良使用逆轉錄病毒進入目標細胞<基因轉移。同時，本發明之逆轉綠病毒定位方法包括對逆轉綠病毒進行培養，該逆轉錄病毒係接觸有效量在同一分子上同時具有目標細胞結合域及逆轉綠病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸，或其功能性當量物）之功能性物質。本發明之第八範疇係關於一種用於進行由逆轉錄病毒仲介進入目標細胞之基因轉移之套組，該套組包含： (a) 有效量在同一分子上同時具有目標細胞結合域及逆轉錄病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸，或其功能）生當量物）之功能性物質； (b) 用於培養目標細胞及逆轉錄病毒之人造物質；及 (c) 用於預刺激目標細胞之目標細胞生長因子。爲就第一及第五範缚之任何方法、第二及第六範嚕之任何培養基、第三及第七範疇之任何方法、以及第四及第八範疇之任何套組進行實施，固定於玻珠上之功能性物質可爲適當使用。本發明之第九範疇係關於一種改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的方法，該方法之特徵係爲在有效 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 M5909

量固定於玻珠上之功能性#質存在下（其選自實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連蛋白片段或其混合物），以逆轉錄病母感染目標細胞’以使用逆轉錄病毒對目標細胞進行轉導。本發明之第十範疇亦關於一種改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的方法，該方法之特徵係爲在有效量未固定之功能性物質存在下（其選自實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連蛋白片段或其混合物），以逆轉錄病毒感染目標細胞，以使用逆轉錄病毒對目標細胞進行轉導。在上述由W0 95-26200及Nature Mdicine所揭示之習知方法中，將逆轉錄病毒與目標細胞於同一分子上同時具有逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質上之共同定位，是改良以逆轉錄病毒將基因轉移至每標細胞之效率的重要機制。在這些方法之中，逆轉錄病毒與目標細胞於同一分子上同時具有逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功旎性物質上之共同定位的進行，首先必須將該於同一分經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂子上同時具有逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質固定於培養基質之上。然而，根據本發明，甚至在使用實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連蛋白片段或其混合物的情況下，令人意外地’以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率，可藉由未固定於培養基質之同一分子上同時具有逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質的使用而獲得改良。 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（12 ) 用於本發明第一、五、九、十範疇之目標細胞可爲，舉例而言，選自幹細胞、造血細胞、非黏著性低密度單核細胞、黏著細胞、骨髓細胞、造血幹細胞、外周血幹細胞、臍血細胞、胎兒造血幹細胞、胚胎形成幹細胞、胚胎細胞、原生殖細胞、卵母細胞、卵原細胞、卵、精母細胞、精子、CD 34 +細胞、C-kit +細胞、多能造血祖細胞、單能造血祖細胞、紅血球前醴細胞、淋巴細胞前體細胞、成熟血細胞、淋巴細胞、B細胞、T細胞、織維母細胞、神經母細胞、神經細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、肌織維母細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞、骨髓瘤細胞及病性白血球細胞。在本發明第一、三、五、七、九及十範疇中之逆轉錄病毒，可使用含有外源基因之逆轉綠病毒，而該逆轉錄病毒可爲，舉例而言，重組逆轉綠病毒栽體。同時，該逆轉綠病毒可爲，舉例而言，複製缺失型重組逆轉錄病毒載體。本發明之第十一範_係關於一種得自本發明第一、五、九或十範疇之經轉導細胞。本發明之第十二範疇係關於一種將本發明第十一範疇之經轉導細胞移植至脊椎動物體内之細胞移植方法。本發明之第十三範疇係關於一種由序列表中序列編號No. 13所代表之多肽，其可改良以逆轉錄病毒，或其功能當量物’將基因轉移至目標細胞之效率。本發明之第十四範疇係關於一種編碼本發明第十三範疇之多肽之基因。此等基因之實例包括由序列表中序列編號本5嫩適用規格(21。二二釐丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 五、發明説明（13 )

No. 17所代表之基因’或可與上逑基因於嚴格條件不進行雜交，且編碼一種多肽，其可改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率之基因。在上述WO 95‘26200及Nature Mdicine之習知方法中，用於基因轉移最有效率之肽係CH-296。相反地，本發明已意外發現，不具有VLA-5結合域和VLA-4結合域之相同多肽亦可用於本發明中。本發明之第十五範辞係關於一種由序列表中序列編號％ 30所代表之多肽，其可改良以逆轉錄病毒，或其功能當量物，將基因轉移至目標細胞之效率。本發明之第十六範_係關於一種編碼本發明第十五範嘴之多肽之基因。此等基因之實例包括由序列表中序列編號 No. 33所代表之基因，或可與上述基因於嚴格條件下進行雜交’且編碼一種可改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率之多肽之基因。本發明之第十七範疇係關於一種由序列表中序列編號N〇 5所代表之多肽，其可改良以逆轉錄病毒，或其功能當量物’將基因轉移至目標細胞之效率。經濟、邓中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本發明之第十八範疇係關於一種編碼本發明第十七範疇之多肤之基因。此等基因之實例包括由序列表中序列编號 No.26所代表之基因，或可與上述基因於嚴格條件下進行雜又’且編碼一種可改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率之多肽之基因。

A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 ------- B7 五、發明説明（14 ) 發明詳述爲執行本發明之基因轉移方法，一般而言，其使用重組逆轉綠病毒載體，特定言之，複製缺失墊逆轉綠病毒載體爲合適者。載體之複製能力受到去除，以阻止其於感染細胞中之自我複製。因此，該載體爲非病原性者。此等載體可侵染進入宿主細胞，如脊椎動物細胞，特別是哺乳動物細胞，以穩定地將插入該載體之外源基因整合至宿主細胞之染色體DNA中。在本發明之中，所欲轉移進入細聦之外源基因之使用，可將其插入一受適當啓動子（例如，存在於逆轉錄病毒之 LTR啓動子或外源啓動子）調控之逆轉錄病毒載體。此外，爲達成外源基因之轉錄，其他可與啓動子及轉綠起始位點合作之調控元件，例如，增強子，亦可存在於載體之中。同時，較佳者，插入基因可於期下游位置具有一終止子序列。所欲轉移進入細胞之外源基因可爲天然或人造者，且可具有衍生自異源來源之額外DNA分子，其以連接反應或其他技藝中已知之方法與此等外源基因偶合^ 插入逆轉綠病毒之外源基因可爲任何所欲用於轉導細胞之基因。舉例而言，此等外源基因可編碼一種與所欲治療之異常情形相關之酵素，一種蛋白質、一種反義核酸、一種核酶或一種錯誤引子（參見，如w〇 9〇/13641)、一種胞内抗體（參見，如WO 94/02610)、一種生長因子等等。用於本發明之逆轉錄病毒載體可具有標記基因，以使經轉導細胞可輕易獲得篩選。可作爲此等標記基因者，例 -17· 本紙張尺度通用宁國國家標準（CNS ) A4規格（210X297^7 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線| 585909 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（15) 如，可使轉形細胞具有抗生素抗性藥物抗性基因，或可爲轉形細胞提供酵素活性而獲得偵測之報導基因。所使用之載體可爲逆轉錄病毒，如已知之MFG載體（ATCC No. 68754)、α-SGC (ATCC No, 68755)等等。此外，用於後述實施例之 N2/ZipTKNEO載體（TJNEOs Blood, vol. 78, ρρ· 310-317 (1991)) 及 PM5neo載體（Exp. Hematol.，vol. 23, ρρ· 630-638 (1995))兩者皆含有新黴素抗性基因（新黴素磷酸轉移酶基因）作爲其標記基因。因此，以此等載體轉形之細胞可經辨識爲具有抗生素 (新黴素、G418等等）抗性之細胞，此等抗生素由轉形細胞之基因產物去活。同時，此等載體可使用已知之包裝細胞株，如卩013(八丁0：00^10686)、1>013/0^8(八丁0：€虹-10685)、 PA317 ( ATCC CRL-9078)、述於美國專利 5,278,056之細胞株、GP + E-86 ( ATCC CRL-9642)、GP + enyAm-12 (ATCC CRL-9641)等等，以將載體包裝於其中之病毒顆粒形式製備。此處所述之「有效量」功能牲物質一詞係指以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞進行轉形作用所需之量。此量可根據特定之功能性物質、逆轉錄病毒及特定種類之目標細胞，使用本發明所述之方法而進行選擇。此處所述之「基因轉移效率」一詞係指轉形效率。功能性物質結合逆轉錄病毒之能力，亦即，功能性物質於本發明之有效性及可用性，可以一般之分析方法確認，如後數實施例所揭示者。此等分析可測定逆轉錄病毒顆粒與本發明固定於基質上之功能性物質結合之程度，以抗拒使其與基質分離之沖洗處理。簡言之，例如，含有病毒之上清液係置於含經固定功能性物質（其具有逆轉錄病毒結合域）之孔槽中。以生理 -18 - 尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210父297公釐1 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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、發明説明（16 經濟部中央標準局員工消費合作社印製鹽水緩衝液徹底沖洗該孔槽，之後，將目標細胞置於該孔槽中’以測定孔槽中殘留病毒之感染活性強度。計算相對於起始病毒上清液之感染活性（或效價）降低情形，並將其與相似之控制組（如，使用BSA_塗覆孔槽）試驗結果進行比較。相較於控制組孔槽，含有功能性物質之孔槽中所殘留之明顯較高效債即顯示，該物質可作爲本發明之功能性物質。爲協助此一篩選過程，該病毒載體可含有一可篩選之標 $己基因。本發明具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質可由此等分析進行篩選。此等具有逆轉綠病毒結合域之功能性物質，諸如具有衍生自纖連蛋白之肝素-Π結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸之逆轉錄病毒結合域之功能性物質。本發明功能性物質之細胞結合域與細胞之結合，亦即，具有目標細胞結合配位體之物質與細胞之結合，亦可使用習知方法進行相似分析。舉例而言，此等方法包括述於

Nature 352: 438441 (1991)者。簡言之，具有細胞結合域之功能性物質係固定於培養盤上’而欲分析之細胞族群則於培養基中覆蓋其上，再共置 3 0分鐘至2小時。在共置之後，回收未與功能性物質黏附之細胞，計數並分析其活性。亦使用胰蛋白酶或細胞分離緩衝液（如，Gibco)，回收與功能性物質黏附之細胞，計數並測試其活性。在某些情形之下，例如，就造血集落形成細胞而言，此等細胞尚進一步培養1 2至1 4天，以確認細 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製五、發明説明（17 ) 胞之集落形成能力。之後，計算黏附細胞之百分比，並與標準値或標準控制組（如以牛血清白蛋白（BSA)固定於培養盤上者）進行比較。目標細胞與受試功能性物質之顯著結合情形提供了指標，説明此種功能性物質/細胞之組合適用於本發明，且該具有細胞結合域之功能性物質可與真有逆轉錄病毒結合預知功能性物質共存或偶合，在評估目標細胞之逆轉錄病毒感染情形之後，建構可用於本發明之功能性物質。可用於本發明之具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質，如上所述，諸如具有衍生自纖連蛋白之肝素_π結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸之逆轉綠病毒結合域之功能性物質。所有具有和上述相當之逆轉錄病毒結合域，且可藉由其與具有目標細胞結合域之配位體偶合或共存而改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率之物質’皆包含於衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸之逆轉錄病毒結合域之當量物中ο 本發明功能性物質有效量，可在經選擇具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質存在下（其與具有目標細胞結合域之功能性物質偶合或共存），使用本發明基因轉移方法中之目標細胞及逆轉錄病毒，再根據上述方法估算基因轉移效率之改良而進行測定。於後，本發明將獲得詳述。本發明之範疇之一係一種增加以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的方法。此方法之特徵爲在可有效增加 -20· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公羞） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 線· 585909 A7 ----- B7 五、發明説明（18 ) 以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率之具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質和具有目標細胞結合域之功能性物質之混合物存在下，以逆轉綠病毒感染目標細胞。此方法可用於取得以逆轉綠病毒轉導之轉形細胞，而將此等細胞移植至單一生物體之處理，將寸使基因轉移進入單一生物體中。可用於此方法之具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質係非專一性受限者，且其實例包括纖連蛋白之肝素-Π結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白、聚離胺酸等等。同樣地，亦可使用其功能當量物（例如，具有肝素結合域之功能性物質）。此外，亦可使用功能性物質之混合物、含有功能性物質之多肽、功能性物質之聚合物、功能性物質之衍生物等等。此等功能性物質可由天然產物取得，或可以人工製備（例如，以基因工程技術或化學舍成製備）。同時，其亦可藉由夭然產物及人工產物之結合而製備。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 線·· 就本發明所述可以高效率完成基因轉移之逆轉錄病毒結合域及/或目標細胞結合域仍獲得保留之情況而言，所用之功能性物質可爲在天然多肽胺基酸序列中具有突變者。在本發明中，甚至在天然多肽胺基酸序列中有一或多個 (例如，多至數個胺基酸）缺失、取代、插入及/或添加之情形存在，只要所欲之逆轉錄病毒結合域及/或目標細胞結合域仍獲得保留，此等多肤仍稱爲具有天然胺基酸序列之多肽之當量物。此等功能當量物之取得，可藉由製備編碼該功能當量物之基因，以產生該當量物，並確認其生物 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 _________ B7 五、發明説明（19 ) ^ 活性而進行。在此方面，生物技術技藝已進步到可依尋常程序，對所須功能域之胺基酸進行缺失、取代、添加或其他修飾之狀態。之後，所得之胺基酸序列亦可依尋常程序，篩選所須之細胞結合活性或病毒結合活性。、編碼功能當量物之基因可藉尋找與編碼上逑功能性物質之基因雜交之基因而取得。亦即，編碼上述功能性物質之基因或其核芬酸序列之部分，可作爲雜交之探針或基因放大法（如pCR等）之引子，以篩選編碼具有功能性物質類似活性之蛋白質ό有時，在此方法中，可取得僅含有一部份目標基因之DNA片段。在此種狀況之下，在確認所得DNA片段爲目標基因之部分之後，可以該DNA片段或其部分作爲探針以進行雜交反應，或者，使用根據該DNA片段之核甞酸序列合成之引子進行 PCR反應，而取得完整之目標基因。舉例而言，上述之雜交反應可於下述條件下進行。亦即，將DNA固定之膜與探針，於含有〇5% SDS、〇 1% BSA、0.1%聚乙晞吡咯烷酮、〇 1% Fic〇u 4〇〇及〇〇1%變性鮭魚精

子 DNA之 6 X SSC 中（1 X SSC : 0.15M NaCl、0.015M檸檬酸納、pH 7·〇)，共置12至20小時。結束共置之後，先以含有〇 5%卿之2 X SSC於37°C下沖洗該膜，再將SSC之濃度變更爲〇j χ SSC，且將溫度變更爲50°C進行沖洗，直到衍生自固定之信號可自背景中辨識。此外，可對由上述方法取得之基因編碼之蛋白質進行活 • 22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公董） ------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（20 ) 性檢驗，以確認由此所得之基因是否爲所欲之目標。如上之WO 95/26200所述，纖連蛋白之肝素_ π結合域係具有逆轉錄病毒結合域之多肽。儘管纖維母細胞生長因子、膠原蛋白及聚離胺酸與纖連蛋白之肝素·Π結合域並無任何結構上之相似性（例入，胺基酸序列之相似性），本發明之發明人卻發現，此等物質亦具有逆轉錄病毒結合域。本發明具有目標細胞結合域之功能性物質亦非專一性受限者’且其係爲具有可與目標細胞結合之配位體之物質。此等配位體之實例包括細胞黏著蛋白、荷爾蒙、細胞因子、抗細胞表面抗原之抗體、多酷、糖蛋白或糖脂中之糖鍵、目標細胞之代謝物等等。此外，亦可使用含有功能性物質之多肽、功能性物質之聚合物、功能性物質之衍生物、功能性物質之當量物等等。此等功能性物質可由天然產物取得，或可以人工製備（例如，以基因工程技術或化學合成製備）。同時，其亦可藉由天然產物及人工產物之結合而製備。所用之細胞黏著蛋白係，舉例而言，纖連蛋白及其片段。例如，美國專利No. 5，198,423所述之人類纖連蛋白之細胞結合域（其對應於Pr〇i239-Serm5)已證實具有本發明所揭示之多肽C-274之功能當量物，且可與細胞結合，包括BHK及 B16-291 細胞（Kimizuka et al·，J. Biochem, Vol. 110, ρρ· 285-291 (1991))。存在於此等多肽中，由RGDS四個胺基酸組成之序列，係 VLA-5受體之配位體。VLA-5受鵲之表現可於多種細胞中得見，且其於未分化細胞中具有優於分化細胞中之表現情 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 585909 A7 B7 五、發明説明（21 ) 形。此外，纖連蛋白之CS-1區域已知為VLA-4受體之配位體，且其可與表現該受體之細胞結合（T細胞、B細胞、單核細胞、NK細胞、嗜酸性細胞、嗜驗性細胞、胸腺細胞、骨髓單核細胞、紅血球母細胞前體細胞、淋巴細胞前體細胞、黑素瘤細胞、肌細胞等等）。述於JP-A 3-284700及由序列編號No. 29代表之多肽（其於後以C277-CS1稱之）係一種具有對 VLA-5及VLA-4受體兩者之配位體之多肽，且可用於將基因轉移至具有此等受體之細胞之中。然而，已證實肝素-II區域可與纖維母細胞、内皮細胞及腫瘤細胞結合。肝素-II區域細胞結合域之多肽序列可用於在具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質多肽存在下，引導逆轉錄病毒對目標細胞之感染。具有細胞專一活性之荷爾蒙及細胞因子係適合作為本發明具細胞結合域之功能性物質者。舉例而言，促紅血球生成素（其為造血系統中之細胞因子）可用於將基因轉移進入造血細胞中。促紅血球生成素可根據已知方法製備及使用。此外，亦可使用促紅血球生成素之功能當量物及含有促紅血球生成素或其功能當量物之多肽。如下之實施例所述，當具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質（例如，H-271及一纖維母細胞生長因子）係與C-274 (其為具有衍生自纖連蛋白之細胞結合活性之多肽）或其相似物混合使用之時，可獲得高基因轉移效率。用於此等實施例之VIH/3T3細胞可表現VLA-5受體，其可結合C-274，而此交互作用亦對基因轉移效率之改良具有貢獻。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 A7 B7 五、發明説明（22 ) 同時，相同之現象亦可見於促紅血球生成素衍生物存在於將基因轉移至表現促紅血球生成素受體之TF-1細胞（Blood, Vol. 73, pp. 375-380 (1989))的過程中。同時，此種效果並未見於未帶有任何造血細胞受體之細胞中。此等結果可清楚顯示，細胞專一性之基因轉移效率提升可發生於具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質及具有細胞結合域之功能性物質的存在之下。在本發明之此一範疇，具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質係以其與具有細胞結合域之另一功能性物質之混合物形式使用。因此，將基因轉移至具有該等功能性物質親和力之目標細胞中的效率獲得顯著改良。由於基因轉移效率獲得改良，因此，可免去與病毒生產細胞之共培養處理，此即為本發明之優點之一。將基因選擇性轉移進入目標細胞之方法具有高度利用性，且亦已進行各種研究。舉例而言，其包括一種非病毒載體（分子共軛載體），其中將一結合細胞表面受體之物質與一 DNA結合物質偶合。使用此一載體進行之基因轉移方法例如，以脫唾液酸糖蛋白將基因轉移至肝癌細胞之方法 (J. Biol. Chem.，Vol. 262, pp. 4429-4432 (1987))、以運鐵蛋白將基因轉移至淋巴母細胞之方法（Proc. Natl· Acad· Sci· USA，Vol· 89, ρρ· 6099-6103 (1992))、以抗EGF受體抗體將基因轉移至癌細胞之方法（FEBS Letters，Vol. 338, pp. 167-169 (1994))等等。此等使用非病毒載體之基因轉移方法就經轉移基因之長期基因表現的角度而言是較差者，因經轉移之基因並未整合進入細胞之 _-25-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 Α7 Β7 五、發明説明（23 ) 染色體DNA中。亦曾有試圖使用逆轉綠病毒之活動，其爲一種廣泛使用之載體，可將基因插入染色體中以感染特定細胞。例如，已發展出藉由逆轉錄病毒之直接化學修飾而與乳糖偶合，以使基因轉移至肝細胞之方法（J Bi〇1 Chem， Vol. 266, PP. 14143-14146 (1991))、利用具有包膜蛋白（其爲與促紅命球生成素融合之融合蛋白）之重組病毒顆粒將基因轉移至促紅血球生成素受體表現細胞之方法（Sdence，v〇L 266, ρρ· 1373_1376 (1994))等等。然而，就此目的而言，必意根據特定目標細胞製備特殊之蛋白顆粒。此外，病毒顆粒之化學修飾需要複雜之流程，且其容易使病毒去活。同時，就以基因工程修飾之病毒包膜而言，並不一定可以取得具有所欲功能（結合目標細胞並建構病毒顆粒）之目標產物。上述之WO 95/26200建議，一種不具任何特殊修飾之逆轉錄病毒載體’可在與具有細胞結合活性之適當配位體共價偶合之纖連蛋白片段的存在下，轉移進入細胞之中。然而’此種方法使用同時具有病毒結合活性及細胞結合活性之功能性分子，因此，必需根據特定之細胞種類，製備個別特殊之功能性物質。此外，並不知所製得知功能性物質是否同時保有此兩種活性。本發明具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質與具有目標細胞結合域之不同功能性物質之結合，可提供一種使用逆轉錄病毒之基因輸送系統，應用於廣泛之細胞種類。爲達成此一目的，具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質並不須與具有細胞結合域之功能性物質進行共價偶合。因此，不 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） '^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

585909 五、發明説明（須根據特疋之細胞種類製備個別特殊之功能性物質（其中具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質與具有細胞結合域之功能性物質共價偶合），而基因轉移進入目標細胞之過程可便利且有效地進行。使用本發明之方法將基因轉移進入目標細胞之實例為造血系統細胞之基因轉移。已知上述纖連蛋白之cs_i細胞黏著區域可用於將基因轉移進入造血幹細胞。同時，亦已知、，除了:上述之促紅血球生成素之外，許多其他細胞專一性 < 細胞因子亦與造血細胞之分化相關，且亦可藉由此等因子 < 使用而專一性進行目標細胞（細胞系）之基因轉移。舉例而言，在使用G-CSF之時，巨核母細胞及粒細胞前體細胞可被用來作為轉導之目標細胞。在使用可專一性或優勢性與惡性細胞結合之物質作為具有細胞結合域之功能性物質時，可進行此等目標細胞之基因轉移。舉例而言，已知稱為HER_2及HER_4之受體表現於某些乳癌細胞之中（Pr〇c· Nat. Acad. Sci. USA，ν〇1· 92, PP. 9747-9751 (1995))。因此，可結合heregulin (其為此等受體之配位體）與具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質，以控制乳癌細胞之生長。此外，藉著使用含有甲狀腺（癌）細胞之碘的功能性物質，或者，使用含有肝（癌）細胞之高密度脂蛋白（HDL)、脫唾液酸糖蛋白或其片段之功能性物質，此等細胞可用來作為轉導之目標細胞。 ___ ____-27- 本紙張尺度適用巾國國家標準(CNS) Α4規格(21Q X 297公董) 585909 A7

同時，藉著使用抗細胞表面抗原之抗體，適當者，單株抗體，作爲具有細胞結合活性之功能性物質，任何具有可取得抗體之細胞皆可用來作爲目標細胞。因此，使用本發明所揭示之逆轉錄病毒及目標細胞之定位方法，許多不門的細胞皆可用來作爲目標細胞。在較佳範疇之中，以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率係使用新穎之功能性物質而獲得提升。至今，僅知道纖連蛋白之肝素-订結合埤爲具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質，其對使用逆轉綠病毒將基因轉移至目標細胞之過程具有功效。如上所述，此等區域本身即可與某些細胞結合，而且，在某些情況之下，此等活性就某些目標細胞而言係不佳者。在此種情形之下，可以其他細胞結合域取代該結合域而獲得所欲之結果。在此方面，可使用具有不同性質之多功能性物質，而此亦使本發明之基因治療可具有更廣泛之應用，而所欲目標細胞之轉導亦可輕易進行。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ 本發明所提供具有逆轉錄病毒結合域之新穎功能性物質包括纖維母細胞生長因子、含有此等因子之多肽、膠原蛋白片段、此等片段之混合物、含有此等片段之多肽、此等功能性物質之聚合物等等。聚離胺酸亦可爲本發明之此一目的使用。此等功能性物質可由天然產物取得，或可以人工製備（例如，以基因工程技術或化學合成製備）。同時，其亦可藉由天然產物及人工產物之結合而製備。此等功能性物質可用於本發明第一範疇之基因轉移方法，而此等功 •28· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公着) ~' 585909 A7 B7 五、發明説明（26) 能性物質和其他具有細胞結合域之功能性物質之嵌合體分子亦可用於進行基因轉移。所有上述之功能性物質皆具有逆轉錄病毒結合活性。然而，此等物質並不含有述於W0 95/26200之人類纖連蛋白之肝素-Π結合域，或具有相似胺基酸序列之多肽。作爲纖維母細雎生長因子，可使用實質上純的天然產物，或使用以基因工程技術製備之產物。在本發明之中，可使用由序列表中序列編號No, 3代表之纖維母細胞生長因子，亦可使用保留該多肽功能之經修飾衍生物。纖維母細胞生長因子衍生物之實例包括由序列表中序列編號No. 4代表之多肽（於後以C-FGF，A稱之）。其爲一多肽，其中纖連蛋白多肽之細胞黏著域與由序列表中序列編號No. 3代表之纖維母細胞生長因子之N -端偶合，且其可爲美國專利 5,302,701所概略揭示之基因工程技術製備。此一多肤可使用上述美國專釣所揭示之大腸桿菌FERMP-12637取得，其現已根據布達佩斯條約，寄存於（National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken，Japan)，寄存編號FERMBP-5278(原始寄存曰期：1991年12 月9曰）。上述具有衍生自纖連蛋白之CS-1細胞黏著域之C-FGF*A之多肽衍生物（其由序列表中序列編號No· 5代表）（於後以C-FGF-CS1稱之），可使用根據布達佩斯條約寄存於NIBH ( 1-1-3, Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，寄存編號 FERM BP-5654 (原 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公董） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（始寄存日期：1996年9月6日）之大腸桿菌，根據本發明所述之方法取得，並同時於1997年3月4日寄存於台灣食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 940144。此一 C-FGF-CS1特別適用於將基因轉移進入具有CS-1結合性質之目標細胞之中，特別是造血幹細胞。作為膠原蛋白，可使用以酵素或化學方法自天然膠原蛋白切割取得之實質上純的片段，或者，可使用由基因工程技術製備$得者。此外，亦可使用保留此等片段功能之修飾片段。在膠原蛋白之中，人類第V型膠原蛋白具有強胰島素結合活性（JP-A 2-209899)。具有胰島素結合域之多肽的實例之一為含有由序列表中序列編號No. 28代表之胺基酸序列之多肽（JP-A 5-97698)，例如，由序列表中序列編號No· 6代表之多肽（於後以ColV稱之）。ColV可根據本發明之實例所揭示之方法進行製備。一種含有ColV且由序列編號No. 7代表之多肽（於後以C277-ColV稱之）係一種多肽，其中纖連蛋白之細胞黏著域多肽與ColV之N -端偶合，且其可根據上述之JP-A 5-97698，以基因工程技術製備。C277-ColV可由JP-A 5-97698中以寄存編號FERM P-12560揭示，且根據布達佩斯條約寄存於 NIBH ( 1-1-3, Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，寄存編號 FERM BP-5277(原始寄存日期：1991年10月7日）之大腸桿菌取得。一種衍生自C277-ColV之多肽（於後以C-ColV-CSl稱之）可如下述進行製備，其由序列編號No. 8代表，且具有衍生自纖連蛋白之CS-1細胞黏著域。使用上述質體pCH102 (其係由根據布達佩斯條約寄存於 ΝΓΒΗ ( 1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，寄存編號FERM BP-5277 (原始寄存日期·· 1991年10 ______-30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（23) 月7日）之大腸样菌進行製備）作爲樣板，以引子CS1-S(其核甞酸序列係由序列表中序列編號No. 9代表）及M4，進行PCR 放大反應以分離一DNA片段，再以限制酶Nhel及Sail進行切割處理。另一方面，使用質體PTF7520C〇1V(其含有編碼C277-ColV之基因，且係由上述大腸桿菌FERMBP-5277製備而得）作爲樣板，以引子CF及CNR進行PCR放大反應以分離一 DNA片段，再以限制酶AccIII及Ndel進行切割處理。CF及CNR之核苷酸序列係由序列表中序列編號No. 10及Π代表。混合上述兩DNA片段，並與一大約4.4kb之0NA片段（其係以限制酶Accffl及Sail切割質體pTF7520ColV製備而得）進行連接反應。所得之質體編碼多肽C-ColV-CSl，其含有位於C277-C01V之C-端之CS-1細胞黏著域，且其中ColV之C-端第二麩胺酸與C-端羥丁胺酸分別由丙胺酸及絲胺酸取代。對以此質體轉形之大腸桿菌進行培養之後，由培養物中取得目標多肽。此一〇C〇1V-CS1特別適用於將基因轉移進入具有CS-1結合性質之目標細胞之中，特別是幹細胞。作爲聚離胺酸，如上所述，具有適當聚合度者可由商業上可得之聚離胺酸選擇並使用。本發明之功能性物質可包括上述功能性物質之衍生物。其實例包括上述之C-FGF-CS1或其功能當量物，以及C-ColV-CS1或其功能當量物。此外，由多分子之此等功能性物質進行聚合反應取得之聚合物，以及根據已知方法（添加糖鏈等等）修飾此等功能性物質取得之經修飾物質，亦可用 •31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公麓） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（29) 於本發明之中。此等聚合物及其功能當量物可使用轉碼此等聚合物之基因及編碼其功能當量物之基因，以基因工程技術進行製備。此外，可用於製備功能性物質之半胱胺酸 -添加性功能性物質，可在功能性物質之胺基酸序列中，以半胱胺酸進行添加、插入及取代而進行製備。此外，一身爲半胱胺酸-添加性功能性物質，且具有逆轉錄病毒結合域之分子，可輕易與另一身爲丰胱胺酸-添加性功能性物質’且具有逆轉錄病毒結合域之分子進行偶合。同時，與另一功能性物質偶合之物質，可使用半胱胺酸-添加性功能性物質之半胱胺酸殘基的反應性而進行製備。在本發明之另一較佳範疇之中，基因轉移係使用纖速蛋白之逆轉錄病毒結合域之聚合物進行，其可改良以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞中之效率。此功能性物質係如上述WO 95/26200所述，在一分子上具有多個人類纖連蛋白肝素-Π結合域之多肽，或該多肽之衍生物。只要保留與該功能性物質相同之活性，亦可包括其中一部份胺基酸序列與天然產物不同之功能當量物。功能性物質之聚合物之實例，包括以酵素或化學方法使上述衍生自纖連蛋白多肽之進行聚合反應而取得者，或以基因工程技術取得者。在一分子上具有兩個衍生自鱗連蛋白之肝素-II結合域之多肽的實例，包括具有由序列表中序列編號No. 13代表之胺基酸序列之多肤（於後以H2-547稱之）。H2-547可使用根據布達佩斯條約寄存於_Η ( μι_3, Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，寄存編號 fem ΒΡ-5656 (原 -32· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 B7 五、發明説明（始寄存日期：1996年9月6日）之大腸桿菌，根據本發明所述之方法取得，並同時於1997年3月4日寄存於台灣食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 940146。具有由序列表中序列編號No. 14代表之胺基酸序列之多肽，係含有與H2-547之 N -端偶合之纖連蛋白細胞黏著多肽之多肽衍生物（於後以 CH 2-826稱之）。此多肽可根據本發明所揭示之方法取得。同時，具有由序列表中序列編號No. 30代表之胺基酸序列之多肽，係含有與H2-547之C -端偶合之纖連蛋白CS-1細胞黏著域之多肽>汗生物（於後以H2S-573稱之）。此一多肽可使用根據布達佩斯條約寄存於 NIBH ( 1-1-3, Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，寄存編號FERM BP-5655 (原始寄存曰期：1996年9 月6日）之大腸桿菌，根據本發明所述之方法取得，並同時於1997年3月4日寄存於台灣食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 940145。具有CS-1細胞黏著域之H2S-573可用於將基因轉移製造血幹細胞之中。在本發明之另一較佳範疇之中，活目標細胞係在固定於玻珠上之功能性物質存在下（其可有效提升以逆轉錄病毒將基因轉移至細胞中之效率），受到複製缺失型逆轉錄病毒載體之感染。使用述於WO 95-26200及Nature Mdicine之功能性物質，以改良使用逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的習知方法，係將功能性物質固定於進行細胞病毒感染之容器上（細胞培養盤）。此等方法須要複雜之流程，例如，在以含有功能性物質之溶液處理培養盤後，將多餘之功能性物質洗去之步驟。因此，使用固定有功能性物質之培養盤進行之基因轉移方法，並不是一個便利的方法。相反的，使用固定於玻珠 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） ^^5909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 、發明説明（31 上之功能性物質之方法具有下列優點。與培養盤相較，玻珠上之固定處理可在相對較小之空間中C行，而且，玻珠可在封閉容器中進行處理。由於固定有功fb性物質隻培養盤係暴露於空氣之中，必需小心避免因貯存期間之乾燥而造成之惡化情形。然而，破珠可懸浮於，谷液中貯存，而此種問題便可獲得避免。同時，功能性物質之表面積在使用玻珠時可變得較大，因此，在於培養盤相較之下，可取得較高之基因轉移效率。功能性物質之固定處理可藉由習知方法進行，舉例而吞’目標細胞培養容器可以功能性物質塗覆，或者，功能性物質可固定於，例如，培養細胞用之培養珠上。起始材科及破珠形式可根據目標用途而進行選擇。舉例而言，玻珠可具有一環狀或球狀之核以作爲中心部分，而核之表面可以一親水性聚合物塗覆。起始材料及核與聚合物種類之實例述於JP-A 8-501092之中。例如，固定有此等功能性物質之生物可降解珠可施用於活體之中。或者，另一有效之方法係使用固定有具逆轉錄病毒結合域之分子之玻珠與固定有具目標細胞結合域之分子之玻珠的混合物。當此等功能性物質係於未固定之狀態使用，舉例而言，目標細胞培養容器可先以防止功能性物質黏著於容器上之物質（例如’牛血清白蛋白（BSA))進行前處理。因此，可在沒有非專一性黏附至容器上之情形下使用功能性物質。根據本發明，基因轉移甚至可在以未固定之狀態下使用本發明功能性物質之系統中有效進行。 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（32 ) 此外，藉由使用後述專門設計用於進行本發明之方法之反應劑套組，細胞之基因轉移可非常便利地進行。如上所述，根據本發明取得之轉形細胞可移植浸入活體之中，因此，可進行基因治療，以在活體中表現外源基因。舉例而言，在使用造血幹細胞作爲目標細胞之時，基因治療可以下述流程進行。首先，自捐贈者取得含有造血細胞之物質，例如，骨髓組織、周邊血液、胎兒臍核血液等等。可直接使用該物質。然而，一般係以密度梯度離心法等等製備含有造血幹細胞之單核細胞部分。或者，亦可使用細胞表面之標記（如CD34及/或C_kit)純化造血幹細胞。含有造血幹細胞之物質可選擇性地以適當之細胞生長因子等等進行前刺激，然後，再根據本發明之方法，以重組逆轉錄病毒載體感染該等細胞（此等載體中已插入所欲之基因），特定言之，係在具有幹細胞結合活性之功能性物質存在下進行，由此取得之轉形細胞可藉由，舉例而言，靜脈投藥而移植至接受者體内。較佳者，該接受者係自身捐贈者，但亦包括異基因移植者，後者特別是在使用臍核血液細胞進行移植之時。使用造血幹細鸠作爲目標細胞之基因治療係爲彌補病患之缺失或異常基因而爲，而其實例包括ADA缺失症及高歇氏病（Gaucher^ disease)。此外，有時候亦進行藥物抗性基因之轉導以解決因癌症、白血病等等之化學治療而產生之造血幹細胞異常情形。 -35 · 本紙張尺度適用中國^家標準（CNS ) M規格（210x297公楚） ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

線I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7____ 五、發明説明（33 ) 已知造血幹細胞表現VLA4受體，因此，可使用本發明所揭示具有CS-1細胞黏著區域之功能性物質，有效進行基因轉移。同時，如上所述，諸如CD34及C-kit之分子係表現於造血幹細胞之表面，因此，基因轉移之效率可藉由抗此等分子之抗體或幹細胞因子（其爲C4dt之配位體）與具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質的結合而獲得改良。同時，在癌症之基因治療方面，已有針對腫瘤疫苗治療之研究，其中，細胞因子基因被轉移至癌細胞中，而在剝奪生長能力之後，此等細胞再被轉回病患體内，以增加腫瘤免疫力（Human Gene Therapy，Vol· 5, pp. 153-164 (1994))。此等治療亦可應用本發明之方法，以具有高癌細胞親和力之功能性物質而有效進行。同時，亦有試圈以基因治療法治療AIDS之行動◊在此方面，曾有人提議將鵠碼可抑制HIV複製或基因表現之核酸分子的基因（如反義核酸、核酶等等），轉移進入經造成 AIDS 之 HIV 感染的 T 細胞之中（J. ViroL，Vol· 69, ρρ· 40454052 (1995))。Τ細胞之基因轉移可藉由本發明之方法，使用可結合表現於Τ細胞表面之分子的功能性物質（例如，CD4抗體等等）而獲得完成。因此，作爲基因轉移之目標細胞，可使用任何細胞，只要本發明具有目標細胞結合域之功能性物質係可爲取得或可爲製備者。同時，本發明之方法遑用於臨床基因治療之流程，因其不須在逆轉錄病毒生產細胞之存在下，進行目標細胞之共本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公董） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（34 ) 培養’且本發明之方法可在無bromide之情形下進行，其對人類係臨床上不利者。同時’本發明對基因治療之外技藝領域之庳用，例如，轉基因脊椎動物可輕易使用胚胎形成幹細胞、原生殖細胞、卵母Μ胞、卵原細胞、卵、精母細胞、精子等等作爲目標細胞而進行製備。亦即，作爲本發明之一項範疇，本發明提供一種細胞移植之方法，其包含將取自本發明之轉形細胞，移植進入脊椎動物體内。可以轉形細胞移植之脊椎動物實例，包括哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、羊、豬、馬、狗、猴、獲猩、人類等等）、鳥類（例如，難、火難、轉鶉、鴨、野鴨等等）、爬蟲類（例如，蛇、鱷魚、龜等等）、兩生類（例如，青桂、山椒魚、蠑螈等等）、魚類（例如，狗鯖魚（d〇g mackerd)、鯖魚、巴斯鱸魚、棘鬣魚、鱸魚（grouper)、黃尾魚 (yellowtail)、鮪魚、鮭魚、鳟魚、鯉魚、甜魚（sweetfish)、鰻魚、比目魚、鯊魚、魟魚、鳢魚等等）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 因此，根據本發明之此一範疇，和實質上純之纖連蛋白、實質上純之纖連蛋白片段或其混合物相似，以逆轉錄病毒進行之基因轉移，可藉由本發明之功能性物質逆轉錄病毒結合·域及目標細胞結合域而有效進行。因此，本發明可提供一種將遣傳物質轉移至脊椎動物體内之技術，沒有任何習知技術之限制。在本發明之另一範_，其使用同一分子上同時具有逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之物質，以及具有實質上 -37-

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（35) 純之纖連蛋白、實質上純之纖連蛋白片段或其混合物之功能當量物的物質作爲功能性物質。此種功能性物質係一種可與纖連蛋白、纖連蛋白片段或其混合物，以相同效率表現基因轉移之物質。一般而言，其爲上述在同一分子上，同時具有本發明之新穎逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質。在使用此等物質之情況下，逆轉錄病毒及目標細胞皆與至少一種功能性物質結合。同一分子上同時具有本發明之新穎逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質的實例包括由序列表中序列編號Nos. 21及22代表之多肽（於後分別以CHV-181及CHV-179稱之）。此等多肽包括含於H-271之第三類相似序列（ΠΜ2、m-13及 ΙΠ-14)。在 CHV-181中，序列ΠΜ2 及 ΠΙ-13,在 CHV-179中，序列 ΠΙ-13及ΙΠ-14，係藉由甲硫胺酸，添加至纖連蛋白細胞黏著多肽（ProinSfcrisi5)之C-端。表現多肽CHV-181之質體，舉例而言，可藉由下列流程製備。首先，於大腸桿菌HBlOl/pHDlOl ( FERM BP-2264)中製備含有編碼纖連蛋白肝素結合多肽（H-271)之DNA片段之質體 pHDIOl。以定位謗變將Hindm位點引入編碼此質體ΠΙ-13序列 C -端之區域，再以Ncol及Hindin進行切割處理，以取得編碼 ΠΙ-12及ΠΙ-13序列之DNA片段。另一方面，以Hindm及Sail對質體載體pINHI-ompAi進行切割處理，以取得編碼脂蛋白終止子區域之D>iA片段。 -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（36) 接著，於大腸桿菌JM109/pTG7021 ( FERM BP-1941)中製備含有編碼纖連蛋白細胞黏著多肽（C-279)之DNA片段之質體 PTF7021，再立刻以定位謗變將Ncol位點引入此質體上C-279之終止密碼子前+以取得質體PTF7520。以Ncol及Sail對此質體進行切割處理，再將其與編碼ΠΙ-12及瓜-13序列之ζ)ΝΑ片段及編碼脂蛋白終止子區域之DNA片段混合，使其進行接合反應，以取得表現多肽CHV-181之質體PCHV181。質體pCHV181 上編碼多肽CHV-181之區域的核甞酸序列示於序列表中之序列編號No. 27。表現多肽CHV-179之質體，舉例而言，可藉由下列流程製備。首先，以定位謗變將Ncol位點引入質體pHDIOl上編碼ΠΙ-13 序列N -端之區域中，再以Ncol及Hindin進行切割處理，以取得编碼ΙΠ·13及ΠΙ-14序列之DNA片段。將其與編碼上述脂蛋白终止子區域之DNA片段及經Ncol及Sail-切割處理之質體 PTF7520混合，使其進行接合反應，以取得表現多肽CHV-179 之質體PCHV179。 CHV-181及CHV_179可藉培養分別經上述質體轉形之大腸桿菌，再對所得之培養物進行純化而取得。此等功能性物質可以固定於，舉例而言，上述之玻珠上，或未固定之形式使用。在另一範疇，本發明提供一種用於以逆轉綠病毒將基因轉移盖目標細胞之目標細胞培養基，其包含⑴如上所述之有效量具有逆轉錄病毒轉合域之功能性物質和有效量具有 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇'〆297公釐 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（37 ) 目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物或（2)有效量於同一分子上同時具有上述新穎之逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質。該功能性物質可經固定或未固定使用。本發明之培養基之其他成分並無特定限制，只要其可用於培養目標細胞，而商業上可購得培養細胞之培養‘可爲使用。本發明之培養基亦可含有血清、目標細胞生長必需之生長因子、預防微生物污染之抗生素等等。例如，就 NIH/3T3細胞而言，可使用含有10〇/〇胎牛血清（Gibc〇)、5〇單位/毫升之青黴素及50微克/毫升之鏈黴素（兩者皆爲

Gibco)之 Dulbecco’s經修飾 Eagle’s培養基（PMEM，JRH Bioscience)作爲培養基。在另一範疇，本發明提供一種逆轉錄病毒之定位方法，其包含對一培養基進行培養，該培養基含有逆轉錄病毒，其接觸⑴如上所述之有效量具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質和有效量具有目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物、（2)有效量於同一分子上同時具有上述新穎之逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質或⑺如上所述之具有逆轉綠病毒結合域之功能性物質。如上所述，該功能性物質可經固定或未自定使用。培養可根據習知之方法進行，例如，在3rc，於％濃度5%及濕度99·5/〇之條件下進行。此等條件可根據所使用之特定目標細胞而適备調整，而培養其亦可根據特定細胞及目的進行變更。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂'

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、藉由本發明方法之使用，可於各種將病毒送入目標細胞之建構中，對病毒進行定位。在本發明之另一範疇，其提供一種使用由逆轉錄病毒仲介進入目標細胞之基因轉移之套組。該套組包含·· (a) 有效量之如上所述之具有逆轉綠病毒結合域之功能性物質和具有目標細胞結合域之另一功能性物質之混合物或（2)於同一分子上同時具有上述新穎之逆轉錄病毒結合域及目標細胞結合域之功能性物質； (b) 用於培養與逆轉錄病毒接觸之目標細胞之人造物質；及 (c )用於預刺激目標細胞之目標細胞生長因子。功能性物質（a)可爲經固定或未固定者。此套組可進一步包含重組逆轉綠病毒載體、必要之緩衝溶液等等。作爲人造物質者，可使用培養細胞之盤、培養m、三角燒瓶等等。其可爲聚苯乙烯製品。就目檁細胞係G〇期細胞之情形言之，逆轉錄病毒之感染並不會發生’因此，較佳者，細胞係經預刺激，以使細胞進入細胞週期。未達成此一目的，目標細胞在以逆轉綠病毒進行感染之前，係於適當細胞生長因子之存在下進行培養例如’就基因轉移進入骨髓細胞及造血細胞之情形而言’可使用諸如間白素-6之目標細胞生長因子或幹細胞因〇 0 除水溶液之外，該套組之各別組成份元件亦可根據此技藝中已知之方法，以束乾產物、顆粒、錠劑之形式製備。 -41 · 本紙張尺度適财:標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) " ' 1 -I I I 1- - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（39 ) 藉由本煢明套組之使用，舉例而言，可取得經轉形之活目標細胞培養物，並可輕易進行以逆轉錄病毒中介進入目標細胞之轉導◊ 本發明亦包括一種以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之方法，其中使用固定於玻珠之上或未固定之功能性物質 (其選自實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連蛋白片段或其混合物，或其聚合物）。本發明包括上述之CH2-826及其功能當量物。此外，本發明提供編碼CH2-826之基因。其實例之一爲由序列表中序列编號No· 20代表之基因。本發明亦包括該基因之功能當量物0 同時，本發明提供上述之CHV_181，且包括其功能當量物。此外，本發明提供編磯CH\M81之基因。該基因之實例之一爲由序列表中序列編號No, 27代表者。本發明亦包括該基因之功能當量物。本發明亦提供一種聚合物，其含有逆轉錄病毒結合域之聚合物及/或目標細胞結合域之聚合物。該聚合物之具體實例爲纖維母細胞生長因子之聚合物及具有衍生自第V型膠原蛋白之政島素結合域之多肽的聚合物。如下文所討論’儘管本發明不受任何理論限制，咸信以逆轉錄病毒將基因轉移進入細胞，亦即，轉形之過程，可藉由逆轉綠病毒及目標細胞與各功能域之結合而獲得改良。可與逆轉錄病毒結合，因此可用於本發明之功能性物 •42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂線< 經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（40) 質，包括實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連蛋白片段或其混合物。本發明發現，上述與實質上之純纖連蛋白等等具有實質上相同功能之本發明功能性物質，可改良以逆轉錄病毒對目標細胞進行之基因轉移效率，亦即，轉形效率〇此處所述之纖連蛋白片段可爲天然或合成來源者，且可以實質上之純度自天然物質製備，例如，根據先前述於 Ruoslahti et al. (1981) J* Biol. Chem. 256:7277 i Patel and Lodish (1986) J. Cell· BioL 102:449 ;及 Bemardi et al· (1987) J. Cell. Biol. 105:489者。在此方面，此處所述之實質上之純纖連蛋白或實質上之純纖連蛋白片段係指其基本上不含其他與纖連蛋白一同自然存在之蛋白質。

此處所述之實質上之純纖連蛋白或實質上之純纖連蛋白片段亦可以基因工程技術進行製備，例如，概略述於美國專利No. 5，198,423者。特定言之，下述實例中稱爲H-271、H-296、CH-271 (序列編號No. 23)及CH-296 (序列編號No. 24)之重組片段，及其取得之方法，皆詳述於該專利之中。用於下述實例中之C-274片段係以述於美國專利No. 5，102,988之方法取得。此等片段或可自其尋常衍生之片段，可對根據布達佩斯條約寄存於 NIBH ( 1 小3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken， Japan)，寄存編號FERMP-10721 (H-296)(原始寄存日期i 1989年 5月12曰）、FERMBP-2799(以甲硫胺酸與H_271結合之C-277)(原始寄存日期：1989年5月12日）、FERM BP-2800 (以甲硫胺酸與 H496結合之c_277)(原始寄存日期：1989年5月12曰）以及FERM ____ - 43 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

線I 585909 A7 B7 五、發明説明（41 BP-2264(H*271)(原始寄存日期：1989年1月30日）之大腸桿菌 (其亦述於美國專利No. 5，198,423)進行培養而取得。此外，有關可用於本發明之纖連蛋白片段，或有關此等片段之起始物質之有用資料，可見於Kimizuka et al·，J· Biochem. 110,284-291 (1991)(其進一步報告上述之重組片段）；EMBOJ.，4， 1755-1759 (1985X其報告人類纖連蛋白基因之結構及 Biochemistry，25, 4936-491 (1986)(其報告人類纖連蛋白之肝素-Π 結合域）。已發現同時含有CS-1細胞黏著域及肝素-Π結合域之纖連蛋白片段，可顯著提升將基因轉移進入造血細胞之效率。因此可明瞭，此處所述之纖連蛋白相關多肽將提供具有纖連蛋白CS-1細胞黏著域之細胞結合活性之胺基酸序列，以及具有可結合病毒之纖連蛋白肝素-Π結合域之胺基酸序列0 由WO 95/26200所揭示，用於增進以逆轉錄病毒載體進行之轉導之病毒結合多肽含有（i)相當於人類纖連蛋白肝素-Π結合域之Alai69〇_Thri96〇之第一胺基酸序列，其以下式（序列編號No. 1)表示：

Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro

Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr

Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met:

Lys Glu 工le Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser

Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（0

Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr

Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala

Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 工le Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr

Pro lie Gin Arg Thr lie Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie

Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr

Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val 工le Asp Ala Ser

Thr Ala 工le Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr

Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie

Thr Gly Tyr lie 工le Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro Pro Arg

Gly Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie

Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala

Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys ,Lys

Thr; 或與其足夠相似之胺基酸序列而具有逆轉錄病毒結合能力者；以及（π)相當於人類纖連蛋白racs結合域之部分之第二胺基酸序列，其以下式（序列編號No. 2)表示：

Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His

Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr; 或與其足夠相似之胺基酸序列而具有造血細胞（如初級組細胞及/或長期再繁殖（幹）細胞）結合能力者。以上述序列編號No. 1 (H-271)表示之多肤的逆轉錄病毒結 -45· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

585909 A7 B7 五、發明説明（43) 合活性顯示具有濃度依附性，同時，如下述實例8所示，其於高濃度時顯示具有與CH-271實質上相同之活性。亦即’在高濃度H-271存在之情形下，逆轉綠病毒及目標細胞第一次與至少一分子之H_271結合。本發明功能性物質病毒結合域之強大病毒結合力可用於建構傳送系統，進行廣大範疇細胞種類間之病毒中介治療。爲達成此一目的，可將含有本發明功能性物質逆轉錄病毒結合域之多肽與任何含有細胞結合域之物質（其爲該建辑提供目標細胞之專一性）進行偶合，或可將其與含有細胞結合預知物質進行共置。亦即，該病毒結合多肽可共價偶合細胞結合物質，或者，其亦可爲不同之分子。此種方法可克服先前技藝中爲每一目標細胞建構專一逆轉錄病毒細胞系之必要性，同時，其亦使得根據特定種類之目標細胞篩選具有最適目標結合域之功能性物質的過程變得更爲便利。因此，藉由本發明功能性物質之使用，對於所用細胞之專一性轉導可以輕易進行，同時，特定言之，本發明之方法中，使用具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質與具有目標細胞結合域之功能性物質之混合物者，特別適於將所需基因轉移進入所欲之目標細胞中^此外，本發明所提供之新穎功能性物質特別適用於改良以逆轉綠病毒將基因轉移進入目標細胞之效率的方法及其相關技術。下列之實例進一步詳細説明本發明，但其並不可視爲本發明範圍之限制。 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（44 ) 實例1 (1)病毒懸浮液之製備將含有逆轉錄病毒質體ΡΜ5ηόο載體（其含有新黴素抗性基因）（Exp· Hematol·，23, 630-638 (1995))之 GP + Ε-86生產細胞（ATCC CRL-9642)，於含有10%胎牛血清（FCS, Gibco)、50單位/毫升之青黴素及50微束/毫升之鏈黴素（兩者皆爲Gibco)之 DulbeccoS 經修飾 Eagle*s培養基（DMEM，Bioscience)中進行培養。所有用於此處之DMEM皆含有50單位/毫升之青黴素及 50微克/毫升之鏈黴素。將4毫升含有10%胎牛血清之 DMEM加至半鋪滿培養盤上，隔夜培養，以收集含有PM5neo 病毒之懸浮液。將所得之培養基通過0.45微米之濾紙 (Millipore)遍濾，取得病毒懸浮液。將其貯存於-80°C下直至使用。另外，關於逆轉錄病毒質體，TKNEO載體（Blood^SJlOJn (1991))，根據與上述相同之流程，使用GP + envAm-12細胞 (ATCC CRL-9641)，製備TKNeo病毒懸浮液。 (2 )測定懸浮液之病毒效價經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據標準方法，使用NIH/3T3細胞測定懸浮液之病毒效價 (J.ViroL，62，pp.ll20_1124(1988))。亦即，將DMEM 及 2,000細胞 / 孔之NIH/3T3細胞加至6-孔之組織培養盤上。於隔夜培養之後，將系列稀釋之病毒懸浮液及終濃度7.5微克/毫弁之 hexadimethrine bromide( Aldrich所生產之 Polybrene) — 同加入每一孔中。於37°C下對此培養24小時，再以含有終濃度7.5亳克/ •47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X 297公釐）一 " 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（鄉）毫升G418 (Gibco)之培養基替換原培養基〇再將培養盤放置培養。以結晶紫染色10至12天後長成之G418抗性群落 (G418f)，記錄其數目。將每孔中之群落數目乘以稀釋倍數，計算每1毫升懸浮液之感染性顆粒數S (cfu/毫升），乘將其作爲懸浮液之效價，以測定用於加入後績實驗之病毒懸浮液量。實例2 (1)衍生自纖連蛋白之多肽之製備衍生自人類纖連蛋白之多肽，H-271 (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 1)係根據揭示於美國專利No, 5，198,423 之方法，由含有編碼多肽DNA之重组質雠（pHDIOl)之大腸桿菌製備，亦即，大腸桿菌HB101/pHD101 (FERMBP-2264)。如下製備多肽CH-271 (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 23)。亦即，根據述於上述專利之方法培養大腸桿菌 HB101/pCH101 (FERM BP-2799)，並由培養物中取得 CH-271。同時，如下製備多肽CH-296(其胺基酸序列示於序列表之序列编號No. 24)。亦即，根據述於上述專利之方法培養大腸桿菌HBl(H/pCH102 ( FERM BP-2800)，並由培養物中取得CH-296- 如下製備多肽CH-274(其胺基酸序列示於序列表之序列編號No* 25)。亦即，根據述於美國專利No. 5，102,988之方法培養大腸桿菌JM109/pTF7221 ( FERM BP-1915)，並由培養物中取得 CH-274。同時，如下製備多肽C277-CS1 (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 29)。亦即，根據逑於上述專利之方法培養 -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7__ 五、發明説明（46 ) 大腸桿菌 HB101/pCS25，其以 FERM P41339揭示於 JP-A 3-284700，並以寄存編號FERM BP-5723根據布達佩斯條約寄存於上述之 NIBH ( 14-3, Higashi，Tsukuba-shi5 Ibaraki-ken)(原始寄存曰期·· 1990 年3月5日），並由培養物中取得C277-CS1。 (2)C-FGF1A之製備經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如下製備多肽C-FGF1A (其胺基酸序列示於序列表之序列編號Nq. 4)。亦即，將含有编碼上述多肽DNA之重組質體 (pYMH-CF_A)之大腸样菌，亦即，大腸桿菌JMl〇9/pYMH-CF1A (FERM BP-5278)於含有100微克/毫升氨苄青黴素之5亳升LB 液體培養基中，在37°C下培養8小時。將此前培養液體培養基接種進入含有100微克/毫升氨苄音擻素及ImM IPTG (異丙基- β- D-硫代半乳糖苷）之500毫升LB液體培養基中，並在37°C下隔夜培養。收集微生物細胞，並將其懸浮於含有1 mM PMSF (苯甲基磺醯氟）及0.05% Nonidet P-40之10毫升PBS (磷酸鹽缓衝溶液）中，以超音波破壞細胞。離心混合物以取得上清液。在此上清液於260nm之吸收値4,000之時，加入1毫升之5%聚乙烯亞胺，離心混合物以取得上清液。將此上清液加至以PBS平衡之HiTrap-Heparin管柱（Pharmacia)。在以PBS清洗非吸收部分之後，以含有自〇.5\1至2\1之灿<：1梯度之？88溶析吸收部分。以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析溶析物，顯示兩部份含有47 kd之多肽。搜集於較高NaCl濃度溶析之部分，並將其加至以含有L5MNaCl之PBS平衡之Superose6 管柱（Pharmacia)。以SDS-PAGE分析溶析物，搜集含有約47kd之多肽之部分，以取得純化之C-FGF1A用於後績步驟。 1 49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（47) (3)C-FGF-CS1之製備首先，建構質體以於大腸桿菌宿主中表現多肽C-FGF-CS1 (其胺基酸序列杀於序列表之序列編號No· 5)。培養大腸桿菌HB101/pCH102 ( FERM BP-2800)，並由所得之微生物細胞中，以鹼性SDS法製備質# PCH102。以此質體樣板、引子M4(TakaraShU2〇Co.，Ltd)及引子CS1-S(其核甞酸序列示於序列表之序列編號No, 9)進行PCR，並以異乙醇沈澱回收反應溶液中之放大DNA片段。以Nhel及Sail切割處理所得之DNA片段，再以瓊脂凝膠電泳自凝膠中回收約970 bp之 DNA片段。培養大腸桿菌JM109/pYMH-CF*A (FERM BP-5278)，並由所得之微生物細胞中，以鹼性SDS法製備質體pYMH-CF*A。以此質體樣板、引子CF (其核苷酸序列示於序列表之序列編號 No. 10)及引子FNR (其核誓酸序列示於序列表之序列編號No. 11)進行PCR，並以乙醇沈澱回收反應溶液中之放大DNA片段。以 Eco52I ( Takara Shuzo Co·，Ltd)及 Nhel切刻處理所得之 DNA 片段，再以瓊脂凝膠電泳自凝膠中回收約320 bp之DNA片段。經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將一約4.1 kb之DNA片段（其係以Eco52I及Sail切割處理質體 pYMH-CF*A，並對其進行瓊脂凝膠電泳而取得）與上述之970 bp DNA片段及320 bp DNA片段混合，使其進行接合反應以取得重組質體插入大腸桿菌JM109中。自所得之轉形株中製備質體，選擇含有上述三種DNA片段各一分子者並命名爲質體PCFS100 β骑使用質體pCFSIOO轉形之大腸桿菌JM109命名爲 -50· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（48) 大腸桿菌JM109/pCFS100。質體pCFSIOO於C-FGF，A之C -端含有衍生自纖連蛋白之CS-1細胞黏著域，並編碼多肽C-FGF-CS1，其中自FGF之C-端起第二個離胺酸經取代爲丙胺酸。如下製備多肽C-FGF-CS1。亦即，將上述之大腸桿菌 JM109/pCFS100於含有100微克/毫升氨芊青黴素之5毫升LB液體培養基中，在37°C下培養S小時。將此前培養液體培養基接種進入含有100微克/毫升氨苄青黴素及1 IPTG之500 毫升LB液體培養基中，並在37°C下隔夜培養以收集微生物細胞。將所得之概生物細胞懸浮於含有〇·5 M Naa、1 mM PMSF及0.05% Nonidet P-40之10亳升PBS (磷酸鹽緩衝溶液）中，以超音波破壞細胞，並進行離心以取得上清液。將此上清液加至以含有0.5 M NaCl之PBS預平衡之HiTrap-Heparin管柱 (Pharmacia)，在以含有0.5 mM NaCl之PBS清洗非吸收部分之後，以含有自0.5 Μ至2 M NaCl濃度梯度之PBS溶析吸收部分。以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析溶析物，搜集含有約50kd之多肽之部分，以取得純化之C-FGF-CS1用於後續步驟。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 檢驗由此取得之純化C-FGF-CS1之N-端至第五胺基酸之胺基酸序列，並發現其與序列表之序列編號No. 5所示者相符。此外，以質譜測量純化C-FGF-CS1之分子量與上述胺基酸序列之期望値相符。 (4)C277-CdV之製備如下製備多肽C277-ColV (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 6)。亦即，將含有编碼上述多肽DNA之重組質體 (PTF7520C〇1V)之大腸桿菌，亦即，大腸桿菌 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐] 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 585909 Α7 Β7 五、發明説明（你） JM109/pTF7520ColV ( FERM BP-5277)於含有 100微克 / 毫升氨爷音黴素之5毫升LB液體培養基中，在37°C下培養6.5小時〇將此前培養液體培養基接種進入含有1〇〇微克/毫升氨窄音黴素及lmMIPTG(異丙基-β-D·硫代半乳糖苷）之500毫升lb 液體培養基中，並在37°C下培養。當於660nm之吸收値到達 0.6時’將IPTG加入液體培養物中至終濃度1 πιΜ，再隔夜培養該液髏培養物以收集微生物細胞。將所得之微生物細胞懸浮於含有 1 mM EDTA、0.05% Nonidet Ρ-40及 2 mM PMSf 之 1〇亳升 PBS中，以超音波處理10分鐘破壞細胞。離心麵胞破壞溶液，並將所得之上清液加至Resource Q管柱（Pharmacia)以取得含有目標多肤之非吸收部分。將此部分加至以PBS平衡之HiTrap. Heparin管柱。在以PBS清洗非吸收部分之後，以含有自〇 μ至 0.5MNaC〖梯度之PBS溶析吸收部分。以SDS-PAGE分析溶析物，搜集含有約48kd之多肽之部分，以取得純化之C277-ColV用於後續步驟p (5)CoIV之製備首先，建構質體以於大腸桿菌宿主中表現多肽ColV(其胺基酸序列示於序列表之序列编號Να 6)。培養大腸桿菌 HB101/pTF7520ColV (FERM ΒΡ-5277)，並由所得之微生物細胞中，以鹼性SDS法製備質體pTF7520ColV。以 Ncol及BamHI (兩者皆爲Takara Shuzo Co·，Ltd,)切割處理所得之質體，再以瓊脂凝膠電泳自凝膠中回收約〇·58kb之DNA片段。將此與經Nc〇I及BamHI預切割處理之質體載體pET8C ( Novagen) 混合以使其接合〇將所得之重组質體引入大腸桿菌BL21以 -52· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ •線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（50) 取得轉形株，自其中製備質體，選擇僅含有一分子上述约 0.58肋之1^人片段之質體並命名爲？£丁〇>丨¥。將以上述質體pETColV轉形之大腸桿菌BL21，亦即，大腸桿菌BL21/pETCdV於含有50微克/亳升氨苄青黴素之10毫升 LB液體培養基中，在37°C下隔夜培養。將0.2亳升之前培養溶液接種進入含有50微克/毫升氨芊青黴素之100毫升L-液體培養基中，並在37°C下培養。當於600皿1之吸收値到達0.4 時，將IPTG加入液體培養物中至終濃度ImM，再隔夜培養以收集微生物細胞。將所得之微生物細胞懸浮於含有ImM EDTA、0.05% Nonidet P-40、10微克/毫升抑蛋白酶肽、10微克 /毫升抑蛋白酶肽（aprotinin)、10微克/毫升亮抑蛋白酶肽 (leupeptin)及2mMPMSF之5毫升PBS(磷酸鹽緩衝溶液）中，以超音波破壞細胞，再離心以取得上清液。將此上清液加至以 PBS平衡之HiTrip-Heparin管柱，在以PBS清洗非吸收部分之後，以含有0.5 M NaCl之PBS溶析吸收部分。以SOS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析溶析物，並確認幾乎均一約18kd之多肽。由此取得純化之ColV用於後續步驟。 (6 ) H2-547之製備如下建構表現多肽H2-547 (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 13)之質體。培養大腸桿菌HB101/pCH102 ( FERM BP-2800)，並由所得之細胞中，以鹼性SDS法製備質體pCH102。以此質體樣板、引子12S (其核甞酸序列示於序列表之序列編號No. 15)及引子14A (其核苷酸序列示於序列表之序列編號No. 16)進行PCR，再以瓊脂凝膠電泳自凝膠中回收約0.8 kb •53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（51) 之DNA片段（其編碼纖連蛋白肝素結合多肽）。以Ncol及Bamffl (兩者皆爲Takara Shuzo Co,，Ltd.)切割處理所得之DNA片段，並與經 NcoI-BamHI切割處理之 pTVl 18N ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)混合以使其接合，再將其引入大腸桿菌JM109中。自所得之轉形株製備質體，選擇含有上述DNA片段之質體並命名爲 pRHl 〇以BamHI及Hindi ( Takara Shuzo Co.，Ltd )切割處理質體載體 pINDI-ompAi ( The BMBO Journal，3, 3437-2442 (1984))以回收含有脂蛋白終止子區域之約0.9 kb之DNA片段。將此與經BamHI-HincII 切割處理之質體pRHl混合，使其接合以取得質體pRHl-T，其依序含有lac啓動子、編碼纖連蛋白肝素結合多肽及脂蛋白終止子之DNA片段。分別製備一約31 kb之DN A片段（以Nhel及Sail (兩者皆爲 Takara Shuzo Co.5 Ltd.)切割處理質體 pRHl-T)及一約 2.5 kb之 DNA 片段（以 Spel (Takara Shuzo Co.，Ltd·)及 Seal切割處理質體 pRHl-T)，並使此二片段進行接合反應以取得質體pRH2-T，其依序含有丨ac啓動子、編碼多肽（其中兩肝素結合多肽以及脂蛋白終止子串聯連接）之開放閱讀框構。上述開放閲讀框構之核甞酸序列示於序列表之序列編號No. 17。如下製備多肽H2-547。準備四個配有調節閥之500毫升三角燒瓶，各含有120毫升含100微克/毫升氨苄青黴素之LB 液體培養基。將以上述質體PRH2-T轉形之大腸桿菌HB101，亦即，大腸桿菌HB101/pRH2-T，接種進入其中。藉離心自培養物中搜集微生物細胞，將其懸浮於40毫升之破壞緩衝溶 _ -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7____ 五、發明説明（52 ) 液中（50 mM tris-HCl，1 mM EDTA, 150 mM NaCl，1 mM DTT，1 mM PMSF，pH 7.5)，並以超音波處理破壞微生物細胞。將離心取得之上清液加至以純化缓衝溶液（5〇mMtris-Hd，pH7.5)平衡之 High trap Heparin管柱（Pharmacia)。在以同樣之緩衝溶液清洗非吸收部分之後，以含有自0M至lMNaCl滚度梯度之純化緩衝溶液溶析吸收部分。以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析溶析物，搜集含有具約60,000分子量之多肽之部分，以取得純化之H2-547製備物。使用牛血清白蛋白作爲標準品，以BCA PROTEIN ASSAY REAGENT (Pierce)分析所得製備物中所含之蛋白質含量，顯示取得約10毫克之H2-547。檢驗由此取得之純化H2-547之N -端至第五胺基酸之胺基酸序列，並發現其與序列表之序列編號No」7所示之核苷酸序列預期之H2-547胺基酸序列相符（其序列示於序列表之序列編號No. 13)。以質譜測量純化H2-547之分子量與序列表之序列編號No. 13所示胺基酸序列之期望値相符。 (7)CH2-826之製備如下建構表現多肽CH2-826 (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 14)之質體。使用上述質ft PCH102樣板、引子 CLS (其核苷酸序列示於序列表之序列编號No· 18)及引子CLA (其核甞酸序列示於序列表之序列編號No. 19)進行PCR，再以瓊脂凝膠電泳自凝膠中回收約0.8 kb之DNA片段（其編碼纖連蛋白細胞黏著多肽）。以Ncol及Bglll (兩者皆爲Takara Shuzo Co.，Ltd，）切割處理所得之DNA片段，旅與經NcoI-BgmHI切割處理之PTV118N混合以使其接合，再將其引入大腸桿菌JM109 ___ -55- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（53) 中。自所得之轉形株製備質體，選擇含有上述DNA片段之質體並命名爲pRCl。將以Spel及Seal切割處理質體pRCl而取得之約2.5 kb之DNA片段及以Ndel及Seal切割處理上述質體卩1012町而取得之約3.9妫之1^八片段混合，使其進行接合反應以取得質體PRCH2-T，其編碼多肽，其中兩肝素結合多肽與細胞黏著多肽之C -端串聯連接）之開放閱讀框構。於質體 PRCH2-T上編碼此多肽之開放閱讀框構核甞酸序列示於序列表之序列編號No. 20。根據述於實例2 ( 6 )中與多肽H2-547多肽之製備相同之方法製備多肽CH2-826。自High trap Heparin管柱之溶析物中搜集含有具約90,000分子量之多肽之部分，以取得純化之CH2_ 826。 (8)H2S-537之製備如下建構表現多肽H2S-537 (其胺基酸序列示於序列表之序列編號No. 30)之質體。使用上述質體pCH102樣板、引子 CS1S (其核謀酸序列示於序列表之序列編號Νρ· 31)及引子 CS1A (其核甞酸序列示於序列表之序列编號No· 32)進行 PCR，再以瓊脂凝膠電泳自凝膠中回收約〇·1 kb之DNA片段 (其編碼纖連蛋白細胞黏著多肽）。以Ncol及BamHI (兩者皆爲 Takara Shuzo Co.，Ltd.)切割處理所得之DNA片段，並與經Ncol-BamHI切割處理之pTVl 18N混合以使其接合，再將其引入大腸桿菌JM109中。自所得之轉形株製備質體，選擇含有上述 DNA片段之質體並命名爲pRCl。以BamHI及Hindi切割處理質體載體pINni-ompA1，以回收含 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（54 ) 有脂蛋白終止子區域之約0.9 kb之DNA片段。將此與經BamHI— Hindi切割處理之質蹲pRSl混合，使其接合以取得質體pRSl-T ’其依序含有lac啓動子、編碼CS-1區域多肤及脂蛋白終止子之DNA片段。製備一約2.4 kb之DNA片段（其以Miel及Seal切割處理質體 pRSl-T取得）及一約3·3 kb之DNA片段（其以Spel、Seal及PstI (Takara Shuzo Co·，Ltd·)切割處琛上述質體pRH2-T取得）。使其進行接合反應以取得質體PRH2S-T，其依序含有lac啓動子、編碼多肽（其具有兩肝素結合多肽串聯連接，並進一步於C-端偶合CS_1區域，以及脂蛋白终止子之結構）之開放閲讀框構。上述開放閲讀框構之核甞酸序列示於序列表之序列編號 No· 32 〇根據述於實例2(6)中與多肽H2-547多肽之製備相同之方法製備多肽H2S-573。自High trap Heparin管柱之溶析物中拨集含有具約60,000分子量之多肽之部分，以取得純化之H2S-573。 (9 )功能性物質於盤上之固定爲於以逆轉綠病毒感染細胞之實驗中使用固定有功能性物質之盤（六孔組織培養盤，Falcon)，根據下述流程進行固定處理。亦即，將每一述於上述實例中之功能性物質以適當濃度溶解於PBS中製成溶液，並將其以每孔（底面積9.6平方公分）2亳升之量加至盤上。將該盤於UV燈下，在室溫不加蓋放置1小時，再加蓋放置1小時。再將多肽溶液置換爲2毫升含有2%牛血清白蛋白（BSA，Boehringer Mannheim)之 PBS，並於室溫下放置30分鐘。以含有25mMHEPES之PBS清洗 __ - 57 -_ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（) 該盤。根據與上相同之方法製備固定有BSA之控制组盤，惟不進行多肽溶液之放置。在下述之基因#移（病毒感染）實驗中，除非另外指明，皆使用上述之六孔組織培養盤。於指明固定於盤上之功能性物質之濃度時，其皆使用單位皮莫耳/平方公分 (pmol/cm2)(以及微克/乎方公分（pg/cm2))之單位描逑每孔中每單位底面積之多肽含量。例如，當固定處理係使用2毫升之48微克/毫升H-271溶液於上述之盤（底面積9.6平方公分）上進行時，該描述即爲「固定處理係以333皮莫耳/平方公分（10微克/平方公分）之H-271進行j。同時，用於在轉導之後培養非黏著性細胞（TF-1、ΗΙ^60)之CH-296固定盤係根據上述流程固定48皮莫耳/平方公分（3微克/平方公分）之CH-296製備。在後續之實例中，目標細胞之病毒感染皆是於不含 Polybrene之培養基中進行。當指明病毒、細胞、培養基等等之量時，除非另外指明，其皆爲描述每孔中之量。實例3 (1)使用功能性物質混合物之基因轉移進行下述實驗以探討將細胞結合物質及逆轉錄病毒結合物質之混合物固定於盤上時對基因轉移之效應p首先，根據述於實例2(9)之相同方式，使用32皮莫耳/平方公分（1.5 微克/平方公分）之C -FGF · A、3 2皮莫耳/平方公分（丨微克/ 平方公分）之0274與32皮莫耳/平方公分（0.5微克/平方公分）之FGF之混合物或32皮莫耳/平方公分（0.5微克/平方公分）之FGF(Bectonliickinson)，將每一多肽固定於盤上。在以2 _ -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 一 ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線一經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 __ B7 五、發明説明（56 ) 毫升含有1，〇〇〇 cfii PM5neo病毒之病毒上清液，於各試驗盤及以BSA塗覆之控制組盤上，在37°C下預置30分鐘之後，以PBS 徹底清洗試驗盤。將2毫升含有2,000 NIH/3T3細胞之DMEM培養基加至各盤之上，在不含Polybrene之情形下，於37°C下放置 2小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理分離黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。將所得之細胞懸浮液分成兩份。將其中一份之細胞於DMEM中進行培養，而將另一份之細胞於含有終濃度〇,75毫克/毫升G418之DMEM 中進行培養。兩部份皆於37°C下放置10天，並計算出現之群落數目。計算G418抗性（G418f)群落數目與得自不含G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率，得到示於圖1之結果。於圖1之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖1所示，在2小時逆轉錄病毒感染之情形下，當使用C-274及FGF之混合物時，取得G418r群落之基因轉移效率幾乎與 C-FGF_A(其中此兩種多肽係共價偶合）相同，而僅使用FGF所得之基因轉移效率則低於C-FGF，A之基因轉移效率。爲進行更爲詳細之探討，玆對單獨固定C-274及單獨固定 FGF之效應與固定其混合物之效應進行比較。亦即，根據述於實例2 ( 9 )之相同方式進行評估，惟分別使用32皮莫耳/ 平方公分（1微克/平方公分）之0274、32皮莫耳/平方公分 (〇·5微克/平方公分）之FGF以及32皮莫耳/平方公分之〇274 與32皮莫耳/平方公分之FGF之混合物製備試驗盤。其結果示於圏2。於圖2之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱 _____ - 59 · _ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇X297公瘦） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（57) 座標指明基因轉移效率。如圖2所示，當使用02訌及FGF之混合物進行固定之試驗盤時，基因轉移效率高於僅使用FGF進行固定之試驗盤。同時，於僅使用C-274(其不具有任何逆轉錄病毒結合域）進行固定之試驗盤上，未出現任何G4181*群落。此顯杀，藉由具有逆轉錄病毒結合域之FGF及具有細胞結合域之C-274之結合，相較於單獨使用FGF所得之基因轉移效率而言，可取得較高之基因轉移效率。同時，多肽間之共價偶合並非產生此種多肽結合之效應所必需者。 (2 )使用功能性物質混合物之基因轉移根據述於實例3 ( 1 )之相同方式進行評估，惟以ColV取代該具有逆轉錄病毒結合域之多肽。在此實驗之中，以各種不同之莫耳比例混合0274及ColV以探討其效應。亦即，根據述於實例2(9)之相同方式進行評估，惟分別使用330皮莫耳/ 平方公分（6微克/平方公分）之ColV、330皮莫耳/平方公分 (10微克/平方公分）之C-274與330皮莫耳/平方公分之ColV之混合物（0274 : ColV之莫耳比例=10 : 10)、100皮莫耳/平方公分（3微克/平方公分）之C-274與330皮莫耳/平方公分之 ColV之混合物（3 : 10)、330皮莫耳/平方公分（16微克/平方公分）之C277-C01V及330皮莫耳/平方公分（10微克/平方公分）之0274進行固定。使用如此製備之試驗盤，根據與上述相同之方式探討逆轉錄病毒感染之效應。其結果示於圖3。於圖3之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（58 ) 如圖3所示，在2小時逆轉錄病毒感染之情形下，ColV固定盤之感染效率低於C277-ColV固定盤之感染效率之1/2，而以 ColV及其1/10量（莫弄數）之C-274進行固定之盤之感染效率則與 C277-ColV固定盤之感染效率相同。再者，c_274之逆轉錄病毒感染增進活性則與其於FGF之試驗當中同樣獲得證實。此一效應在C-274分子相對於ColV分子之量增加之時尚隨之減低。當塗覆含有相同量之ColV及C-274之混合物時，該混合物與單獨之ColV間並無明顯差異。 (3 )使用功能性物質混合物之基因轉移進行下述實驗以探討就具有細胞結合域之物質及具有逆轉錄病毒結合域之物質之混合物進行固定對基因轉移效率之效應。首先，根據述於實例2 ( 9 )之相同方式進行評估，分別使用32皮莫耳/平方公分（1微克/平方公分）之C-274、 330皮莫耳/平方公分（1〇微克/平方公分）之H-271以及32皮莫耳/平方公分（1微克/平方公分）之C-274與330皮莫耳/平方公分（10微克/平方公分）之H-271之混合物對試驗盤進行固定。在以2毫升含有1，〇〇〇 cfii PM5neo病毒之病毒上清液’於各試驗盤上，在37°C下預置30分鐘之後，以PBS徹底清洗試驗盤。將2亳升含有2,〇〇〇 NIH/3T3細胞之DMEM培養基加至各盤之上，在不含P〇lybrene之情形下，於37°C下放置2小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理分離黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。將所得之細胞懸浮液分成兩份。將其中一份之細胞於DMEM中進行培養，而將另一份之細胞於含有終濃度0.75毫克/毫升G418之DMEM中進行培養。 -61 - 本紙張尺度適用中國國家橾準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 585909 A7 _B7__ 五、發明説明（59 ) 兩部份皆於37°C下放置10天，並計算出現之群落數目。計算 G418抗性（G418f)群落數目與得自不含G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率，其結果示於圖4。於圖 4之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖4辨示，使用固定有C-274與H-271之混合物（莫耳比例= 1: 10)之試驗盤時，感染效率顯著增加。C-274固定盤則未見基因轉移之情形。 (4 )使用C277-CS1之基因轉移經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 進行下述實驗以探討使用C277«CS1作爲具有細胞結合域之物質，並就其混合物以及具有逆轉錄病毒結合域之物質進行固定對基因轉移效率之效應。使用聚離胺酸[(Lys)n，聚-L -離胺酸氫溴化物，分子量：50,00(M00,000，Wako Pure Chemical Co.，Ltd·]以及H-271作爲結合逆轉錄病毒之物質。首先，根據述於實例2 ( 9 )之相同方式進行評估，分別使用下述溶液對試驗盤進行固定：C-277-CS1 ( 33皮莫耳/平方公分，1.1微克/平方公分）、聚離胺酸（133皮莫耳/平方公分，10微克/平方公分）、C-277-CSl(33皮莫耳/平方公分）及聚離胺酸（133皮莫耳/平方公分）之混合物、H-271(333皮莫耳/平方公分，1〇微克/平方公分）以及C-277-CSl(33皮莫耳 /平方公分）及H-271( 333皮莫耳/平方公分）之混合物、及 CH-296(33皮莫耳/平方公分，2.1微克/平方公分）。將含有 1 X 1〇4 cfU之 TKNEO病毒、1 X 1〇4 之 TF-1 細胞之 RPMI 1640培養基 (其含有 5 納克 / 毫升（ng/ml)之 GM-CFS (Petre Tech)、50單位 / -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（60) 毫升之青黴素以及50微克/亳升之鏈黴素）加入各盤之中，並將各試驗盤置於37°C下24小時。放置之後，以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理除去黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。分別將所得細胞懸浮液之五分之一部分轉移至兩個以CH-296塗覆之盤上，並放置24小時。然後，以上述培養基代換其中一份之培養基，並以含有終濃度0.75 毫克/亳升G418之上述培養基代換其中另一份之培養基。兩部份皆於37°C下放置8天，並計算出現之群落數目。0418『群落之發生率（基因轉移之效率）係根據有及無G418之情形下出現之群落數目計算。其結果示於圖5。於圖5之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。於圖5之中，（a)代表使用聚離胺酸作爲逆轉錄病毒結合物質而（b)代表使用H-271者。在與僅固定逆轉綠病毒結合物質之盤作比較之時，基因轉移效率顯著藉由聚離胺酸或H-271結合具有細胞結合域之C277-CS1之使用而增加。 (5)衍生自促紅血球生成素之多肽之製備爲用於將基因轉移至具有促紅血球生成素受體之細胞之中，製備一由促紅血球生成素與谷胱甘肽轉移酶融合之多肽衍生物（GST-Epo)。其胺基酸序列示於序列表之序列編號Νο·34。在此序列之中，由第233胺基酸至第398胺基酸之胺基酸序列相當於促紅血球生成素。首先，以下述流程建構質體以表現GST-Epo。使用衍生自人類胎肝之cDNA庫（Clonetech)作爲樣板，並使用引子EPF1及 -63· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（61) 引子EPR1 (引子EPF1及EPR1之核苷酸序列示於序列表之序列編號No. 35及36)進行PCR。取出部分之反應混合物，將其作爲樣板，並使用引子EPF2及引子EPR2 (引子EPF2及EPR2之核苷酸序列示於序列表之序列編號No. 37及38)進行另外之 PCR。由反應混合物中回收經放大之DNA片段，以EcoRI及 BamHI (兩者皆爲Takara Shuzo Co·，Ltd.)進行切割處理，再次對其進行瓊脂電泳以回收含有編碼促紅血球生成素區域之約 520 bp之DNA片段。將所得之片段與經EcoRI (Takara Shuzo Co.， Ltd.)及 BamHI 切割處理之質體載體 pTV118N (Takara Shuzp Co.， Ltd.)混合以使其與質體接合。接著，再以此質體轉形大腸桿菌JM109。自所得之轉形株中選擇含有上述質體者以製備該質體，並將其命名爲質體pEPO。以EcoRI及SalI(TakaraShuzo Co.，Ltd.)切割處理所得之質體pEPO,再對其進行瓊脂電泳以回收約0.5 kb之DNA片段。將此片段與經EpoRI及Sail切割處理之質體載體pGEX5X-3 (Pharmacia)混合以使其接合。以所得之質體轉形大腸桿菌JM109。自所得之轉形株中選擇含有上述質體者以製備該質體，並將該質體命名爲PGSTEPO。此質體編碼GST-EPO，其中，促紅血球生成素之胺基酸序列與衍生自載體之谷胱甘肽-S-轉移酶之C-端偶合。於質體 pGSTEPO上編碼GST-EPO之核苷酸序列示於序列表之序列編號 No· 39。以下述流程製備多肽GST-Epo。提供七支培養管，各含有含 100微克/毫升氨芊青黴素之5毫升LB液體培養基。將以上述質體pGSTEPO轉形大腸桿菌JM109 (大腸桿菌 -64 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（62) JM109/pGSTEPO)接種進入各管之液體培養基中，再將其於37 PC下隔夜放置。接著，提供七個2升之三角燒瓶，各含肴500 毫升之相同液體培養基。將5毫升部分之上述培養物接種進入瓶中，再將其置於37°C下。自起始放置3.5小時之時，加入EPTG至終濃度1 mM，並繼續放置另外3.5小時。在培養完成之後，以離心將細胞自培養液中回收，懸浮於100毫升含有1 mM PMSF及1 mM EDTA之PBS中，並以超音波破壞細胞。將 100 亳升含有 1 mM PMSF、1 mM EDTA 及 2% Triton X-100之 PBS加入經破壞之溶液中。將混合物置於冰上30分鐘，並離心以收集上清液。使所得之上清液通過0.45微米之濾紙 (Millipore)過滤，並將其加至以PBS平衡之Sephallose 4B管柱 (Pharmacia，3毫升）。在以PBS清洗非吸收部分之後，以含有10 mM谷胱甘肽之50mMTrisrHCl(pH8.0)溶析吸收部分。以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析溶析物，並搜集含有具約44,000分子量之多肤之部分。使此部分對PBS進行透析。將透析樣本加至以PBS平衡之Resource Q管柱（Pharmacia)。在以PBS清洗管柱之後，以含有自0M至0.6MNaCl梯度之PBS溶析管柱。根據上述相同之方法，以含有谷胱甘肽之50 mM Tris-HCl ( pH 8.0)溶析管柱以搜集含有具約44,000分子量之多肽之部分。以Certricon 10 (Amicon)對此進行超過濾以濃縮至約50微升。同時，以Ultrafree C3GVSTRL (Millipore)對其進行過濾，並使用Superdex 200管柱、（Pharmacia，經PBS平衡）對滤液進行凝膠過滤層析。搜集含有具約44,000分子量之多肽之溶析部分，並以此作爲GST-Epo多肽溶液以用於後續實驗。在此GST-Epo溶液中，約50%之總蛋 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線一 585909 A7 B7 五、發明説明（63) 白質爲GST-Epo 〇 (6)進入促紅血球生成素受體表現細胞之基因轉移經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用兩種細胞，表現促紅血球生成素受體之TF-1以及不表現促紅血球生成素受體之1^-60(八丁0：€0^240)，探討使用促紅血球生成素作爲具有細胞結合活性物質之基因轉移效應。於此實驗之中，以上述之促紅血球生成素多肽衍生物（GST-Epo)作爲促紅血球生成素，並使用聚離胺酸作爲逆轉錄病毒結合物質。首先，根據述於實例2(9)之相同方式，分別使用相當於34皮莫耳/平方公分（1.5微克/平方公分）之GST-Epo、聚離胺酸（133皮莫耳/平方公分，10微克/ 平方公分）、GST-Epo (34皮莫耳/平方公分）及聚離胺酸（133 皮莫耳/平方公分）之混合物對試驗盤進行固定。將含有lx lCHcfii之TKNEO病毒及lxlO4細胞之培養基加入各盤之中，並將各試驗盤置於37°C下24小時。作爲培養基，對ΉΜ細胞使用RPMI1640培養基（其含有5納克/毫升（ng/ml)之GM_CFS、50 單位/毫升之青黴素以及50微克/毫升之鏈黴素），並對HL-60使用RPMI培養基（Nissui，含有10%之FCS、50單位/毫升之青黴素以及50微克/毫升之鏈黴素）。放置之後，以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理除去黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。分別將所得細胞懸浮液之五分之一部分轉移至兩個固定CH-296之盤上，並放覃24小時。然後，以上述培養基代換其中一份之培養基，並以含有終濃度 0.75毫克/毫升G418之上述培養基代換其中另一份之培養基。兩部份皆於37°C下放置8天，並計算出現之群落數目。 -66r 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 ___ B7 五、發明説明（64 ) G418群落之發生率（基因轉移之效率）係根據有及無以18之情形下出現之群落數目計算。其結果示於圖6。於圖6之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖6(a)所示，就使用 TF-1細胞者而言，儘管在僅固定聚離胺酸之盤上產生了某些程度之基因轉移，在GST-Epo存在的情形之下，可以取得較高之基因轉移效率。另一方面，如圖6(b)所示，就使用见勒細胞者而言，在GST-Epo存在之時，未觀察到任何基因轉移效率增加之情形。此等結果顯示，可使用促紅血球生成素進行目標細胞專一性之基因轉移。此外’以H2-547取代逆轉綠病毒結合物質而進行將基因轉移進入TF-1細胞之另一實驗。根據述於實例2(9)之相同方式，分別使用H2-547 ( 333皮莫耳/平方公分，2〇微克/平方公分）、相當於34皮莫耳/乎方公分（ι·5微克/平方公分）之 GST-Epo、以及GST-Epo ( 34皮莫耳/平方公分）及fj2_547 ( 333皮莫耳/平方公分，20微克/平方公分）之混合物對試驗盤進行固定。同時，使用BSA固定盤進行控制組實驗。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果示於圖7。於圖7之中，橫座標指明使用之功能性物質’而縱座標指明基因轉移效率。如圖7所示，就使用H2-547 之情形而言，在GST-Epo存在之時，進入TF-1細胞之基因轉移效率獲得增加。 (7)使用固定功能性物質混合物之玻珠之基因轉移針對使用同時固定有具細胞結合域之功能性物質及聚逆轉綠病毒結合域之功能性物質之玻珠是否可增加逆轉錄病 •67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

經濟部中央標準局員工消費合作社印I 585909 A7 _ B7_ ·_ 五、發明説明（65 ) 毒感染效率之問題進行探討。根據下述流程製備固定多肽之玻珠。作爲玻珠，使用直徑 1.14 微米之聚苯乙晞玻珠（Polybeads Polystyrene Microsphere， PolyScience製造）。將80微升之乙醇以及2毫升之各式多肽PBS 溶液加至20微升上述玻珠之2.5%懸浮液中，再將其隔夜靜置於4°C下。加入BSA及PBS以製備4毫升之BSA/PBS懸浮液。離心以自該懸浮液中回收玻珠，並將其再次懸浮於5毫升之1% BSA/PBS中。接著，將懸浮液靜置於室溫下1小時以取得多肽固定玻珠。作爲多肽溶液，使用1〇〇微克/毫升之C-274、100微克/毫升之H-271、100微克/亳升之CH-271、100 微克/毫升之CH-296及100微克/毫升之H-271與10微克/毫升之C-274之混合物。作爲控制組，根據同樣方式製備以2% BSA溶液塗覆之玻珠。將十分之一如此製得之多肽固定玻珠由上述懸浮液中回收，並將其分別與2,000 TF-1細胞及l，000cfU之TKNEO病毒懸浮液共同於37°C隔夜放置。回收細胞，並將其懸浮於含有0.3% Bacto瓊脂之处⑽培養基中（含有1〇%之FCS、50單位/毫升之青黴素以及50微克/毫升之鏈黴素），再將其播種於由含有 0.5% Bacto瓊脂之上述培養基製成之35 mm盤上。使用含有〇·75毫克/亳升G418及不含G4i8之兩種培養基。於5%之C02 中，在37°C下，放置該盤14天。計數於有G418存在及無G418存在之情形下出現之集落，並計算〇4比群落之出現比例（基因轉移效率）。其結果示於圖8。於圖8之中，橫座標指明使用之功能性物質及BSA，而縱座標指明基因轉移效率。當使用 _______ - 68 - 本紙張尺度適用中( CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（66 ) 固定H-271與0274之混合物之玻珠時，相較於使用僅固定H-271之玻珠，以及固定CH-271或CH296 (其於同一分子上具有逆轉綠病毒結合域及細胞結合域），可取得較高之基因轉移效率。實例4 (1 )使用FGF及C-FGF*A之基因轉移以NIH/3T3細胞群落形成分析探討FGF (Becton Deckinson)及由序列編號No. 4所代表之多肽（C-FGF_A)對逆轉錄病毒感染之效應。亦即，根據述於實例2(9)之相同方式進行評估，分別使用FGF( 132皮莫耳/平方公分，2.25微克/平方公分）以及C-FGF*A(133皮莫耳/平方公分，6.3微克/平方公分）對試驗盤進行固定，同時，將BSA固定於控制组盤上。將2毫升含有l，000efU PM5neo病毒之病毒上清液加至各盤，並在37°C下預置30分鐘，之後，以PBS徹底清洗各盤。將2毫升含有2,000 NIH/3T3細胞之DMEM培養基加至各盤之上，於37°C下放置24小時，再於含有0.75毫克/毫升G418之選擇培養基中放置10天。染色並計算群落數目p其結果示於圖9。於圖9之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明出現之G41f群落數目。如圖9所示，固定BSA之控制組盤上並未出現任何群落。另一方面，當使用FGF及C-FGF*A之固定盤時，兩盤上皆觀察到 G418f群落。此一結果顯示，FGF及C-FGF*A皆具有逆轉錄病毒結合域，而其中偶合纖連蛋白之細胞結合域多肽之C-FGF*A則顯示較FqF爲佳之基因轉移效率。 -69 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（67) (2 ) C-FGF*A之濃度與基因轉移效率間之關係使用經各種濃度之C-FGF_A塗覆之盤以比較基因轉移效率。根據與述於實例4(1)之流程相同者進行逆轉錄病毒之感染，惟根據述於實例2(9)之相同方式，使用0.521皮莫耳/ 平方公分（0.0247微克/平方公分）-5.21皮莫耳/平方公分 (0.247微克/平方公分）之C-FGF*A製備試驗盤，以及BSA固定盤（控制組盤）。於病毒感染處理之後，以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理分離黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。將所得之細胞懸浮液分成兩份。將其中一份之細胞於DMEM中進行培養，而將另一份之細胞於含有終濃度0.75毫克/毫升G418之DMEM中進行培養。兩部份皆於37°C 下放置10天，並計算出現之群落數目。計算G418f群落數目與得自不含G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率。其結果示於圖10。於圖10之中，橫座標指明用於固定試驗盤之C-FGF*A濃度，而縱座標指明基因轉移效率。控制組盤之實驗結果亦繪製於多肽濃度0微莫耳/平方公分之處。如圖 10所示，基因轉移效率隨經固定之C-FGF*A濃度增加而有濃度依附性之增加情形。 (3 )進入HL-60細胞之基因轉移 · 有關非黏著性細胞HL-60細胞（ATCC CCL-240)之逆轉錄病毒感染，根據下述流程探討各種多肽存在之效應。亦即，將2 毫升含有1 X IQ4 cfii之TKNEO病毒及1 X 104 HL-60細胞之RPMI培養基（Nissui，含有10%之FCS、50單位/毫升之青黴素以及50 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（68 ) 微克/毫升之鏈黴素），加入各個根據實例2(9)之方法，使用100皮莫耳/平方公分之C-FGF*A ( 4.8微克/平方公分）或 C-FGF-CS1(5.1微克/平方公分）製備之盤，以及固定BSA之控制組盤中，再將其置於37°C下24小時。放置之後，以傾析收集非黏著性細胞，並以移液吸管收集黏著於盤上之細胞。結合此等細胞。將所得細胞懸浮液之各個二分之一部分轉移至塗覆有CH-296之盤上，放置24小時，並以含有終濃度0.75毫克 /毫升G418之RPM培養基代換原培養基。在於37°C下放置12 天後，計算出現之群落數目。使用每種多肽所得之G418"群落數目示於圖11。於圖11之中，橫座標指明功能性物質，而縱座標指明G4181群落數目。如圖丨1所示，當使用C-FGF*A或C-FGF-CS1之固定盤時，G4# 群落顯著增加，指出此等多肽可促進逆轉錄病毒對HL-60細胞之感染。 (4)進入小鼠骨髓細胞之基因轉移進行下述實驗以探討FGF、C-FGF*A& C-FGF-CS1在逆轉綠病毒對小鼠骨骑瘤細胞感染之效應。將150毫克/公斤之5-氟尿嘧啶（5-FU，Amlesco)由腹膜内投藥至6至8週齡之小鼠（C3H/HeJ)身上，並於投藥2天之後分離股骨及脛骨以收集骨髓。使用FicoIUHypaque (密度1.0875克/毫升，Pharmacia)，對所得之骨髓進行密度梯度離心，以取得低密度之單核細胞部分作爲小鼠骨髓細胞。根據Luskey et al. (Blood，80, 396 (1992))之方法，在以逆轉錄病毒進行感染之前預刺激此等小鼠骨髓細胞。亦即，將此等小鼠 -71 - 本紙張尺度適用中國國家;^ ( CNS ) A4規格（210父297公羡1 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（69) 骨髓細胞以1 X 1〇6細胞/毫升之細胞密度，加入含有20%之 FCS、100單位/亳升之重組人類間白素-6(rhIL-6，Amgen)、100 納克/毫升之重組小鼠幹細胞因子（rmSCF，Amgen)、50單位/ 毫升之青黴棄及50微克/毫升之鏈黴素之a-MEM(Gibco)中，再於5%之（：02中，在37°C下放置48小時。以移液吸管抽吸以收集此等預刺激之細胞，包括黏附於容器上者。將每一用於上述之預刺激處理中之2毫升含有lx 106預刺激細胞之培養基，以及1 X 104 cfU PM5neo病毒，加至根據實例 2(9)所述之方法，使用236皮莫耳/平方公分（4微克/平方公分）之FGF、169皮莫耳/平方公分（8微克/平方公分）之C-FGF*A ( 4.8微克/平方公分）或159皮莫耳/平方公分（8微克/ 平方公分）之C-FGFCS1製備之盤，以及固定BSA之控制組盤中，再將其置於37°C下。2小時之後，重新將含有同樣病毒查之培養基（2毫升）加至各盤，再繼續放置22小時。放置結束之後，以傾析收集非黏著性細胞，並使用細胞分離緩衝溶液（CDB，不含任何酶，Gibco)收集黏著於盤上之細胞。結合此等細胞，並以同樣之緩衝溶液清洗兩次。計算細胞數目。對所得之細胞進行HPP-CFC (高增殖性潛在群落形成細胞）分析。 HPP_CFC分析係根據 feradley et al. (Aust. J. Exp. Bio. Med. Sci.，44,287-293 (1966))之方法進行。作爲培養基，使用l%/0.66%層式軟瓊脂肪培養基，含或不含終濃度1.5毫克/毫升之G418。將經感染之細胞以lxlO4細胞/孔之量加至其上，再於5%之C02中，在37°C下放置13天。放置完成之後，以倒置顯微經觀察出現 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（7Q) 之群落，對衍生自HPP-CFC之高密度群落（具有不小於0.5公釐直徑者）進行計數，以計算計算041¥群落之出現比例（基因轉移效率）。其結果示於圖12。於圖12之中，橫座標指明使用之功能性物質及BSA，而縱座標指明基因轉移效率。如圖12所示，以BSA塗覆作爲控制組之盤上並未出現G4181* 群落，而使用分別固定上述多肽之盤上則取得G418f群落。基因轉移效率增加程度之順序爲FGF、C-FGF*A及C-FGF-CS1，其建議衍生自纖連蛋白之細胞黏著域以及具有細胞域結合活性之CS-1多肽之存在可增加逆轉錄病毒對小鼠骨髓瘤細胞之感染。 (5 )固定於盤上之C277-ColV濃度與基因轉移效率間之關係根據下述流程，使用以不同濃度之C277-ColV塗覆之盤比較基因轉移效率。根據述於實例2(9)之方法，使用0.1皮莫耳/平方公分（0.1微克/平方公分）-416皮莫耳/平方公分（20 微克/平方公分）之C277-ColV製備試驗盤。將2毫井含有1，000 cibPM5neo病毒之病毒懸浮液加至各盤，並在37°C下預置30分鐘，再以PBS徹底清洗。將2毫升含有2,000 NIH73T3細胞之 DMEM培養基加至各盤之上，並將該等試驗盤於37°C下放置24 小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理分離黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。將所得之細胞懸浮液分成兩份。將其中一份之細胞於DMEM中進行培養，而將另一份之細胞於含有終濃度0.75毫克/毫升G418之DMEM中進行培養。於37°C下放置10天，並計算出現之群落數目。計算 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（71 ) G4181*群落數目與得自不含G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率。其結果示於圖13。於圖13之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖13所示，當使用C277-ColV固定盤時，基因轉移效率隨固定所用之C277-ColV濃度之增加而增加。 (6)使用聚離胺酸之基因轉移以下述流程探討聚離胺酸[([^^。與逆轉錄病毒之結合。作爲聚離胺酸，使用聚-L-離胺酸氫溴化物（分子量： 50,000-100,000, Wako Pure Chemical Co.，Ltd·)，同時，根據述於實例2 (9)之相同方法，使用133皮莫耳/平方公分（10微克/平方公分）之聚離胺酸固定於盤上。根據述於實例4(2)之相同方式，對此試驗盤及固定BSA之控制組盤之基因轉移效率進行評估。其結果示於圖14。於圖14之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖13所示，以BSA塗覆作爲控制組織盤上並未出現G418r群落，而聚離胺酸固定盤上則出現G418f群落，其建議，在清洗之後，逆轉錄病毒因逆轉錄病毒與固定於盤上之聚離胺酸之結合而保留於盤上。實例5 (1)使用多肽聚合物之基因轉移使用多肽聚合物之基因轉移以未將該多肽固定於盤上之形式進行。將2毫升含有1，000 cfU之PM5neo病毒、2,000之 NIH/3T3細胞、以及終濃度爲0.63納莫耳/毫升之各別多肽（沁 271、CH-271、H2-547及CH2-826)之DMEM培養基，加至根據述 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 Α7 Β7 五、發明説明（72) 於實例2 (9)之方法，使用BAS預塗覆之盤上，再放置24小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理移除黏著於盤上之細胞而收集之。然後，結合此等細胞。作爲控制組，根據同樣方式，不加入任何多肽，進行同樣之基因轉移實驗。將所得之細胞懸浮液分成兩份，並將其中一份之細胞於DMEM中進行培養。將另一份之細胞於含有終濃度0.75毫克 /毫升G418之DMEM中進行培養。兩部份皆於37°C下放置10 天，並計算出現之群落數目。計算G418f群落數目與得自不含 G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率。其結果示於圖15。於圖15之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖15所示，在H2-547存在下之基因轉移效率明顯高於H271 存在下者。同時，就CH2_826之情形言之，可取得相當或高於 Οί-2Ή之基因轉移效率。同時，根據上述相同之方式進行更爲詳細之探討，惟對各盤分別以0· 126納莫耳（終濃度0.063納莫耳/亳升）及1.26納莫耳 (終濃度0.63納莫耳/毫升）之量使用CH-271、CH-296及Η2-547作爲多肽。其結果示於圖16。於圖16之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖16所示，當使用Η2-547之時，在任一多肽量之情形下，基因轉移效率皆明顯高於CH-271及CH-296者。 (2 )使用H2S-573之小鼠骨髓細胞基因轉移爲探討H2S-573在逆轉錄病毒對骨髓細胞感染之效應，根據述於實例4(4)之相同方式進行對小鼠骨髓細胞之基因轉移 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 585909 A7 B7 _ . 五、發明説明（73 ) 實驗。根據述於上述實例之方式製備小鼠骨髓細胞，並對此等細胞進行預刺激。作爲逆轉錄病毒感染之試驗盤，除H2S-573( 160皮莫耳/平方公分，10微克/平方公分）固定盤外，尚使用CH-296( 132皮莫耳/平方公分，8.3微克/平方公分）固定盤，以及BSA固定盤（作爲控制組盤）。以HPP-CFC分析取得之結果示於圖17°於圖17之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖17所示，以BSA塗覆作爲控制組之盤上並未出現G41# 高密度群落◊儘管CH-296固定盤可取得約50%之基因轉移效率，在使用H2S-573固定盤之情形下，可有較高的效率取得 G4181"高密度群落。實例6 (1 )使用未固走功能性物質之基因轉移經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如下探討當多肽以未固定之形式出現於盤上之時，其對逆轉錄病毒感染效率之效應。亦即，將2毫升含有100 cfU之 PM5neo病毒、2,000之NIH/3T3細胞、以及終濃度爲10、40、250 微克/毫升之CH-296(其分別相當於0.158、0.632及3.950納莫耳 /毫升）之DMEM培養基，加至根據述於實例2(9)之方法，使用BAS預塗覆之盤上，再放置24小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理移除黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。將所得之細胞懸浮液轉移至10公分之細胞培養盤上，再放置24小時。以含有終濃度0.75毫克/毫升 _ ·76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五 '發明説明（74 ) G418之DMEM交換培養基，再另外放置1〇天。另外，作爲控制組，叙備無CH-296之盤，以及固定32皮莫耳/平方公分（2微克/平方公分）或127皮莫耳/平方公分（8微克/平方公分）CH-296之盤，並將病毒懸浮液及細胞加至其上以進行上述流程。計算所得之G418r群落數目而結果摘逑於表1之中。表1 盤 CH-296

(請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} BSA BSA BSA BSA CH-296 (32皮莫耳/平方公分） CH-296 (127皮莫耳/平方公分) 10微克/亳升 40微克/亳升 250微克/亳升 5 41 66 91 55 47

經濟部中央標準局員工消費合作社印I 如表1所示，當細胞、病毒以及CH-296皆一同存在於溶液中時，相較於無CH-296存在之情形，G4181*群落之數目顯著增加。此數目相當或高於使用以CH-296塗覆之盤所得之數目。此外，當分別以上述之濃度，將CH-296溶液加至塗覆BSA之盤，同時，在靜置一段時間之後，清洗該盤並將其用於病毒感染實驗時，所得之G418r群落數目與未加入CH-296之情形下所取得者相似。有此可明瞭，CH-296並未與固定之BSA結合。 -77· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 _B7__ 五、發明説明（75 ) 因此，咸認爲上述CH-296之逆轉錄病毒感染增進效應，並非是因爲溶液中之CH-296在放置過程中與盤發生黏附所致。 (2) 使用未固定功能性物質之基因轉移如下探討當多肽一同以未固定之形式出現於盤上之時，其對逆轉錄病毒感染效率之效應。亦即，將2毫升含有 1,000 cfU之PM5neo病毒、2,000之NIH/3T3細胞、以及終濃度爲1.67 納莫耳/毫升之C-FGF*A、ColV及C277«ColV之DMEM培養基，加至根據述於實例2 (9)之方法，使用BAS預塗覆之盤上，再放置24小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理移除黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。將所得之細胞懸浮液分成兩份，並將其中一份之細施於DMEM中進行培養。將另π份之細胞於含有終濃度0.75毫克/毫升G418之 DMEM中進行培養。兩部份皆於37Χ：下放置10天，並計算出現之群落數目。計算G418r群落數目與得自不含G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率。其結果示於圖 18。於圖18之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖18所示，當病毒感染是在每一多肽存在之情形下進行，可取得較高之基因轉移效率。囱此，可明顯知道，甚至在此等多肽並未固定於盤上之時，逆轉錄病毒感染仍獲得提升。 (3) 使用未固定功能性物質之非黏著性細胞之基因轉導如下探討未固定之多肽對於非黏著性細胞之基因轉移效率之效應。亦即，將2毫升含有lxlO4 cfb之TKNEO病毒及1 x ______ —_____ ，78 -__________ 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) Μ規格（21〇乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（76 ) KHTF-1細胞之RPMI培養基（含有5納克/毫升之GM-CFS、50單位/毫升之青黴素以及50微克/毫升之鏈黴素），加入根據述於實例2(9)之方法，使用333皮莫耳/平方公分（10微克/ 平方公分）之H-271製備之盤，以及固定BSA之控制組盤中。另對BSA固定盤加入H-271至終濃度50微克/毫升（1.67納莫耳 /毫升）之H-271。將各盤置於37°C下24小時。放置之後，以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理除去黏著於盤上之細胞而收集之。結合此等細胞。分別將所得細胞懸浮液之五分之一部分轉移至兩個固定CH-296之盤上，並放置24小時。以上述培養基代換其中一份之培養基，並以含有終濃度0.75 毫克/毫升G418之上述培養基代換其中另一份之培養基。於 37°C下放置8天後，計算出現之群落數目。G418f群落之發生率（基因轉移之效率）係根據有及無G418之情形下出現之群落數目計算。其結果示於圖19。於圖19之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖19所示，當使用来固定之H-271時，所得之基因轉移效率高於使用經固定之H-271者。因此，其證實，當使用H-271對 TF-1細胞1進行基因轉導之時，未固定之狀態爲較佳者。 (4)多肽增進逆轉錄病毒感染之機制説明進行下列實驗，以確認上述諸等實驗所示多肽對於逆轉錄病毒感染之增進情形（其因細胞與多肽之結合以及多肽與逆轉錄病毒之結合而產生）。首先，將2毫升含有1，000細胞之NIH/3T3細胞之DMEM培養基，加至根據述於實例2(9)之方法製備之BAS固定盤上，再於37°C下放置24小時。將培養 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（77 ) 基由盤上移除，分別加入2毫升1.67納莫耳/毫升之H-271、 CH-27卜C-FGF，A、及PBS (作爲控制組），再於37°C下放置2.5小時。以含有25mMHEPES之Hanks*平衡鹽溶液（HBSS，Gibco)清洗試驗盤。將2毫升含有l，000cfUPM5neo病毒之病毒懸浮液加至盤上，再於37°C下放置30分鐘。以PBS清洗試驗盤。將2毫升之DMEM加至此等盤上，再於37°C下放置24小時。以傾析收集非黏著性細胞，並以胰蛋白酶處理分離黏著於盤上之細胞而收集之。分別結合此等細胞。將所得之每一細胞懸浮液分成兩份，將其中一份之細胞於DMEM中進行培養，並將另一份之細胞於含有終濃度0.75毫克/毫升G418之DMEM中進行培養。兩部份皆於37°C下放置10天，並計算出現之群落數目。計算G418r群落數目與得自不含G418之培養基之群落數目間之相對比例作爲基因轉移效率。其結果示於圖20。於圖20之中，橫座標指明所用之功能性物質，而縱座標指明基因轉移效率。如圖20所示，當病毒感染是在先以上述之多肽溶液處理過盤上之細胞後進行，可觀察到感染效率之顯著增加。此即建議，感染效率可藉由多肽與細胞之結合而提升，再藉由逆轉錄病毒與細胞上多肽之結合而進一步提升。進行類似之實驗，惟分別使用0.29納莫耳/亳升之C-FGF*A 及0.79納莫耳/毫升之CH-296取代添加之多肽。其結果示於圖 21。於圖21之中，橫座標指明所用之功能性物質及控制組，而縱座標指明基因轉移效率。如圖21所示，在C-FGF*A及CH-296之情況下皆觀察到基因轉移效率之增加。因此，上述之 __ -80-__ 本紙張尺度適用中國國家榡準（Cns ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 __B7 五、發明説明（78 ) 活性再次爲C+GF，A確認。同時，其亦顯示CH-296具有以同樣機制增進逆轉綠病毒感染之同樣活性。實例7 (1 )使用固定於玻珠上之功能性物質之基因轉移根據下列流程探討逆轉錄病毒感染效率是否可藉使用塗覆有功能性物質之玻珠而獲得增進。作爲玻珠，使用直徑 1.14 微米之聚笨乙婦玻珠（p〇iybeads Polystyrene Microsphere， PolyScienqe製造）。將80微升之乙醇以及2毫井之40微克/毫升之CH-296加至20微升上述玻珠之15%懸浮液中，再將其隔夜靜置於4°C下。加入BSA及PBS以製備BSA/PBS懸浮液（4毫升；）。離心以自該懸浮液中回收玻珠，再製備5毫升之1% BSA/PBS懸浮液，並再次將其靜置於室溫下1小時，以取得 CH-296固定玻珠。作爲控制組，根據同樣方式製備玻珠，惟使用2% BSA溶液取代CH-296溶液。將十分之一之部分（〇·5亳升）由上述玻珠懸浮液中取出，並以離心回收玻珠。將2毫升含有丨，000 cftl PM5neo病毒之 DMEM加至其上，再於37°C下放置30分鐘。以1%BSA/P即清洗玻珠兩次，懸浮於2毫升之DMEM中，並將其中之1毫升加至一試驗盤上。將1毫升含有3x 105細胞之NIH/3T3細胞之DMEM 加至其上，再於C02怪溫箱中，在37°C下放置24小時。之後’ 以含有終濃度075毫克/毫升G418之DMEM交換培養基’再另外放置10天。染色並計數出現之群落。其結果示於表2。如表2所示，當使用以CH-296塗覆之玻珠時，出現264個 G418r群落，而在使用以BSA作爲控制組塗覆之玻珠時，未出現任何抗性群落。此即建議，甚至在將CH-296固定於玻珠之 -81 - 張尺度適用中( CNS ) M規格（210X297公羡] _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（79 ) 上時，其仍具有與固定於盤上相同之增進逆轉錄病毒感染效率之效應。表2 玻珠 G418_落數目固定BS A者(控制組） 0 固定CH-296者 264 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2 )使用固定於玻珠上之功能性物質對小鼠骨髓細胞之基因轉移根據下述流程探討使用塗覆有功能性物質之玻珠增加對小鼠骨髓細胞之逆轉錄病毒感染效率之可能性。根據述於實例4 ( 4 )之相同方式製備小鼠骨髓細胞，並對此等細胞進行預刺激。將每一用於上述之預刺激處理中之2亳升含有ΐχ ι〇6預刺激細胞之培養基，以及1 X 1〇4 cfu PM5neo病毒，加至根據實例 2(9)所述之方法，使用BSA塗覆之盤，以及使用BSA塗覆，並於其上固定有於實例7(1)中製備之十分之一部分之CH-296 固定玻珠之類似盤，再將其置於37°C下。2小時之後，重新將含有同樣病毒量之培養基（2亳升）加至各盤，再繼續放置 22小時。放置結束之後，以傾析收集非黏著性細胞，並使用細胞分離緩衝溶液（CDB，不含任何酶，Gibco)收集黏著於盤上之細胞。結合此等細胞，並以同樣之缓衝溶液清洗兩次。 -82 - 丁 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（80) 計算細胞數目。對所收集得之細胞根據述於實例4(4)之相同方式進行HPP-CFC(高增殖性潛在群落形成細胞）分析。其結果示於圖22。於圖22之中，橫座標指明所用之功能性物質及其形式，而縱座標指明基因轉移效率。如其結果所示，可明瞭對小鼠骨髓細胞之逆轉錄病毒感染效率亦可使用 CH-296固定玻珠而獲得提升。實例8 (1 )使用H-271及CH-271之基因轉移 H-271對逆轉錄病毒感染之效應係藉由將病毒懸浮液分別預置於經H-271及CH-271 (其已知可增進逆轉錄病毒感染效率）塗覆之盤上，在徹底清洗盤後，以NIH/3T3細胞群落形成分析測定剩餘之病毒量，並比較兩試驗盤之結果而進行評估。亦即，根據述於實例2 ( 9 )之相同方式，分別使用不同濃度之H-271 [67皮莫耳/平方公分（2微克/平方公分）至333皮莫耳/平方公分（10微克/平方公分）]及CH-271 [67皮莫耳/ 平方公分（4微克/平方公分）至333皮莫耳/平方公分（20微克 /平方公分）]製備試驗盤。將2毫升含有l，000cfU PM5neo病毒之病毒上清液加至各盤，並在37°C下預置30分鐘，之後，以 PBS徹底清洗各盤。將2毫升含有2,000 NIH/3T3細胞之DMEM培養基加至各盤之上，於37°C下放置24小時，再於含有0.75毫克 /毫升G418之選擇培養基中放置10天。染色並計算群落數目。其結果示於圖23。圖23係説明功能性物質與基因轉移效率間之關係之圖。於圖23之中，橫座標指明使用之功能性物質之量，而縱座標指明G418f群落之數目。 -83 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（81 ) 如圖23所示，當使用CH-271固定盤時，不論多肽之濃度為何，出現之G4181群落數目幾乎相同。相反的，就H-271之情形言之，出現之群落數目根據用於固定之多肽濃度之增加而有濃度依附性支撐加，同時，就使用333皮莫耳/平方公分之H-271製備之盤而言，其出現之群落數目幾乎與CH-271者相同。此即建議，當將足夠量之H-271固定於盤上之時，可取得與 CH-271相當之病毒感染效率。 (2 )使所C-FGF，A之基因轉移以NIH/3T3細胞群落形成分析探討C-FGF.A對逆轉錄病毒感染之效應。亦即，根據述於實例8 (1)之相同方式進行評估，惟其使用根據實例2(9)所述之方法，使用127皮莫耳/平方公分（6微克/平方公分）之C-FGF^A、127皮莫耳/平方公分（7.6 微克/平方公分）之CH-271及127皮莫耳/平方公分（8微克/平方公分）之CH-289製備之試驗盤，以及固定有BSA之控制組盤。其結果示於圖24。圖24係說明功能性物質與基因轉移效率間之關係之圖。於圖24之中，橫座標指明使用之功能性物質及BSA，而縱座標指明基因轉移效率。如圖24所示，固定有BSA之控制組盤並未出現任何群落。相反的，當使用固定有C-FGF.A之盤時，G4181群落之出現獲得確認，而此等群落之數目與使用CH-271及CH-296之盤所得之數目相同。此即建議，FGF分子上存在有一個逆轉錄病毒結合域，其與CH-271及CH-296上者具有實質上相同之功能。 (3 )使用C-FGF-CS1之基因轉移根據下述流程探討C-FGF-CS1多肽對逆轉錄病毒感染之效 _-84-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（82 ) 應。亦即，根據述於實例8 (1)之相同方式，分別使用根據實例2 ( 9)所述之方法，使用133皮莫耳/平方公分之C-FGF-CS1 (6.7微克/平方公分）、C-FGF，A ( 6.3微克/平方公分）、CH-271 (8微克/平方公分）及CH-296 ( 8.4微克/平方公分）製備之試驗盤，進行NIH/3T3細胞群落形成分析。其結果示於圖25。圖25 係說明功能性物質與基因轉移效率間之關係之圖。於圖25之中，橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明G41f群落之數目。：如圖25所示，在固定此四種多肽之盤中，幾乎皆出現同樣數目之群落，此即指明，C-FGF-CS1分子具有等同於其他多肽之逆轉錄病毒結合活性。 (4 )使用C277-ColV之基因轉移根據述於實例8 (1)之相同方式，以使用124皮莫耳/平方公分（6·4微克/平方公分）之C277-ColV所製備之試驗盤，以及固定有BSA之控制組盤進行評估。其結果示於圖26。圖26係說明功能性物質與基因轉移效率間之關係之圖。橫座標指明使用之功能性物質，而縱座標指明G418f群落之數目。如圖26所示，固定有BSA之控制組盤並未出現任何群落。相反的，當使用固定有C277-Colv之盤時則出現G4181群落。此即指明，在清洗之後，盤上剩餘之逆轉錄病毒係因為ColV分子上逆轉錄病毒結合域之存在而產生。如此所述，本發明提供一種以逆轉錄病毒對目標細胞進行有效基因轉移之方法。當本發明之方法係以選擇適合目標細胞之細胞結合物質而進行之時，經轉形之目標細胞可在不須 _ -85-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 A7 B7 五經濟部中央標準局員工消費合作社印製、發明説明（83 ) 任何特殊逆轉綠病毒載體之情況下，便利地以高基因轉移效率取得。藉由轉型細胞對脊椎動物之移植，經轉形之動物可以輕易取得，而本發明可用於各式技術領域，如醫藥科學、細胞技術、基因工程及發育技術。此外，本發明亦提供一種含有本發明功能性物質或其混合物之培養基，以及進行以逆轉錄病毒媒介之目標細胞基因轉移之反應劑套組。藉由此等培養基及套組之使用，逆轉綠病毒之定位、外源基因對目標細胞之轉導等等皆可輕易且便利地進行。圖式簡要説明圖1係説明以纖維母細胞生長因子、含有纖維母細胞生長因子之功能性物質、以及纖維母細胞生長因子與纖連蛋白之細胞結合域多肽之混合物，將基因轉移進入目標細中之基因轉移效率之圖。 & 圖2係説明以纖維母細胞生長因子、纖維母細胞生長因子與纖連蛋白之細胞結合域多肽之混合物、以及纖連蛋白之細胞結合域多肽，將基因轉移進入目標細胞中之基移效率之圖。圖3係説明以膠原蛋白片段、纖連蛋白之細胞結合域肽與膠原蛋白片段之混合物、含有膠原蛋白片段與纖連白之細胞結合域多肽之混合物之功能性物質，將基因轉進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖4係説明以纖連蛋白片段、以及纖連蛋白之細胞牡人域多肤與纖連蛋白片段之混合物，將基因轉移進入目襟二胞中之基因轉移效率之圖。 '、 -86 · 本紙張尺度適用悄國家標準（公釐了 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁j -訂- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（84) 圖5係説明以纖連蛋白之細胞結合域多肽、聚離胺酸、聚離胺酸與纖連蛋白之細胞結合域多肽之混合物、纖連蛋白片段、以及纖連蛋白之細胞結合域多肽與纖連蛋白片段之混合物，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖6係説明以促紅血球生成素衍生物、聚離胺酸、以及促紅血球生成素衍生物與聚離胺酸之混合物，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖7係説明以促紅血球生成素衍生物、纖連蛋白片段聚合物、以及促紅血球生成素衍生物與纖連蛋白片段聚合物之混合物，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖8係説明以固定纖連蛋白片段之玻珠、固定纖連蛋白細胞結合域多肽之玻珠、以及固定纖連蛋白片段與纖連蛋白細胞結舍域多肽之混合物之玻珠，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖9係説明以纖維母細胞生長因子、以及含有纖維母細胞生長因子之功能性物質，對目標細胞進行轉形之圖。圖1 0係説明所用含有纖維母細胞生長因子之功能性物質之量與基因轉移效率間之關係之圖。圖1 1係説明以含有纖維母細胞生長因子之功能性物質’ 對目標細胞進行轉形之圖。圖1 2係另一説明以纖維母細胞生長因子、以及含有纖維母細胞生長因子之功能性物質，對目標細胞進行轉形之 -87- 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製、發明説明（85 ) 廣（〇圖13係説明所用含有膠原蛋白片段之功能性物質之量與基因轉移效率間之關係之圖。圖14係説明以聚離胺酸將基因轉移進入目樣細胞中之基因轉移效率之圖。圖15係説明以纖連蛋白片段以及纖連蛋白片段之聚合物，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖16係另一説明以纖連蛋白片段以及纖連蛋白片段之聚合物，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖1 7係再一説明以纖連蛋白片段以及纖連蛋白片段之聚合物，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖1 8係説明以含有纖維母細胞生長因子之功能性物質、膠原蛋白片段、以及含有膠原蛋白片段之功能性物質，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖1 9係説明以纖連蛋白片段將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖2 0係説明以含有纖連蛋白片段之功能性物質以及纖維母細胞生長因子，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖2 1係説明以含有纖維母細胞生長因子之功能性物質以及纖連蛋白片段，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。圖22係説明以固定餘玻珠上之纖連蛋白片段，將基因轉移進入目標細胞中之基因轉移效率之圖。 88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂線· 585909 A7 B7 五、發明説明（86 ) 圖23係説明所用纖連蛋白片段之量與目標細胞之基因轉導間之闕係之圖。圖2 4係説明以含有纖連蛋白片段之功能性物質以及纖維母細胞生長因子，對目標細胞之基因轉導之圖。圖2 5係另一説明以含有纖連蛋白片段之功能性物質以及纖維母細胞生長因子，對目標細胞之基因轉導之圖。圖2 6係説明以含有膠原蛋白片段之功能性物質，對目標細胞之基因轉導之圖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線一經濟部中央標準局員工消費合作社印製 89 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 585909 A 7 B7 五、發明説明（3 序列表序列編號No. 1 長度：271 類型：胺基酸股性：單拓襆結構：線性分子類型··肽序列：經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr 20 25 30 Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met 35 40 45 Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser 50 55 60 Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu 65 70 75 Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr 80 85 90 Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala 95 100 105 Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 110 115 120 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ -90- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（， lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr 125 130 135 Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie 140 145 150 Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr 155 160 165 Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser 170 175 180 Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr 185 190 195 Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie 200 205 210 Thr Gly Tyr lie 工le Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg 215 220 225 Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie 230 235 240 Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala 245 250 255 Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu 工le Gly Arg Lys Lys 260 265 270 Thr序列編號No. 2 長度：25 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製類型··胺基酸 91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（叫股性··單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： SEQUENCE: · . Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His 15 10 15 Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 20 25 序列编號No. 3 長度：1 5 5 類型：胺基酸股性：單拓樸結構··線性分子類型：肽序列： Met Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp 15 10 15 Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys 20 25 30 Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg lie His Pro 35 40 45 Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His lie 50 55 60 Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser lie Lys (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -S. -92 - ϋ張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（3 65 70 75 Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg 80 85 90 Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu· Cys Phe Phe Phe Qlu 95 100 105 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 110 115 120 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly G-ln Tyr Lys Leu 125 130 135 Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro 140 145 150 Met Ser Ala Lys Ser 155 序列編號No. 4 長度：4 3 2 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr Φ. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（91)

Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser 工le Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -94 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（92) 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu 工le Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser 工le Thr Thr 275 280 285 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro 290 295 300 Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 Phe Phe Leu Arg 工le His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lys Ser Asp Pro His lie Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu 335 340 345 Arg Gly Val Val Ser lie Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu 350 355 360 Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 365 370 375 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -95 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇'〆297公董） 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7五、發明説明（气 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420 Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 425 430 序列編號No. 5 長度：457 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser 工le Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT -(96- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（3 95 100 105

Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135

Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165

Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180

Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195

Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 工le Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pr〇 Val Gin Glu Phe 215 220 225

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240

Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255

Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270

Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 、tr 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 275 280 285 -97 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（3

Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro 290 295 300

Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315

Phe Phe Leu Arg lie His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330

Glu Lys Ser Asp Pro His Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu 335 340 345

Arg Gly Val Val Ser lie Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu 350 355 360

Ala Met: Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 365 370 375

Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 380 385 390

Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405

Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420

Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu 425 430 435

Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu 440 445 450 lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 455 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -98 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印袋 A7B7__五、發明説明（^ •序列编號No. 6 長度：1 86 類型：胺基酸股性：單 . 拓樸結構··線性分子類型.·肽序列： Gly lie Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp 15 10 15 Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg 20 25 30 Gly Glu 工le Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu 35 40 45 Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu 50 55 60 Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro 65 70 75 Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro 80 85 90 Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro 95 100 105 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg 110 115 120 Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 工le Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys 125 130 135 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（97) Gly Asn Ser Gly GXy Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg 140 145 150 Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys 155 16G 165 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro 170 175 180 Gly Gin Arg Gly Glu Thr 185 序列編號No. 7 長度：464 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（陶 65 70 75 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90

Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105

Thr Val His Trp 工le Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 _ 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135

Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser 工le Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165

Glu Glu Ser Pro Leu Leu 工le Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180

Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195

Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240

Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 245 250 255 -101 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（")

Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270

Thr Glu 工le Asp Lys Pro Ser Met Gly lie Arg Gly Leu Lys Gly 275 280 285

Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300

Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly 305 310 315

Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly 320 325 330

Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly 335 340 345

Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly 350 355 360

Pro Lys Gly Ser He Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly 365 370 375

Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly 380 385 390

Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 395 400 405 工le Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly 410 415 420

Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly 425 430 435 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 102 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 經濟部^^標準局員工消費合作社印策五、發明説明（10P 440 445 450 Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gin Arg Gly Glu Thr 455 460 序列编號No· 8 長度：489 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser 工le Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 一 103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7B7 五、發明説明（1〇)1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser 工le Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser 工le Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr 工le Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 工le Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu 工le Asp Lys Pro Ser Met Gly lie Arg Gly Leu Lys Gly 275 280 285 Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly -104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 B7 五、發明説明（1G2) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 290 295 300 Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly 305 310 315 Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly 320 325 330 Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly 335 ^ 340 345 Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly 350 355 360 Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly 365 370 375 Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly 380 385 390 Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 395 400 405 lie Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly 425 430 435 Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gin Arg Gly Ala Ser Asp 455 460 465 Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly 470 475 480 105 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 B7五、發明説明（1〇3) Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 485 序列編號No. 9 長度：30 * 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： AAACCATGGC AGTCAGCGAC GAGCTTCCCC AACTGG 序列編號No. 1〇長度：20 類型··核酸股性··單拓樸結構··線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： AATTGACAAA CCATCCATGG 序列編號No. 11 長度·· 3 3 類型··核酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 585909 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（104) 股性：單拓樸結構：線性分子類型··其他核酸（合成DNA) 序列： CCATTAAAAT CAGCTAGCAG CAGACATTGG AAG 33 序列編號No. 12 長度：36 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： TCTAGAGGAT CCTTAGCTAG CGCCTCTCTG TCCAGG 36 序列編號No. 13 長度：547 類型：胺基酸 ^ 股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Ala Ala Ser Ala He Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin 5 10 15 Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val 20 25 3〇 -107- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 S. 585909 A7 B7 五、發明説明（105 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁

Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr 35 40 45 Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val 50 55 60 Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val 65 70 75 Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val 80 85 90 Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val 95 100 105 Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys 110 115 120 Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn 125 130 135 Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser 140 145 150 Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr 155 160 165 Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie 170 175 180 Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu 185 190 195 Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg 200 205 210 Ala Arg 工le Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser -108 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、?T 暴· 585909 A 7 B7__ 五、發明説明（1〇6) 215 220 225

Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu 230 235 240

Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr 245 250 255

Val 工le Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu 工le Gly 260 265 270

Arg Lys Lys Thr Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe 275 280 285

Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro 290 295 300

Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu 305 310 315

Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser 320 325 330

Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val 335 340 345

Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin 350 355 360

Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala 365 370 375

Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 工le Thr lie Ser Trp Arg 380 385 390

Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 395 400 405 -109-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐T 585909 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1Q7) Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val 410 415 420 Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys 425 430 435 lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val 440 445 450 Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg 455 460 465 Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro 470 475 480 Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro 485 490 495 Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val 500 505 510 Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr 515 520 525 工le Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu 530 535 540 工le Gly Arg Lys Lys Thr Ser 545 •序列編號No. 14 長度·· 82 6 類型：胺基酸股性：單 -110- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr s'. 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7__五、發明説明（_) 拓樸結構：線性...... . 分子類型：肽序列： Ala Ala Ser Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp 5 10 15 Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr 20 25 30 Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val 35 40 45 Ala Glu Leu Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr 50 55 60 Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val 65 70 75 Tyr Glu Gin His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr 80 85 90 Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala 95 100 105 Asn Ser Phe Thr Val His Trp lie Ala Pr〇 Arg Ala Thr lie Thr 110 115 120 Gly Tyr Arg lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro 125 130 135 Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr 140 145 150 Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu 155 160 165 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr 本紙張尺度適财酬家絲（CNS)A4規格（210x 297公羡 1 585909 A7B7 五、發明説明（1的）經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr 170 175 180 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 185 190 195 Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg 200 205 210 Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val 215 220 225 Gin Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr 工le Ser 230 235 240 Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val 245 250 255 Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 工le Ser lie 260 265 270 Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Thr Ser Ala lie Pro 275 280 285 Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu 290 295 300 Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg 305 310 315 Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie 320 325 330 Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met 335 340 345 Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -口 585909 A7B7 五、發明説明（ 110 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 350 355 360 Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn 365 370 375 Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr 380 385 390 Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly 395 400 405 Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin 410 415 420 Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu 425 430 435 Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp 440 445 450 Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val 工le Asp Ala Ser Thr Ala lie 455 460 465 Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser 470 475 480 Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr 485 490 495 lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val 500 505 510 Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu 515 520 525 Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr 工le Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn 530 535 540 -m 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公羡） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（111 ) Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr Ser Ala 545 550 555 工le Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr 560 565 570 Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly 575 580 585 Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys 590 595 600 Glu 工le Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly 605 610 615 Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys 620 625 630 Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu 635 640 645 Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr 650 655 660 Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie 665 670 675 Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro 680 685 690 工le Gin Arg Thr 工le Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr 工le Thr 695 700 705 Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu 710 715 720 Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（112) 725 730 735

Ala 工le Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro 740 745 750

Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg 工le Thr 755 760 765

Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu 770 775 780

Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr 785 790 795

Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu 800 805 810

Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 815 820 825

Ser 序列編號No. 15 長度·· 3 8 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型··其他核酸（合成DNA) 序列： AAACCATGGC AGCTAGCGCT ATTCCTGCAC CAACTG^C 38 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -^9·. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -115- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 _五、發明説明（113) 序列編號No. 16 長度：36 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： AAAGGATCCC TAACTAGTCT TTTTCCTTCC AATCAG 36 序列編號N〇. 17 長度：1 644 類型：核酸股性··雙拓樸結構：線性分子類型··其他核酸（編碼人造多肽之〇να) 序列： ATGGCAGCTA GCGCTATTCC TGCACCAACT GACCTGAAGT TCACTCAGGT CACACCCACA 60 AGCCTGAGCG CCCAGTGGAC ACCACCCAAT GTTCAGCTCA CTGGATATCG AGTGCGGGTG 120 ACCCCCAAGG AGAAGACCGG ACCAATGAAA GAAATCAACC TTGCTCCTGA CAGCTCATCC 180 GTGGTTGTAT CAGGACTTAT GGTGGCCACC AAATATGAAG TGAGTGTCTA TGCTCTTAAG 240 GACACTTTGA CAAGCAGACC AGCTCAGGGT GTTGTCACCA CTCTGGAGAA TGTCAGCCCA 300 CCAAGAAGGG CTCGTGTGAC AGATGCTACT GAGACCACCA TCACCATTAG CTGGAGAACC 360 AAGACTGAGA CGATCACTGG CTTCCAAGTT GATGCCGTTC CAGCCAATGG CCAGACTCCA 420 ATCCAGAGAA CCATCAAGCC AGATGTCAGA AGCTACACCA TCACAGGTTT ACAACCAGGC 480 ACTGACTACA AGATCTACCT GTACACCTTG AATGACAATG CTCGGAGCTC CCCTGTGGTC 540 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚:）

ATCGACGCCT CCACTGCCAT TGATGCACCA TCCAACCTGC GTTTCCTGGC CACCACACCC AATTCCTTGC TGGTATCATG GCAGCCGCCA CGTGCCAGGA TTACCGGCTA CATCATCAAG TATGAGAAGC CTGGGTCTCC TCCCAGAGAA GTGGTCCCTC GGCCCCGCCC TGGTGTCACA GAGGCTACTA TTACTGGCCT GGAACCGGGA ACCGAATATA GAATTTATGT CATTGCCCTG AAGAATAATC AGAAGAGCGA GCCCCTGATT GGAAGGAAAA AGACTAGCGC TATTCCTGCA CCAACTGACC TGAAGTTCAC TCAGGTCACA CCCACAAGCC TGAGCGCCCA GTGGACACCA CCCAATGTTC AGCTCACTGG ATATCGAGTG CGGGTGACCC CCAAGGAGAA GACCGGACCA ATGAAAGAAA TCAACCTTGC TCCTGACAGC TCATCCGTGG TTGTATCAGG ACTTATGGTG GCCACCAAAT ATGAAGTGAG TGTCTATGCT CTTAAGGACA CTTTGACAAG CAGACCAGCT CAGGGTGTTG TCACCACTCT GGAGAATGTC AGCCCACCAA GAAGGGCTCG TGTGACAGAT GCTACTGAGA CCACCATCAC CATTAGCTGG AGAACCAAGA CTGAGACGAT CACTGGCTTC CAAGTTGATG CCGTTCCAGC CAATGGCCAG ACTCCAATCC AGAGAACCAT CAAGCCAGAT GTCAGAAGCT ACACCATCAC AGGTTTACAA CCAGGCACTG ACTACAAGAT CTACCTGTAC ACCTTGAATG ACAATGCTCG GAGCTCCCCT GTGGTCATCG ACGCCTCCAC TGCCATTGAT GCACCATCCA ACCTGCGTTT CCTGGCCACC ACACCCAATT CCTTGCTGGT ATCATGGCAG CCGCCACGTG CCAGGATTAC CGGCTACATC ATCAAGTATG AGAAGCCTGG GTCTCCTCCC AGAGAAGTGG TCCCTCGGCC CCGCCCTGGT GTCACAGAGG CTACTATTAC TGGCCTGGAA CCGGGAACCG AATATACAAT TTATGTCATT GCCCTGAAGA ATAATCAGAA GAGCGAGCCC CTGATTGGAA GGAAAAAGAC TAGT 585909 A 7 B7_ _ _ 五、發明説明（114) 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1644 序列編號No. 18 長度：37 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) -117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585909 A7 B7 五、發明説明（115:

序列： AAACCATGGC AGCTAGCCCC ACTGACCTGC GATTCAC 序列編號No. 19 長度：3 8 類型：核酸股性··單拓樸結構：線性分子類型··其他核酸（合成DNA) 序列： AAAAGATCTC TAACTAGTGG ATGGTTTGTC AATTTCTG 37 38 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榡準局員工消費合作祍印製序列編號No. 20 長度·· 2 4 8 1 類型··核酸股性：雙拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（編碼人造多肽之〇1^八）序列： ATGGCAGCTA GCCCCACTGA CCTGCGATTC ACCAACATTG GTCCAGACAC CATGCGTGTC 60 ACCTGGGCTC CACCCCCATC CATTGATTTA ACCAACTTCC TGGTGCGTTA CTCACCTGTG 120 AAAAATGAGG AAGATGTTGC AGAGTTGTCA ATTTCTCCTT CAGACAATGC AGTGGTCTTA 180 ACAAATCTCC TGCCTGGTAC AGAATATGTA GTGAGTGTCT CCAGTGTCTA CGAACAACAT 240 GAGAGCACAC CTCTTAGAGG AAGACAGAAA ACAGGTCTTG ATTCCCCAAC TGGCATTGAC 300 118- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐）訂 -n 1 --- 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7__五、發明説明（116) TTTTCTGATA TTACTGCCAA CTCTTTTACT GTGCACTGGA TTGCTCCTCG AGCCACCATC 360 ACTGGCTACA GGATCCGCCA TCATCCCGAG CACTTCAGTG GGAGACCTCG AGAAGATCGG 420 GTGCCCCACT CTCGGAATTC CATCACCCTC ACCAACCTCA CTCCAGGCAC AGAGTATGTG 480 GTCAGCATCG TTGCTCTTAA TGGCAGAGAG GAAAGTCCCT TATTGATTGG CCAACAATCA 540 ACAGTTTCTG ATGTTCCGAG GGACCTGGAA GTTGTTGCTG CGACCCCCAC CAGCCTACTG 600 ATCAGCTGGG ATGCTCCTGC TGTCACAGTG AGATATTACA GGATCACTTA CGGAGAAACA 660 GGAGGAAATA GCCCTGTCCA GGAGTTCACT GTGCCTGGGA GCAAGTCTAC AGCTACCATC 720 AGCGGCCTTA AACCTGGAGT TGATTATACC ATCACTGTGT ATGCTGTCAC TGGCCGTGGA 780 GACAGCCCCG CAAGCAGCAA GCCAATTTCC ATTAATTACC GAACAGAAAT TGACAAACCA 840 TCCACTAGCG CTATTCCTGC ACCAACTGAC CTGAAGTTCA CTCAGGTCAC ACCCACAAGC 900 CTGAGCGCCC AGTGGACACC ACCCAATGTT CAGCTCACTG GATATCGAGT GCGGGTGACC 960 CCCAAGGAGA AGACCGGACC AATGAAAGAA ATCAACCTTG CTCCTGACAG CTCATCCGTG 1020 GTTGTATCAG GACTTATGGT GGCCACCAAA TATGAAGTGA GTGTCTATGC TCTTAAGGAC 1080 ACTTTGACAA GCAGACCAGC TCAGGGTGTT GTCACCACTC TGGAGAATGT CAGCCCACCA 1140 AGAAGGGCTC GTGTGACAGA TGCTACTGAG ACCACCATCA CCATTAGCTG GAGAACCAAG 1200 ACTGAGACGA TCACTGGCTT CCAAGTTGAT GCCGTTCCAG CCAATGGCCA GACTCCAATC 1260 CAGAGAACCA TCAAGCCAGA TGTCAGAAGC TACACCATCA CAGGTTTACA ACCAGGCACT 1320 GACTACAAGA TCTACCTGTA CACCTTGAAT GACAATGCTC GGAGCTCCCC TGTGGTCATC 1380 GACGCCTCCA CTGCCATTGA TGCACCATCC AACCTGCGTT TCCTGGCCAC CACACCCAAT 1440 TCCTTGCTGG TATCATGGCA GCCGCCACGT GCCAGGATTA CCGGCTACAT CATCAAGTAT 1500 GAGAAGCCTG GGTCTCCTCC CAGAGAAGTG GTCCCTCGGC CCCGCCCTGG TGTCACAGAG 1560 GCTACTATTA CTGGCCTGGA ACCGGGAACC GAATATACAA TTTATGTCAT TGCCCTGAAG 1620 AATAATCAGA AGAGCGAGCC CCTGATTGGA AGGAAAAAGA CTAGCGCTAT TCCTGCACCA 1680 ACTGACCTGA AGTTCACTCA GGTCACACCC ACAAGCCTGA GCGCCCAGTG GACACCACCC 1740 AATGTTCAGC TCACTGGATA TCGAGTGCGG GTGACCCCCA AGGAGAAGAC CGGACCAATG 1800 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -119- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐Γ 585909 A7 B7 五、發明説明（1

AAAGAAATCA ACCAAATATG GGTGTTGTCA ACTGAGACCA GTTGATGCCG AGAAGCTACA TTGAATGACA CCATCCAACC CCACGTGCCA GAAGTGGTCC GGAACCGAAT ATTGGAAGGA ACCTTGCTCC TGACAGCTCA AAGTGAGTGT CTATGCTCTT CCACTCTGGA GAATGTCAGC CCATCACCAT TAGCTGGAGA TTCCAGCCAA TGGCCAGACT CCATCACAGG TTTACAACCA ATGCTCGGAG CTCCCCTGTG TGCGTTTCCT GGCCACCACA GGATTACCGG CTACATCATC CTCGGCCCCG CCCTGGTGTC ATACAATTTA TGTCATTGCC AAAAGACTAG Τ

TCCGTGGTTG AAGGACACTT CCACCAAGAA ACCAAGACTG CCAATCCAGA GGCACTGACT GTCATCGACG CCCAATTCCT AAGTATGAGA ACAGAGGCTA CTGAAGAATA

TATCAGGACT TGACAAGCAG GGGCTCGTGT AGACGATCAC GAACCATCAA ACAAGATCTA CCTCCACTGC TGCTGGTATC AGCCTGGGTC CTATTACTGG ATCAGAAGAG

TATGGTGGCC ACCAGCTCAG GACAGATGCT TGGCTTCCAA GCCAGATGTC CCTGTACACC CATTGATGCA ATGGCAGCCG TCCTCCCAGA CCTGGAACCG CGAGCCCCTG 1960 1920 1980 20402100 21602220 2280 2340 2400 2460 2481 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號No. 21 長度：472 類型：胺基酸股性：單拓樸結構··線性分子類型：肽序列：

、tT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（110 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 35 40 45 Ser 工le Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser*Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp 工le Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser 工le Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 -121- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂參· 585909 A 7 B7 五、發明説明（119) 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 · 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp 275 280 285 Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300 Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 315 Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro 320 325 330 Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 335 340 345 Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360 Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 365 370 375 Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 工le Thr lie 380 385 390 Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr He Thr Gly Phe Gin Val Asp 395 400 405 Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys -122 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT 585909 A7 B7 五、發明説明（12°) 410 415 420 Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr 425 430 435 Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp· Asn Ala Arg Ser 440 445 450 Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser 455 460 465 Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr 470 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號No. 22 長度：457 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser 工le Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 -123- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 k#·. 585909 A7 B7 五、發明説明（121 )

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly 工le Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp 工le Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 請先閱讀背之注

I t

訂經濟部中標準局員工消 t 合作社印製

Leu 工le Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr 工le Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg ‘124- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） # 585909 A7 B7 五、發明説明（1气經濟部中央標率局員工消費合作社印製 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser -Pro Pro Arg Arg 275 280 285 Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 工le Thr 工le Ser Trp 290 295 300 Arg Thr Lys Thr Glu Thr 工le Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val 305 310 315 Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro 工le Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp 320 325 330 Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr 335 340 345 Lys 工le Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro 350 355 360 Val Val 工le Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu 365 370 375 Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin 380 385 390 Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie 工le Lys Tyr Glu Lys 395 400 405 Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly 410 415 420 Val Thr Glu Ala Thr He Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr 425 430 435 -125 本紙张尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、?T 參. 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 _五、發明説明（123) Thr lie Tyr Val 工le Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro 440 445 450 Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 455 · 序列編號No. 23 長度：54 9 類型··胺基酸股性··單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser 工le Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly He Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（124) 95 100 105

Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg，Pro Arg Glu Asp 125 130 135

Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165

Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180

Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195

Leu lie Ser Trp Asp Ala Pr〇 Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240

Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255

Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270

Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 275 280 285 -127- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（125 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300 Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 . 315 Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu 工le Asn Leu Ala Pro 320 325 330 Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 335 340 345 Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360 Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 365 370 375 Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 工le Thr lie 380 385 390 Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr He Thr Gly Phe Gin Val Asp 395 400 405 Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro 工le Gin Arg Thr 工le Lys 410 415 420 Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr 425 430 435 Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser 440 445 450 Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala 工le Asp Ala Pro Ser 455 460 465 Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser -128- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（126) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 470 475 480 Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr 485 490 495 Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val* Pro Arg Pro Arg 500 505 510 Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr 515 520 525 Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser 530 535 540 Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 545 序列編號No. 24 長度：574 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列： Prp Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn 工le Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 -129- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7B7 五、發明説明（3 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾

Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 * 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp 工le Ala Pro Arg Ala Thr 工le Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr 585909 A7 B7五、發明説明（128) 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 經濟部中央標準局員合作社印製 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser·工le Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu 工le Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp 275 280 285 Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300 Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 315 Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro 320 325 330 Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 335 340 345 Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360 Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 365 370 375 Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie 380 385 390 Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp 395 400 405 Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys 410 415 420 -13卜本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請先閱讀背面之注意事項再貪訂 # 585909 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（129) Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr 425 430 435 Asp Tyr Lys 工le Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser 440 445 · 450 Ser Pro Val Val 工le Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser 455 460 465 Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser 470 475 480 Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr 485 490 495 Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg 500 505 510 Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr 515 520 525 Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser 530 535 540 Glu Pro Leu 工le Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gin Leu 545 550 555 Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp 560 565 570 Val Pro Ser Thr 序列編號No. 25 長度：274 類型：胺基酸 -132- 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) a4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（130) 股性：單拓襆結構：線性分子類型：肽序列： . Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met: Arg 15 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr 工le Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1.τ

-133- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公慶"T 585909 A7 B7 五、發明説明（131) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr*Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 工le Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr 工le Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 工le Ser lie A孕n Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu lie Asp 序列編號No. 26 長度：1 374 類型：核酸股性：雙拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（編碼人造多肽之DNA) 序列： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂筹· -134 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（13?

ATGCCCACTG CCACCCCCAT GAAGATGTTG CTGCCTGGTA CCTCTTAGAG ATTACTGCCA AGGATCCGCC TCTCGGAATT GTTGCTCTTA GATGTTCCGA GATGCTCCTG AGCCCTGTCC AAACCTGGAG GCAAGCAGCA GCCGGGAGCA CCCGGCCACT ATCCACCCCG CAACTTCAAG CTGGCTATGA TTTTTTGAAC TGGTATGTGG CAGAAAGCTA ACCCTTCCAC

ACCTGCGATT CACCAACATT GGTCCAGACA CCATGCGTGT CACCTGGGCT 60 CCATTGATTT AACCAACTTC CTGGTGCGTT ACTCACCTGT GAAAAATGAG 120 CAGAGTTGTC AATTTCTCCT TCAGACAATG CAGTGGTCTT AACAAATCTC CAGAATATGT AGTGAGTGTC TCCAGTGTCT ^CGAACAACA TGAGAGCACA GAAGACAGAA AACAGGTCTT GATTCCCCAA CTGGCATTGA CTTTTCTGAT ACTCTTTTAC TGTGCACTGG ATTGCTCCTC GAGCCACCAT CACTGGCTAC ATCATCCCGA GCACTTCAGT GGGAGACCTC GAGAAGATCG GGTGCCCCAC CCATCACCCT CACCAACCTC ACTCCAGGCA CAGAGTATGT GGTCAGCATC ATGGCAGAGA GGAAAGTCCC TTATTGATTG GCCAACAATC AACAGTTTCT GGGACCTGGA AGTTGTTGCT GCGACCCCCA CCAGCCTACT GATCAGCTGG CTGTCACAGT GAGATATTAC AGGATCACTT ACGGAGAAAC AGGAGGAAAT AGGAGTTCAC TGTGCCTGGG AGCAAGTCTA CAGCTACCAT CAGCGGCCTT TTGATTATAC CATCACTGTG TATGCTGTCA CTGGCCGTGG AGACAGCCCC AGCCAATTTC CATTAATTAC CGAACAGAAA TTGACAAACC ATCCATGGCA TCACCACGCT GCCCGCCTTG CCCGAGGATG GCGGCAGCGG CGCCTTCCCG TCAAGGACCC CAAGCGGCTG TACTGCAAAA ACGGGGGCTT CTTCCTGCGC ACGGCCGAGT TGACGGGGTC CGGGAGAAGA GCGACCCTCA CATCAAGCTA CAGAAGAGAG AGGAGTTGTG TCTATCAAAG GAGTGTGTGC TAACCGTTAC AGGAAGATGG AAGATTACTG GCTTCTAAAT GTGTTACGGA TGAGTGTTTC GATTGGAATC TAATAACTAC AATACTTACC GCTCAAGGAA ATACACCAGT CACTGAAACG AACTGGGCAG TATAAACTTG GATCCAAAAC AGGACCTGGG TACTTTTTCT TCCAATGTCT GCTGCTAGCG ACGAGCTTCC CCAACTGGTA ACCCCAATCT TCATGGACCA GAGATCTTGG ATGTTCCTTC CACA 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂毒. 585909 A7 B7 五、發明説明（133) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂序列編號No. 27 長度：1416 類型：核酸股性：雙拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（編碼人造多肽之DNA) 序列： CCCACTGACC TGCGATTCAC CAACATTGGT CCAGACACCA TGCGTGTCAC CTGGGCTCCA 60 CCCCCATCCA TTGATTTAAC CAACTTCCTG GTGCGTTACT CACCTGTGAA AAATGAGGAA 120 GATGTTGCAG AGTTGTCAAT TTCTCCTTCA GACAATGCAG TGGTCTTAAC AAATCTCCTG 180 CCTGGTACAG AATATGTAGT GAGTGTCTCC AGTGTCTACG AACAACATGA GAGCACACCT 240 CTTAGAGGAA GACAGAAAAC AGGTCTTGAT TCCCCAACTG GCATTGACTT TTCTGATATT 300 ACTGCCAACT CTTTTACTGT GCACTGGATT GCTCCTCGAG CCACCATCAC TGGCTACAGG 360 ATCCGCCATC ATCCCGAGCA CTTCAGTGGG AGACCTCGAG AAGATCGGGT GCCCCACTCT 420 CGGAATTCCA TCACCCTCAC CAACCTCACT CCAGGCACAG AGTATGTGGT CAGCATCGTT 480 GCTCTTAATG GCAGAGAGGA AAGTCCCTTA TTGATTGGCC AACAATCAAC AGTTTCTGAT 540 GTTCCGAGGG ACCTGGAAGT TGTTGCTGCG ACCCCCACCA GCCTACTGAT CAGCTGGGAT 600 GCTCCTGCTG TCACAGTGAG ATATTACAGG ATCACTTACG GAGAAACAGG AGGAAATAGC 660 CCTGTCCAGG AGTTCACTGT GCCTGGGAGC AAGTCTACAG CTACCATCAG CGGCCTTAAA 720 CCTGGAGTTG ATTATACCAT CACTGTGTAT GCTGTCACTG GCCGTGGAGA CAGCCCCGCA 780 AGCAGCAAGC CAATTTCCAT TAATTACCGA ACAGAAATTG ACAAACCATC CATGGCTATT 840 CCTGCACCAA CTGACCTGAA GTTCACTCAG GTCACACCCA CAAGCCTGAG CGCCCAGTGG 900 ACACCACCCA ATGTTCAGCT CACTGGATAT CGAGTGCGGG TGACCCCCAA GGAGAAGACC 960 GGACCAATGA AAGAAATCAA CCTTGCTCCT GACAGCTCAT CCGTGGTTGT ATCAGGACTT 020 ATGGTGGCCA CCAAATATGA AGTGAGTGTC TATGCTCTTA AGGACACTTT GACAAGCAGA 1080 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -蠢_ -136- 尺度適财_家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（ 134> CCAGCTCAGG GTGTTGTCAC CACTCTGGAG AATGTCAGCC CACCAAGAAG GGCTCGTGTG 1140 ACAGATGCTA CTGAGACCAC CATCACCATT AGCTGGAGAA CCAAGACTGA GACGATCACT 1200 GGCTTCCAAG TTGATGCCGT TCCAGCCAAT GGCCAGACTC CAATCCAGAG AACCATCAAG 1260 CCAGATGTCA GAAGCTACAC CATCACAGGT TTACAACCAG GCACTGACTA CAAGATCTAC 1320 CTGTACACCT TGAATGACAA TGCTCGGAGC TCCCCTGTGG TCATCGACGC CTCCACTGCC 1380 ATTGATGCAC CATCCAACCT GCGTTTCCTG GCCACC 1416 序列編號N〇. 28 長度：35 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列：

Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg 1 5 10 15 Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly lie Thr 20 25 30 Gly Lys Pro Gly Pro 35 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列编號No. 29 長度：302 類型：胺基酸股性：單 -137- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'犬297公釐） 585909 A7 B7_ _ 五、發明説明（1予拓樸結構：線性分子類型：肽序列：

Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro .Asp Thr Met Arg 1 5 10 15

Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser 工le Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30

Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45

Ser 工le Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75

His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90

Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105

Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr He Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 工le Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135

Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser He Val Ala Leu Asn Gly Arg 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 155 160 165 ___ -138- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 五、發明説明（136 ) Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 . 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr 工le Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 工le Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu 工le Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr 275 280 285 Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro 290 295 300

Ser Thr 請先閱讀背面之注意事項再貪 r

訂經濟部t 央標準局員工消費合作社印製序列編號No. 30 長度：573 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性 -139- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） # 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7_五、發明説明（137 )分子類型：肽序列： Met Ala Ala Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr 5 10 15 Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn 20 25 30 Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys 35 40 45 Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser 50 55 60 Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser 65 70 75 Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly 80 85 90 Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg 95 100 105 Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 工le Thr lie Ser Trp Arg Thr 110 115 120 Lys Thr Glu Thr 工le Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala 125 130 135 Asn Gly Gin Thr Pro 工le Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg 140 145 150 Ser Tyr Thr He Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie 155 160 165 Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr -140-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦Γ 585909 A7B7 五、發明説明（138) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 170 175 180 工le Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe 185 190 195 Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser.Trp Gin Pro Pro 200 205 210 Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly 215 220 225 Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr 230 235 240 Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie 245 250 255 Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie 260 265 270 Gly Arg Lys Lys Thr Ala 工le Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe 275 280 285 Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro 290 295 300 Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu 305 310 315 Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser 320 325 330 Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val 335 340 345 Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin 350 355 360 -141 - 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7 B7 五、發明説明（139) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala 365 370 375 Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg 380 385 * 390 Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro 395 400 405 Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val 410 415 420 Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys 425 430 435 lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val 440 445 450 Val lie Asp Ala Ser Thr Ala 工le Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg 455 460 465 Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro 470 475 480 Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro 485 490 495 Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val 500 505 510 Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr 515 520 525 lie Tyr Val He Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu 530 535 540 lie Gly Arg Lys Lys Thr Ser Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr -142 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇'乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 B7 五、發明説明（14G ) 545 、 550 555

Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro 560 565 570

Ser Thr Ser 序列編號No. 31 長度：37 類型：核酸股性··單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成dna) 序列： AAACCATGGC AGCTAGCAAT GTCAGCCCAC CAAGAAG 37 序列編號No. 32 長度：37 類型：核酸股性：單拓樸結構··線性分子類型··其他核酸（合成dna) 序列： AAAGGATCCC TAACTAGTGG AAGGAACATC CAAGATC 37 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號No. 33 長度：1 722 -143- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製五、發明説明（14》類型：核酸股性：雙拓樸結構：線性分子類型··其他核酸（編碼人造多肽之DNA) 序列：蜃 ATGGCAGCTA GCGCTATTCC TGCACCAACT GACCTGAAGT TCACTCAGGT CACACCCACA 60 AGCCTGAGCG CCCAGTGGAC ACCACCCAAT GTTCAGCTCA CTGGATATCG AGTGCGGGTG 120 ACCCCCAAGG AGAAGACCGG ACCAATGAAA GAAATCAACC TTGCTCCTGA CAGCTCATCC 180 GTGGTTGTAT CAGGACTTAT GGTGGCCACC AAATATGAAG TGAGTGTCTA TGCTCTTAAG 240 GACACTTTGA CAAGCAGACC AGCTCAGGGT GTTGTCACCA CTCTGGAGAA TGTCAGCCCA 300 CCAAGAAGGG CTCGTGTGAC AGATGCTACT GAGACCACCA TCACCATTAG CTGGAGAACC 360 AAGACTGAGA CGATCACTGG CTTCCAAGTT GATGCCGTTC CAGCCAATGG CCAGACTCCA 420 ATCCAGAGAA CCATCAAGCC AGATGTCAGA AGCTACACCA TCACAGGTTT ACAACCAGGC 480 ACTGACTACA AGATCTACCT GTACACCTTG AATGACAATG CTCGGAGCTC CCCTGTGGTC 540 ATCGACGCCT CCACTGCCAT TGATGCACCA TCCAACCTGC GTTTCCTGGC CACCACACCC 600 AATTCCTTGC TGGTATCATG GCAGCCGCCA CGTGCCAGGA TTACCGGCTA CATCATCAAG 660 TATGAGAAGC CTGGGTCTCC TCCCAGAGAA GTGGTCCCTC GGCCCCGCCC TGGTGTCACA 720 GAGGCTACTA TTACTGGCCT GGAACCGGGA ACCGAATATA CAATTTATGT CATTGCCCTG 780 AAGAATAATC AGAAGAGCGA GCCCCTGATT GGAAGGAAAA AGACTAGCGC TATTCCTGCA 840 CCAACTGACC TGAAGTTCAC TCAGGTCACA CCCACAAGCC TGAGCGCCCA GTGGACACCA 900 CCCAATGTTC AGCTCACTGG ATATCGAGTG CGGGTGACCC CCAAGGAGAA GACCGGACCA 960 ATGAAAGAAA TCAACCTTGC TCCTGACAGC TCATCCGTGG TTGTATCAGG ACTTATGGTG 1020 GCCACCAAAT ATGAAGTGAG TGTCTATGCT CTTAAGGACA CTTTGACAAG CAGACCAGCT 1080 CAGGGTGTTG TCACCACTCT GGAGAATGTC AGCCCACCAA GAAGGGCTCG TGTGACAGAT 1140 -144- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 585909 A7 B7 五、發明説明（142 )

GCTACTGAGA CCACCATCAC CATTAGCTGG AGAACCAAGA CTGAGACGAT CAAGTTGATG CCGTTCCAGC CAATGGCCAG ACTCCAATCC AGAGAACCAT GTCAGAAGCT ACACCATCAC AGGTTTACAA CCAGGCACTG ACTACAAGAT ACCTTGAATG ACAATGCTCG GAGCTCCCCT GTGGTCATCG ACGCCTCCAC GCACCATCCA ACCTGCGTTT CCTGGCCACC ACACCCAATT CCTTGCTGGT CCGCCACGTG CCAGGATTAC CGGCTACATC ATCAAGTATG AGAAGCCTGG AGAGAAGTGG TCCCTCGGCC CCGCCCTGGT GTCACAGAGG CTACTATTAC CCGGGAACCG AATATACAAT TTATGTCATT GCCCTGAAGA ATAATCAGAA CTGATTGGAA GGAAAAAGAC TAGCGACGAG CTTCCCCAAC TGGTAACCCT AATCTTCATG GACCAGAGAT CTTGGATGTT CCTTCCACTA GT 序列編號N〇. 34 長度：4 1 2 類型：胺基酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：肽序列：

CACTGGCTTC CAAGCCAGAT CTACCTGTAC TGCCATTGAT ATCATGGCAG GTCTCCTCCC TGGCCTGGAA GAGCGAGCCC TCCACACCCC 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1722 請先閲讀背之注意事項再訂經濟部中標準 % 員工消合作社印製

Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin 5 10 15 Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu 20 25 30 His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys 35 40 45 Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp # 145 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（143 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 50 55 60 Gly Asp Val Lys Leu Thr Gin Ser Met Ala lie 工le Arg Tyr lie 65 70 75 Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro. Lys Glu Arg Ala 80 85 90 Glu 工le Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly 95 100 105 Val Ser Arg 工le Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 110 115 120 Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp 125 130 135 Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His 140 145 150 Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met 155 160 165 Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 170 175 180 Lys Arg 工le Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr Leu Lys Ser 185 190 195 Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala Thr Phe 200 205 210 Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu lie Glu Gly Arg 215 220 225 Gly 工le Pro Arg Asn Ser Gly Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp 230 235 240 -146 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585909 A7B7 五、發明説明（ 144

Ser Arg Val Leu Gin Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu 245 250 255 Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 260 265 . 270 lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 275 280 285 Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala 290 295 300 Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn 305 310 315 Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 320 325 330 Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly 335 340 345 Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 350 355 360 Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg 365 370 375 Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 380 385 390 Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Leu Ala Met Asp Pro Leu Glu 395 400 405 Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser 410 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -147-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（14S) 序列編號No. 35 長度·· 2 4 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序歹J ·· GCTCCCTCTG GGCCTCCCAG TCCT 序列編號No. 36 長度·· 2 4 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： GTTGGTGAGG GAGGTGGTGG ATAT 序列編號N〇. 37 長度：33 類型：核酸股性：單拓樸結構：線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 s'. -148- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585909 A7 _^_B7_____五、發明説明（146 ) GGCCTCCCGA ATTCCGGTGC CCCACCACGC CTC 33 序列編號No. 38 長度·· 3 3 類型：核酸股性··單拓樸結構··線性分子類型：其他核酸（合成DNA) 序列： CGCACGTGGA TCCATGGCTA ATCTGTCCCC TGT 33 序列編號No. 39 長度：1239 類型：核酸股性：單拓樸結構··線性分子類型：其他核酸(編碼人造多肽之DNA) 序列： ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT 60 TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120 TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180 GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240 ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -149- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ：297公釐） 585909 A7B7 五、發明説明（147) GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420 ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480 GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 540 AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 600 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660 CTGATCGAAG GTCGTGGGAT CCCCAGGAAT TCCGGTGCCC CACCACGCCT CATCTGTGAC 720 AGCCGAGTCC TGCAGAGGTA CCTCTTGGAG GCCAAGGAGG CCGAGAATAT CACGACGGGC 780 TGTGCTGAAC ACTGCAGCTT GAATGAGAAT ATCACTGTCC CAGACACCAA AGTTAATTTC 840 TATGCCTGGA AGAGGATGGA GGTCGGGCAG CAGGCCGTAG AAGTCTGGCA GGGCCTGGCC 900 CTGCTGTCGG AAGCTGTCCT GCGGGGCCAG GCCCTGTTGG TCAACTCTTC CCAGCCGTGG 960 GAGCCCCTGC AGCTGCATGT GGATAAAGCC GTCAGTGGCC TTCGCAGCCT CACCACTCTG 1020 CTTCGGGCTC TGGGAGCCCA GAAGGAAGCC ATCTCCCCTC CAGATGCGGC CTCAGCTGCT 1080 CCACTCCGAA CAATCACTGC TGACACTTTC CGCAAACTCT TCCGAGTCTA CTCCAATTTC 1140 CTCCGGGGAA AGCTGAAGCT GTACACAGGG GAGGCCTGCA GGACAGGGGA CAGATTAGCC 1200 ATGGATCCTC TAGAGTCGAC TCGAGCGGCC GCATCGTGA 1239 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -150- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210Χ297公釐）

Claims

585909 第〇861〇2752號專利申請案益 —~乞木申請專利範圍替拖太(93年3 D8 六、申請專利範— ———~- 1. 一種在活體外增加以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之效率的方法，其特徵為改良包含藉著在有效量具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質（其係選自纖連蛋白之肝 f - Π結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白及聚離胺酸），和有效量具有目標細胞結合域之另一功能性物質 (其係選自纖連蛋白細胞結合區域多肽、促紅血球生成素、可與C D抗原結合之抗體及高甘露糖型糖鏈）之混合物存在下’以逆轉錄病毒感染目標細胞以進行轉導。 2 .根據申μ專利範圍第丨項之方法，其中該纖連蛋白細胞結合域多肽係對於VLA-5& /或VLA_4之結合域多肽。 3·根據中巧專利範圍第丨或2項之方法，其中該功能性物質係經固定者。 4 · 一種用於以逆轉綠病毒將基因轉移至目標細胞之目標細胞培養基，其特徵為包含有效量具有逆轉錄病毒結合域之功旎性物質（其係選自纖連蛋白之肝素_ Η結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白及聚離胺酸），以及有效 I具有目標細胞結合域之另一功能性物質（其係選自纖連蛋白細胞結合區域多肽、促紅血球生成素、可與C D 抗原結合之抗體及高甘露糖型糖鏈）之混合物。 5·根據申請專利範圍第4項之培養基，其中該纖連蛋白細胞結合域多肽係對於VLA_5及/或VLA_4i結合域多肽。 6·根據申請專利範圍第4或至5項之培養基，其中該功能十生物質係經固定者。本紙張尺歧财® ®家揉準(CNS) A4規格(210X297公董)_ 申請專利範圍 •種用於進行由逆轉錄病毒仲介進入目標細胞之基因轉移之套組，其特徵為該套組包含： U)有效量具有逆轉錄病毒結合域之功能性物質(其係選自纖連蛋白之肝素·η結合域、纖維母細胞生長因子、膠原蛋白及永離胺鉍)及//或有效量具有目標細胞結合域、力把丨生物貝（其係選自纖連蛋白細胞結合區域多肽、促紅血球生成素、可與⑶抗原結合之抗體及高甘露糖型糖鏈）； (b) 用於培養逆轉錄病毒及目標細胞之人造物質；及 (c) 用於預刺激目標細胞之目標細胞生長因子。 8·根據中請專利範圍第7項之套組.，纟中該纖連蛋白細胞結合域多肽係對於VLA-5&//或VLA-4之結合域多肽。 9·根據申凊專利範圍第7或8項之套組，其中該功能性物質係經固定者。 10. —種在活體外增加以逆轉錄病毒將基因轉移進入目標細胞之效率的方法，其特徵為改良包含藉著在有效量之於同一分子上同時具有目標細胞結合域之功能性物質功能性物貝（其係選自纖連蛋白細胞結合區域多肽、促紅血球生成素、可與C D抗原結合之抗體及高甘露糖型糖鏈）及逆轉錄病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸）之存在下，以逆轉錄病毒感染目標細胞以進行轉導。 U·根據申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該纖連蛋白細胞結合域多肽係對於VLA-5及/或VLA-4之結合域多肽。 ________ -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐） 585909 8 8 8 8 A BCD 六、申請專利範圍 12. 根據申請專利範圍第1 〇項之方法’其中該纖維母細胞生長因子係選自由序列表中序列編號Ν〇· 3表不之纖維母細胞生長因子及含有該因子之多肽：序列编號No. 3 Met Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys 20 25 30 Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg lie His Pro 35 40 45 Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His He 50 55 60 Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser lie Lys 65 70 75 Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg 80 85 90 Lau Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu- Cys Phe Phe Phe Qlu 95 100 . i〇5 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 110 115 120 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lvs Arg Thr Gly Gla Tyr Lys Lau 125 130 135 GIv Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin Lys Ala lie Lau Phe Lau Pro 140 145 150 Met Ser Ala Lys Ser 〇 155 13. 根據申請專利範圍第1 0項之方法，其中該功能性物質 -3- _ _ 本紙張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 8 8 8 8 A B c D 585909 六、申請專利範圍係具有由序列表中序列編號No. 4或5表示之胺基酸序列的多肽：序列编铳No. 4 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn 工丄e Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 l〇 15 Val Thr Trp A丄a Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asa Phe Leu 20 25 30 Vai Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Vai Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 〇〇 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Va丄 Ser Sar Val Tyr GJLu Glo 55 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asa Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Oly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 130 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 -4- 適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公董)

585909 A BCD 申請專利範圍 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 工le Thr Tyr Gly Glu Thr Giy Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Xla Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr GIv Arg 245 250 . 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ila Sar lie Asn Tyr Arg 260 _ 255 270 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met: Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr 275 230 235 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly- Gly Ser Gly Ala ?he Pro Pro 290 295 300 Glv His Phe Lys Asp Pro Lys A£g T：ea.. .Tyr Cvs Lys Asn Gly Gly 305 310 315 Phe Phe Leu Arg lie His Pro Asp Gly. .Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lys Ser Asp Pro His He Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu 335 340 345 Arg Gly Val Val Ser lie Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu 350 355 360 Ala Met: Lys Glu Asp Gly Arg Leu Lea Ala Ser Lys Cys Val Thr 365 370 375 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Lea Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420 -5 本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

585909 六、申請專利範圍 A B c D Lys Ala He Leu ?he Leu Pro Met Ser Ala Lys Sar 425 430 序列编號No. 5 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu' 20 25 30 Va丄 Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Lau Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ila Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asa Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val' Ser lie Val Ala Lau Asa Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val' *AlT Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 參裝訂 f 585909 A8 B8 C8

六、申請專利範圍 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro A丄a Va丄 Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210' lie Thr Tyr Gly GIu Thr Gly Gly Asa Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Giv Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro He Ser lie Asa Tyr Arg 260 ' 265 270 Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser He Thr Thr 275 280 285 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro 290 295 300 Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 Phe Phe Leu Arg lie His Pro Asp Gly Arg Val *Aso Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lys Ser Asp Pro His lie Lys Leu Gin Leu Gin A丄a Glu Glu 335 340 . 345 Arg Gly Val Val Ser lie Lys Gly Val Cys Ala Asa Arg Tyr Leu 350 355 360 Ala Met Lvs Glu Asp Gly Arg Leu Leu一Ala Ser Lys Cys Val Thr 365 370 37S Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asa Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Va丄 Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公A)

裝訂 t 585909 A B c D 六、申請專利範圍 Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu 425 430 435 Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu 440 445 450 Xla Leu Asp Val Pro Ser Thr 0 455 14. 根據申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該膠原蛋白係選自衍生自第V類膠原蛋白之含有胰島素結合域之膠原蛋白片段及含有該片段之多肽。 15. 根據申請專利範圍第1 4項之方法，其中該衍生自第V類膠原蛋白之含有胰島素結合域之膠原蛋白片段係具有由序列表中序列編號No. 6表示之胺基酸序列之片段： •序列编號No. 6 Gly He Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp 1 5 l〇 15 Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg 20 25 30 Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly P*ro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu 35 40 45 Gly Pro Lys Gly Arg Giv Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu 50 55 60_ Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro 65 70 75 Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly Pro Lys Gly Ser He Gly Phe Pro 80 85 90 Glv Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro 95 100 105 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 110 115 120 Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly He Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lvs 125 130 135 Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg 140 145 150 Gly ?ro Asn Gly Pro Gin Gly Pro Thr Gly ?he Pro Gly Pro Lys 155 160 165 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro 170 175 180 Gly Gin Arg Gly Glu Thr 〇 185 16.根據申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該功能性物質係具有由序列表中序列編號No. 7或8表示之多肽：序列编號No. 7 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn He Gly Pro Asp Thr Met Arg I 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ila Asp Phe Ser Asp Ila Thr Ala Asn Ser Phe g5 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly. Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ils Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asa Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Vai Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Gly lie Arg Gly Leu Lvs Gly 275 280 235 Thr Lys GIv Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300 Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly 305 310 315 Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly* Arg Gly GIv 320 325 330 Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly 335 340' 345 Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly 350 355 360

裝

585909 A BCD 六、申請專利範圍 Pro Lys Gly Ser 工ie Gly Phe Pro Gly Phe Pro Giy Ala Asn Gly. 365 370 375 Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly 380 385 390 Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 395 400 . 405 工le Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly 425 430 435 Pro Thr Gly phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gin Arg Gly Glu Thr 455 460 序列编號No. S Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn iJLe Gly Pro Asp Thr Met: Arg 15 l〇 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser He Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30. Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Xle Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asa Ser Phe 95 100 105 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Thr Val His Tro lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 X15 120 lie Arg His His Pro Glu Kis Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu ASp 125 130 135 Arg. Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie, Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asa Ser Pro Val Gin Glu Phe* 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 2S0 255 Gly Asp Ser Pro A丄a Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asa Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Gly lie Arg Gly Leu Lys Glv 275 280 235 Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300 Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg GIv Glu lie Glv Pro Pro Giv 305 310 315 Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys GIv Arg GIv Gly 320 325 330 Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly -12- 本紙張尺度適用中國國家搮準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 335 340 345 Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr. Pro Gly Arg Gin Glv 350 355 3〇0 Pro Lys Gly Ser He Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asa Glv 365 370 375 —- 峰 Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Glv 380 385 390 Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 395 400 405 He Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Glv Pro Gin Gly 425 430 435 Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Glv Gin Arg Gly Ala Ser Asp 455 460 465 Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly 470 475 480 Pro Glu He Leu Aso Val Pro Ser Thr " O 485 17.根據申請專利範圍第1 0至2 1項中任一項之方法，其中該功能性物質係經固定者。 • 13- 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 A B c D 、申請專利範圍 18. 根據申請專利範圍第1 0至2 1項中任一項之方法，其中該功能性物質係未經固定使用。 19. 一種用於以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞之目標細胞培養基，其特徵為包含有效量於同一分子上同時具有目標細胞結合域之功能性物質（其係選自纖連蛋白細胞結合區域多肽、促紅血球生成素、可與C D抗原結合之抗體及高甘露糖型糖鏈）及逆轉錄病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸）。 20·根據申請專利範圍第1 9項之培養基，其中該纖維母細胞生長因子係選自由序列表中序列編號No. 3表示之纖維母細胞生長因子及含有該因子多肽·· 序列编號No. 3 Met Ala Ala Glv Ser lie Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp 1 5 15 Gly Giy Ser Gly Aia Phe ?ro Pro Gly His ?he Lys Asp Lys 20 25 30 Arg Leu Tvr Cys Lvs Asa Glv Gly Phe Phe Leu Arg lie His Pro 35 40 43 Asp Gly Arg Vai Asp Gly VaJL Arg Glu Lys Ser Asp Pro His lie 50 55 60 Lys Leu Gin Leu Gin Aia Giu Giu Arg Giy Vai Vai Ser Hie Lys 65 70 75 Gly Val Cys Ala Asa Arg Tyr Leu Ala M.e- Lvs Glu As? Gly Arg 30 35 90 Lau Lau Ala Ser Lys Gvs Vai Thr Asp Glu? Cys ?ha ?he Clu 95 100 . 1.05 Arg Leu Glu Ser Asa Asa Tyr Asn Thr Tvr Arg Ser Arg Cys Tyr HO 115 L20 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 8 8 8 8 A B c D 々、申請專利範圍 Thr Ser Trp Tyr Val A丄a Lau Lvs Arg Thr Glv Glr. Tyr Lys Lau 125 130 135 Glv Ser Cys Thr Gly Pro Giy Gin Lys Ala lie Lau ?he Lau Pro 140 145 150 Met: Ser Ala Lys Ser O 155 21.根據申請專利範圍第1 9項之培養基，其中該功能性物質係具有由序列表中序列編號No. 4或5表示之胺基酸序列的多肽：序列衾纥No. 4 Pro Thr Asp Lau Arg ?he Thr Asn lie Glv Pro Asp Thr Mer Arg 1 5 15 Va丄 Thr τ：τρ A丄a ?ro Pro Pro Ser 工丄s Asp Lsu Th: Asn ?he Lau 2。 25 30 Val Arg Tyr Ser ?ro Vai Lys Asn Glu Gili As? Vai Ak Giu Leu 35 40 45 Ser :：La Ser ?ir。Ser As? Asn A：U V3丄 Va丄 Leu Thr Asn Ceu Leu 50 55 50 ?r。G丄V Thr Glu Tyr Va丄 Va*L Ser Va丄 Ser Ser Va丄 Tyr G_lu Gi〇 70 75 His Glu Ser Thr Pro Lau Arg Gly Arg Gla Lvs Thr Gly Leu Asp 30 85 g〇 Ser Pro Thr Gly Ha Asp ?he Ser Asp lie Thr Ala Asa Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Glv Tyr Arg m 115 120 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 585909 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 He Arg Kis His Pro Gia His ?he Ser Civ Arg Pro Arg Gla Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser IIs Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Giv Thr Glu Tyr Val Vai Ser Ila Vai Ala Lau Asn Gly Arg 155 160 155 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie G丄y G丄n Gin Ser Thr Vai Ser Asp 170 175 130 Vai Pro Arg Asp Lau Gla Vai Va丄 A丄a A丄a Thr Pro Thr Ser Lau 185 190 195 Leu He Ser Tro Asp Ala Pro Ala Vai Thr Vai Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Glv Gly Asn Ser Pro Vai Gin Glu ?he 215 220 225 Thr Vai Pro Gly Ser Lys Ser Thr Aia Thr Ila Sar Gly Lau Cvs 230 235 240 Pro Gly Vai Asp Tyr Thr lie Thr Vai τ>·:τ Ala Vai Thr Gly Arg 245 250 . 255 Gly Asp Ser Pro A丄a Sar Ser Lys Pro lie Ser lie Asa Tyr Arg 260 255 270 Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Ala Aid Gly Ser lie Thr Thr 275 230 235 Cau Pro a丄a Leu Pro Glu Asp Cly Civ Ser Gly Ala ?ha Pro Pro 290 295 300 Gly Kis Phe Lys Asp Pro Lys A*£g Hau-· Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 Phe Phe Leu Arg Ila Kis Pro Aso Gly .Arg Vai Asp GLv Vai Arg 320 325 330 -16-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 585909 8 8 8 8 A BCD 六、申請專利範圍 Giu Lvs Ser Asp Pro Kis lie Cys Lau Gin Lau Gin Ala Glu ^Ια 335 340 345 Arg Giv VaJL Val Ser Xia Lys Gly Vai Cys Ala Asn Arg Tyr Leu 350 355 360 Ala Met: Lys Glu Asp Giy Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Vs丄 Thr 365 370 37 5 Asp Glu Cys Phe ?he ?he Glu Arg Leu Giu Ser Asa Asa Tvr Asa 380 335 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lvs Tvr Thr Ser Trp Tvr Val Ala Leu Lys 395 400 4〇5 Arg Thr Glv Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly ?ro Gly Gin 410 41S 420 Lys A丄a lie Lau ?he Leu Pro Met Ser Ala Lys Sar 425 430 序列编號No. 5 Pro Thr Asp Lau Arg Phe Thr Asa J：丄s Gly ?ro Asp Thr Met: Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ila Asp Lau Thr Asa Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser ?r*o Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 S<ar Ila Ser Pro Ser Asp Asn A丄a Vai Va丄 Leu Thr Asa Lau Lau 50 55 60 Pro Giy Thr Glu Tyr Vai Va丄 Ser Vai Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Lau Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Lau Asp 80 35 90 Ser Pro Thr Gly He Asp Phe Ser Asp Ila Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 -17- _ ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 585909 A B c D 申請專利範圍 Thr Val Kis Trp lia A丄a Pro Arg A丄a Thr lie Thr Glv Tyr Arg U.0 115 120 lie Arg His His ?ro Giu His ?he Ser Gi/ Arg ?ro Arg Giu Asp 125 130 ' 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser He Thr Lau Thr Asa Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr GIu Tyr Val Val· Ser lie Val Ala Lau Asa Gly Arg 155 160 165 Glu GIu Ser Pro Leu Lau lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 130 Val Pro Arg Asp Leu Glu Va丄 VaT AIT Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Lau lie Ser Trp Aso Ala Pro A丄a Vai Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210· Ila Thr Tyr Gly Giu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu ?h& 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ila Ser Glv Leu Lvs 230 235 240 Pro Gly Val Aso Tyr Thr XIa Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 Gly Aso Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 ， 265 270 Thr Glu lie Asp Lys ?ro Ser Met: Ala Ala Giy Ser Ila Thr Thr 275 230 285 Leu Pro Ala Lau Pro Gla Aso Gly Glv Ser Gly Ala ?ha Pro Pro 290 295 300 Gly Kis ?he Lys Asp Pro Lv*s Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 ?he Phe Lau Arg Ila His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lys Ser Asp Pro His lia Lys Lea Gla Leu Gin Ala Glu GIu 335 340 345 18 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Arg GIv Vai Val Ser lie Lvs Gly Val Cvs Ala Asa Arg Tyr Leu 3SO 355 360 Ala Met Lvs Glu Asp Cly Arg Leu .Leu一Aia Ser Lys Cvs Val Thr 365 370 375 Asp Glu Cvs ?he ?he ?he Glu Arg SLeu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg lys Tyr Thr Ser Trp Tyr VaJL Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420 Lys A丄a He Leu Phe Leu Pro Met: Ser A丄a Ala Ser Asp Glu Leu 425 430 435 Pro Gin Lau Val Thr Leu Pro His Pro Asa Leu His Gly Pro Glu 440 445 450 Ha Leu Asp Val Pro Ser Thr O 455 22. 根據申請專利範圍第1 9項之培養基，其中該膠原蛋白係選自衍生自第V類膠原蛋白之含有胰島素結合域之膠原蛋白片段及含有該片段之多肽。 23. 根據申請專利範圍第1 9項之培養基，其中該衍生自第V 類膠原蛋白之含有胰島素結合域之膠原蛋白片段係具有由序列表中序列編號No. 6表示之胺基酸序列之片段：序列豸焚No. 6 Gly tie Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Giu Lys Gly Glu Asp 15 l〇 15 Glv ?he Pro Gly Phe Lys Gly Aso Met Gly Ha Lys Gly Asp Arg 20 25 30 Gly Glu 工丄a Gly Pro ?ro Gly PtO Arg Giy Glu Asp Giy Pro GJLu 35 40 45 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 585909 A8 B8 C8 D8 六申請專利範圍 Gly Pro Lvs Glv Arg Gly Gly Pro Asn Giy Asp Pro GIv Pro Leu 50 55 60 Gly Pro Pro G丄/ Giu Lys Gly Lys Lau Gly Val Pro Gly Leu Pro 55 70 75 Gly Tvr Pro Gly Arg Gin Gly Pro Lvs Giy Ser He Gly Phe Pro 30 35 90 Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro 95 100 105 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg HO 115 120 Gly Glu Arg Gly Pro Arg GIv Ila Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys 125 130 135 Gly Asa Ser Gly Gly Asp Glv Pro Ala Gly Pro -Pro Gly Glu Arg 140 I45 lJ〇 Gly ?ro Asn Gly Pro Gin GIv Pro Thr Gly ?he Pro Gly Pro Lys 155 U0 165 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Lau Pro Gly ^is .-〇 170 175 130 Gly Gin Arg Glv Glu Thr 〇 18524.根據申請專利範圍第1 9項之培養基，其中該功能性物質係具有由序列表中序列編號No· 7或8表示之多肽：序列裟就No· 7 Pro Thr Asp Lau Arg ?he Thr Asn Ila Gly Pro Asp Thr Met Arg i 5 10 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Sar lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tvr Ser Pro Vai Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Lau 35 40 45 20- 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）參裝訂參 585909 A8 B8 C8

六、申請專利範圍 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Va丄 Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 〇〇 Pro G丄y Thr Glu Tyr Val Va丄 Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 7 5 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lvs Thr Gly Lau Asp 30 35 90

Ser Pro Thr Giv lie Asp Phe Ser Asp Ila Thr Ala Asn Ser ?he 95 100 105 Thr Val His Trp lie A丄a Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ila Arg His His Pro Glu His Phe Ser Glv. Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asa Ser lie Thr Leu Thr Asa Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ila Vai Ala Lau Asn Gly Arg 155 150 165 Glu Glu Ser Pro Lau Lau He Gly Gla Gla Ser Thr* Val Ser Asp 170 175 130 t Val Pro Ajrg Aso Leu GJLu Vai Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 135 190 195 Lau lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 工JLe Thr* Tyr Giy Giu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu ?he 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lvs Ser Thr A丄a Thr lie Ser Gly Leu Lvs 230 235 240 Pro Gly Val As? Tyr Thr lie Thr Val Tyr A丄a Vai Thr Gly Arg 245 250 255 -21 - 本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 A B c D 六、申請專利範圍 Glv Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ila Ser Ha Asa Tyr Arg 250 255 270 Thr Gia Ila Asp Lys Pro Ser Met GIv He Arg Glv Lau Lys Gly 275 230 285 Thr Lvs Giy Glu Lys Gly GIu Asp Gly ?he Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300 Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg GIv Glu He Gly Pro Pro Gly 305 310 315 Pro Arg Glv Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Glv Arg Gly Giy 320 32S 330 Pro Asa Gly Aso Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Gla Lys Gly 335 3*40' 345 Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly 350 355 360 Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro Gly Phe Pro Glv Ala Asn Gly 355 370 375 Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Glv Pro Arg Gly 380 385 390 Gin Arg Glv Pro Thr Gly- Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 395 400 405 He Thr Giy Lys Pro Giy Pro Lys Glv Asa Ser Glv Glv Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Glv Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Glv Pro Gin Gly 425 430 433 Pro Thr Gly ?he Pro Gly Pro Lys Glv Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Lau pro 〇iy His Pro Gly Gin Arg Glv Glu Thr 455 460 -22- 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝訂 585909 A B c D 申請專利範圍序列缄號No, 3 Pro Thr Asp Lea Arg Phe Thr Asa Ili GIv Pro Aso Thr Met: Arg L 5 10 15 Val Thr Trp Ala ?ro Pro Pro Sar He Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30' Val Arg Tyr Ser Pro Val Lvs Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tvr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr ?ro Lau Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 30 85 90 Ser Pro Thr Gly Xle Asp Phe Ser Asp He Thr Ala Asa Ser Phe 95 100 Thr Val His Tro lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Glv Tyr Arg ' 110 115 120 Ils Arg His His Pro Glu His Phe Sar Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Val Pro His Ser Arg Asa Ser lia Thr Leu Thr Asn. Lau Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Vai Vai Ser He Val Ala Lau Asn GIv Arg 155 160 . 165 Giu Giu Ser Pro Leu Leu Ha Glv Gin Gin Sar Thr Val Ser Asp 170 175 180 Pro Arg Asp Leu Giu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Lau 135 190 195 Le^ lie Ser Tro Asp A丄a Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg ' · · 200 205 210 -23- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 B8 C8 D8

六、申請專利範圍 lie Thr Tyr Gly Gla Thr Gly -Gly Asn Ser Pro Vai Gin Glu Phe' 215 220 225 Thr Vai Pro Gly Ser Lys Ser • Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Vai Asp Tyr Thr lie ί Thr Vai Tyr Ala Va： .Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ila Ser lie Asn Tyr Arg 260 255 270 Thr Glu He Asp Lys. Pro Ser Met Gly lie Arg Gly* Leu Lvs Gly 275 280 235 Thr Lys Gly Gla Lys Gly Glu Asp Gly Phe ?ro Gly Phe Lys Gly 290 295 300 Asp Met Giy Xle Lys Gly Asp Arg Gly Glu lie Glv Pro Pro Giy 305 310 315 Pro Arg Gly Gla Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Giy Glv 320 325 330 Pro Asa Gly Asp Pro Gly Pro Ldu Gly Pro Pro Civ Gla Lys Ciy 335 340 345 Lvs Leu Gly Vai Pro Gly Lau Pro Gly Tyr.?ro oiy Arg Gin Gly 350 355 350 Pro Lys Gly Ser Ha Gly Phe Pro Glv ?ha Pro Giy Ala Asn Gly 365 370 375 Glu Lys Gly Giy Arg Gly Thr Pro Glv Lys Pro gly Pro Arg Glv 380 385 390 Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg 零·· Giy Gla Arg ciy Pro Arg Gly 395 400 405 lie Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser GIY Gly Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asa Giy Pro Gin Gly 425 430 435 Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro CIY Pro Pro Gly 440 445 450 24 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍 Lys Asp Giy Leu Pro G丄y His ?ro Gly Gin Arg Giy Ala Ser Asp 455 460 455 Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asa Leu His Civ 47。 475 430 Pro Glu He Leu Asp Val Pro Ser Thr O 435 25. 根據申請專利範圍第1 9至2 4項中任一項之培養基，其中該功能性物質係經固定者。 26. —種用於進行由逆轉錄病毒仲介進入目標細胞之基因轉移之套組，其特徵為該套組包含： (a)有效量在同一分子上同時具有目標細胞結合域（其係選自細胞黏著蛋白、荷爾蒙、細胞因子、抗體、糖鏈及碳水化合物）之功能性物質及逆轉錄病毒結合域（其衍生自纖維母細胞生長因子、膠原蛋白或聚離胺酸）； (b )用於培養逆轉錄病毒及目標細胞之人造物質；及 (c)用於預刺激目標細胞之目標細胞生長因子。 27. 根據申請專利範圍第2 6項之套組，其中該纖維母細胞生長因子係選自由序列表中序列編號No. 3表示之纖維母細胞生長因子、該因子之功能性當量物、及含有該因子或其功能性當量物之多肽者：序列瑞虼No. 3 Met Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr Leu ?ττο Ala Lau Pro Giu Asp I 5 l〇 15 Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro ?ro Giy His Phe Lys Asp ?ro Lys 20 25 30 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 8 8 8 8 A BCD 々、申請專利範圍 Axg Leu Tyr Cys Lys Asn Giy Giy ?he Hsu Arg lie His ?ro 35 40 45 Asp Gly Arg Val Aso Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro Hxs lie 50 55 60 Lys Leu Gin Leu Gin A：U Giu Glu Arg Giy Val Vai Ser lie Lys 55 70 75 Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met: Lvs Glu Asp Gly Arg 30 35 90 Leu Leu Ala Ser Lvs Cys Val Thr Asp Glu- Cvs ?ha Phe Phe Qlu 95 100 . 105 Arg Lau Glu Ser Asa Asa Tyr Asn Thr Tvr Arg Sar Arg Lvs Tyr HO 115 120 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lvs Arg Thr Gly Glr. Tyr Lys Lau L25 130 135 Giv Ser Lys Thr Glv Pro Giy Gin Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro 140 145 150 Met Ser Ala Lys Ser 0 155 28·根據申請專利範圍第2 6項之套組，其中該功能性物質係具有由序列表中序列編號No. 4或5表示之胺基酸序列的多肽：序 Η 编 No. 4 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ha Gly ?ro Aso Thr Met Arg 1 5 10 15 Vai Thr Trp a丄a Pro Pro Pro Ser I丄e Asp Lau Thr Asn Phe Lau 20 25 30 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 585909 Α8 Β8 C8

六、申請專利範圍 val Arg Tyr Ser ?ro Vai Lys Asn Glu G丄u Asp va丄八一 Lau 45 35 Sei： He Ser ?ro Ser As? Asn A丄a V3丄 Va丄 Leu Thr 50 55 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Sar Vai Ser Ser Val 65 70 75 His Glu Ser Thr ?ro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Giy Leu AsP “ 30 85 90 Ser Pro Thr Gly He As? ?he Ser Asp Ha Thr Ala Asa Ser ?he 95 100 103 Thr Vai His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr He Thr Giy Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His ?he Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Vai Pro His Ser Arg Asa Ser He Thr Leu Thr Asa Leu Thr 140 145 150 Pro G丄y Thr Glu Tyr Va丄 Vai Ser lie Vai Ala Lau Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Lau Leu He Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 L80 Vai Pro Arg Asp Leu Glu Va丄 Va丄 A丄a A丄a Thr Pro Thr Ser Lau 135 190 195 •ash Cau Leu 50 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Vai Thr Vai Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Vai Gin Glu ?he 215 220 225 Thr Va丄？ro GJly Ser Lys Ser Thr Th: Ua Ser Giy Leu Lys 230 235 240 Pro Gly va丄 Asp Tyr Thr IJl3 Thr Va丄 Tyr* A丄忍 Va丄 Thr 01 v Arg 245 250 . 255 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 裝 t 585909 A8 B8 C8 D8 六申請專利範圍 GXv aso Ser Pro Ala Ser Ser Lvs Pro lla Ser lie Asn Tyr Arg 250 265 270 Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Ala Ala Glv Ser lla Thr Thr 275 230 235 Leu Pro Ala Laa Pro Gia Asp Ciy Gly Ser Glv Aia ?he Pro Pro 290 295 300 Glv Kis ?he Lys Asp Pro Lys Arg Heu-. .Tyr Cys Lvs Asa Glv Gly 305 310 315 Phe ?he Leu Arg lie His Pro Asp Gly .Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330 Giu Lys Ser Asp Pro His He Lys Lau GJLn Lau Gin Ala Giu Glu 335 340 345 Arg Gly Va丄 Vai Ser lie Hys Giy Vai Cys A丄a Asn Arg Tyr Lea 350 355 360 Ala Met Lys Glu Asp Giy Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cvs Va丄 Thr 365 370 375 Aso G丄u Cvs ?he Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn. Asn Τντ 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 4L0 415' 420 Lvs A丄a lie Lau ?he Leu Pro Met Ser A丄a Lys Ser 425 430 序列编就Mo. 5 Pro Thr Asp Lau Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met: Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp A丄a Pro Pro Pro Ser lla Asp Lea Thr Asn Phe Leu-20 25 30 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱)

裝訂 t 585909 A BCD 六、申請專利範圍 Val Arg Tvr Ser Pro Val Lvs Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn A丄a Val Val lieu Thr Asn Leu Lau 50 55 50 pr〇 Gly Thr Glu Tyr· Val Va丄 Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 55 70 75 His Glu Ser Thr Pro Lau Arg Civ Arg Gin Lys Thr Glv Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Glv lie Asp Phe Ser Asp 工丄e Thr A丄a Asn Ser Phe 95 ' 100 105 Thr Val His Tro lie Ala Pro Arg Ala Thr Ila Thr Glv Tyr Arg 110 115 120 lie Arg Kis His Pro Glu His Phe Ser Gly* Arg ?ro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg val Pro His Ser Arg Asn Ser Ila Thr Lau Thr Asa Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Va丄·Ser Ila Val Ala Lau Asa Glv Arg 155 I60 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 130 Val Pro Arg Asp Lau Glu Val V'^l AlT Ala Thr ?ro Thr Ser Lau 185 190 195 Lau lie Ser Trp Asp Ala Pro A丄a Vai Thr Vai Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210. Ha Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val G丄n Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Sar Glv Lau Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro A丄a Ser Ser Lys Pro lie Ser Xle Asa Tyr Arg 260 265 270 29 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

ABCD 585909 六、申請專利範圍 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Sar lie Thr Thr 275 280 235 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Sar Gly Ala ?he Pro Pro 290 295 300 Gly His ?he Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Giy Giy 305 310 315 〇he ?he Leu Arg lie Kis Pro Asp Gly Arg Va丄 Asp Gly Val Arg 320 325 330 Giu Lvs Ser Asp Pro His li^a Lvs Lau Gin Leu Gin Ala Glu Glu 335 340 . 345 Arg Gly Val Val Ser lie Lys Gly Vai Cvs Ala Asa Arg Tyr Lau 350 3S5 360 Ala tMel: Lys Glu Asp Gly Arg Lau .Geu一A丄a Sar Lys Cvs Val Thr 365 370 373 Asp Glu Cys ?he Pha ?he Glu Arg Lau Glu Ser Asn Asn Tyr Asn —- 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Lau Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420 Lys A丄a lie Leu ?he Leu Pro Met: Ser A丄a Ala Ser Asp Glu Leu 425 430 435 Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu 440 445 450 lie Lau Aso Va丄 Pro Ser Thr ' O 455 29.根據申請專利範圍第2 6項之套組，其中該膠原蛋白係選自衍生自第V類膠原蛋白之含有胰島素結合域之膠原蛋白片段、該片段之功能性當量物、及含有該片段或其 -30- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍功能性當量物之多肽。 30.根據申請專利範圍第2 9項之套組’其中該衍生自第V類膠原蛋白之含有胰島素結合域之膠原蛋白片段係具有由序列表中序列編號No· 6表示之胺基酸序列之片段· 序列劣號No. 6 Gly lie Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp 1 5 l〇 15 Glv ?he Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met: Giy lie Lys Gly Asp Arg 20 25 30 Gly Glu Ila Glv Pro Pro Gly P'io Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu 35 40 45 Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu SO 55 60 Gly Pro Pro Glv Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro 65 70 75 Gly Tyr Pro Glv Arg Gin Gly Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro 80 35 90 Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lvs Gly Gly Arg Gly Thr Pro 95 100 105 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg 110 1X5 120 Giy Giu A:g Giy ?ro Arg Giy lie Thr Gly Lys ?r。Giy ?ro Lys 125 130 135 Gly Asn Ser Glv Gly Asp Glv Pro Ala Giy Pro Pro Gly Glu Arg 140 145 150 Gly Pro Asn Giy Pro Gin Glv Pro Thr Gly ?he Pro Gly Pro Lys 155 160 U5 Giy Pro Pro 〇ly Pro Pro Gly Lys Asp Glv Cau Pro Giv His Pro __ -31 - 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 585909 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範園 170 175 130 Gly Gin Arg Cly Gla Thr 〇 185 31.根據中請專利範圍第2 6項之套組，其中該功能性物質係具有由序列表中序列編號No. 7或8表示之多肽·· 序列系號No. 7 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met: Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp A丄a Pro Pro Pro Ser lie Asp Lau Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tvr Ser Pro Val Lys Asn Giu Giu Aso Val Ala Gla Leu 3S 40 45 Ser He Ser Pro Ser Aso Asn A丄a Val Val Leu Thr Asn Leu Lau 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 30 35 90 Ser Pro Thr Giv lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser ?he 95 100 105 Thr Val His Trp Ila Ala Pro Arg Ala Thr Xla Thr Glv Tyr Arg 110 115 120 工丄a Arg Kis His Pro Glu His Phe S^r Gly. Arg Pro Arg Glu Asp 125 120 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lia Thr Leu Thr Asa Lea Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ila Val Ala Leu Asn GI7 Arg 155 LoO 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Xla Gly Glrv Gla Ser Thr Val Ser Asp -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 585909 8 8 8 8 A BCD 六、申請專利範圍 170 175 130 Val Pro Arg Asp Leu Glu 7al Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser* Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr* Gly Glu Thr Glv Gly Asn Ser Pro Val Gin Giu Phe 2丄 5 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Giy Va丄 Asp Tyr Thr lis Thr Val Tyr Ala Vai Thr Gly Arg 245 250 255 裝 Gly Asp Ser* Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Met Glv lie Arg Glv Lau Lys Gly 275 230 285 Thr Lys Giy Glu Lys Giy Glu Asp Giy ?he Pro Glv Phe Lys Glv 290 295 300 Aso Met: Gly lie Lys Gly Asp Arg Gly Glu lie Gly Pro Pro Giv 305 310 315 Pro Arg Gly Glu Aso Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Giy Glv 320 32S 330 Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly 335 340' 345 Lys Lau Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Giy* 350 355 360 Pro Lvs Gly Ser He Gly Phe Pro Gly 〇he Pro Oly Ala Asn Gly* 365 370 375 Glu Lys Glv Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Glv Pro Arg Gly 380 385 390 Gin Arg G丄y Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 585909 A8 B8 C8

六、申請專利範圍 39S 400 405 工le Thr Giy Lvs Pro Giv Pro Lys Gly Asn Ser GIv Gly Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asa Gly Pro Gin Gly 425 430 435 Pro Thr Gly Phe Pro Giv Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Lau Pro Gly His Pro Giv Gin Arg Gly Glu Thr 455 450 序列编號No. 3 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met; Arg 1 5 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asa Phe Leu 20 25 30 Va丄 Arg Tyr Ser Pro Va丄 Lys Asn Glu Glu Asp Val Aia Giu Leu 35 40 45 Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Va丄 Val Ser Val Ser Ser Vai Tyr Glu Gin 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Giy Leu Asp 30 as 90 Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg * U〇 115 120 I丄s Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly- Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Arg. Val Pro Kis Ser Arg Asn Ser lie Thr Lau Thr Asn Lau Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Vdl Val Ser Ua Val Ala Lea Asa Gly Arg 155 !〇0 165 Gla Glu Ser Pro Leu Leu Ha Gly Gla Gla Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Lau Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 135 ' 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 20S 210 He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro val Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Sar Thr Ala Thr lie Ser Gly Lau Lys 230 235 240 Pro Gly Val ASO Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro A丄a Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Gly lie Arg Gly Lau Lv-s Giv 275 280 285 Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300 Asp Met: Gly lie Lys Gly Asp Arg GIv Gla lie Giv Pro Pro Giv 305 310 315 Pro Arg Gly Glu ASO Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly 320 325 330 Pro Asn Gly ASO Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Glv Glu Lys Gly 335 340 345 Lys Leu Gly Va丄 Pro Gly Leu ： Pro < Tyr.： Pro丨 Gly t \rg Gin Gly 350 355 360 Pro Lys Gly Ser Xia Gly Phe : Pro Gly Phe : Pro i Gly Ala Asn Gly 365 370 375 -35 i- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐) 585909 ABCD 々、申請專利範圍 Glu Lys Gly Gly Arg Glv Thr Pro Gly Lvs Pro Gly Pro Arg Glv 380 335 390 Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Glv Pro Arg Gly 395 400 405 工:Le .Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Glv Gly Asp Glv 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gin Glv 425 430 435 Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gin Arg Gly Ala Sar Asp 455 460 465 Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asa Leu His Glv 470 475 480 Pro Glu He Leu Asp Valero Ser Thr 0 435 32·根據申請專利範圍第2 6至3 1項中任一項之套組，其中該功能性物質係經固定者。 33.根據申請專利範圍第3或1 7項之方法，其中該功能性物質係固定於玻珠之上。 34·根據申請專利範圍第6或2 5項之培養基，其中該功能性物質係固定於玻珠之上。 35.根據申請專利範圍第9或3 2項之套組方法，其中該功能性物質係固定於玻珠之上。 36· —種在活體外增加以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞 ___ -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A8 B8

政率的万法，其特徵為改良包含在有效量 ^選自由實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連Γΐ ^又或其混合物組成之群之功能性物質存在下，以綠病毒感染目標細胞以進行傳導，其巾該纖連蛋白 G έ肝素-11結合域及c s _ j細胞黏合域。

A y種在活體外增加以逆轉錄病毒將基因轉移至目標細胞 <效率的方法，其特徵為改良包含在有效量未固定之選自由實質上之純纖連蛋白、實質上之純纖連蛋白片段或其混合物組成之群功能性物質存在下，以逆轉錄病毒感染目標細胞以進行傳導，其中該纖連蛋白片段包含肝素-11結合域及c S -1細胞黏合域。 t 38·根據申請專利範圍第1至3、1 〇至1 8、3 3、3 6及3 7，中任一項之方法，其中該目標細胞係選自幹細胞、造血細胞、非黏著性低密度單核細胞、黏著細胞、骨髓細胞、造血幹細胞、外周血幹細胞、臍血細胞、胎兒造血幹細胞、胚胎形成幹細胞、胚胎細胞、原生殖細胞、卵母細胞、卵原細胞、卵、精母細胞、精子、CD 34 +細胞、C-kit +細胞、多能造血祖細胞、單能造血祖細胞、紅血球前體細胞、淋巴細胞前體細胞、成熟血細胞、淋巴細胞、：B細胞、T細胞、纖維母細胞、神經母細胞、神經細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、肌纖維母細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞、骨髓瘤細胞及病性白血球細胞。 39·根據申請專利範圍第1至3、1 0至1 8、3 3及3 6至3 8項 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585909 六 A8 B8 C8 D8 _____ 、申請專利範圍中任一項之方法，其中該逆轉錄病毒包括一外源基因。 40. 根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中該逆轉錄病毒係重組逆轉錄病毒載體。 41. 根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中該逆轉錄病毒係複製缺失型重組逆轉錄病毒載體。 42. —種多肽，其係由序列表中序列編號No· 13所代表：序列編號No. Π A丄a Ala Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin 5 10 15 Va丄 Thr Pro Thr Ser Leu Ser A丄a Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val 20 25 30 Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr 35 40 45 Gly pr〇 Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val 50 55 〇〇 Val Val Ser Gly Leu Met: Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val 65 70 *75 Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val 80 85 90 Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val 95 100 105 Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr 工la Ser Trp Arg Thr Lys 110 115 120 Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asa 125 130 135 Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser 140 145 150 Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr' 155 160 165 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asa Ala Arg Ser Ser Pro Val Val He 170 175 180 Asp A JL 2L Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu 135 190 19S Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg 200 205 210 Ala Arg He Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser 215 220 225 Pro Pro Arg Gla Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu 230 235 240 Ala Thr lie Thr Gly Leu GIu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr 245 250 255 Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly 260 265 270 Arg Lys Lys Thr Ser Ala He Pro AXsi Pro . Thr Asp Leu Lys Phe 275 280 285 Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro 290 295 300 Asn Val Gla Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu 305 310 315 Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu He Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser 320 325 330 Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val 335 340 345 Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro A丄a Gin 350 355 360 Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala 365 370 375 Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr He Thr lie Ser Trp Arg 380 385 390 - 39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 A8 B8 C8 D8 穴、申請專利範圍 Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro 395 400 405 Ala Asn Gly Gin Thr Pro He Gla Arg Thr lie Lys Pro Asp Val 410 415 420 Arg Ser Tyr Thr Ils Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys 425 430 435 lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val 440 445 450 Val lie Asp Ala Ser Thr Ala Ila Asp Ala Pro Ser Asa Leu Arg 455 460. 465 Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro 470 475 480 Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro 485 —· · . 490 495 Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val 500 505 510 Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr 515 520 525 lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu 530 535 540 He Gly Arg Lys Lys Thr Ser 〇 545 43. —種基因 J 其特徵為編碼根據申請專利範圍第4 2項之多肽< > 44. 一種多肽，其特徵為其係由序列表中序列編號No· 30所代表· 序列编號No. 30 Met Ala Ala Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Lau Lys Phe Thr 5 10 15 - 40- 本紙張尺度適M中國國家操準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585909 六、申請專利範圍 A B c D Gin Val Thr Pro Thr Ser Lau Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn 20 25 30 Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr'Pro Lvs Glu Lys 35 40 45 Thr Gly Pro Met: Lys Glu lie Asa Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser 50 55 60 Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr_Lys Tyr Glu Val Ser 65 ’7C 75 Val Tyr A丄a Lau Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly 80 85 90 Val Val Thr Thr Leu G丄u Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg 95 100 105 Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr 110 115 120 Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala 125 130 135 Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg 140 145 150 Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie 155 150 l〇5 Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val 170 175 180 工le Asp Ala Ser Thr Ala 工le Asp A丄a Pro Ser Asn Leu Arg Phe 185 190 195 Leu Ala Thr Thr ?ro Asn Ser Leu Leu Val Ser.Trp Gin Pro Pro 200 205 210 Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly 215 220 225 Ser Pro Pro,Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr 230 235 240 裝訂 f 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr He 245 250 255 Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gl-rr^y?* Ser Glii Pro Leu lie 260 265 270 Gly Arg Lys Lys Thr Ala lie Pro AJLa Pro Thr Asp Leu Lys Phe 275 280 285 Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser A丄a Gin Trp Thr Pro Pro 290 295 300 Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu 305 310 315 Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser 320 325 330 Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val A丄a Thr Lys Tyr Glu Val 335 340 345 Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin 350 355 360 Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala 365 370 375 Arg Val Thr Asp AX21 Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg 380 385 390 Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Vd丄 Pro 395 400 405 Ala Asa Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr Ila Lys ΡΓΟ Asp Val 410 415 420 Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr ASO Tyr Lys 425 430 435 Ila Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala ^Arg Ser Ser Pro Val 440 445 450 Val lie. Asp Ala Ser Thr Ala He Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg 455 460 465 _ 42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 585909 六、申請專利範圍 ?he Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro 470 475 480 Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr He lie Lys Tvr Glu Lvs Pro 485 490 495 Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val 500 505 510 Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr 515 520 525 He Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu 530 535 540 lie Gly Arg Lys Lys Thr Ser Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr 545 ， 550 555 Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro 560 555 570 Ser Thr Ser O 45. —種基因，其特徵為編碼根據申請專利範圍第4 4項之多肽。 46. —種多肽，其特徵為其係由序列表中序列編號No. 5所代表·· 序列瑞號No. 5 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met: Arg 15 10 15 Val Thr Trp A丄a Pro Pro Pro Ser Xla Asp Lau Thr Asn Phe Leu' 20 25 30 Va丄 Arg Tyr Ser Pro Vai Lys Asa Glu Glu Asp Val A丄a GJLu Leu 35 40 45 See* Xle Ser ?vo Sex* Asp Asn A丄2L Val Va丄 Lsu Asn Lsu Leu S〇 55 〇〇 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

585909 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser val Tyr Glu Gin 65 70 75 His •Glu Ser Thr Pro Lau Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Lau Asp 30 85 90 Ser Pro Thr Gly 工丄e Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr Ii3 Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Xla Arg His His Pro Glu His Phe Ser Glv Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Lau Thr Asn Lau Thr 140 145 150 Pro Glv Thr Glu Tyr Val Val' Ser lie Val Ala Leu Asa Gly Arg 155 150 165 Giu Glu Ser Pro Leu Lau lie Gly Gin Gin Ser Thr Vai Ser Asp 170 175 130 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val val ilT Λ丄a Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Lau lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210· Ha Thr Tyr Glv Glu Thr Gly Gly Asa Ser ?ro Vs丄 Gin Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly* Ser Lys Ser Thr A丄己 Thr lie Ser Gly Lau Lys 230 235 240 Pro Gly Va丄 Asp Tyr Thr Ha Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Glv Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 2S5 270 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) k 訂 f 585909 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 295 280 Thr Glu I丄3 Asp Lys Pro Ser Met: Ala A丄Gly Ser lie Thr Thr 275 Leu Pro A丄a Lau Pro Glu Asp Glv Gly Ser Gly A丄a ?he ?ro Pro 290 295 300 Giv His Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Glv Gly 305 310 315 Phe Phe Lea Arg He His Pro Asp Gly Arg Val *Aso Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lvs Ser Asp Pro His lie Lys Lau Gin Leu Gin A丄a Glu Glu 335 340 · 345 Arg Gly Vai Vai Ser Ils Lys GLy Val C/s Ala Asn Arg Tyr Lau 350 355 360 Ala Mel: Lys Glu Asp Giv Arg Leu JLau__Ala Ser Lys Cvs Val Thr 365 370 375 Asp Glu Cys ?he Phe Phe Glu Arg Lau Glu Ser Asa Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Lau Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420 Lys Ala lie Leu Phe Lau Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu 425 «0 435 Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro Kis Pro Asn Lau His Gly ?r〇 Glu 440 «5 450 lie Lau Asp Val Pro Ser Thr O 455 47. —種基因，其特徵為編碼根據申請專利範圍第4 6項之多肽。 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）